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Principios de Biología Molecular
2º Curso de Postgrado en Salud Reproductiva
Centro Rosarino de Estudios Perinatales
Gustavo Leguizamón
Unidad de Embarazo de Alto Riesgo
Hitos en el camino hacia la secuenciación de ADN
• 1940 reconocimiento de AND como material de herencia
• 1953 estructura de la doble cadena• 1966 decodificación del código genético• 1972 tecnología del ADN recombinante• 1975-1977 tecnología de la secuenciación
de ADN
• 1983 mapeo genético de enfermedad (Huntington)
• 1990 lanzamiento del PGH• 1996 comienza la secuenciación• 2001 borrador
Hitos en el camino hacia la secuenciación de ADN
Watson & Crick
• Watson: zoologo, Crick: físico
• “En 1947 Crick no poseia conocimientos de biología ni de quimica orgánica o cristalografía..” – www.nobel.se
• Aplicando las reglas de Chagraff y las imàgenes de rayos X de Rosalind Franklin construyeron el modelo de la doble hélice
• En 1953 Nature: “It has not escaped our notice that the specific pairing we have postulated immediately suggests a possible copying mechanism for the genetic material.”
Watson & Crick with DNA model
Rosalind Franklin with X-ray image of DNA
Porquè era necesario secuenciar el genoma humano?
• Las enfermedades son producto de interacciones del medio-genes
• Los progresos relacionados a enfermedades asociadas a un gen
• Cáncer, cardiopatía, hipertensión: asociadas a componente genéticoMúltiples genes comprometidosDifícil su estudio
Proyecto genoma humano: objetivos
• Identificar los 30.000 a 35.000 genes humanos
• Determinar la secuencia de los 3 millones de pares de bases
• Almacenar la información en bases de datos
• Mejorar las herramientas de análisis• Transferencia de tecnología al sector
privado• Analizar las implicancias éticas, legales y
sociales
Proyecto Genoma Humano
Major events in the history of Molecular Biology 2000-2001
• 2001 International Human Genome Sequencing: primer borrador de la secuencia del genoma humano
Niveles de organización
• Nucleo = biblioteca• Cromosomas = estantes• Genes = libros
Purinas Pirimidinas
DNA Components• Nitrogenous Base:
N is important for hydrogen bonding between bases A – adenine with T – thymine (double H-bond)C – cytosine with G – guanine (triple H-bond)
• Sugar: Ribose (5 carbon)Base covalently bonds with 1’ carbonPhosphate covalently bonds with 5’ carbonNormal ribose (OH on 2’ carbon) – RNAdeoxyribose (H on 2’ carbon) – DNA dideoxyribose (H on 2’ & 3’ carbon) – used in DNA sequencing
• Phosphate:negatively charged
Estructura del ADN
Base (A,T, C or G)
Azùcar
Fosfato
Antiparalela
Double helix of DNA
• The double helix of DNA has these features:Concentration of adenine (A) is equal to thymine
(T) Concentration of cytidine (C) is equal to guanine
(G). Watson-Crick base-pairing A will only base-pair
with T, and C with Gbase-pairs of G and C contain three H-bonds, Base-pairs of A and T contain two H-bonds. G-C base-pairs are more stable than A-T base-
pairsTwo polynucleotide strands wound around each
other.
Double helix of DNA
• The DNA strands are assembled in the 5' to 3' direction by convention, we "read" them the same way.
• The phosphate group bonded to the 5' carbon atom of one deoxyribose is covalently bonded to the 3' carbon of the next.
• The purine or pyrimidine attached to each deoxyriboseprojects in toward the axis of the helix.
• Each base forms hydrogen bonds with the one directly opposite it, forming base pairs (also called nucleotide pairs).
Superestructura
Lodish et al. Molecular Biology of the Cell (5th ed.). W.H. Freeman & Co., 2003.
The Histone Code• State of histone tails govern TF access to
DNA
• State is governed by amino acid sequence and modification (acetylation, phosphorylation, methylation)
Lodish et al. Molecular Biology of the Cell (5th ed.). W.H. Freeman & Co., 2003.
DNA, RNA, and the Flow of Information
TranslationTranscription
Replication
Replicación del DNA
• Semiconservadora• Diferentes
mecanismos para cada cadena
DNA RNA: Transcription• DNA gets transcribed by
a protein known as RNA-polymerase
• This process builds a chain of bases that will become mRNA
• RNA and DNA are similar, except that RNA is single stranded and thus less stable than DNAAlso, in RNA, the base
uracil (U) is used instead of thymine (T), the DNA counterpart
Transcription• Transcription is highly regulated. Most DNA is in a
dense form where it cannot be transcribed. • To begin transcription requires a promoter, a small
specific sequence of DNA to which polymerase can bind (~40 base pairs “upstream” of gene)
• Finding these promoter regions is a partially solved problem that is related to motif finding.
• There can also be repressors and inhibitors acting in various ways to stop transcription. This makes regulation of gene transcription complex to understand.
Definition of a Gene
• Regulatory regions: up to 50 kb upstream of +1 site
• Exons: protein coding and untranslated regions (UTR)
1 to 178 exons per gene (mean 8.8)8 bp to 17 kb per exon (mean 145 bp)
• Introns: splice acceptor and donor sites, junk DNAaverage 1 kb – 50 kb per intron
• Gene size: Largest – 2.4 Mb (Dystrophin). Mean – 27 kb.
Central Dogma Revisited
DNA hnRNA mRNA
protein
Splicing
Spliceosome
Translation
Transcription
Nucleus
Ribosome in Cytoplasm
Traducción
Traducción: codigo genético degenerado
Overview of DNA to RNA to Protein
A gene is expressed in two stepsTranscription: RNA synthesisTranslation: Protein synthesis
Western blot (SDS PAGE)
• Gel de poliacrilamida (poro variable)• Disociación de la proteina en unidades polipeptídicas
por rotura de puentes S-S (agente reductor-mercaptoetanol)
• El detergente SDS de carga negativa se une a la regiones hidrofóbicas de la proteina desplegandola y neutralizando su carga
• La migración es por tamaño ( no por forma ni carga)• Identificación de proteinas
Western blot (SDS PAGE)
Western blot (SDS PAGE)
Tratamiento del trabajo del parto prematuro:conclusiones parciales
• Tocolíticos: efectivos por 48-72 horas• Corticoides: disminuyen la morbi-
mortalidad neonatal• Antibióticos: no son efectivos en el
tratamiento del TPP
?
Gemelos
Contracción Infección
RPM
?
? Parto pretérmino
Parto pretérmino: fundamentos de la tocolisis
Tocolíticos: mecanismo de acción
Ca++Ca++
Calmodulina-Ca
Ca++
Ca++Voltaje dependientes
V.Ind
MLK
AMPcProg
A/M
OcitocinaPGs
Beta miméticos Sulfato de Mg
Bloqueantes cálcicosIndometacina
Stress/Fisiológico Gemelar/PoliAbruptioInfección
Eje Inflamación Hemorragia DistenciónHip Hip decidual
CRH-Cortisol TNFIL-1-6-8
Trombina Stretching
AA PGsCOX
PGDH
InactivosProteasas
Amnion
Mecanismos de parto prematuro
Cox-2Cox-2
Antecedentes (I): inducción de la expresión de COX-2 mediante stretching
celularMecánico
Químico
La síntesis de prostaglandinas en el amnios esta incrementada en mujeres que presentan parto prematuro secundario a sobredistención (gemelos y polihidramnios). Esto se debe a un aumento en la expresión y actividad de la iso-enzima COX-2.
Hipótesis
Leguizamón et al AJOG 2000Leguizamón et al AJOG 2000
• Membranas de pacientes con parto pretérmino secundario a sobredistención controladas con membranas de pacientes sin trabajo de parto
• Determinación de PG E2 en amnion (EIA)• Determinación de la expresión de COX-1 y
COX-2 (Western Blot)• Inhibición selectiva de COX-1 (SC 560) y de
COX-2 (SC 236)
Método
Leguizamón et al AJOG 2000Leguizamón et al AJOG 2000
Producción de PGE2 en amnionGemelos y polihidramnios
Producción de PGE2 en amnionGemelos y polihidramnios
00
20002000
40004000
TwinsTwins Poly-Poly-hydramnioshydramnios
Non-Non-LaborLabor
LaborLabor
PG
E2
(pg/
mg
tissu
e)P
GE
2(p
g/m
g tis
sue)
Leguizamón et al AJOG 2000Leguizamón et al AJOG 2000
*
** P < 0.05
Leguizamón et al AJOG 2000Leguizamón et al AJOG 2000
Expresión de COX-1 y COX-2 en pacientes con parto pretérmino secundario a gemelos
y polihidramnios
Expresión de COX-1 y COX-2 en pacientes con parto pretérmino secundario a gemelos
y polihidramnios
Amnion
PGE2 ASSAY
DMSO DMSO INDOMETHACIN SC236 SC560
H2O AA AA AA AA
Controles
Leguizamón et al 2.000
Efecto de los inhibidores del COX sobre la producción de PGE2 por el amnion
Efecto de los inhibidores del COX sobre la producción de PGE2 por el amnion
0
20
40
60
80
100
120
140
1 2 3 4 5 6 7 8
IndoIndoSC-236SC-236SC-560SC-560
PG
E2
prod
uctio
n (%
of c
ontro
l)
TwinsTwins Poly-hydramnios
Poly-hydramnios
Leguizamón et al AJOG 2000Leguizamón et al AJOG 2000
El parto prematuro secundario a embarazo múltiple o polihidramnios se asocia a un aumento de la expresión y actividad del COX-2 del amnion
Conclusión
Especulación: Los inhibidores selectivos de la COX-2 podrían ser tocolíticos efectivos y
segurosLeguizamón et al AJOG 2000Leguizamón et al AJOG 2000
Polymerase Chain Reaction (PCR)• Polymerase Chain Reaction
(PCR)Used to massively replicate DNA sequences.
• How it works:Separate the two strands with low heatAdd some base pairs, primer sequences, and DNA Polymerase
Creates double stranded DNA from a single strand.Primer sequences create a seed from which double stranded DNA grows.
Repeat. Amount of DNA grows exponentially.1→2→4→8→16→32→64→128
Denaturation
Raise temperature to 94oC to separate the duplex form of DNA into single strands
Design primers
• To perform PCR, a 10-20bp sequence on either side of the sequence to be amplified must be known because DNA pol requires a primer to synthesize a new strand of DNA
Annealing
• Anneal primers at 50-65oC
Annealing• Anneal primers at 50-65oC
Extension• Extend primers: raise temp to 72oC, allowing Taqpol to attach at each priming site and extend a new DNA strand
Extensiòn• Extend primers: raise temp to 72oC, allowing Taqpol to attach at each priming site and extend a new DNA strand
Repeat
• Repeat the Denature, Anneal, Extension steps at their respective temperatures…
Polymerase Chain Reaction
Polymerase Chain Reaction
• Problem: Modern instrumentation cannot easily detect single molecules of DNA, making amplification a prerequisite for further analysis
• Solution: PCR doubles the number of DNA fragments at every iteration 1… 2… 4… 8…
DNA Arrays--Technical Foundations
• An array works by exploiting the ability of a given mRNAmolecule to hybridize to the DNA template.
• Using an array containing many DNA samples in an experiment, the expression levels of hundreds or thousands genes within a cell by measuring the amount of mRNA bound to each site on the array.
• With the aid of a computer, the amount of mRNA bound to the spots on the microarray is precisely measured, generating a profile of gene expression in the cell.
Tipos de Microarrarys
GENÓMICOS DE EXPRESIÓN MUTACIONES
MICROARRAYS
Microarray GenMicroarray Genóómicomico•• DetectaDetecta la la presenciapresencia o o ausenciaausencia de un de un gengen y en y en cucuáántas ntas copiascopias
••MicroarrayMicroarray de de ExpresiExpresióónn•• Determina los niveles relativosDetermina los niveles relativos de de expresiexpresióónn ((mRNAmRNA) de ) de loslosgenesgenes
AnAnáálisis por Microarrayslisis por Microarrays
Duggan DJ. et al., Nature Genet. 21: 10-14 (Supplement) (1999).
An experiment on a microarray
In this schematic:
GREEN represents Control DNA
RED represents Sample DNA
YELLOW represents a combination of Control and Sample DNA
BLACK represents areas where neither the Control nor Sample DNA
Each color in an array represents either healthy (control) or diseased (sample) tissue. The location and intensity of a color tell us whether the gene, or mutation, is present in the control and/or sample DNA.
Tipos de Muestra Tipos de Muestra DiagnDiagnóóstico Pre y Poststico Pre y Post--natalnatal
• Sangre• Líquido Amniótico
Células en CultivoCélulas sin cultivar
• Vellosidades Coriónicas• Blastómeros• Cuerpos Polares• Productos de Aborto
Análisis mediante microarray de expresión génica
• Objetivo: identificar patrones de expresión génica durante el trabajo de parto prematuro y de término en el humano y la rata
• Análisis de microarray utilizando ARN miometral de pacientes con:
o Parto prematuro con y sin trabajo de partoo Parto de término con trabajo de parto
DNA Microarray
Tagged probes become hybridized to the DNA chip’s microarray.
Millions of DNA strands build up on each location.
77 genes incrementaronsu actividad (X2) enpacientes con trabajode parto a tèrmino y pretèrmino
PTNL PTL TL
Sin cambiosAumentoDisminución
Agrupación funcional en clusters de genes de miometrio humano
Bethin et al
Agrupación funcional en clusters de genes de miometrio de rata
PTNL PTL TL
Activación de diferentes genes enel humano y en la rata