Purificazione della GFP LLC Bologna - 2007. La GFP è una proteina di media grandezza formata da 238...

Purificazione della GFP

LLC Bologna - 2007

La GFP è una proteina di media grandezza formata da 238 amminoacidi e con un peso molecolare intorno a 26 kDa. Essa venne estratta e purificata per la prima volta dalla medusa Aequorea Victoria nel 1962

La medusa contiene una proteina bioluminescente, detta aequorina, che emette luce blu. La proteina fluorescente verde converte questa luce in luce verde che è quella che davvero vediamo quando la medusa si illumina. Una soluzione di proteina GFP purificata appare gialla alla normale luce da interni ad incandescenza, ma quando viene osservata alla luce ultravioletta, questa soluzione emette un brillante colore verde.

La proteina assorbe infatti le radiazioni UV, e poi le emette come luce verde di minore energia.

Proteina Fluorescente Verde

All’interno di questa struttura estremamente stabile (T. stab  76 °C) è contenuta un’ulteriore a-elica che comprende il cromoforo della proteina. Il corretto ripiegamento della proteina è necessario per ottenere un ambiente rigido e strutturato intorno al cromoforo e per schermare il cromoforo da agenti esterni in grado di deprimere la resa di fluorescenza

Questa proteina possiede una struttura tridimensionale molto particolare, che ricorda un cilindro cavo o un barilotto (in inglese, b-barrel), con un diametro di 24 Å ed una altezza di 42 Å .

Le pareti del cilindro sono formate da 11 ß-foglietti intrecciati a coppie e collegati tra loro mediante delle corte a-eliche che chiudono le due basi della struttura.

Struttura Tridimensionale Delle Proteine Verdi Fluorescenti

Utilizzi proteina GFP

LLC Bologna - 2009

Utilizzi proteina GFP

Trasformazione Batterica

Osservazione espressione fenotipica

I batteri vengono sottoposti ai seguenti passaggi:

LLC Bologna - 2007

Trattamento con CaCl2 per rendere i batteri

competenti Shock termico - Inserimento del plasmide

Aggiunta di terreno di coltura liquido ed incubazione

Semina in piastre con terreni selettivi

Incubazione overnight

Separare la Green Fluorescent Protein dal contesto cellulare e dal pool molecolare in cui si trova in soluzione

Finalità

LLC Bologna - 2007

lisozima

lisi

Lisi della cellula batterica

LLC Bologna - 2007

UV

Centrifugazione

pellet

surnatante

Centrifugazione

LLC Bologna - 2007

Tecnica che consente la

separazione dei singoli

componenti di una miscela in

base alle loro caratteristiche

chimico-fisiche

Cromatografia

LLC Bologna - 2007

Atomi polari1011

Atomi apolari706

GFP

LLC Bologna - 2007

++

+++

+++

++

++

++

++

++

++

++

+ +

++

+

+

+

+

+

+

+

+

GFP in soluzione acquosa

Idrofilo-idrofobo

+ +

+

+

+

+

GFP in soluzione salina

+

+

+

+

+

+

+

+

+

+

+

+

+

+

+

+

+

+

+

+Ione ammonio

Ione solfato

LLC Bologna - 2007

Modello della struttura della GFP in soluzione acquosa

Residuo aminoacidico idrofiloResiduo aminoacidico idrofoboMolecola H2O

+

+

+++++

+

+

+++++

Modello della struttura della GFP in soluzione salina

+

+

++

+

+

+

+

+

+

+ +

+

Residuo aminoacidico idrofiloResiduo aminoacidico idrofoboMolecola H2O+

Ione ammonio

Ione solfato

+

+

++

+

+

Colonna cromatografica ad interazione idrofobica

(HIC)

LLC Bologna - 2007