REACCIÓN EN CADENA DE LA POLIMERASA (PCR) ·  · 2016-05-09Tipos de PCR Nested PCR Técnica muy...

REACCIÓN EN CADENA DE LA POLIMERASA (PCR)

Lic. en BioquímicaLic. en Biotecnología

Microbiología de los Alimentos 2016

• Desarrollada por Kary Mullis en 1986

• Técnica in vitro que permite amplificar enzimáticamente unaregión determinada de ADN, la cual se encuentra flanqueadapor 2 secuencias de ADN conocidas

• Se basa en el mecanismo de replicación in vivo de ADN: ElADN bicatenario se desenrolla pasando a monocatenario,duplicándose y volviéndose a enrollar.

Pasos para realizar una PCR

1) Extracción del ADN deseado

2) Preparación de la mezcla de reacción (Master mix)

3) Separación de master mix en alícuotas y agregado delADN de interés

4) Amplificación en Termociclador

5) Electroforesis en gel de agarosa

6) Observación en transiluminador UV

Extracción de ADNExisten distintos métodos para extracción de ADN.

Técnica A:

Enriquecimiento debacteria en mediode cultivo Ansada

Resuspender en 150µlde Triton X-100 enbuffer TE

Hervir a baño de agua a100°C 15 minutos

Centrifugar a12000 rpm 5minutos

Tomar 50 µl delsobrenadante ycolocar en tubonuevo

ADN listo para PCR

Técnica B: Kit comercial de extracción QIAamp

Componentes de la Master Mix

H2O ultrapura

Buffer

Mg+2

dNTPs

Primer forward

Primer reverse

ADN polimerasa

+ ADN de interés

Termociclador

Preparación de Master mix

Reactivos Solución stock Solución de

trabajo

Volumen en la

mezcla (ml)

Buffer 10 x 1x

dNTPs 2,5 mM 0,1 mM

MgCl2 25 mM 1,5 mM

Iniciador a 100 pmol/ml 2 pmol/ml

Iniciador b 100 pmol/ml 2 pmol/ml

Taq pol 5 U/ml 0,02 U/ml

ADN templado 2

H2O ultrapura

Volumen final 50

Pasos durante la amplificación1) Desnaturalización inicial

2) Ciclos: - Desnaturalización

- Unión o annealing

- Extensión

3) Extensión final

Importancia de los controles

Control Positivo: ADN diana que se sabe amplifica el gen buscado. Permite verificar queeste correcto el procedimiento.

Control Negativo: Componentes de Master mix sin ADN. Permite ver que no hayacontaminación.

92 - 94°C

92 – 94°C

55 – 61°C

72 – 74°C

72 – 74°C

Cuidados a tener en cuentaTrazas de ADN contaminante podrían servir como ADN molde, llevando a la amplificación de unfragmento incorrecto (FALSOS POSITIVOS). Para evitarlo es fundamental:

• Trabajar en condiciones de asepsia

• Lugar de trabajo bien limpio, trabajar con guardapolvo, guantes

• Material que se utiliza debe estar esterilizado

• Preferible si es material nuevo

• Evitar corrientes de aire

Zonas de trabajo

Recomendable: zonas de trabajo físicamente separadas y dotadas de material adecuado.

• Zona de preparación de la muestra: Extracción y purificación del material genético.

• Zona de PCR: preparación de master mix y muestras.

• Zona post-PCR: donde se realiza la amplificación de ADN.

ReveladoLos fragmentos de PCR se revelan mediante electroforesis en gel deagarosa.

Gel de agarosa y bufferde corrida TAE o TBE

Siembra 5 µl de muestra+ 2 µl de azul debromofenol

Visualización

Conceptos básicos

En Microbiología:

• Identificación de microorganismos por presencia de una secuencia especifica del gen 16S ARNr uotros genes específicos de especie

• Selección de clones que posean genes asociados a virulencia, resistencia a antibióticos, etc.

• Establecer relación entre cepas durante brotes o estudio epidemiológicos

En otras áreas:

• Identificación de genes para diagnostico y medicina legal

• Investigación de modelos de expresión

• Especificidad: Generación de un único producto de amplificación.• Eficiencia: Máxima producción de amplificación en función del número de ciclos.• Fidelidad: Número de errores que comete la DNA polimerasa durante la copia (menor

número de errores, mayor fidelidad).• Sensibilidad: Mínima cantidad de ADN que se necesita para obtener una gran

cantidad de copias

Aplicaciones

Ventajas• A partir de una muestra pequeña de ADN se puede obtener una cantidad

considerable

• Rapidez en el diagnostico

• Mayor sensibilidad que los cultivos

• Se puede amplificar ADN de cualquier organismo, vivo o muerto

• El fragmento obtenido se puede clonar, secuenciar y analizar

Desventajas

• Se pueden reproducir partes del genoma cuya secuencia se conoce y consta de 20 a 40pb de longitud

• Se necesitan “PRIMERS” específicos

• La enzima ADN polimerasa puede tener errores al sintetizar

• Puede contaminarse con otro ADN

• Reactivos costosos

Tipos de PCR

Nested PCR

Técnica muy sensible de PCR en laque el producto de amplificaciónes utilizado como molde pararealizar una segunda amplificacióncon cebadores que se ubicandentro de la primera secuenciaamplificada.

Ventajas: brinda alta sensibilidad yespecificidad

Desventajas: no permitecuantificar la muestra

PCR multiplex

PCR en la cual se amplificasimultáneamente dos o mássecuencias. Para lo cual secombinan dos o más paresde cebadores en el tubo dela mezcla junto con losdemás reactivos.

RT- PCR

Variante de PCR en donde una hebra de ARN mensajero es transcripta a ADN complementario (ADNc) usando la enzima retrotranscriptasa, y el resultado se amplifica como una PCR tradicional.

Aplicaciones en el laboratorio de Microbiología

Electroforesis en gel de agarosa al 1% teñido con bromuro de etidio de los productos de amplificación obtenidos por nested-PCR cuando distintas concentraciones de Y. enterocolitica W1024 fueron inoculadas en chorizo de puro cerdo. (a)ADN extraido mediante el protocolo desarrollado por Kapperud y modificado en el presente trabajo, (b) ADN extraído mediante el reactivo PrepMan Ultra. Línea M: marcador de peso molecular de 100pb; C (-): control negativo.

Sensibilidad de la técnica nested-PCR para el gen

yadA

PCR múltiplex para la

determinación de la

presencia de genes de virulencia

Electroforesis en gel de agarosa para ver los fragmentos de PCR multiplex de Yersinia enterocolitica para los genes Inv y yst.

1: Cepa 51, B2/O:9: Inv: 558pb ; yst: 192pb

2: Cepa 52, B2/O:9: Inv: 558pb ; yst: 192pb

3: Cepa 53, B2/O:9: Inv: 558pb ; yst: 192pb

4: Cepa 64, B4/O:3: Inv: 558pb

5: Marcador de peso molecular

6: Cepa 68, B4/O:3: Inv: 558pb ; yst: 192pb

7: Cepa de referencia, W1024, B2/O:9:Inv: 558pb ; yst: 192pb

8: Cepa de referencia, MCH700, B4/O:3: Inv: 558pb ; yst: 192pb

9: Control negativo

10: Marcador de peso molecular

1 2 3 4 5

6 7 8 9 10

Resistencia a ATM de Helicobacter pylori

El mecanismo de resistencia a Cla esta asociado a mutaciones puntuales en la región peptidiltransferasa del gen 23s RNAr principalmente en las posiciones 2142 y 2143 en las cuales una guanina o citocina reemplazan una adenina.

ACGGAAAGACC WT S CLAACGGGAAGACC A2142G R CLAACGGAGAGACC A2143G R CLA

Corte con enzima

BsaI

Corte con

enzima MboII

Amplificación fragmento 450 pb

Bibliografía, dónde buscar?

• US National Library of Medicine. National Institute of Health

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed

• Science Direct

http://www.sciencedirect.com/

• Biblioteca electrónica de Ciencia y Tecnología. Argentina

http://www.biblioteca.mincyt.gob.ar/