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09/09/2014
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Explicación de TP Nº 2
Reacción en cadena de la
Polimerasa (PCR)
Química Biológica Patológica
Bioq. Mariana L. Ferramola
2014
Definición de PCR
� Es la amplificación enzimática de un fragmento de interés
(DNA) localizado entre dos oligonucleótidos (cebadores).
� Permite generar cantidades ilimitadas de una secuencia de
interés.
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Componentes del sistema de PCR
� ADN molde
� Oligonucleótidos (cebadores o primers)
� Polimerasa termoestable
� Solución buffer
� dNTPs (dATP; dCTP; dTTP; dGTP)
Máster
Mix
Componentes del sistema de PCR: ADN molde
El ADN molde puede ser de cadena sencilla o doble, circular
o lineal. En caso de desear amplificar una secuencia de ARN
se debe utilizar primeramente una transcriptasa reversa.
� Deben tenerse en cuenta los posibles contaminantes
presentes en el ADN molde, que pudieran disminuir la
eficiencia de reacción:
� Urea
� SDS
� Acetato de sodio
� Agarosa
� Fenol
La cantidad de ADN molde a utilizar depende de la muestra de partida.
Demasiada cantidad de ADN puede inhibir la reacción de PCR.
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Componentes del sistema de PCR: ADN molde
Componentes del sistema de PCR: cebadores
� Longitud de la región complementaria al ADN molde de
entre 18-25pb.
� Deben ser específicos.
� No deben presentar auto-complementariedad.
� No deben ser complementarios entre ellos.
� El contenido de G+C debe estar entre el 40-60%.
� El Tm de los oligos no debe diferir en más de 5ºC.
� La diferencia entre el Tm de los oligos y del amplicón no
debe superar los 10ºC.
� Su concentración debe ser de entre 0.1-1μM
(concentraciones excesivas pueden dar lugar a
inespeficidad de amplificación).
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Componentes del sistema de PCR: polimerasa
termoestable
Las ADN polimerasas termoestables presentan las siguientes
características:
� Polimerizan en dirección 5’→ 3’.
� Necesitan de un extremo 3’-OH libre para comenzar la
polimerización.
� Incorporan dNTPs por complementariedad en una cadena
que sirve de molde.
� Necesitan la presencia de Mg para funcionar.
� Son capaces de resistir altas temperaturas por períodos
considerables.
Componentes del sistema de PCR: polimerasa
termoestable
ADN polimerasa Vida media
(95ºC)
A) B) C)
Taq (Thermus aquaticus) 40 + - -
Vent (Thermococcus litoralis) 400 - + -
Pfu (Pyrococcus furiosus) 120 - + -
Tth (Thermus thermophilus) 20 + - +
A) AcDvidad exonucleasa 5’ → 3’.
B) AcDvidad exonucleasa 3’ → 5’.
C) Actividad de transcriptasa inversa.
Existe una variedad de enzimas con características diferentes, según
la finalidad de la PCR a realizar.
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Componentes del sistema de PCR: solución
buffer y MgCl
� Se utiliza un buffer Tris-HCl, de pH 8,4 (tº amb).
� La concentración de MgCl influye directamente en la actividad
de la polimerasa, y es uno de los parámetros a ajustar:
� Si la concentración de Mg2+ es deficiente, ↓ la eficiencia de la
enzima.
� Si la concentración de Mg2+ es excesiva, ↑ la polimerización
inespecífica.
La concentración ideal de MgCl
varía entre 0,5-5mM,
dependiendo de:
Conc de ADN molde de partida.
Conc. y longitud de cebadores.
Conc. de dNTPs.
Long. del amplicón.
Componentes del sistema de PCR: dNTPs
� Generalmente se utilizan concentraciones equimolares de los
4 dNTPs (dATP, dCTP, dGTP, dTTP) en concentraciones que
varían entre 200 – 250 μM de c/u.
� Concentraciones mayores a 4mM inhiben la PCR por
quelación de Mg2+.
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Protocolo típico de una reacción de PCR.
1º) Desnaturalización (94 – 95ºC; 5 min)
2º) Desnaturalización (94 – 95ºC; 30 seg – 1
min)
3º) Hibridación (tº específica para c/par de
cebadores; 30 seg)
4º) Elongación (72ºC; 30 seg – 3 min,
dependiendo del tamaño del amplicón)
5º) Elongación (72ºC, 5 min)
Los pasos 2, 3 y 4
constituyen un
ciclo de PCR y se
repiten entre 25-
35 veces.
Etapas de un ciclo de PCR.
94ºC
Tm
Primers
72ºC
(min)
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Etapas de una PCR: Mezcla inicial
Etapas de un ciclo de PCR: Desnaturalización
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Etapas de un ciclo de PCR: Hibridación
Etapas de un ciclo de PCR: Elongación
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Reacción de PCR: esquema de amplificación
exponencial
Pérdida de eficiencia de PCR
Factores que llevan a la
pérdida de eficiencia de PCR
luego de varios ciclos:
� Disminución de actividad
de la polimerasa.
� Disminución de la
disponibilidad de dNTPs y
cebadores.
� Disminución de la
disponibilidad de Mg2+,
para el funcionamiento de
la enzima.
[AD
N]
Nº de ciclo
Fase lag
Fase
exponencial
Fase de
meseta
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Tipos de PCR.
• PCR-semicuantitativa
• PCR-cuantitativa (PCR-en tiempo
real)
• RT-PCR
• PCR-multiplex.
• PCR-anidada.
• PCR-aleloespecífica.
• PCR-mutagénesis dirigida.
PCR cuantitativa: PCR en Tiempo Real
� Permite cuantificar el producto obtenido a partir de cada
muestra mientras se lleva a cabo la amplificación.
� El equipo se compone de un termociclador y un lector de
fluorescencia, adosados a un equipo de recolección de datos
(ordenador).
Para la cuantificación se
establece un valor de corte
(valor umbral) de
fluorescencia emitida por las
muestras. Una muestra con
mayor concentración inicial
de ADN blanco necesitará
menos ciclos para alcanzar
dicho valor umbral.
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RT-PCR
� Se parte de una muestra de ARN.
� Se realiza primero una transcripción reversa, para obtener
DNA copia y luego se realiza la reacción de PCR.
PCR multiplex
� Permite amplificar distintos blancos a la vez en una muestra.
� Se utilizan 2, 3 o más pares de cebadores.
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PCR anidada� Consiste en amplificar un blanco con un par de cebadores, y en
una reacción posterior amplificar una fracción interna del
fragmento previamente amplificado.
� Aumenta la especificidad de amplificación.
PCR alelo específica
� Se diseñan cebadores que hibridan específicamente con el alelo
wild type o con el mutado.
� Permite la identificación de individuos que presenten dos
alelos normales, de portadores de mutación, y de individuos
con dos alelos mutados.
Mutagénesis dirigida por PCR
� Consiste en introducir una modificación en la secuencia del
amplicón obtenido mediante el diseño de un cebador que
contenga dicha mutación.
