RECREANDO LA DIVERSIDAD EN EL TUBO DE ENSAYO. ESTRATEGIAS in vivo E in vitro PARA LA GENERACION DE...

RECREANDO LA DIVERSIDAD EN EL TUBO

DEENSAYO

ESTRATEGIAS in vivo E in vitro PARA LA GENERACION DE

DIVERSIDAD MOLECULAR

Problemática:1. Necesidad de nuevas actividades2. Métodos basados en la estructura: gran requerimiento

Mediante la evolución dirigida pretendemos mimetizar los procesos naturales de selección

Ventajas:1. Empleo de elevado número de

variantes2. Posibilidad de resumir siglos de

evolución en días3. Amplio uso en biología molecular

Inconvenientes:1. Necesidad de un buen sistema

de selección

GENERACIÓN DE DIVERSIDAD

Librería (población de individuos)

Individuos

Identificación

Generación de diversidad

Selección

Análisis

Materia origen

EL PROBLEMA DE LA DIVERSIDAD

Repertorio natural de Ab 1012

Oligonucleótidos degenerados (8 aa´s) 208=2x1010

Electroporación E. coli 109/µg ADN

Librería de phage display 108

Librería de ribosome display 1012

Librería combinatoriales >1012

GENERACIÓN DE DIVERSIDAD

1. Mutagénesis química

2. Mutagénesis con cepas hipermutadoras

3. PCR

4. “DNA shuffling”

5. Phage display

6. Ribosomal display

MUTAGÉNESIS QUÍMICA

* Mutágeno: EMS, HA, ...

* Supervivencia: 0,1-10%

CEPAS HIPERMUTADORAS

* E. coli XLI-red (mutD mutS mutT)

PCR

* Taq pol: error 1/10000 por ciclo

* sales de manganeso

* nucleótidos desbalanceados

“DNA SHUFFLING”

The structure of FabsThe structure of Fabs

Antigen binding by Antigen binding by CDRs in scFvsCDRs in scFvs

Expression of antibody Expression of antibody fragments in fragments in E. coliE. coli

VH CH1

VL CL

Anchor-protein

IM

PFab

OM

VH VL

NH2NH2

CH1 CL

SS

COO-COO-

Fab

Expression of antibody Expression of antibody fragments in fragments in E. coliE. coli

Anchor-proteinVH VLlinker

OM

IM

PscFv

NH2

VH VL

COO-

scFv

Massive cloning of V-Massive cloning of V-genes by PCRgenes by PCR

B-cellsB-cells

cDNAcDNA

PCRPCR

mRNAmRNA

SpleenSpleen

HybridomaHybridoma

BloodBlood

Combinatorial synthesis

Assembly of V genes as Assembly of V genes as scFvsscFvs

VH fragments

VL fragmentsLinker

Homology drivenamplification

Sfi I Not I

Assembly of V genes as Assembly of V genes as scFvsscFvs

Assembly of V genes as Assembly of V genes as scFvsscFvs

The filamentous phages: The filamentous phages: M13 life cycleM13 life cycle

N CN1 N2 CTSP

GS-rich linkers

Length in aas 67

19

131 150

39

Function TolA binding F-pili binding Phage morphogenesis

s-s s-s

The protein gp3 of The protein gp3 of M13phageM13phage

Cloning of scFv genes into Cloning of scFv genes into phagemidsphagemids

bla

Sfi I Not I

ColE1 ori

M13 ori

gene 3

VH VL

(Apr)

pCANTAB-5E

plac

scFv

pIII

M13 phage

pVIII coat

Phagemid DNA

scFv-SELECTION MIMICS THE scFv-SELECTION MIMICS THE IMMUNE SYSTEM IMMUNE SYSTEM

Antigen

Infect E. coli

****

****

Amplification

**

Binding

**

Phab library

**

****

****

Expression of scFv

Elution

ARM (RIBOSOME) DISPLAY