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• FUNDAMENTO:La hemoglobina A de los glóbulos rojos del adulto esfácilmente eluída en medio acido, mientras que losglóbulos rojos fetales que contienen hemoglobina F, sonmas resistentes. Cuando se expone un frotis de sangre

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mas resistentes. Cuando se expone un frotis de sangrea un buffer ácido, la hemoglobina de los glóbulos rojosdel adulto pasa al medio y solo queda el estroma; lascélulas fetales conservaran la hemoglobina y seidentifican por un patrón de tinción positivo.

• COMPOSICIÓN DE LOS REACTIVOS:

REACTIVO DE FIJACIÓN: alcohol metílico

REACTIVO DE ELUCIÓN: buffer pH 3.2 to 3., Hematoxilina e REACTIVO DE ELUCIÓN: buffer pH 3.2 to 3., Hematoxilina e iones metálicos (FeCl3, MgCl2).

REACTIVO DE CONTRATINCIÓN: Eritrosina B.

• Muestra:

� Sangre anticoaguladas en tubos con EDTA, HEPARINA oCITRATO. No son adecuadas las muestras con sangre coagulada.

� Exceso de EDTA disuelto en la muestra: inapropiada elución dela hemoglobina del adulto (volúmenes inferiores a 0,5 ml de sangrela hemoglobina del adulto (volúmenes inferiores a 0,5 ml de sangreen tubos preparados para recolectar 5 ml de sangre).

� Edad de las muestras: de más de cuatro días de recolecciónpueden mostrar problemas en la elución de la hemoglobina. Losglóbulos rojos pueden aparecer crenados.

• Cuando tomar la muestra?:MANAGEMENT OF WOMEN WHO HAVE RHD NEGATIVE BLOOD GROUP King Edward Memorial Hospital Ideally, the sample should be routinely collected a minimum of 15 minutes after placental separation and preferably

within 2 hours to allow sufficient time for any fetal red cells to be dispersed in the maternal circulation. In exceptional circumstances, Kleihauer Tests may be collected up to 72 hours after the event but this increases the risk

that that any additional doses of RhD-Ig needed for large FMH will not be administered within the required 72 hours.

Protocolo utilizado en mujeres RH negativas King Edward Memorial Hospital. Idealmente la muestra debe ser recolectada con un minimo de 15min, preferentemente dentro de las 2hs posteriores a la separacion placentaria

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recolectada con un minimo de 15min, preferentemente dentro de las 2hs posteriores a la separacion placentaria con el fin de permitir que todos los GR fetales se dispersen en la circulacion materna.

En circunstancias excepcionales, la muestra puede ser recolectada para hacer el test de Kleinhauer hasta 72hs luego del evento, pero esto incrementa el riesgo que de ser necesarias altas dosis adicionales de Ig-RhD en caso de HFM las mismas no podran ser administradas dentro de las 72hs como es debido.

• Extendido:

� Debe ser de fino espesor ya que un extendido espeso tiende alavarse después de la fijación.

� La superposición de células protege una de otras de la elucióndando como resultado una elución pobre en muchas células deldando como resultado una elución pobre en muchas células deladulto que toman el colorante de contratinción apareciendo teñidasde rosa/rojo.

� Los extendidos de sangre fijados no pueden ser almacenadosmás allá de las 72 horas, ya que se fija la hemoglobina. Serecomienda que la fijación, elución y contraste sean consecutivos yprogresivos sin demora entre ellos.

• FIJACIÓN:

� Algunas preparaciones alcohólicas pueden fijar la hemoglobinaen los glóbulos rojos evitando la elución completa, dando comoresultado glóbulos rojos teñidos por el colorante de contraste. Estopuede variar de un rosa suave a un rojo profundo.

� Si el periodo de fijación es abreviado existe la posibilidad de que� Si el periodo de fijación es abreviado existe la posibilidad de quelas células del adulto se tiñan con el reactivo de contratinción.

� Si se prolonga la fijación se evapora el alcohol cambiando larelación agua/alcohol. Esta relación es crítica y algunas elusionesde la hemoglobina fetal pueden resultar en una pérdida de tinciónde las células fetales.

� Concentraciones de alcohol elevadas pueden causar la eluciónde la HbF y bajas pueden causar alteraciones morfológicas.

• SECADO:

� Se debe permitir en todas las etapas del proceso que la películade glóbulos rojos se seque al aire.

� No se recomienda ayudar el secado usando una placa caliente oun secador de pelo. La hemoglobina puede ser fijada por calorun secador de pelo. La hemoglobina puede ser fijada por calorresultando en una elución inapropiada en los glóbulos rojos deladulto observándose así glóbulos rojos teñidos de rojo.

• ELUCIÓN:

� El tiempo establecido para la elución es de 30 segundos.

� Se utilizaron diferentes tiempos de elución para determinar cuancrítico es respetar los 30 segundos recomendados:

- 10 segundos, 20 segundos, 30 segundos, 40 segundos y 50segundos

En 100 muestras ensayadas en los tiempos que se detallan arriba nofueron detectados falso positivos y en todas las muestras los glóbulosrojos fetales fueron teñidos de rojo. Se concluye que la elución seproduce dentro de los primeros segundos y que la concentración deácido es tal que la exposición prolongada al reactivo de elución noproduce la elución de la HbF en los glóbulos rojos fetales, definiendocomo “No crítico” el tiempo recomendado de 30 segundos.

Es común que los pacientes con Talasemia muestren una eluciónpobre de algunos de sus glóbulos rojos, este problema se haceextensivo a pacientes con células con rasgos falciformes.

• CONTRATINCIÓN:

� El tiempo establecido para la contratinción fue de 2 minutos.

� Se utilizaron diferentes tiempos de contraste para determinarcuan crítico es respetar los 2 minutos recomendados:

- 1 minuto, 1.5 minutos, 2 minutos, 3 minutos y 4 minutos.

En 100 muestras testeadas la contratinción era optima entre 1.5minutos y 3 minutos. Resultados ligeramente más tenues seobtuvieron al minuto de exposición, aunque los glóbulos rojosfetales todavía se mostraban rojos y se podían diferenciar comotales. A los 4 minutos los portaobjetos comenzaban a tomar un colorrojo/rosa en el fondo y los glóbulos rojos fetales se veían masintensamente coloreados.

• DESVENTAJAS:

� Calidad de tinción sujeta a habilidad del técnico

� Subestimación al avanzar la edad gestacional ya que elcontenido de Hb F de los eritrocitos fetales disminuyecontenido de Hb F de los eritrocitos fetales disminuye

� Sobreestimación en condiciones maternas que llevan aproducción de Hb F (persistencia hereditaria, anemia drepanocítica,beta talasemia)

Legislación vigente impone realizar una prueba que cuantifique la HFM

Existe prueba que cuantifica HFM+

¿Por que no lo hacemos?

¡¡¡Muchas gracias!!!

kikelongo@gmail.comkikelongo@gmail.com