View
7
Download
0
Category
Preview:
Citation preview
REKOMBİNANT DNA TEKNİKLERİI
DR. ONUR YILMAZ
2017
Rekombinasyon: Yenibileşim - yenidenoluşum. Bir molekülün-hücrenin, atasal “wild type” yada ilkin (orijinal) yapısından farklılık göstermesidurumudur.
I - In vivo rekombinasyon
II- In vitro rekombinasyon
REKOMBİNANT DNA TEKNOLOJİSİ VE GEN MÜHENDİSLİĞİNİN TANIMI VE UYGULAMA ALANLARI
Rekombinant DNA teknolojisine ilişkin deneysel çalışmalar 1944 yılında genetik bilginin nükleik asitlerde depolandığının bulunması ile başlamıştır.
Rekombinant DNA teknolojisinin gerçek hikayesi 1970 yılında Smith’in mikroorganizmalarda bulunan ve DNA’yı spesifik bölgelerden kesen restriksiyonendonükleaz enzimlerini bulması ile başlamıştır.
1860-1865: Gregor Mendel Bezelye çaprazlamaları iledöllere “gen” geçişini ilk kez ortaya çıkardı.
1953 : Watson ve Crick DNA' nın çift iplikli sarmalyapısı keşfedildi.
1957 : Kornberg DNA polimeraz izole edildi
1966: Nırenberg ve ark Genetik kod çözümlendi.
1967 : Gellert DNA ligaz izole edildi.
Rekombinant DNA Teknolojisinin Gelişimi
1970: Hamilton Smith Restriksiyon enzimlerini (DNA makasları) keşfetti DNA yı belli noktalardan kesebilen enzimler
1972-73: Jackson ve ark : İlk r-DNA molekülü oluşturuldu.
1972-73: Boyer ve ark Gen klonlama tekniğinde plazmidler keşfedildi
1975: Southern hibridizasyon tekniği geliştirildi. "Southern Blot " tekniği.
1975: Kan ve ark: ilk prenatal teşhis
Walter Gilbert, Allan Maxam , ve Fred Sanger ayrı ayrı laboratuvarlarda DNA nınşifresini çözecek DNA baz dizisini ortaya çıkaran “DNA dizileme” metodunu geliştirdiler
1978: Yuet Wai Kan ve Andree-Marie Dozy “restriction-fragment-lengthpolymorphism” (RFLP) yöntemini geliştirdiler
1979: Goeddel ve ark, ilk rekombinant – insülin
1982: Palmiter ve Brinster Transgenik fareler
1982: Spradling ve Rubin Transgenik meyve sinekleri üretildi.
1985-1990: Kary Mullis arkadaşları polimeraz zincir reaksiyonu (PCR) adı verilen , hızlı DNA klonlaması ve dizi tepitinde önemli bir teknik geliştirdiler
1986: İlk hastalık (kronik granulomatos) geni pozisyonelklonlama ile tayin edildi
1987: Rekombinant hepatit B aşısı üretildi.
1989: ABD de İnsan Genomu Araştırma Ulusal Merkezi kuruldu
1994: İlk transgenik domates satış izni aldı
1993: Stilman ve Hall İnsan embriyosunun klonlanması çalışmaları
1997: Wilmut Koyun klonlanması (Erişkin memeli hücrelerinden)
1998: İnsan Genom Projesi (İGP) başlatıldı
2000 li yıllar: İGP tamamlandı (2003) DNA çipleri Farmakogenetikteatılımlar, Kök Hücre - tedavi
REKOMBİNANT DNA TEKNOLOJİSİNDE KULLANILAN YÖNTEMLER
Özel kesici enzimler kullanarak DNA molekülünün kesilmesi
DNA nın Klonlanması
DNA - nukleotid dizisinin hızlı bir şekilde saptanması
Nukleik asit hibridizasyonu
Genetik Mühendisliği
DNA-RNA MODİFİKASYON ENZİMLERİ
DNA-RNA MODİFİKASYON ENZİMLERİ
DNA/RNA modifikasyon enzimleri, katalizledikleri reaksiyonların tipine göre 4 anasınıfa ayrılabilirler
DNA/RNA Modifikasyon Enzimleri
Nükleazlar Ligazlar PolimerazlarKinaz ve
Fosfotazlar
11
NÜKLEAZLAR
Nükleazlar bir DNA /RNA zincirinde bir nükleotidin sonraki ile bağlantısını,
fosfodiester bağlarını kırarak yıkar. İki farklı tip nükleaz çeşidi vardır:
Ekzonükleazlar (Uçlardan kesim): DNA /RNA molekülünün bir ucundan bir kerede bir
nükleotidi uzaklaştırır. Ekzonükleazlar, uzaklaştırdıkları iplik sayısına göre ayrılırlar.
Endonükleazlar (Dahili kesim): DNA /RNA molekülünde içteki fosfodiester bağlarını
kırar. Endonükleazlar da aynı şekilde sınıflandırılır.
NÜKLEAZLAR
DNA-NÜKLEAZLAR
13
DNAZ-1
İnek pankreasından elde edilir.
DNA’nın hem tek hemde iki ipliğini birden kesebilen bir endonükleazdır.
RNA veya protein saflaştırmasında DNA'yı yok etmek için,
Shotgun sekans ile DNA kütüphanesi oluşturmada,
DNA-protein bağlanma yerlerini haritalamak (DNAse I footprinting).
DNA'nın nick translokasyon yöntemiyle radyokatif işaretlenmesi amacıyla
DNA'nın tek zincirinde kesikler yaratmakta kullanılır.
14
NÜKLEAZLAR
DNAZ-1
EKZONUKLEAZ-III
Çift iplikli DNA'nın 3' uçlarından nükleotitler çıkarır.
Genelde linear DNA moleküllerinin uçlarından farklı miktarlarda kısaltmalar
elde etmek için kullanılır.
Çift iplikli DNA’da 3’5’ yönünde ekzonükleaz akivitesi gösterir.
Tek iplik üzerinde etkili olmaz.
BAL-31
Alteromonas espejiana bakterisinden saflaştırılır,
Hem ekzonukleaz hem de endonükleaz aktivitesi gösterir,
DNA tek iplikli olduğu durumlarda endonükleaz aktivitesi gösterir.
DNA tek iplikli olmadığı durumlarda çift iplikli DNA’yı hem 3’- hem de 5’- yönünde
keser (Ekzonükleaz aktivitesi).
BAL-31
RNA-NÜKLEAZLAR
RİBONÜKLEAZ-A
Pirimidin bazlarında RNA’yı degrede eder.
Bir nükleotitin 5’-riboz ile komsu pirimidin
nükleotitin 3’-ribozundaki fosfat grubu
arasındaki fosfodiester bağından keser.
Genomik ve plazmit DNA hazırlamada,
DNA ve RNA’daki tek baz mutasyonlarının
taranmasında kullanılır.
RİBONÜKLEAZ-H
RNA'yı pirimidin bazlarında keser.
DNA/RNA hibritlerinde eşleşmemiş bazların olduğu noktalarda RNA'yı keserek
mutasyonlarının haritalanması için kullanılır.
DNA izolasyonunda RNA'yı yok etmek amacıyla kullanılır.
cDNA oluştururken RNA primerinin uzaklaştırılmasında,
Oligo(dT) varlığında mRNA’dan poliA kuyruğunun çıkarılmasında kullanılır.
RİBONÜKLEAZ-H
RİBONÜKLEAZ-H
DNA/RNA-NÜKLEAZLAR
S1-NÜKLEAZ
Aspergillus orizae’den elde edilir,
Düşük konsantrasyonda kullanılınca hem DNA hem
RNA'nın tek iplikli halini keser.
Yüksek konsantrasyonda çift iplikli nükleik asitleri
(DNA:DNA, DNA:RNA, RNA:RNA) keser.
S1-NÜKLEAZ
DNA-DNA veya DNA-RNA hibridlerinde tek iplikli bölgeleri ortamdan uzaklaştırır.
DNA:RNA komplekslerinin haritalanmasında
Tek iplikli uç uzantıları olan DNA parçalarının uçlarının düzleştirilmesi için kullanılır.
MUNG BEAN NÜKLEAZ
Mung fasulyesi (Vigna radiata) filizlerinden elde edilen tek iplikli DNA veya RNA’ya
özgü bir nükleazdır.
Yapışkan uçlu DNA moleküllerinin uçlarının düzleştirilmesi için kullanılır.
Dizinin ApN bölgesinde yüksek oranda verim gösterir. CpC ve CpG de verim
oldukça düşüktür.
Tek iplikli DNA veya RNA’ya S1 nükleazdan spesifitesi daha fazla olduğu için tek ipliğe
özgü nükleaz gerektiren çoğu uygulamada özellikle kullanılır.
Çift iplikli DNA’yı küt uçlu yapar.
LİGAZLAR
İki büyük molekül arasında bir kimyasal bağ oluşturarak onları birleştiren bir
enzimdir,
Genelde reaksiyonu sırasında bu büyük moleküllerden birine ait küçük bir
kimyasal grup hidroliz olur.
LİGAZLAR
DNA-LİGAZLAR
31
LİGAZLAR Hücredeki DNA ligazın işlevi, çift zincirli DNA molekülünün tek zincirde meydana
gelen kırıkları tamir etmektir.
Pekçok organizmadan elde edilen DNA ligazlar
çift zincirli DNA’nın iki ayrı fragmentini (3’-OH
ve 5’-P) fosfodiester bağı ile birbirine
bağlayabilir.
DNA LİGAZ
32
T4 DNA LİGAZ
Escherichia coli bakteriyofaj T4 kodlar,
DNA ve RNA’daki 5’-fosfat ile 3’-hidroksil uçları arasındaki fosfodiester bağını katalizler.
Kofaktör olarak ATP ve Mg+2 gerekir.
Hem küt uçlu kesimi hem de yapışkan uçlu kesimi ligasyon yapabilir.
Bu enzim ile
Bir vektöre DNA parçası eklenir.
DNA parçası ile Linker veya adaptör ligasyonu yapılır.
Kısa uzantılı yapışkan uçların ligasyonu düşük sıcaklıkta(4-8 °C) uzun süre içinde (genelde bir gece boyunca) gerçekleştirilir.
5' ucunda fosfat olmayan DNA'ların ligaz tarafındanbirleştirilebilmesi için 5' uçlarının fosforile edilmesigerekir.
Küt uçlu DNA'ların da ligasyonu mümkündür amareaksiyon çok daha yavaştır. Reaksiyon ortamındapolietilen glikol ve 150-200 mM NaCl bulunması DNA moleküllerinin ligasyonunu kolaylaştırır.
T4 DNA LİGAZ
NA molekülünün 3' hidroksil ucu ile bir diğerinin 5' fosfat ucu arasında bir fosfodiesterbağ oluşturmaktır.
DNA sentezi sırasında oluşan Okazaki parçalarının birleştirilmesi, ayrıca DNA tamiri içingereklidir.
ECOLİ DNA LİGAZ
RNA-LİGAZLAR
36
T4 RNA LİGAZ
T4 bakteriyofaj tarafından kodlanan bir enzimdir.
Kofaktör olarak ATP’ye ihtiyaç vardır.
RNA’nın 3’-OH ucuna 5’-fosfat ucunun bağlanmasını katalizler.
RNA-RNA ligasyonu yapabildiği gibi DNA-RNA ligasyonu da yapabilir, ancak yavaş olur.
DNA-DNA ligasyonu oldukça yavaştır ve bu ligasyon çift zincirli nükleik asitleri tanımada başarısız olmaktadır.
POLİMERAZLAR
38
POLİMERAZLAR
İşlevi RNA ve DNA gibi nükleik asit polimerleri ile ilgilidir,
Esas fonksiyonu, mevcut bir DNA veya RNA kalıbı kullanarak, yeni bir DNA veya RNA'nın polimerizasyonudur,
Bir grup başka enzim veya protein eşliğinde, çözeltide bulunan nükleotitleri alırlar ve bir polinükleotit iplikçiğin karşısında yeni bir polinükleotit iplikçiğinin sentezini katalizler.
39
POLİMERAZLAR
DNA-POLİMERAZLAR
41
DNA POLİMERAZ I
Hem ikileşme hem de tamir mekanizması içerir,
Mg+2 iyonuna gerek duyar,
RNA polimerazdan farklı olarak, sentezlediği yeni ipliği sadece nükleotitlerdenbaşlayarak uzatamaz, ancak mevcut bir DNA zincirini uzatabilir.
DNA POLİMERAZ I
43
KLENOW FRAGMENT
DNA nükleotit dizilerinin bulunmasında kullanılan ve ekzonükleaz faaliyetlerinesahip DNA polimeraz I enziminin parçası olan bir proteindir.
Polimeraz I’den farkı 5’3’ yönünde ekzonükleaz aktivitesi gösterir.
44
KLENOW FRAGMENT
Tek iplikli DNA’dan çift iplikli DNA eldesinde,
Küt uçlu DNA parçası yapımında,
Radyoaktif DNA problarının hazırlanmasında,
Dizilemede kullanılır.
45
T4 DNA POLİMERAZ
Tek iplikli DNA’da Klenow fragmentinden çokdaha spesifik 3’5’ yönünde ekzonukleazaktivitesi gösterir,
5’3’ekzonükleaz aktivitesi göstermez,
Güçlü 3’5’ ekzonükleaz aktivitesi ile DNA parçalarının 3’ ucunun işaretlenmesinde,
DNA parçasını küt uçlu yapmada kullanılır.
46
T4 DNA POLİMERAZ
47
T7 DNA POLİMERAZ 5’3’yönünde DNA sentezler,
Çok uzun DNA fragmanlarını sentezleyebilir,
Tek ve çift iplik üzerinde klenowfragmentinden 1000 kat daha güçlü 3’5’ ekzonükleaz aktivitesi gösterir,
Hem ikileşme hem de tamir mekanizmasıiçerir,
5’ overhang DNA’yı keserek o bölgeyi doldurma,
Apoptosiste DNA parçalanmasının belirlenmesi,
Kalıntı genomik DNA’nın ortamdanuzaklaştırılarak halkasal DNA’nın purifiyeedilmesinde kullanılır.
RNA-POLİMERAZLAR
49
T7 RNA POLİMERAZ
DNA’dan 5’3’yönünde RNA sentezler,
Hibridizasyonda,
Genomik DNA sekanslama Için kalıp olarakkullanılır.
50
SP6 RNA POLİMERAZ
Salmonella typhimurium LT2 dan enfekte olan faj SP6 DNA’sının kodladığı birenzimdir.
Template olarak SP6 promotor dizisi, subtsrat olarak NTP içeren çift iplikliDNA dizisinin kullanıldığı 5´→ 3´ yönünde RNA sentezler.
Northern ve southern hibridizasyonunda işaretli RNA problarınınhazırlanmasında,
Invitro translasyon Için RNA sentezinde kullanılır.
SP6 RNA POLİMERAZ
KİNAZ VE FOSFOTAZLAR
53
T4 POLİNUKLEOTİT KİNAZ
T4 bakteriyofajı genomundan kodlanan bir enzimdir.
DNA ve RNA’nın 5’-OH ucuna ATP’nin -fosfat’ının transferini katalizler.
ATP varlığında 5’-OH ucuna fosfat ekler.
ADP varlığında 5’-ucundaki fosfatın koparılmasını sağlar.
DNA ve RNA’nın 5’-ucunun işaretlenmesini sağlar.
Yapay DNA linkerların 5’-ucuna fosfat bağlanmasını sağlar.
DNA veya RNA’nın 5’-ucunun 32P veya 33P ile işaretlenmesinde yaygın olarak kullanılır.
ADP varlığında 5’-ucundaki fosfat grupları ve ATP’nin değiş-tokuş mekanizmasınıkatalizler.
54
T4 POLİNUKLEOTİT KİNAZ
55
BAKTERİYEL ALKALEN FOSFOTAZ
DNA ve RNA’dan 3’- ve 5’- uçlarında bulunan fosfat grubunu ortamdan uzaklaştırır.
Koparılan parçaların tekrar ligasyonunu önlemek amacıyla vektör DNA’nın 5’-fosfat
ucundaki fosfatı koparır.
T4 polinükleotit kinaz ile işaretlemeden önce nükleik asitlerin 5’-ucundaki fosfatın
koparılmasını sağlar.
En etkili alkali ortamda işlev görür.
Sekanslamadan önce PCR ürünündeki degrede DNA’nın temizlenmesinde kullanılır.
56
BAKTERİYEL ALKALEN FOSFOTAZ
Bu enzimler işgalci DNA ‘yı keserek, onu zararsız hale getirirler.
Virüs ve yabancı DNA’lardan bakteriyi korur
Recommended