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Klinische Chemie Klinische Chemie und Laboratoriumsdiagnostikund LaboratoriumsdiagnostikggVorlesung: Chromatographie und Vorlesung: Chromatographie und MassenspektrometrieMassenspektrometrie
Dr. rer. nat. Frank Kannenbergg Zentrale Einrichtung Labor
– UKM Labor –Universitätsklinikum MünsterAlbert-Schweitzer-Campus 1
D 48149 MünsterD-48149 MünsterTel.: 0251 83-47227Fax: 0251 83-47225
www.klichi.uni-muenster.defrank.kannenberg@ukmuenster.de
Wintersemester 2020/21
Säulenchromatographieg pPetroleum ether Farbe
h“chroma”schreiben
“ h i ”Chlorophyll-Extrakt “graphein”
CaCO3
Was ist Chromatographie?g pTrennung ähnlicher Moleküle aus komplexen Gemischen
• Die Analyte werden in einer mobilen Phase gelöst und y gdarin durch eine stationäre Phase transportiert.
• Die Phasen werden so gewählt, dass sich die Analyte unterschiedlich in ihnen verteilen.
• Durch die dadurch entstehenden Mobilitätsunterschiede trennen sich die Probe Komponenten in Banden a ftrennen sich die Probe-Komponenten in Banden auf.
Trennprinzipp pmobile Phase
Säulenanfang Säulenende• Stoffgemisch
StationärePhase
• Stoffgemisch• Komponenten
wechseln ständigzwischen mobiler
Zeitund stationärerPhasePhase
• Gleichgewicht(V t il(Verteilung,Adsorption)
• Trennung
Trennprinzipp pIInjektorInjektor
SSäuleSäule
DDDetektor
CCChromato-gramm
Dünschichtchromatographie (DC)• stationäre Phase:
B Ki l l ( l ) f– z.B. Kieselgel (polar) aufGlasplatte oder Alufolie
• mobile Phase:mobile Phase:– Laufmittel, z.B. Ethanol
• DC-Chromatogramm:DC Chromatogramm:– Auftragen (man./autom.)– Entwickeln („DC-Lauf“)– Trocknen, Detektieren
(ggf. Anfärben)P l ität b ht !• Polaritäten beachten!- polare (hydrophile)
Analyten laufen“ aufAnalyten „laufen aufKieselgel nicht
Retentionsfaktor (R Wert)Retentionsfaktor (Rf –Wert)
Laufstrecke SubstanzR
• Substanzspezifisch (bei gleichen chromat
Laufstrecke LösungsmittelRf
(bei gleichen chromat.Bedingungen)
Eintauch- 1 2Eintauchtiefe
HPLC (HighPerformanceLiquidChromatography)( )
Pumpe
PumpeTrennsäuleTrennsäule
EluentDetektor
EinspritzventilSäulennofen
RP-HPLC: Medikamentenanalyse
• Detektion + QuantifizierungQuantifizierung– Photometrie
(„UV-/vis Detektor“)(„ )– auch andere
Detektoren• Peak
– Retentionszeitsubstanzspezifischsubstanzspezifisch
– Höhe, Fläche proportional zur Konzentration
– KalibrationQuantifizierung– Quantifizierung
Gaschromatographie: Vgl. HPLC• HPLC: Mobile Phase flüssig (Laufmittel)• GC: Mobile Phase gasförmig (Trägergas)
GC– Vorteile GC:• Trennleistung (v.a. kleine, unpolare Moleküle)g ( p )• Empfindlichkeit
Nachteile GC:– Nachteile GC:• Verbindungen müssen flüchtig oder leicht
d fb i ( f D i ti i )verdampfbar sein (ggf. Derivatisierung)• Apparativer Aufwand (Gasleitungen)
GC: Schematischer AufbauReservoir für Probenaufgabe Chromatogr. Detektormobile Phase Trennsäule Schreiber, EDV
Gasflaschemit Vorreinigung
InjektorAutosamplerHeadspace-
f
gepackte SäuleKapillarsäule
FIDWLDMSD
Aufgabe AEDNPDECD
10.06.2011 11
GC-Anwendung: Toxikologie Blutalkohol Methanol-VergiftungBlutalkohol, Methanol-Vergiftung
Blood Alcohols
Column: Econo-Cap™ EC-WAX , 30m x 0.32mm x 0.25um Temp: 50°CCarrier: Helium at 1.08mL/min (22.5 cm/sec) D t t FID t 300°CDetector: FID at 300°C
Peak Identification1 Acetaldehyde1 . Acetaldehyde2 . Acetone3 . Methanol4 . 2-Propanol4 . 2 Propanol5 . Ethanol
GC-Anwendung: StoffwechseldiagnostikGC Anwendung: StoffwechseldiagnostikSmith-Lemli-Opitz Syndrom
• SLO-Syndrom– vererbbarer Defekt in der Cholesterolbiosynthese– vererbbarer Defekt in der Cholesterolbiosynthese– schwere Missbildungen– Cholesterin stark erniedrigt
7-Dehydrocholesterin (7-DHC) und 8-DHC stark– 7-Dehydrocholesterin (7-DHC) und 8-DHC starkerhöht (Marker)
• AnalytikRoutine Cholesterin Analytik ungeeignet– Routine Cholesterin-Analytik ungeeignet
– GC zur Quant. von Cholesterin, 7-DHC, 8-DHC– 22 Fälle seit 1995 hier entdeckt, davon 2 pränatal
SLO: Häufige Missbildungeng g• Schädeldeformierung (Mikrozephalie)• breite Nasenwurzel• hoher Gaumenhoher Gaumen• abnorm kleiner Oberkiefer (Mikrognathie)
H bhä d Lid lt (Pt i )• Herabhängen der Lidspalten (Ptosis)• Verwachsungen an Fingern + Zehen (Syndaktylie)• Minderwuchs• geistige Retardierung• geistige Retardierung• Muskelschwäche• Entwicklungsanomalie der Genitalien
Cholesterinvorläufer & Defekte• Endogenes Cholesterol
Biosynthese (Leber)
Lanosterol
Biosynthese (Leber)• Precurser
Lanosterol Cholestenol– Lanosterol, Cholestenol,Lathosterol, 7-DHC, 8-DHC
– DesmosterolCHILD-Syndrom
• Enzymdefekte– hereditär CHH-Syndrom
– schwere Erkrankungen
• Marker für die Lathosterolose
CholesterolsyntheseSLO-Syndrom
DesmosteroloseCholesterol
Quelle: Herman, Hum Mol Genet. 2003 15
SLO: GC-Chromatogrammg80
wl200195 ard
60
ster
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Cho
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40
ehyd
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8-D
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7-D
Resp
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R
0 10 20 30
0
Retentionszeit in min
GC-Chromatogramm der Plasma-Neutralsterolfraktion eines SLO-Patienten.
GC/MS-Kopplung• GC
Ch t hi h– ChromatographischeGemisch-Trennung
• MS• MS– Detektor– Ionisation durchIonisation durch
Elektronenstoß (EI)– Massenspezifische
Trennung– Massenspektrum
substanzspezifischsubstanzspezifisch
Quelle der Animation: Trace GC. Thermo-Finnigan, 2002
Warum GC (oder HPLC) + MS?• alle GC-Methoden (FID) auch GC/MS tauglich
vielfältige Anwendungsbereiche– vielfältige Anwendungsbereiche– Medizin, Lebensmittel, Umwelt, Industrie, Gericht
höhere Empfindlichkeit• höhere Empfindlichkeit– mind. Faktor 100 im Vergleich zu GC (FID)
• NWG Dioxin: 1967 GC FID 500 pg; 1992 GC/HRMS 0 005 pg• NWG Dioxin: 1967 GC-FID 500 pg; 1992 GC/HRMS 0,005 pg• z.B. Drogennachweis in Haaren („Drogenkarriere“ über Jahre)
• qualitativ besseres Messergebnisqualitativ besseres Messergebnis– mehr Informationen (Massenspektrum)– höhere Sicherheit bei der Substanzidentifizierunghöhere Sicherheit bei der Substanzidentifizierung
(z.B. Doping-Kontrolle)– Analyse unbekannter Verbindungen
(S )(Spektren-Bibliotheken)
Grundprizip der MSp p• geladene Teilchen (Ionen) können unter Vakuum
in einem Magnetfeld von ihrer Flugbahn abgelenkt werdeng
• Abhängig vonMasse (m)– Masse (m)
– Ladung (z)– Geschwindigkeit– Magnetfeldstärkeg
• massenabhängige Selektion von Ionen m/z
GC/MS: schematischer Geräteaufbau
• Verbindung zum GC:I t f T f LiInterface, Transfer Line
• Ionenerzeugung:Q ll I i i kQuelle, Ionisierungskammer
• massenspezifische Trennung der Ionen:MS-Analysator, Magnetfeld
• Detektion der Ionen:Detektor, Multiplier
• Datenaufnahme und Auswertung:gPC, EDV
Quelle der Animation: T.G. Chasteen 1996 (www.shsu.edu)
GC/MS: Dopingkontrolle
Urin Isolierung GC/MS-AnalyseUr n rung G /M na y
GC/MS-Gerät
LaborAnalyse
2 412.422.43
CoffeinInterner
x 10 6Standard
Positiver Dopingbefund
1 00 2 00 3 00 4 00 5 00 6 00 7 00 8 00 9 00
2.382.392.402.41
Ti >
Amphetamin Positiver Dopingbefund
1.00 2.00 3.00 4.00 5.00 6.00 7.00 8.00 9.00Time ->
Quelle: „Doping im Sport“; W. Schänzer; Institut für Biochemie, DSHS Köln, 2000
Sitosterolämie (Phytosterolämie)• Klinik:
– Xanthome, Xanthelasmen
Cholesterin
– Gelenkschmerzen, Arthritis– frühe Arteriosklerose + KHK
• Serum:
HO
Sitosterin
• Serum:– Cholesterin norm bis leicht – Phytosterine (pflanzl.Kost)
HO
y (p )bes. Sitosterin, Capesterin;)
– Sitostanol, CampestanolGallensäure CDCA– Gallensäure CDCA
• Nachweis:– GC, GC/MS,– Gen-Sequenzierung
• genetischer Defekt:– autosomal rezessiv– Mutation ABC G5, ABC G8 Quelle : www.meded.ucsd.edu
LC/MS• HPLC (LC)
– ChromatographischeTrennung
• MS– Problem: Lösungsmittel– Problem: Lösungsmittel– Ionisation: Elektrospray (ESI)
f– Massenspezifische Trennung– „Sanfte Ionisierung“
• Analyse großer Moleküle und Proteine
Quelle: “MASSENSPEKTROMETRIE gestern - heute – morgen”; Dr. Stefan Schürch, Universität Bern, 2004
Tandem-Massenspektrometrie• Kopplung von Massenspektrometern (MS)• „mehrdimensionale Massenspektrometrie“• Tandem-Massenspektrometrie = MS/MS• MS1: massenspezifisches Clean up“• MS1: massenspezifisches „Clean up
– Substanzgemisch– Matrix (Blut, Serum, Urin)
MS2 D t kti d A l t• MS2: Detektion der Analyten
MS/MS: Prinzip MS/MS: Drogen in Haaren• Nachweis von Drogen in Haaren
GC/MS (SIM)– GC/MS (SIM)– Signal: Analyt (Konzentration)– S/N durch clean up“ besserS/N durch „clean up besser
• höhere Empfindlichkeit• qualitativ besseres Messergebnisqualitativ besseres Messergebnis
– Informationsgehalt 1000x höherim Vergleich zu GC/MS
– höhere Sicherheit bei der Substanzidentifizierung(z B Doping-Kontrolle)(z.B. Doping Kontrolle)
– Analyse unbekannter Verbindungen(Spektren-Bibliotheken)
Isotopen-Verdünnungs-Analyse (ID/MS)
• Zugabe eines isotopenmarkierten Standardsisotopenmarkierten Standards(gleiches Verhalten wie Analyt)E t h h• Extrem hoheRichtigkeit/Präzision
f f• Referenzmethode fürKreatinin, Cholesterin, T t t GlTestosteron, Glucose,Harnsäure, Harnstoff, M dik tMedikamente.....
LCMS/MS: Immunsuppressiva• Kontrolle nach
OrgantransplantationenOrgantransplantationen– Enges therapeutisches Fenster– Zu niedrig: Organ-AbstoßungZu niedrig: Organ Abstoßung– Zu hoch: Nebenwirkungen (z.B.
Nierenversagen)• hohe Empfindlichkeit• qualitativ bessere Messergebnisse
im Vergleich zu Immunoassays– Bestimmung der „Muttersubstanz“
M t b lit k i K kti ität– Metaboliten: keine Kreuzreaktivität
MS/MS: Neugeborenen-Screening• Phenylketonurie (PKU)• Ahornsirupkrankheit (Leu, Ile, Val) • Homocystinurie• Glutarsäure Acidämie• Methylmalonsäure Acidämie• Propionsäure Acidämie• Tyrosinämie• Nicht-ketotische Hyperglyzinämie• Argininbernsteinsäure-Krankheit
H li ä i• Hyperprolinämie• Hypermethioninämie
ProNeugeborenen-Screening: PKU
PheAla KontrollePräparation und MS/MS-Analyse
Leu
Leu + Ile
Tyr
Phe
Kontrolle• Blutspot auf Filterpapier (3 mm )
MikrotiterplatteZ b M th l l i t
140 160 180 200 220 240 260 280
Gly
Ala
Val MetCit
Tyr
GluGly Ser
ValGlny
GluAsp
• Zugabe von Methanol plus isotopen-markierter interner StandardB t li ll A i i ä (AS) 140 160 180 200 220 240 260 280
Pro
Phe interner, isotopen-markierter Standard
• Butylierung aller Aminisäuren (AS)• Injektion und Ionisierung der Probe
keine Chromatographie !
AlaPKU
keine Chromatographie !• MS/MS-Analyse der AS-Produkte
(Neutralverlust Analyse)
AlaLeu
Cit
Phe
TyrVal
Leu + Ile
Gln Glu
(Neutralverlust-Analyse)• Quantifizierung der AS durch
Standard
140 160 180 200 220 240 260 280
GlyAla
Val MetCit Tyr
GluGly Ser
ValTyr
GluAsp
m/z
Standard
MALDI TOF MS:MALDI-TOF MS:Matrix Assisted Laser Desorption/Ionization Time-of-Flight Mass Spectrometry
ion detector
field free+ +
++
field-freedrift range
id l t d
acceleration
grid electrode
+
+
accelerationzone
matrix/analytecrystals
31
template
Mikobiologie: Identifizierung von Keimen
• SpektrenbibliothekenId tifi i d• Identifizierung desStammes und der S iSpezies
• z.B. auch „EHEC“ ((enterohämorrhagischeEscherichia coli)
(Abb. : Fa. Shimadzu)
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