View
214
Download
0
Category
Preview:
Citation preview
Ruhr-Universität Bochum PD Dr. med. A. M. Müller
Dienstort: Klinikum der Johann-Gutenberg-Universität Mainz Abteilung für Kinderpathologie
VE-Cadherin in humanen Lungen mit septisch bedingtem ARDS und endothelialen Zellkulturen
Inaugural-Dissertation zur
Erlangung des Doktorgrades der Medizin einer
Hohen Medizinischen Fakultät der Ruhr-Universität Bochum
vorgelegt von Martina Christina Herwig
aus Dortmund 2006
Dekan: Prof. Dr. med. G. Muhr Referent: Priv. Doz. Dr. med. A. M. Müller Koreferent: Prof. Dr. med. J. Guzman y Rotaeche Tag der mündlichen Prüfung: 28.11.2006
Inhaltsverzeichnis Abkürzungsverzeichnis 1 Einleitung
1.1 Das Blutgefäßsystem der Lunge ....................................................................................1 1.1.1 Vasa publica 1.1.2 Vasa privata 1.2 Endothel .........................................................................................................................3 1.2.1 Endotheliale Zelladhäsionsmoleküle 1.2.2 Metabolische Aktivität des Endothels 1.2.3 Endothelzellaktivierung 1.2.3.1 Endothelzellaktivierung bei Sepsis 1.2.3.2 Leukozytenadhäsion 1.2.4 Heterogenität der Endothelzellen 1.3 Zelladhäsion...................................................................................................................9 1.4 Zytoskelett ...................................................................................................................10 1.5 VE-Cadherin ................................................................................................................11 1.5.1 Charakterisierung 1.5.2 Aufbau 1.5.3 Verknüpfung mit dem Zytoskelett 1.5.4 Regulation 1.5.5 Funktionen 1.5.6 VE-Cadherin-vermittelte Zelladhäsion im Rahmen einer Entzündungsreaktion 1.6 Sepsis ...........................................................................................................................25 1.6.1 Definition und klinisches Bild 1.6.2 Pathophysiologie 1.7 ARDS...........................................................................................................................28 1.7.1 Ätiologie 1.7.2 Pathogenese unter Berücksichtigung der Pathophysiologie 1.7.3 Klinisches Bild 1.7.4 Prognose 1.7.5 IRDS 1.8 Endothelzellkulturen....................................................................................................34 1.9 LPS...............................................................................................................................35 1.9.1 Charakterisierung 1.9.2 Struktur 1.9.3 Pathophysiologie 1.9.4 Funktion 1.9.5 Bedeutung im Hinblick auf die Sepsis 1.10 TNFα ..........................................................................................................................40 1.10.1 Charakterisierung 1.10.2 Expression 1.10.3 Rezeptoren 1.10.4 Funktionen 1.10.5 Bedeutung im Hinblick auf ARDS und Sepsis 1.10.6 Klinische Bedeutung 1.11 IFNγ (Interferon-gamma) ..........................................................................................44 1.11.1 Interferone 1.11.2 Aufbau 1.11.3 Funktion
1.11.4 Regulation 1.11.5 Bedeutung im Hinblick auf die Sepsis 1.12 Fragestellung..............................................................................................................47 2 Material und Methoden
2.1 Material ........................................................................................................................50 2.1.1 Lungengewebe 2.1.2 Zellkulturen 2.2 Methoden .....................................................................................................................53 2.2.1 Immunhistochemische Aufarbeitung 2.2.1.1 Vorbehandlung 2.2.1.2 VE-Cadherin-Färbung 2.2.1.3 Isotypkontrolle 2.2.1.4 CD31-Färbung 2.2.1.5 Farbentwicklung 2.2.1.6 Gegenfärbung 2.2.2 Zellkultur
2.2.2.1 Kultivierung humaner pulmonaler mikrovaskulärer Endothelzellen (HPMEC)
2.2.2.2 Kultivierung humaner Umbilicalvenen-Endothelzellen (HUVEC) 2.2.2.3 Stimulation 2.2.2.4 Immunzytochemische Fluoreszenzfärbung 2.2.3 Antikörper 2.3 Auswertung..................................................................................................................61 2.3.1 Auswertung der Lungengewebsproben 2.3.1.1 Färbungsintensität der Endothelzellen 2.3.1.2 Einteilung der Patienten 2.3.2 Auswertung der Zellkulturen 3 Ergebnisse
3.1 In-situ Befunde ............................................................................................................65 3.1.1 VE-Cadherin-Antigenexpression in den verschiedenen Gefäßtypen 3.1.1.1 Alle Proben 3.1.1.2 Kontrollgruppe "Frauen" und "Männer" 3.1.1.3 Kindergruppe 3.1.1.4 Patienten mit Sepsis 3.1.1.5 Patienten mit IRDS 3.1.1.6 Unterschiede zwischen den einzelnen Gefäßtypen
3.1.2 VE-Cadherin-Expression der Sepsisgruppe im Vergleich zur Kontrollgruppe 3.1.2.1 Lungengewebe von Patienten mit Sepsis 3.1.2.2 Vergleich der Gruppe "gesund" und "krank"
3.1.2.3 Vergleich der VE-Cadherin-Werte Erwachsener mit regelrechtem Lungengewebe und Erwachsener mit Zeichen eines septisch bedingten ARDS nach dem Kriterium "gesund – krank"
3.1.3 Einfluss des Geschlechts auf die VE-Cadherin-Expression 3.1.3.1 Gesamtkollektiv
3.1.3.2 Kontrollgruppe 3.1.3.3 Gruppe der an septischem Multiorganversagen verstorbenen Patienten
3.1.4 Einfluss des Alters auf die VE-Cadherin-Expression 3.1.4.1 Untersuchung aller 78 Patienten, verteilt auf vier Altersgruppen 3.1.4.2 Vergleich der Lungengewebsproben gesunder Erwachsener mit denen
gesunder Kinder
3.1.5 VE-Cadherin-Antigenexpression in Abhängigkeit vom Obduktionszeitpunkt 3.1.6 Zusammenfassung der in situ-Ergebnisse 3.2 Zellkulturen..................................................................................................................87 3.2.1 Expression von VE-Cadherin in HPMEC 3.2.1.1 Unstimulierte HPMEC 3.2.1.2 Vierstündige Stimulation 3.2.1.3 24-stündige Stimulation 3.2.1.4 Zusammenfassung 3.2.2 Expression von VE-Cadherin in HUVEC 3.2.2.1 Unstimulierte HUVEC 3.2.2.2 Vierstündige Stimulation 3.2.2.3 24-stündige Stimulation 3.2.2.4 Zusammenfassung 3.2.3 Vergleich der VE-Cadherin-Antigenexpression bei HPMEC und HUVEC 4 Diskussion
4.1 Charakterisierung der VE-Cadherin-Antigenexpression entlang der Lungenstrombahn .....................................................................................................................................97
4.1.1 Heterogenität der Endothelzellen bezüglich Morphologie und Expression funktionsbestimmender Moleküle
4.1.2 Heterogenität des Endothels in Abhängigkeit von der endothelialen Barrierefunktion
4.1.3 Einfluss eines Lungentumors auf die VE-Cadherin-Expression 4.2 VE-Cadherin-Antigenexpression in regelrechtem Lungengewebe und Lungengewebe
bei septisch bedingtem ARDS ...................................................................................102 4.2.1 Zusammenhang zwischen verminderter VE-Cadherin-Expression und
Endothelpermeabilität 4.2.2 Einfluss weiterer Faktoren auf die VE-Cadherin-Expression 4.2.3 Reaktivität des septischen Lungengewebes 4.3 VE-Cadherin-Antigenexpression bezogen auf Geschlecht und Alter .......................104 4.4 VE-Cadherin-Antigenexpression bezogen auf den Zeitraum zwischen Todeseintritt und Obduktionszeitpunkt...........................................................................................105 4.5 IRDS ..........................................................................................................................106 4.6 Kritische Anmerkungen zur VE-Cadherin-Untersuchung in situ..............................107 4.7 VE-Cadherin-Antigenexpression in Zellkulturen (HPMEC und HUVEC)...............108 4.8 VE-Cadherin-Antigenexpression in unstimulierten Zellkulturen im Vergleich zu stimulierten Zellkulturen............................................................................................110 4.8.1 Analyse der Stimulationsfaktoren 4.8.1.1 Stimulation mit TNFα 4.8.1.2 Stimulation mit IFNγ 4.8.1.3 Stimulation mit IFNγ plus TNFα 4.8.1.4 Stimulation mit LPS 4.8.2 Verbesserung der Zellkulturversuche 4.9 Zellkulturen (HPMEC und HUVEC) als Modell für die VE-Cadherin-Expression in humanem Lungengewebe ..........................................................................................115 4.10 Zusammenfassung ...................................................................................................117 4.11 Regulation von VE-Cadherin...................................................................................118 4.11.1 Pathomechanismus der Reduktion der VE-Cadherin-Antigenexpression 4.11.2 Phosphorylierung und Dephosphorylierung 4.11.3 Internalisation / Endozytose 4.11.4 Proteolyse 4.11.5 Diffusion
4.11.6 Spaltung der Zell-Zell-Verbindungen 4.11.7 Gegenüberstellung der verschiedenen Theorien 4.12 Leukozytentransmigration ......................................................................................124 4.12.1 Transmigration 4.12.2 "real time"-Transmigration 4.12.3 Einfluss auf das Lungengewebe 4.13 Vergleich systemischer Kreislauf zu Lungenkreislauf ............................................127 4.14 Ausblick ...................................................................................................................128 5 Zusammenfassung .........................................................................................................129 6 Literaturverzeichnis ......................................................................................................131
7 Danksagung ....................................................................................................................144
8 Lebenslauf.......................................................................................................................145
Abkürzungsverzeichnis ABC-Methode Avidin-Biotin-Komplex-Methode ACCP/SCCM Consensus Conference des American College of Chest Physicians /
der Society of Critical Care Medicine ACE Angiotensin Converting Enzyme ALI Acute Lung Injury Aqua dest. destilliertes Wasser ARDS Acute Respiratory Distress Syndrome BAL bronchioloalveoläre Lavage BSA Bovine Serum Albumin = Rinderserumalbumin Ca2+ Kalzium CAL Calmodulin CAM Zelladhäsionsmoleküle CAR Cell Adhesion Recognition CHO Chinese Hamster Ovary Cells CO2 Kohlenstoffdioxid CSA Colony-Stimulating Activity CSF Colony-Stimulating Factor DAB 3,3-Diaminobenzidin Dsh Dishevelled E-Cadherin Epithelial Cadherin ECGS Endothelial Cell Growth Supplement EDTA Ethylen-Diamin-Tetracetat ELISA Enzyme-Linked-Immuno-Sorbent-Essay ET-1 Endothelin 1 EvG-Färbung Elastica van Giesson-Färbung FCS Fetal Calf Serum GDP Guanosyldiphosphat GTP Guanosyltriphosphat H2O2 Wasserstoffperoxid HCL Salzsäure HDL High Density Lipoprotein HE-Färbung Hämalaun-Eosin Färbung HMEC Human Dermal Microvessel Endothelial Cells HPMEC Human Pulmonary Microvascular Endothelial Cells HUVEC Human Umbilical Vein Endothelial Cells ICAM-1 Intercellular Adhesion Molecule 1 IQGAP1 Calmodulin-Binding Domain GAP 1 IFNγ Interferon gamma IL Interleukin IRDS Infant Respiratory Distress Syndrome KCl Kaliumchlorid KDa Kilodalton kg Kilogramm LBP Lipopolysaccharid Binding Protein LDL Low Density Lipoprotein LPS Lipopolysaccharid M Mol M-Cadherin Muscle Cadherin MHC Major Histocompatibility Complex
MVEC Pulmonary Microvascular Endothelial Cells NaCl Natriumchlorid N-Cadherin Neuronal Cadherin NO Nitric Oxide (Stickstoffmonoxid) O2 Sauerstoff p0071 Plakophilin-4 p120ctn p120-Catenin PAF Platelet-Activating-Factor PaO2 Sauerstoffpartialdruck PBS Phosphatgepufferte Kochsalzlösung PC + 15% FKS bFGF/Hep
PC (= Endothelial Cell Growth Medium (ECGM-MV) von PromoCell (PC, BestellNr. C-90320)) mit 15% FCS, dem Wachstumsfaktor bFGF (basic FGF), Heparin in der Konzentration von 2,5ng bFGF und 10µg Heparin
P-Cadherin Placental Cadherin PDGF Platelet Derived Growth Factor PECAM-1 Platelet Endothelial Cell Adhesion Molecule PFA Paraformaldehyd PMN Polymorphonuclear Leukocytes (= Granulozyten) POX Peroxidase PTK Protein Tyrosine Kinase PTP Protein Tyrosine Phosphatase RHS Retikulo-Histiozytäres System SIRS Systemic Inflammatory Response Syndrome TBS Tris-Buffer-Saline TH-Zellen T-Helfer-Zellen TLR Toll-Like Receptor TNFα Tumor Necrosis Factor alpha Tris-Puffer (THAM) Tris-(Hydroximethyl-)Aminomethan Trp Tryptophan VCAM-1 Vascular Cell Adhesion Molecule 1 VEcadGFP VE-Cadherin / Green Fluorescent Fusion Protein Construct VE-Cadherin Vascular Endothelial Cadherin VE-PTP Vascular Endothelial Protein Tyrosine Phosphatase vWf von Willebrand-Faktor Wnt Wingless int-1 7TM-cadherine Seven Transmembrane Cadherins
Kapitel 1 – Einleitung 1
1 Einleitung
1.1 Das Blutgefäßsytem der Lunge
Die Hauptaufgabe der Lunge besteht in der Vermittlung des Gasaustausches zwischen Blut
und Atemluft im Bereich der alveolokapillären Membran. Um diese Funktion zu erfüllen,
besitzt die Lunge ein außerordentlich dichtes Gefäßnetz – die Vasa publica. Diese sind von
den Vasa privata zu unterscheiden, die zur Blutversorgung der Lunge dienen.
1.1.1 Vasa publica
Die Vasa publica bilden den funktionellen Blutkreislauf der Lunge, in dem das
sauerstoffarme Blut des Körpers oxygeniert und CO2 – zwecks anschließender Abatmung
über die Lunge – aus dem Blut abgegeben wird.
Zu den Vasa publica gehören die Aa. pulmonales, die alveolären Kapillarnetze und die Vv.
pulmonales, die gemeinsam den Lungenkreislauf bilden.
Die Aa. pumonales folgen dem Bronchialbaum und gehen an den Bronchioli respiratorii
und Ductus alveolares in Arteriolen über. Die Arterien sind in das lockere peribronchiale
Bindegewebe eingebettet. Sie geben zahlreiche kleinere Äste zu den ihnen naheliegenden
Alveolen ab und ihre Endäste ziehen als Arteriolen zu den in den Interalveolarsepten
verlaufenden alveolären Kapillarnetzen. Die Pulmonalarterien bilden mit ihren einzelnen
Ästen jeweils Endarterien.
Die A. pulmonalis hat im Vergleich zu gleichkalibrigen Körperarterien eine geringe
Wandstärke mit einem niedrigen elastischen Faseranteil. Dies ist darauf zurückzuführen,
dass die Vasa publica ein Niederdrucksystem darstellen. Hier herrschen systolische Drücke
von 22 mmHg und diastolische Drücke von 8 mmHg.
Der Gasaustausch spielt sich größtenteils in den Kapillaren ab, die flächige und
engmaschige Kapillarnetze in den Interalveolarsepten bilden. Man unterscheidet die
ständig durchbluteten Ruhekapillaren von Arbeitskapillaren, die nur bei erhöhter
Beanspruchung durchströmt werden. Ein wesentlicher Bestandteil des Gasaustausches ist
das Kapillarendothel. Die Endothelzellen sind nicht nur durchlässig für Gase wie
Sauerstoff und CO2, sondern auch für diverse Plasmabestandteile.
Die Kapillaren gehen im weiteren Verlauf in die Venolen über. Sie liegen im interlobulären
Bindegewebe und fließen zur nächstgelegenen Segmentoberfläche ab. Dort münden sie in
Kapitel 1 – Einleitung 2 größere Venen, die zwischen den Segmenten oder unterhalb der Pleura zum Lungenhilus
verlaufen. Die Vv. pumonales besitzen keine Venenklappen.
1.1.2 Vasa privata
Die Vasa privata versorgen als nutritiver (ernährender) Kreislauf die Bronchien bis zu den
Bronchioli terminales sowie die Pulmonalarterien mit Sauerstoff und Nährstoffen. Die
Vasa privata der Lunge werden von den Rami bronchiales und den Vv. bronchiales
gebildet und sind jeweils kleiner als die Aa. und Vv. pulmonales.
Die Rami bronchiales entspringen entweder direkt aus der Aorta oder aus den 3. oder 4.
Interkostalarterien. Sie laufen wie die Aa. pumonales im peribronchialen Gewebe bis zu
den Bronchioli terminales. Aus ihren Kapillarnetzen sammeln sich feine Vv. bronchiales,
die letztendlich in die V. azygos bzw. V. hemiazygos münden. Peripher gelegene Vv.
bronchiales fließen auch in die Vv. pumonales ab.
Zwischen den Vasa publica und den Vasa privata bestehen Anastomosen, die insbesondere
bei Verlegungen (z. B. durch Emboli) große Bedeutung erlangen.
Kapitel 1 – Einleitung 3
1.2 Endothel
Endothelzellen sind flache Zellen, die die Lumina von Blutgefäßen einschichtig
auskleiden. Sie sind in Längsrichtung der Gefäße orientiert. Auf Grund ihrer besonderen
Lage bilden Endothelzellen eine physikalische Barriere, die das Blut vom Gewebe trennt
(Stevens et al., 2000). Die Endothelzellen liegen auf der dem Lumen abgewandten Seite
auf einer – von wenigen Ausnahmen abgesehen – durchgehenden Basallamina. Die
Basallamina formt eine sekundäre Barriere für die Passage von flüssigen und geformten
Elementen in das extravaskuläre Kompartiment (Jaffe, 1987). Sie hat also nicht nur
mechanische Aufgaben, sondern dient auch als Permeabilitätsschranke.
Bei einem 70 kg schweren Erwachsenen bedecken die Endothelzellen eine Oberfläche von
mehr als 1000 m² (Jaffe, 1987).
1.2.1 Endotheliale Zelladhäsionsmoleküle
Untereinander sind die Endothelzellen über Zelladhäsionsmoleküle miteinander
verbunden. Eines von ihnen ist das "Vascular Endothelial Cadherin" (VE-Cadherin), das
zur Familie der Cadherine gehört. Haftstrukturen wie "Tight Junctions" (Zonula
occludens), Desmosomen und "Adherens Junctions" (Zonula adhaerens,
Adhärensjunktionen) vermitteln die Zell-Zell-Adhäsion zwischen Endothel- oder
Epithelzellen (Hordijk et al., 1999). Mittels Auf- und Abbau von Zelladhäsionsmolekülen
wird die endotheliale Gefäßpermeabilität reguliert. Entzündungsmediatoren induzieren
eine Reduktion der Zelladhäsionsmoleküle. Die Zellen haften nicht mehr so fest
aneinander, es entstehen Lücken und den Leukozyten wird der Übertritt aus der Blutbahn
in das Gewebe ermöglicht.
Das Endothel stellt somit eine semipermeable Barriere dar (Stevens et al., 2000), die den
Fluss in den Alveolarraum beschränkt.
1.2.2 Metabolische Aktivität des Endothels
Aufgrund ihrer Lokalisation mit Kontakt zum Blutstrom sind Endothelzellen perfekt
positioniert, um in zahlreiche biologische Systeme im Blut einzugreifen (Jaffe, 1987). Sie
synthetisieren physiologisch wichtige Moleküle und sezernieren diese ins Blut und/oder in
die subendotheliale extrazelluläre Matrix (Jaffe, 1987).
Zu den vom Endothel sezernierten bzw. exprimierten Molekülen gehören
1. die Zelladhäsionsmoleküle Vascular Endothelial (VE-) Cadherin und Neuronal (N-)
Cadherin (Hordijk et al., 1999; Orfanos et al., 2004). Über die Expression der Cadherine
Kapitel 1 – Einleitung 4 (und über die Synthese von Rezeptoren für Entzündungsmediatoren) wird die
Gefäßpermeabilität und die Barrierefunktion reguliert (Aird, 2003; Orfanos et al., 2004).
2. Substanzen zum Aufbau des subendothelialen Bindegewebes, z. B. Kollagen Typ IV,
Elastin und Laminin. Endothelzellen können daher die Basalmembran umbilden (Jaffe,
1987).
3. Rezeptoren für die Anhaftung von Leukozyten an der Endothelzelloberfläche (z. B.
ICAM-1, E-Selektin, P-Selektin, VCAM (Engelhardt und Wolburg, 2004; Grau et al.,
1996)).
4. Rezeptoren für β-LDL, HDL, Chylomikronen und den Scavenger Rezeptor, die
Lipoproteine binden (Baker et al., 1984; Brinton et al., 1985; Fielding et al., 1978), sowie
Hormonrezeptoren (z. B. für Insulin (Bar et al., 1978)).
5. Proteine und Rezeptoren, die eine Rolle bei der Regulation des Gefäßtonus, der
Koagulation und Fibrinolyse, des Zellwachstums, der Zelldifferenzierung, der
Immunantwort und der Entzündungsreaktion spielen (Aird, 2003; Cines et al., 1998; Faure
et al., 2001; Fishman et al., 1998; Mantovani et al., 1992; Orfanos et al., 2004; Vuong und
Berry, 2002). Dazu zählt die Synthese von gefäßerweiternden Faktoren wie
Stickstoffmonoxid (NO) (Cines et al., 1998; Noris et al., 1995; Orfanos et al., 2004),
Prostazyklinen (Cines et al., 1998; Jaffe, 1987; Orfanos et al., 2004) und Angiotensin II
(Orfanos et al., 2004), aber auch die Synthese von gefäßverengenden Faktoren wie ET-1
(Cines et al., 1998; Noris et al., 1995; Orfanos et al., 2004; Yanagisawa et al., 1988) und
ACE (Angiotensin Converting Enzyme) (Jaffe, 1987; Orfanos et al., 2004). Die Balance
zwischen vom Endothel freigesetzten Vasodilatatoren und -konstriktoren hat großen
Einfluss auf die Aufrechterhaltung des regelrechten Gefäßtonus (Thorin und Atkinson,
1994).
Über die Synthese des "von Willebrand-Faktor" (vWf), "Platelet-Activating Factor" (PAF)
(Cines et al., 1998) und "Tissue Factor" greifen Endothelzellen in das
Blutgerinnungssystem ein (Jaffe, 1987). Außerdem binden diverse Gerinnungsfaktoren
(z. B. IX und X) an Endothelzellen (Jaffe, 1987). Endothelzellen synthetisieren auch
antithrombotisch wirksame Substanzen, wie z. B. Prostazykline, Thrombomodulin und
Heparansulfat (Cines et al., 1998; Jaffe, 1987). Des Weiteren werden auch Plasminogen-
Aktivatoren und -Inhibitoren vom Endothel freigesetzt (Jaffe, 1987).
Durch Sekretion von Faktoren, die das Wachstum anderer Zellen (z. B. das glatter
Muskelzellen) regulieren (Jaffe, 1987; Orfanos et al., 2004), beeinflussen Endothelzellen
das Wachstum neuer Blutgefäße (Aird, 2003).
Kapitel 1 – Einleitung 5 Daneben spielen Endothelzellen eine Rolle bei der Differenzierung anderer Zellen.
Beispielsweise sezernieren sie "Colony-Stimulating Factor" (CSF), der auf Makrophagen-
Granulozyten-Kolonien einwirkt (Mantovani et al., 1997; Mantovani et al., 1992).
Menschliche Endothelzellen enthalten die ABO-Blutgruppen und die HLA-A,B-Antigene
und können somit auch als antigenpräsentierende Zellen agieren (Gibofsky et al., 1975;
Jaffe et al., 1973). Nicht nur deshalb ist das Gefäßendothel ein wesentlicher Bestandteil der
angeborenen Immunantwort. Über die Bindung von Immunkomplexen registrieren
Endothelzellen u. a. die Anwesenheit von bakteriellen Zellwandkomponenten und sind
durch entsprechende Antworten in die frühesten Stadien der Immunantwort involviert
(Faure et al., 2001; Orfanos et al., 2004).
Endothelzellen nehmen an Entzündungsreaktionen teil. Im Zusammenhang mit der
Endothelzellaktivierung sind sie Zielpunkte für Lipopolysaccharid (LPS) und andere
Zytokine (Mantovani et al., 1992). Endothelzellen sezernieren auch Zytokine und
Chemokine (Mantovani et al., 1992; Orfanos et al., 2004), sie interagieren mit Bakterien
und Blutkomponenten wie Leukozyten und Thrombozyten (Orfanos et al., 2004) und
beeinflussen somit die Entzündung.
1.2.3 Endothelzellaktivierung
Die metabolische Funktion der Endothelzellen ist Bestandteil der Endothelzellaktivierung.
Eine Definition der Endothelzellaktivierung (Zimmerman et al., 1999) beschreibt diese als
einen "Wechsel des Phänotyps oder der Funktion als Reaktion auf äußere Stimuli".
Diese Stimuli induzieren aktivierungsabhänginge funktionelle Veränderungen in
menschlichen Endothelzellen. Es sind verschiedenste Faktoren bekannt, die Endothelzellen
aktivieren: Zytokine und Chemokine, welche mit den Zelloberflächenrezeptoren
interagieren, Thrombin und Fibrin-Spaltprodukte, bakterielle Endotoxine wie das LPS,
aktivierte Leukozyten, proteolytische Enzyme, Immunkomplexe, Bakterien und
mikrobielle Produkte, hämodynamische Störungen, Oxidantien, Ischämie und Hyperoxie,
Hyperlipidämie, mechanische Belastung, Strahlung und Medikamente (Cines et al., 1998;
Fishman et al., 1998; Orfanos et al., 2004).
Die Endothelzellaktivierung kann ein regulierter Bestandteil einer physiologischen
Gefäßreaktion sein, unter pathologischen Bedingungen aber auch fehl- oder unreguliert
ablaufen. In diesen Fällen ist die Endothelzellaktivierung nicht reversibel oder limitiert
(Zimmerman et al., 1999).
Die Reaktion auf die endotheliale Aktivierung hängt vom Stimulus, dem Zeitraum nach
Stimulusapplikation sowie der Stärke und Potenz des Stimulus ab. Auch die gleichzeitige
Kapitel 1 – Einleitung 6 Applikation verschiedener Stimuli, eine zusätzliche Stimulation nach einer
vorangegangenen submaximalen Stimulation, vorangegangene Verletzungen und andere
Faktoren haben Einfluss auf die Endothelzellaktivierung (Zimmerman et al., 1999).
1.2.3.1 Endothelzellaktivierung bei Sepsis
Die Endothelzellaktivierung gilt als ein grundlegender Mechanismus der komplexen
pathologischen Ereignisse, die in einem ARDS resultieren (Zimmerman et al., 1999). Die
Endothelzellaktivierung ist in diesem speziellen Fall eine Antwort auf Faktoren wie
Bakterientoxine im Rahmen einer Sepsis, Trauma, oxidativer Stress oder chemische
Alteration. Die Endothelzellaktivierung oder -verletzung durch mikrobielle
Zellwandkomponenten wie LPS spielt eine Rolle bei der Entwicklung einer Sepsis und
dem septischem Schock (Faure et al., 2001). Die Aktivierung von Endothelzellen durch
LPS und andere Faktoren resultiert zum einen in der endothelialen Produktion
verschiedenster proinflammatorischer Moleküle sowie löslicher Zytokine und Chemokine
(Carlos und Harlan, 1994; Cohen, 2002; Morrison und Ryan, 1987) und zum anderen in
einer stimulus- und organspezifischen Induktion verschiedenster Adhäsionsmoleküle
(Bauer et al., 2000; Eppihimer et al., 1996; Henninger et al., 1997).
Lösliche Adhäsionsmoleküle, die als Marker für Endothelzellaktivierung angesehen
werden, sind vermehrt im Plasma von Patienten mit ARDS, lokalisiertem akutem
Lungenschaden und hypoxischer akuter Bergkrankheit (= Höhenkrankheit) nachweisbar
(Grissom et al., 1997; Moss et al., 1996). Dies unterstützt aus klinisch-chemischer Sicht die
These, dass Endothelzellen unter diesen Bedingungen aktiviert werden bzw. auf einen
pathologischen Stimulus mit ansteigender Synthese und/oder Freisetzung von
zirkulierenden Proteinen antworten (Zimmerman et al., 1999).
1.2.3.2 Leukozytenadhäsion
Die Endothelzellaktivierung kann in einem gewissen Maße mit der Expression von
Molekülen, die die Zelladhäsion und die Leukozytenmigration vermitteln, gleichgesetzt
werden. Jedoch nimmt nur das aktivierte Endothel an der inflammatorischen Antwort teil.
So exprimiert im Gegensatz zum nicht-aktivierten Endothel das aktivierte Endothel
Leukozytenadhäsionmoleküle und ermöglicht so die Transmigration der Neutrophilen
(Ward und Hunninghake, 1998). Wenngleich die Endothelaktivierung für die
Akkumulation von inflammatorischen Zellen erforderlich ist, so ist sie nicht stereotyp
(Zimmerman et al., 1999). Für die Interaktion mit Leukozyten werden die verschiedensten
endothelialen Moleküle benötigt. Menschliche Endothelzellen exprimieren
Kapitel 1 – Einleitung 7 unterschiedliche Adhäsions- und Signalmoleküle, die von verschiedenen Klassen von
Leukozyten erkannt werden; dieser Vorgang erfolgt Agonist- und Zeit-abhängig (Cines et
al., 1998; Luscinskas und Gimbrone, 1996; Orfanos et al., 2004). Des Weiteren können
aktivierte menschliche Endothelzellen auch verschiedene Kombinationen von Adhäsions-
und Signalmolekülen für eine bestimmte Leukozytenklasse, die Granulozyten
(polymorphonukleären Leukozyten = PMNs), die von besonderer Bedeutung für die
Initiation und Amplifikation eines ARDS-bedingten Lungenversagens sind, exprimieren
(Zimmerman et al., 1999). Die Granulozyten sind die ersten Zellen, die bei einer akuten
Entzündungsreaktion schon nach wenigen Minuten aus dem Blut rekrutiert werden (Harris
et al., 2000; Del Maschio et al., 1996).
1.2.4 Heterogenität der Endothelzellen
Die Endothelzellen und ihre Antworten auf die Aktivierung an verschiedenen Stellen des
Gefäßsystems sind sehr heterogen (Rajotte et al., 1998). Eine Heterogenität besteht
zwischen den verschiedenen Gefäßtypen innerhalb der Lunge und des Systemkreislaufs,
aber auch zwischen Lungenendothel und nicht-pulmonalem Endothel (Aird, 2003).
Endothelzellen unterscheiden sich durch die Lokalisation des Gefäßes in der Strombahn.
So unterscheiden sich Endothelzellen in kleinen Gefäßen von Endothelzellen in großen
Gefäßen (Stevens et al., 2000; Swerlick et al., 1992; Thorin et al., 1997). Beispielsweise
besteht in menschlichen mikro- und makrovaskulären Endothelzellen eine funktionelle
Heterogenität für die Verteilung von Bradykinin und die Aktivität von Plasminogen-
Aktivator-Inhibitor-1 (Gräfe et al., 1994; Shatos et al., 1995).
In der Lunge bildet die Mikrovaskulatur eine sehr große Oberfläche, pro Fläche findet aber
ein geringerer Blutdurchstrom statt als in den Arterien oder Venen (Parker und Yoshikawa,
2002). Dementsprechend ist die Endothelbarriere in den mikrovaskulären Gefäßen weniger
durchlässig als in den makrovaskulären. Auch bezüglich der Art der
Endothelzelljunktionen im übrigen Körperkreislauf bestehen Unterschiede. Während
Arteriolen mit einem sehr dichten Netzwerk von verschiedenen Junktionen ausgestattet
sind, sind Arterien vergleichsweise schlecht mit Junktionen ausgestattet. In den Kapillaren
fehlen bestimmte Junktionstypen sogar vollständig. Die Venolen weisen nur gering
organisierte Junktionen und demzufolge ein diskontinuierliches Endothel auf (Simionescu
et al., 1976; Simionescu et al., 1975).
In struktureller Hinsicht unterscheiden sich Endothelzellen verschiedener Lokalisationen
des Gefäßbaumes in Größe, Form und Dicke. Beispielsweise sind bei einer Ratte
Endothelzellen, die die Pulmonalarterie auskleiden, größer und rechteckiger als die die
Kapitel 1 – Einleitung 8 Aorta auskleidenden Endothelzellen. Hingegen sind diese Endothelzellen dicker als ihre
Gegenstücke in den Kapillaren oder Venen (Aird, 2003).
Aus diesen strukturellen Unterschieden ergeben sich funktionelle Unterschiede, die sich in
streng lokalisierten Prozessen widerspiegeln. Im Gegensatz zum systemischen Kreislauf
findet die Neutrophilenmigration in der Lunge in den Kapillaren statt. Die Kapillaren sind
mit einem Durchmesser von 6 - 9 µm sehr eng. Für die verformbaren Erythrozyten stellt
die Kapillarpassage kein Problem dar. Dies gilt nicht für die weniger verformbaren
Leukozyten. Die Leukozyten adhärieren an den Oberflächen der Endothelzellen in vivo
und können den extravaskulären Raum durch Überwindung der Endothelzellbarriere
erreichen. Die Leukozyten-Endothelzell-Interaktion findet über Adhäsionsmoleküle der
Leukozyten und der Endothelzellen statt (Burns et al., 2002).
Zusammenfassend ist zu sagen, dass Endothelzellen, obwohl sie grundlegende strukturelle
und funktionelle Charakteristika teilen, ausgeprägte Unterschiede in ihrer Morphologie und
ihren Wachstumscharakteristika, bei der Freisetzung von Molekülen und der Antwort auf
eine Vielzahl von Mediatoren aufweisen (Thorin et al., 1997). Wichtige Faktoren, von
denen die Endothelzellvariationen abhängen, sind die embryonale Herkunft, die
Lokalisation des Gefäßes in der Strombahn, Geschlecht, Alter und der Gesundheitszustand
(McCarron et al., 1994; Marín und Rodríguez-Martínez, 1999; Risau, 1995).
Kapitel 1 – Einleitung 9
1.3 Zelladhäsion
Zwischen fast allen Zellen des Körpers werden vorübergehende oder dauerhafte Kontakte
(Junktionen) gebildet. Kontakte zwischen Zellen desselben Zelltyps bezeichnet man als
homotypische Kontakte, Kontakte zu anderen Zelltypen als heterotypische Kontakte.
Die Kontakte werden nach Funktion, Morphologie und molekularem Aufbau in drei
Hauptgruppen eingeteilt: Adhäsionskontakte (Kontakte mit überwiegend mechanischer
Funktion, hierzu gehören die Cadherine), Kommunikationskontakte (Kontakte mit
metabolischer und elektrisch-koppelnder Funktion) und Barrierenkontakte (Kontakte, die
den Interzellularraum verschließen, wie z. B. die Zonula occludens bzw. Tight Junction).
Zu den Adhäsionskontakten gehören die Zelladhäsionsmoleküle (CAMs). Sie beinhalten
eine sehr heterogene Gruppe von Proteinen, die für die Zell-Zell-Haftung zwischen
benachbarten Zellen verantwortlich sind. Die vier wichtigsten Klassen sind: die Cadherine,
die Zelladhäsionsmoleküle der Immunglobulinsuperfamilie, die Selektine und die
Integrine.
Cadherine sind die am häufigsten auftretenden Haftproteine, insbesondere in
Desmosomen. Als kalziumabhängige Proteine können sie nur in Anwesenheit von
Kalziumionen homophile Zellkontakte eingehen.
Die Familie der Cadherine besteht aus verschiedenen Subgruppen: den klassischen
Cadherinen, den desmosomalen Cadherinen, den Protocadherinen, den 7TM (Seven
Transmembrane Cadherins, auch Flamingo Cadherine genannt), den FAT-family
Cadherinen und den T-Cadherinen (Angst et al., 2001).
Zu den klassischen Cadherinen gehören das in den frühen 80er Jahren des letzten
Jahrhunderts erstbeschriebene E-Cadherin (Epithelial Cadherin, Uvomorulin), das N-
Cadherin (Neuronal Cadherin), das P-cadherin (Placental Cadherin), M-Cadherin (Muscle
Cadherin) und das VE-Cadherin (Vascular Endothelial Cadherin). Ihnen allen gemeinsam
ist eine charakteristische Grundstruktur. Jedes Cadherin hat aber ein eigenes
Verteilungsmuster im Gewebe. Auf den Endothelzellen werden N-Cadherin, VE-Cadherin
und auch – in geringerem Maße – P-Cadherin exprimiert. Nur VE-Cadherin wird
ausschließlich auf Endothelzellen exprimiert (Angst et al., 2001).
Es ist hier anzumerken, dass die Einteilung der Cadherine in Gruppen nicht einheitlich ist.
Es existieren verschiedene Ansichten, auch über die Einordnung von VE-Cadherin (Nollet
et al., 2000).
Kapitel 1 – Einleitung 10
1.4 Zytoskelett
Das VE-Cadherin ist eng mit dem Zytoskelett verbunden. In der Zelle übernimmt das
Zytoskelett die Aufgabe eines internen Stütz- und Bewegungsapparates und erfüllt damit
statische und dynamische Zellfunktionen.
Zum Zytoskelett gehören Mikrotubuli (Zentriol, Zentrosom, Kinetosom; Kinozilien,
Flagellen), Intermediärfilamente, Aktinfilamentsystem, Spektrinsystem,
Membranzytoskelett, Dystrophin und das Laminsystem.
VE-Cadherin ist sowohl mit dem Intermediärfilament (über Plakoglobin und Desmoplakin)
als auch mit dem Aktinfilamentsystem (über β-Catenin, α-Catenin und Vinculin)
verbunden.
Das Intermediärfilament ist bevorzugt in Bündeln angeordnet. Die genaue Funktion ist
unbekannt. Man geht derzeit von einer passiven Funktion im Sinne eines zellulären
Stützgerüstes aus, das Zellorganellen und den Zellkern in ihrer Position hält.
Das Aktinfilament ist hauptsächlich aus Aktin aufgebaut. Aktin ist an aktiven
Formveränderungen von Zellen bis hin zur Kontraktion beteiligt. Es reguliert die
Viskosität des Zytoplasmas und dient der mechanischen Stabilisierung verschiedener
Zellfortsätze und Zellkontakte, v. a. der Adhäsionskontakte.
Kapitel 1 – Einleitung 11
1.5 VE-Cadherin
1.5.1 Charakterisierung
Das "Vascular Endothelial Cadherin" (VE-Cadherin) ist ein calciumabhängiges
Glykoprotein und gehört zur großen Familie (Superfamilie) der Cadherine. Es ist in einem
Cluster von insgesamt sechs Cadherinen auf dem langen Arm des Chromosoms 16
(16q22.1) lokalisiert. Sein Gewicht beträgt 135 Kda (Abb. 1).
Der Name "Vascular Endothelial Cadherin" basiert auf den strukturellen Ähnlichkeiten mit
der Familie der Cadherine und auf der alleinigen Expression auf Endothelzellen. Weitere
Bezeichnungen für das "VE-Cadherin" sind "cadherin-5", "7B4", "cd144" und
"Endothelial-Specific Cadherin".
1990 beschrieben Heimark, Degner und Schwartz (Heimark et al., 1990) in Zellkulturen
aus Endothelzellen der Aorta ein calciumabhängiges Zell-Zell-Adhäsionsmolekül. Damals
waren das Uvomorulin (E-Cadherin) und andere im Epithel vorkommende
calciumabhängige Zelladhäsionsmoleküle bekannt.
1991 wurde VE-Cadherin von Suzuki, Sano und Tanihara (Suzuki et al., 1991) entdeckt.
Sie propagierten die Existenz acht neuer Cadherine (Cadherin-4 bis Cadherin-11) aufgrund
von Untersuchungen der menschlichen cDNA in Gehirn und Retina.
1992 produzierten Lampugnani und Mitarbeiter (Lampugnani et al., 1992) einen
monoklonalen Antikörper (7B4), der mit dem von Suzuki et al. gefundenen Protein
immunopräzipitierte (Vincent et al., 2004). Dieser Maus-Antikörper band sich an die
interzellulären Junktionen von HUVEC-Monolayern. Die Inkubation der HUVEC mit dem
Antikörper führte außerdem zu einer gesteigerten Permeation von Makromolekülen durch
die Monolayer ohne offensichtliche Veränderung der Zellmorphologie. Bei der durch u. a.
TNFα/IFNγ gesteigerten Endothelpermeabilität zeigte sich eine veränderte Verteilung des
Antikörpers. Damit stellte sich schon 1992 heraus, dass das 7B4-Antigen ein
endothelspezifisches Cadherin ist, das eine Rolle bei der Organisation der lateralen
endothelialen Junktionen und bei der Kontrolle der Permeabilitätseigenschaften des
Gefäßendothels spielt (Lampugnani et al., 1992).
Abb. 1: Genomorganisation von VE-Cadherin auf dem Chromosom 16, bestehend aus Signal- und Prosequenz, fünf Cadherin-Einheiten (Repeats), der transmembranären Domäne und der zytoplasmatischen Domäne (Angst et al., 2001)
Kapitel 1 – Einleitung 12 1.5.2 Aufbau
Klassische Cadherine bestehen aus einer extrazellulären Domäne mit fünf Cadherin-
Repeats (= fünf gleichartige kettenartig aneinandergeknüpfte Einheiten), einer
transmembranären/juxtamembranären Region und einem zytoplasmatischen/intrazellulären
Teil (Abb. 2).
Abb. 2: Schema des Aufbaus des VE-Cadherin-Moleküls (Vincent et al., 2004) mit der extrazellulären (bestehend aus fünf Einheiten) und der intrazellulären Domäne (bestehend aus juxtamembranärer und Catenin-bindender Domäne, Catenin Binding Domain)
Die extrazelluläre Region knüpft calciumabhängig über den interzellulären Spalt hinweg
homophile Zelladhäsionskontakte zu benachbarten Endothelzellen. Die fünf extrazellulären
Cadherin-Repeats sind an der EC1-Domäne mit einem aminoterminalen Tryptophan (Trp-
2) verknüpft. Innerhalb der EC1-Domäne findet sich auch die "Cell Adhesion Recognition"
(CAR). Zwischen jedem Cadherin-Repeat finden sich drei Ca2+-Moleküle (Abb. 2).
VE-Cadherin bildet ausschließlich homophile Zellkontakte. Gebildet werden cis-Dimere
(Verbindungen von zwei benachbarten Cadherinen an einer einzigen Zelle) und trans-
Dimere (Zell-Zell-Verbindungen zwischen aneinander angrenzenden Zellen). Durch die
Verbindung von cis- und trans-Dimeren entstehen Reisverschluss-ähnliche Strukturen
(Shapiro et al., 1995). Die homophilen Bindungen werden vor allem über die EC1-
Domäne, aber auch über die EC4- oder EC5-Domänen geschlossen.
Die extrazelluläre Domäne ist damit ein wichtiger Bestandteil der Zelladhäsion (Navarro et
al., 1995), scheint aber keine Schlüsselrolle bei der Regulation der Gefäßpermeabilität inne
zu haben (Guo et al., 2004).
Die intrazelluläre Domäne beinhaltet die Transmembranregion, die p120-Catenin (p120ctn)
bindet, und die "Catenin Binding Domain" (Vincent et al., 2004). VE-Cadherin bildet über
Kapitel 1 – Einleitung 13 die "Catenin Binding Domain" Komplexe mit anderen zytoplasmatischen Komponenten
wie β-Catenin, α-Catenin, Plakoglobin und Vinculin, über die eine Verbindung mit dem
intrazellulären Aktin hergestellt wird (Angst et al., 2001). Untypischerweise für die
klassischen Cadherine interagiert das VE-Cadherin (vergleichbar mit dem desmosomalen
Cadherin) auch mit Plakoglobin und Plakophilin, zwei Mitgliedern der Armadillo Familie
(Angst et al., 2001a). Sie bilden einen Komplex, der über Desmoplakin mit dem
intermediären Filamentnetzwerk interagiert (Kowalczyk et al., 1998). VE-Cadherin knüpft
also sowohl mit Aktin und als auch dem Intermediärfilament Verbindungen (Abb. 3). Die
Regulation der Cadherinfunktion – und damit der parazellulären Permeabilität – erfolgt
über die Interaktion des zytoplasmatischen Anteils des VE-Cadherins mit den
zytoplasmatischen Proteinen, den Cateninen (Iyer et al., 2004; Navarro et al., 1995). Die
intrazelluläre Domäne ist Ziel inflammatorischer Signale, da die meisten
Entzündungsmediatoren durch die Bindung an ihre Rezeptoren konsekutiv eine Kaskade
intrazellulärer Signale triggern und darüber die zelluläre Funktion affektieren (Guo et al.,
2004).
Vinc (Vinculin), α-CAT (α-Catenin), β-CAT (β-Catenin), PG (Plakoglobin), DP (Desmoplakin), IF
(Intermediäres Filament), Cadherin repeat, Catenin-binding domain
Abb. 3: Homophile Zell-Zell-Verbindung zweier Zellen (rechts und links) durch VE-Cadherin mit je fünf extrazellulären Cadherin-Repeats, der transmembranären Region und dem zytoplasmatischen Teil, der mit dem Zytoskelett verbunden ist (Angst et al., 2001a)
Die juxtamembranäre Domäne des zytoplasmatischen Anteils des VE-Cadherins ist eine
funktionell aktive Region, die über die Interaktion mit dem p120ctn an der endothelialen
Zell-Zell-Adhäsion mitwirkt (Iyer et al., 2004; Yap et al., 1998). Die Bindung von p120ctn
an das VE-Cadherin (bzw. deren juxtamembranäre Domäne) steigert die Stärke der Zell-
Zell-Adhäsion, verhindert die Endozytose von VE-Cadherin und führt zu einer
Kontaktinhibition. Ein Verlust von p120ctn ist mit einem Abfall des VE-Cadherin-Level in
den Endothelzellen assoziiert, da die juxtamembranäre Domäne ohne p120ctn eine
Neuordnung des Zytoskeletts, einen Anstieg von VE-Cadherin-Phosphorylierung und -
Endozytose und eine Neuverteilung der Adhäsionsmoleküle auf der Endothelzelloberfläche
Kapitel 1 – Einleitung 14 bedingt (Anastasiadis und Reynolds, 2000; Ferber et al., 2002; Iyer et al., 2004; Thoreson
et al., 2000; Xiao et al., 2003; Yap et al., 1998).
Die juxtamembranäre Region ist prinzipiell für die Zusammenlagerung der VE-Cadherin-
Moleküle verantwortlich, wohingegen die Catenin-bindende Region den Hauptlink an das
Aktinzytoskelett darstellt (Yap et al., 1998).
Nach Lambert et al. (2005) erfolgt als erster Schritt der Bildung einer Zelladhäsion die
Verknüpfung der extrazellulären Domänen untereinander, gefolgt von der Verknüpfung
der intrazellulären Domäne mit dem Zytoskelett.
1.5.3 Verknüpfung mit dem Zytoskelett
Es gibt drei Typen von VE-Cadherin: 1. Membran-assoziiertes VE-Cadherin, 2.
Zytoskelett-assoziiertes (Aktin-abhängig) VE-Cadherin und 3. Zytoskelett-assoziiertes
(Aktin-unabhängig) VE-Cadherin (Lim et al., 2001). VE-Cadherin ist sowohl an das Aktin
(Aktin-abhängig) als auch an das Intermediäre Filament-Zytoskelett (Aktin-unabhängig)
gebunden (Kowalczyk et al., 1998). Über bestimmte Proteine, die Catenine, ist das VE-
Cadherin mit dem Aktinzytoskelett verknüpft. Die Catenine sind für die Regulation der
Cadherin-vermittelten Adhäsion wichtig. Von Bedeutung sind α-, β- und γ-Catenin, sowie
p120ctn.
α-Catenin ist mit Vinculin verknüpft und nimmt eine Schlüsselrolle bei der Verknüpfung
des Schwanzteiles von VE-Cadherin mit dem Aktinzytoskelett ein.
β-Catenin verbindet den Cadherin-Schwanz mit dem α-Catenin.
γ-Catenin hingegen ist identisch mit dem desmosomalen Protein Plakoglobin und
übernimmt teilweise die gleichen Funktionen wie β-Catenin. β-Catenin und Plakoglobin
gehören beide zur Familie der Armadillo Proteine (Vincent et al., 2004).
Plakoglobin kommt nicht nur in Desmosomen, sondern auch – weil es an klassische
Cadherine bindet – in Adhärensjunktionen vor. Es bindet an Aktin und an das intermediäre
Filament. Damit ist Plakoglobin für eine Verbindung zwischen Adhärensjunktionen und
Desmosomen verantwortlich.
β-Catenin und Plakoglobin verbinden beide den Cadherin-Schwanz mit α-Catenin, welches
den Cadherin-Catenin-Komplex mit dem Aktin-Zytoskelett verknüpft. Die beiden
Armadillo-Proteine binden dabei an der "Catenin Binding Domain" des VE-Cadherins. In
Abwesenheit von β-Catenin ist der Cadherin-Schwanz unstrukturiert und anfällig für
Proteolyse. Bindet jedoch das β-Catenin an den Cadherin-Schwanz, verknüpft sich die
aminoterminale Region des β-Catenin mit dem α-Catenin. Plakoglobin agiert ähnlich. Es
bindet auch an α-Catenin (was an E- und N-Cadherin untersucht wurde), kommt aber nie
Kapitel 1 – Einleitung 15 gleichzeitig mit β-Catenin im Cadherin-Catenin-Komplex vor. Im Gegensatz zu β-Catenin
ist es mit Desmoglein und Desmocollin assoziiert (Alberle et al., 1994; Sacco et al., 1995).
β-Catenin und Plakoglobin nehmen also Schlüsselrollen in der Vernetzung des VE-
Cadherin mit dem Aktinzytoskelett ein (Abb. 4).
Abb. 4: Interaktion von VE-Cadherin mit dem Zytoskelett: Zum einen Bindung über α- und β-Catenin bzw. Plakoglobin p120-vermittelt an Aktin, zum anderen über Desmoplakin und Plakoglobin p0071-vermittelt an Vimentin (Vincent et al., 2004)
Das Protein p120ctn (p120-Catenin) spielt bei der Regulation der Cadherinfunktion
ebenfalls eine wichtige Rolle (Iyer et al., 2004). p120ctn interagiert mit der
juxtamembranären Domäne des VE-Cadherin. Es verbindet das VE-Cadherin nicht direkt
mit dem Zytoskelett, reguliert jedoch die Funktion von VE-Cadherin. Außerdem ist es
zusammen mit der juxtamembranären Region für die Organisation von Aktin im Rahmen
VE-Cadherin-vermittelter Zellkontakte zuständig und reguliert die Zusammenballung von
VE-Cadherin (Thoreson et al., 2000; Yap et al., 1998). p0071 (= Plakophilin-4) übernimmt
wohl eine ähnliche Funktion wie p120ctn (Vincent et al., 2004).
1.5.4 Regulation
Die strukturelle und funktionelle Regulation des Cadherin-Catenin-Komplexes ist noch
nicht endgültig geklärt. Ein wichtiger Bestandteil der Regulation ist das Zusammenspiel
von Wnt (Wingless int-1) und β-Catenin. Wnts sind einflussreiche Regulatoren der
Zellproliferation und Differenzierung (Venkiteswaran et al., 2002). Ihr Signalweg
Kapitel 1 – Einleitung 16 involviert Proteine, die direkt an der Gentranskription und der Zelladhäsion teilnehmen.
Das zentrale Protein des Signalwegs ist β-Catenin (Nelson und Nusse, 2004).
β-Catenin existiert in mehreren Formen (Abb. 5):
- in einer Cadherin-gebundenen Form zur Regulation der Zelladhäsion,
- in einer phosphorylierten Form in einem Komplex aus mehreren Komponenten,
- im Nucleus.
Über die Wnt-Signalkette wird β-Catenin freigesetzt und kann in den Zellkern eintreten,
wo es mit den Transkriptionsfaktoren interagiert und durch Beeinflussung der
Genexpression in die Zelladhäsion und die Expression von Cadherinen eingreift (Bienz
und Clevers, 2000; Nelson und Nusse, 2004).
Abb. 5: Zentrale Rolle von β-Catenin im Wnt-Signalweg (Wingless int-1): β-Catenin existiert in einer Cadherin-gebundenen Form zur Regulation der Zelladhäsion, in einer phosphorylierten Form und im Nucleus zur Beeinflussung der Transkription (Nelson und Nusse, 2004)
Der Grundmechanismus der Regulation des Cadherin-Catenin-Komplexes ist die
Phosphorylierung. Die strukturelle und funktionelle Regulation erfolgt durch das
Gleichgewicht der Tyrosinkinase- und der Phosphataseaktivität. Cadherin bindet β-
Catenin, das seinerseits wieder α-Catenin bindet, und p120. Die Integrität dieses
Komplexes ist negativ durch die Phosphorylierung von β-Catenin reguliert (Angst et al.,
2001). Die Phosphorylierung erfolgt durch Tyrosinrezeptorkinasen (RTKs) und
zytoplasmatische Tyrosinkinasen (Fer, Fyn, Yes und Src), die besondere Tyrosinreste
(Y654, Y142) im β-Catenin phosphorylieren (Abb. 6). Das führt zur Dissoziation des
Cadherin-Catenin-Komplexes (Ukropec et al., 2000). Die Integrität ist somit positiv über
die Phosphorylierung von β-Catenin durch die Kasein Kinase II und die
Kapitel 1 – Einleitung 17 Dephosphorylierung durch die Protein-Tyrosin-Phosphatase reguliert. Letztere bindet p120
und β-Catenin (Abb. 6). Veränderungen in der Phosphorylierung von β-Catenin haben
Auswirkungen auf die Zell-Zell-Adhäsion, die Zellmigration, die Menge an
signalwirksamem β-Catenin und über die Barriereintegrität den parazellulären
Transportweg (Nelson und Nusse, 2004; Sui et al., 2005; Tinsley et al., 2005; Ukropec et
al., 2000).
Die Aktivierung der Tyrosinkinase führt demnach zu einem Verlust an Cadherin-
vermittelten Zell-Zell-Kontakten und lässt das zytoplasmatische β-Catenin ansteigen. Im
Gegensatz dazu, stabilisiert die Aktivierung der Protein Tyrosine Phosphatase (PTP) den
Cadherin-Catenin-Komplex und es resultiert eine Vermehrung der Cadherin-vermittelten
Zell-Zell-Kontakte. Daraus ergibt sich, dass der Regulationsmechanismus auf dem
Gleichgewicht der Tyrosinkinase und der Tyrosinphosphatase beruht (Nelson und Nusse,
2004).
Abb. 6: Regulation des Cadherin-Catenin-Komplexes über De-/Phoshorylierung von β-Catenin; rote Pfeile: Phosphorylierung, grüne Pfeile: Dephosphorylierung (Nelson und Nusse, 2004)
Die Tyrosinphosphorylation von VE-Cadherin kann durch TNFα, einem u. a. bei Sepsis
freigesetzten Entzündungsmediator, und PAF (Platelet Activating Factor) induziert
werden. TNFα ruft eine verstärkte interzelluläre Lückenbildung hervor und steigert
Kapitel 1 – Einleitung 18 dadurch die Endothelzellpermeabilität zwischen den Zellen (Hudry-Clergeon et al., 2005;
Nwariaku et al., 2002).
Daneben existieren noch weitere Signalwege. Einer davon wird durch IQGAP1
(Calmodulin-Binding Domain GAP 1) vermittelt, das bei niedriger intrazellulärer Ca2+-
Konzentration mit einem GTP-gebundenen, aktivierten in der Zellmembran verankerten
Komplex (CDC42/RAC1) und Aktin interagiert. Daraus resultieren ein stabiler Cadherin-
Catenin-Komplex und eine feste interzelluläre Adhäsion. Steigt der intrazelluläre Ca2+-
Spiegel an, bindet Ca2+ direkt an IQGAP1 und Calmodulin (CAL) (Abb. 7). IQGAP1
dissoziiert vom membrangebundenen Komplex und vom Aktin, es bindet sich an den
Cadherin-Catenin-Komplex, wobei α-Catenin abgespalten wird. Die Cadherin-vermittelte
Zell-Zell-Adhäsion ist reduziert (Angst et al., 2001).
GRD = GAPrelated domain; IQ = calmodulin-binding domain; C = calponin-homology domain; V= vinculin
Abb. 7: Regulation des Cadherin-Catenin-Komplexes in Abhängigkeit von der Ca2+-Konzentration in der Zelle (Angst et al., 2001)
Für die Regulation der VE-Cadherin-Expression und die Präsentation von Cadherinen an
der Plasmamembran ist die Endoztyose, also die Aufnahme von Substanzen in die Zelle
über Ausstülpungen der Zellmembran, ein wichtiger zellulärer Mechanismus. Sie findet
während der Entwicklung als Reaktion auf die Zellmigration triggernde
Wachstumsfaktoren statt. Beispielsweise führt H2O2 in Endothelzellen zur Internalisation
von VE-Cadherin. Daraus resultiert eine Dysfunktion der Endothelbarriere mit Bildung
von "Lücken" (Vincent et al., 2004).
Kapitel 1 – Einleitung 19 Für die biochemische Erklärung des Prozesses spielt die Bindung von VE-Cadherin zu β-
Catenin und p120ctn eine Rolle. Die Menge von freiem p120ctn hat Einfluss auf die Menge
an freiem VE-Cadherin. Wird p120ctn von VE-Cadherin getrennt, wird VE-Cadherin
internalisiert und zudem von β-Catenin getrennt (Abb. 8). Der Verlust der Bindung mit
p120ctn setzt eine Abbaukaskade des VE-Cadherins in Gang, in die Lysosomen und
Proteosomen involviert sind. Ob ein "Recycling" stattfindet, evtl. unter dem Einfluss von
p120ctn-Kinesin, ist bis dato nicht bekannt (Vincent et al., 2004).
Abb. 8: Endozytose von VE-Cadherin: nach Dissoziation von p120ctn und VE-Cadherin, konsekutive Ablösung des β-Catenin von VE-Cadherin mit nachfolgender Internalisation/Endozytose von VE-Cadherin (Vincent et al., 2004)
1.5.5 Funktionen
Während VE-Cadherin spezifisch von Endothelzellen der Blut- und Lymphgefäße
exprimiert wird, ist es auf zirkulierenden Blutzellen wie Monozyten, PMNs und Plättchen
– im Gegensatz zu anderen Adhäsionsmolekülen – nicht vorhanden (Lampugnani et al.,
1992; Vincent et al., 2004). Am Endothel bildet VE-Cadherin kalziumabhängig homophile
Bindungen an den interzellulären Junktionen aus und bedingt so eine endotheliale Zell-
Zell-Adhäsion (Breviario et al., 1995; Navarro et al., 1995). An den Zell-Zell-Adhäsionen
(Adhärensjunktionen), an denen VE-Cadherin die Hauptkomponente darstellt, bestimmt es
die Stärke der Zelladhäsion und die Monolayereigenschaften des Endothels (Dejana et al.,
1996; Hordijk et al., 1999; Venkiteswaran et al., 2002). Eine verminderte Expression bzw.
der Verlust von VE-Cadherin bedingt eine Endothelzellverbandlockerung und eine
Kapitel 1 – Einleitung 20 Steigerung der Endothelpermeabilität mit Ausbildung von "Lücken" (Breviario et al.,
1995; Hordijk et al., 1999) (Abb. 9).
VE-Cadherin ist somit nicht nur ein wichtiger Regulator der Gefäßpermeabilität, sondern
auch wichtig für die Aufrechterhaltung der Endothelbarrierenfunktion (Angst et al., 2001;
Breviario et al., 1995; Corada et al., 2001; Corada et al., 1999; Dejana et al., 1999;
Haselton und Heimark, 1997; Hordijk et al., 1999; Kevil et al., 1998; Lum und Malik,
1996; Navarro et al., 1995; Stevens et al., 2000). Über die Regulierung der
Endothelpermeabilität wird auch die Transmigration hochmolekularer Moleküle reguliert,
da die Expression von VE-Cadherin deren Durchtritt durch das Endothel erschweren und
damit senken kann (Breviario et al., 1995). Ebenso kann die VE-Cadherin-Expression die
Transmigration von Zellen (Breviario et al., 1995; Hordijk et al., 1999; Navarro et al.,
1995), insbesondere die der Leukozyten und Neutrophilen (Shaw et al., 2001),
beeinflussen. Des Weiteren führt die gesteigerte Endothelpermeabilität zur Ausbildung
eines Ödems (Grau et al., 1996; Lehr et al., 2000; Petrache et al., 2003; Wong et al., 1999).
VE-Cadherin ist für die Organisation gefäßähnlicher Strukturen in Embryos verantwortlich
(Vittet et al., 1997). Hier spielt es durch Ausbildung einer homotypischen Zellaggregation
eine Rolle bei der Embryogenese und der Entwicklung definierter Gewebe und Organe
(Breviario et al., 1995), sowie bei der Gefäßmorphogenese, der Gefäßneu- und -umbildung
(Angst et al., 2001; Corada et al., 2001; Gory-Fauré et al., 1999). Im Rahmen der
Neovaskularisation ist VE-Cadherin für die Ausbildung von Adhärensjunktionen zwischen
den Endothelzellen wichtig (Liao et al., 2002). Endothelzellen, die eine Nullmutation für
das VE-Cadherin Gen in sich tragen, zeigen erhebliche Veränderungen in ihrem
funktionellen Verhalten und können keine gefäßähnlichen Strukturen organisieren (Vittet
et al., 1997). Daneben ist VE-Cadherin nicht nur bei der Gefäßbildung (Vittet et al., 1997),
sondern auch bei der Aufrechterhaltung der Funktion der Blutgefäße von Bedeutung
(Breviario et al., 1995). VE-Cadherin fördert das Zellwachstum (Caveda et al., 1996) und
beeinflusst die Apoptose (Corada et al., 2001; Herren et al., 1998) – letztere wird durch
eine Hemmung von VE-Cadherin ausgelöst.
Auf der einen Seite fördert VE-Cadherin die Tumorvaskularisation (Liao et al., 2002)
durch die Eigenschaft der Angiogenese, führt aber auf der anderen Seite auch zur
Zellkontakt-induzierten Wachstumsinhibition der Zellen. Aus Letzterem ergibt sich die
Rolle der Cadherine als Tumorsuppressorgene mit bei verschiedenen Tumoren
auftretenden Veränderungen auf dem Chromosom 16 (Kremmidiotis et al., 1998).
Kapitel 1 – Einleitung 21
Abb. 9: Interendotheliale Lückenbildung durch VE-Cadherin-Affektion (Lim et al., 2001): (1) membranäres, nicht mit dem Zytoskelett verknüpftes VE-Cadherin als "Schwachstelle" für eine Lückenbildung; (2) Dissoziation der extrazellulären VE-Cadherin-Moleküle; (3) Bildung interzellulärer Lücken an "VE-Cadherin-freien" Zellwandabschnitten
1.5.6 VE-Cadherin-vermittelte Zelladhäsion im Rahmen einer Entzündungsreaktion
Bei einer Entzündungsreaktion führt das Auseinanderweichen der VE-Cadherin-
vermittelten Zell-Zell-Adhäsion zur Ausbildung von interendothelialen Lücken (Corada et
al., 1999). Die Akkumulation von Entzündungszellen im perivasalen Gewebe infolge des
Durchtretens von Entzündungszellen durch die entstandenen Lücken erfolgt im Detail
folgendermaßen: Der Austritt von Neutrophilen aus dem Blutstrom wird von einer
Kaskade von Zelladhäsionsmolekülen und Leukozyten-aktivierenden Mediatoren, die das
Andocken von Neutrophilen an der Endothelzelloberfläche kontrollieren, initiiert.
Selektine sorgen für das Anhängen der Leukozyten am Endothel und das Entlangrollen am
selben (Hasleton und Roberts, 1999). Integrine und Adhäsionsmoleküle vermitteln die
feste Anheftung am Endothel. So spielt z. B. PECAM-1 bei der Adhäsion und
Transmigration eine Rolle (Bogen et al., 1994; Muller et al., 1993).
Neutrophile verändern dabei die endotheliale junktionale Integrität durch die Elastase-
vermittelte Proteolyse junktionaler Proteine wie VE-Cadherin (Carden et al., 1998) und
induzieren durch diesen Mechanismus ihre eigene Transmigration.
Auch im menschlichen Knochenmark führt der Verlust von VE-Cadherin-vermittelter Zell-
Zell-Adhäsion zu einer Permeabilitätssteigerung des Endothels (van Buul et al., 2002). Die
Kapitel 1 – Einleitung 22 reduzierte Zelladhäsion und der lokal begrenzte Verlust von VE-Cadherin führt zur
transendothelialen Migration von CD34+-Zellen. Der Verlust von VE-Cadherin ist
allerdings reversibel (van Buul et al., 2002).
Die große Bedeutung von VE-Cadherin für die Transmigration von Neutrophilen durch die
Endothelzellschicht wurde mittels eines VE-Cadherin-Antikörpers untermauert (Gotsch et
al., 1997). Dieser Antikörper beschleunigte in vivo durch eine gesteigerte
Gefäßpermeabilität die Rekrutierung von Neutrophilen aus dem Blut ins Gewebe.
Bei einer real-time-Darstellung (Shaw et al., 2001) mit markiertem VE-Cadherin konnte
der Vorgang der Diapedese beobachtet werden. Die Transmigration erfolgte dabei auf zwei
verschiedene Arten: 1. Transmigration durch neu entstandene Lücken im
Endothelzellverband und 2. Transmigration durch vorbestehende Endothellücken.
Bei der Migration näherten sich die Leukozyten dem kontinuierlichen Endothelverband, es
entstand eine Lücke – bzw. es bestand schon eine Lücke – und durch diese Lücke
wanderten die Leukozyten hindurch. Es konnten auch zwei Leukozyten hintereinander,
noch bevor diese wieder verschlossen wird, durch dieselbe Lücke gelangen. Sowohl die
neu entstandenen als auch die vorhandenen Lücken wurden nach einigen Minuten wieder
geschlossen (Shaw et al., 2001).
Unter inflammatorischen Bedingungen "öffnen" Endothelzellen ihre interzellulären
Junktionen und erlauben Makromolekülen und Leukozyten die Passage in das umgebende
Gewebe und damit den Angriff auf invasive Pathogene im Interstitium. Die Trennung und
Wiederherstellung des VE-Cadherin-Komplexes im Rahmen der inflammatorischen
Lückenbildung und der Transmigration von Leukozyten verlangt eine Regulation der
extrazellulären Bindungen (Baumgartner et al., 2000).
Die Cadherin-vermittelte Adhäsion zwischen Endothelzellen hat zwei Hauptfunktionen zu
erfüllen: Zum einen soll sie mechanische Stabilität gegen externe Kräfte wie Shearstress,
die auf die Junktionen einwirken, verleihen, zum anderen soll sie ein dynamisches
Zellverhalten (Veränderung der Zellgestalt und der Barriereeigenschaften) erlauben. Die
anscheinend recht niedrige Affinität zwischen den Cadherinen führte Baumgartner et al.
(2000) zu der Theorie, dass die Anzahl der Adhäsionen zwischen den Zellen durch einen
einfachen thermodynamischen Mechanismus im Organismus reguliert werden könnte.
Wie andere Membranproteine unterliegen auch Cadherine einer zufälligen seitlichen
Diffusion in der Plasmamembran, so dass die Bildung von Adhäsionen diffusionslimitiert
ist. Auf Grund der Diffusionskinetik, der kurzen Lebenszeit der Adhäsionen und der hohen
Kapitel 1 – Einleitung 23 Dissoziationskonstante dissoziieren die Adhäsionsmoleküle schnell und werden durch
laterale Diffusion getrennt. Es kommt nicht zu einer Readhäsion derselben Moleküle. Eine
große Fraktion ungebundener frei diffundierender Cadherin-Moleküle verbleibt in einem
ungebundenen Status in der Plasmamembran (Baumgartner et al., 2000).
Wird die Diffusion der Cadherine durch eine zytoplasmatische Bindung über Catenine an
das Aktin-Filament-Zytoskelett zurückgehalten, so steigt die Wahrscheinlichkeit eines
Adhäsionsmoleküls, nach der Dissoziation wieder eine Bindung einzugehen. Eine
Dissoziation der Cadherine vom Zytoskelett führt zu einer Reduktion der interzellulären
Junktionen, bedingt durch die seitliche Diffusion der Moleküle. Die Stärke der Adhäsion
zwischen den Zellen wird über den Grad der Anbindung der Cadherine an das Zytoplasma
bestimmt. Jeder Signalmechanismus, der die Anbindung der Cadherine an das Zytoskelett
ändert (z. B. durch Phosphorylierung der Catenin-Adapter-Moleküle oder durch
Modulation des Status der Aktinpolymerisation) wirkt auf die laterale Mobilität der
Cadherine und somit auf die Anzahl der Adhäsionen ein. Die transmembranäre Adhäsion
ist streng abhängig von der Affinität der extrazelluären Bindungen, d. h. der Bindung der
extrazellulären Domänen der Cadherine aneinander, und der intrazelluären Bindungen, d.h.
der Bindung von VE-Cadherin an das Zytoskelett. Die sehr niedrigen Bindungsaffinitäten
zwischen den interagierenden Cadherinen machen die Cadherine zu idealen Kandidaten für
die adhäsive Regulation durch zytoskelettale Anbindung, weil mit wenig Energie
Bindungen geknüpft und gelöst werden können (Baumgartner et al., 2000).
An der Erhaltung der Barrierefunktion sind viele Proteine beteiligt und dementsprechend
an den Zell-Zell-Junktionen konzentriert (z. B. Okkludine, Desmoplakine, Connexine,
Integrine, Cadherine, PECAM-1). VE-Cadherin, eine der Hauptkomponenten, bestimmt
maßgeblich die Stärke der Zell-Zell-Adhäsion und die Monolayer-Eigenschaften (Hordijk
et al., 1999). Das beruht vor allem darauf, dass VE-Cadherin – im Gegensatz zu PECAM-1
– an den Zell-Zell-Verbindungen mit "Actin Stress Fibers" kolokalisiert ist, ebenso wie β-
Catenin und Plakoglobin, die jeweils mit den Endpunkten der Stressfasern verknüpft sind.
In Verbindung mit den Stressfasern imponiert VE-Cadherin in einer unregelmäßigen
Verteilung an den Zell-Zell-Adhäsionen. Die Abwesenheit von Stressfasern führt zu einer
linearen Verteilung von VE-Cadherin (Hordijk et al., 1999).
Aus dieser Kolokalisation des Cadherin-Catenin-Komplexes mit den Endpunkten der
Aktin-Stressfasern ist eine funktionelle Verbindung zwischen VE-Cadherin und dem
Aktinzytoskelett abzuleiten. Inhibition von intaktem funktionierendem VE-Cadherin führt
zu einer Neubildung des Aktinzytoskeletts. Das zieht einen Verlust der junctionalen VE-
Kapitel 1 – Einleitung 24 Cadherin-Lokalisation mit reduzierter Zell-Zell-Adhäsion, steigender Permeabiliät und
wachsender Neutrophilentransmigration nach sich; Retraktionsfasern können beobachtet
werden und Lücken im Monolayer werden sichtbar (Hordijk et al., 1999).
Die Zellverbindungen aus VE-Cadherin werden von der Dynamik des Aktin-Zytoskeletts,
der Aktinpolymerisation, Organisation des Aktinzytoskeletts und Anwesenheit von
Aktinstressfasern kontrolliert. Der Verlust von VE-Cadherin führt zu einer Neu- und
Umbildung des Aktinzytoskeletts (Hordijk et al., 1999). Die Untersuchungen von Hordijk
et al. wurden an HUVEC durchgeführt.
Kapitel 1 – Einleitung 25
1.6 Sepsis
1.6.1 Definition und klinisches Bild
Der Begriff Sepsis (griech. Fäulnis) bezeichnet eine lebensbedrohliche "systemische"
Infektion, bei der – von einem lokalen Infektionsherd ausgehend – kontinuierlich oder in
Schüben Erreger und deren Toxine in die Blutbahn eingeschwemmt werden, auf Grund
dessen es zu schweren Allgemeinsymptomen und im Rahmen der hämatogenen Streuung
zu metastatischer Absiedlung in andere Organe kommt.
Dementsprechend werden das Krankheitsbild und die Folgen der Sepsis durch drei
Faktoren bestimmt: 1. den in den Körper eingedrungenen Erreger, 2. die gebildeten
Produkte (Toxine) und 3. die Abwehrreaktion des Organismus. Vor allem die Freisetzung
körpereigener Mediatoren (Zytokine wie TNFα und Interleukine) wird für zahlreiche
Symptome verantwortlich gemacht.
Der Begriff Sepsis gilt nicht für Viren, Rickettsien oder für zellgebundene Bakteriämien,
bei denen die Erreger innerhalb der Blutmonozyten auftreten, ohne eine
Sepsissymptomatik hervorzurufen.
Von der Sepsis ist die Bakteriämie abzugrenzen, bei der lediglich Bakterien im Blut
nachgewiesen werden können und (noch) keine Krankheitssymptome vorliegen. Bei Sepsis
besteht hingegen eine Septikämie, d. h. eine Systemkrankheit, verursacht durch Bakterien
und deren Toxine im Blut, bei der mindestens zwei der folgenden Symptome auftreten
(1991 definiert durch die ACCP/SCCM, die Consensus Conference des American College
of Chest Physicians und der Society of Critical Care Medicine):
Temperatur > 38 °C oder < 36 °C, Tachykardie > 90/min (oder Bradykardie) bei
Ausschluss einer Herzkrankheit, Tachypnoe > 20/min als wesentliches Leitsymptom bei
Ausschluss einer Lungenkrankheit, pCO2 < 32 mmHg, Leukozyten > 12000/µl bzw.
< 3800/µl; erhöhte Anzahl von Stabkernigen, starke Reduktion der Thrombozyten.
Die Sepsis tritt bei zwei von 100 Einlieferungen ins Krankenhaus auf und betrifft folgende
Organsysteme: Niere (Infektion des oberen Harntraktes), Leber und Gallenblase, Darm im
Rahmen einer Peritonitis, Haut (Pusteln, Nekrosen, Blasen, petechiale Blutungen), Lungen
(bakterielle Pneumonie), Meningen, bei Kindern auch das Knochenmark (Osteomyelitis).
Neben der charakteristischen Hyperventilation ist die schwere Sepsis mit
Organdysfunktion und Perfusionsstörungen wie Hypoperfusion oder Hypotension
Kapitel 1 – Einleitung 26 assoziiert. Weitere Symptome sind Schüttelfrost, Oligurie, Benommenheit und
Verwirrtheit. Im Rahmen eines Diabetes mellitus kann es auch zu einer metabolischen
Entgleisung (Laktatazidose) kommen.
Die häufigsten Erreger der Sepsis sind: E. coli (Eintrittspforte über die Harnwege und den
Gastrointestinaltrakt), Staphylokokkus aureus (bei Hautinfektionen und intravasalen
Fremdkörpern), koagulase-negative Staphylokokken (bei intravasalen Fremdkörpern),
Klebsiella species (Eintrittspforte über die Harnwege), Pseudomonas aeruginosa (bei
beatmeten Patienten und Verbrennungswunden), Pseudomonas mirabilis (Eintrittspforte
über die Harnwege).
Besonders gefährdet sind stationäre Patienten hohen Alters und solche mit schweren
Allgemeinerkrankungen (Diabetes, Tumoren). Auch nach Verbrennungen, großen
Operationen, invasiver Diagnostik und unter immunsuppressiver Therapie bzw. bei
Immunschwäche ist das Risiko an einer Sepsis zu erkranken erhöht. Venenverweilkatheter,
chirurgische Drainagen und Dekubitus stellen bei hospitalisierten Patienten Risikofaktoren
für eine Sepsis dar.
Fulminante Verlaufsformen der Sepsis sind das Waterhouse-Friederichsen-Syndrom
(ausgelöst durch Meningokokken, einhergehend mit Nebennierenblutungen, petechialen
Hautblutungen und Verbrauchskoagulopathie), eine Sepsis nach Splenektomie und das
"Toxic Shock Syndrom" (ausgelöst durch Stayphylokokken oder Strepktokokken).
Eine schwere Form der Sepsis kann zum septischen Schock mit
Multiorganfunktionsstörung und schließlich zum Exitus letalis führen.
Die Therapie besteht aus Herdsanierung und Antibiotikagabe.
1.6.2 Pathophysiologie
Entscheidend für die Pathophysiologie der Sepsis ist die Freisetzung von Endotoxinen ins
Blut (= Endotoxinämie) (Faure et al., 2001). Das Endotoxin schädigt die Elemente des
RHS (= retikulohistiozytäres System) und blockiert dadurch die phagozytäre
Abwehrkomponente, vor allem schädigt es aber die Gefäßendothelien. Im Mittelpunkt der
Pathogenese der Sepsis steht die ebenfalls zytokin-induzierte mikrozirkuläre Dysfunktion
(Lehr et al., 2000; Mutunga et al., 2001; Wong et al., 1999). Die Konsequenzen der
mikrozirkulären Dysfunktion sind der Zusammenbruch der endothelialen und epithelialen
Barrierefunktion, die zu Gewebeödem und unkontrollierter inflammatorischer
Kapitel 1 – Einleitung 27 Zellinfiltration führt, die Vasodysregulation, die zur Bildung arteriovenöser Shunts
und/oder dem Verlust des peripheren Widerstandes mit erheblichen
makrohämodynamischen Konsequenzen wie z. B. Tachypnoe/Tachykardie und
Kreislaufzentralisation führt und die Störung des Sauerstofftransports und -verbrauchs der
Gewebezellen (Lehr et al., 2000). Das Endotoxin führt des Weiteren zu einer Aktivierung
und Adhäsion von Leukozyten an Endothelzellen und Leukozyten. Dies trägt ebenfalls
zum Gewebeschaden bei (Lehr et al., 2000).
Auf Grund dieser Mechanismen führt der weitreichende Endothelschaden zu
Organdysfunktion und -schaden (Mutunga et al., 2001).
Kapitel 1 – Einleitung 28
1.7 ARDS
1967 wurde das akute Atemnotsyndrom des Erwachsenen ("Acute Respiratory Distress
Syndrome") erstmals von Ashbaugh et al. in Zusammenhang mit einem akuten
Lungenversagen beschrieben. Es handelt sich dabei um eine akute respiratorische
Insuffizienz bei vorher lungengesunden Patienten durch pulmonale Schädigungen
unterschiedlicher Genese, die mit einem nicht-kardiogenen Lungenödem einhergeht.
1994 definierte die "American-European Consensus Conference on ARDS" das
Atemnotsyndrom folgendermaßen: (a) akuter Beginn, (b) bilaterale Infiltrate auf dem
frontalen Röntgen-Thorax-Bild, (c) pulmonaler arterieller Verschlussdruck bei pulmonaler
arterieller Kathetermessung ≤ 18 mmHg oder keine klinischen Anzeichen einer Links-
Herz-Hypertonie, (d) verringerte Oxygenierung mit PaO2/FIO2 ≤ 200 Torr, unabhängig
von der Höhe des endexpiratorischen Druckes.
1.7.1 Ätiologie
Ausgelöst wird das ARDS durch direkte oder indirekte Schädigung der Lunge. Die direkte
pulmonale Schädigung wird z. B. durch Magensaftaspiration, Beinahe-Ertrinken,
Rauchvergiftung, Vergiftung mit verschiedenen Toxinen sowie Drogenabusus, O2-
Vergiftung, primäre bakterielle und virale Pneumonien verursacht.
Indirekte pulmonale Schädigung kann z. B. durch Sepsis, Fettembolie, Verbrennungen,
Thoraxtrauma, kardiopulmonalen Bypass, prolongierten Schock, massive Bluttransfusion
und akute hämorrhagische Pankreatitis entstehen.
ARDS entwickelt sich in 20 - 50 % bei Patienten nach schweren Störungen wie multiplem
Trauma, Sepsis oder Schock. Des Weiteren wird geschätzt, dass in mehr als 30 % der Fälle
eine Sepsis die auslösende Ursache für ein ARDS ist.
1.7.2 Pathogenese unter Berücksichtigung der Pathophysiologie
Das ARDS ist eine akute Funktionsstörung der Gasaustauschstrecke der Lunge im Bereich
von Kapillaren, Interstitium und Alveolen.
Die Blut-Luft-Schranke ist für den Gasaustausch zwischen Alveolarluft und Blut
verantwortlich. Wird die Schranke geschädigt – wie dies beim ARDS der Fall ist – können
Bestandteile aus dem Blut in die Alveolen übertreten und ein Ödem ausbilden.
Die Blut-Luft-Schranke besteht aus:
Kapitel 1 – Einleitung 29 1. Zytoplasma der dünn ausgezogenen (kapillären) Endothelzellen, 2. miteinander
verschmolzenen Basalmembranen der Kapillarwand und des Alveolarepithels (= alveoläres
Interstitium, normalerweise ein virtueller Spalt), 3. Zytoplasma der Alveolarepithelzellen,
Alveolarepithelzellen Typ I (Deckzellen) und Alveolarepithelzellen Typ II
(Surfactantproduktion), und die 4. Schicht aus Surfactant.
Unabhängig von der Ätiologie des ARDS verläuft die Schockreaktion in der Lunge in drei
Phasen:
1. Exsudative Phase mit gesteigerter Kapillarpermeabilität und interstitiellem Lungenödem
2. Alveoläres Lungenödem, Untergang der Pneumozyten Typ II mit verminderter Synthese
des Surfactant-Factors, Bildung hyaliner Membranen und Ausbildung intrapulmonaler
Shunts mit Folge einer Hypoxie sowie Mikroatelektasen
3. Proliferative Phase mit Ausbildung einer Lungenfibrose und einer Endothelproliferation
der Alveolarkapillaren (irreversibles Stadium)
Charakteristisch für das ARDS ist der exzessive Entzündungsprozess in den Lungen, der
im weiteren Verlauf bis zur Fibrose fortschreiten kann (Hasleton und Roberts, 1999):
Innerhalb von 24 - 48 Stunden nach dem ursprünglichem Auslöser entwickeln sich
zunächst sog. Frühveränderungen bestehend aus einem – wohl nur funktionellen – Schaden
der Gefäßwand, der einen Flüssigkeitsübertritt aus den Blutgefäßen in das Interstitium der
Alveolarwandungen ermöglicht (Müller und Grundmann, 1980). Für den akuten
Lungenschaden ist ein komplexes Zusammenspiel zwischen pro- und anti-
inflammatorischen Mediatoren verantwortlich (Hasleton und Roberts, 1999). Unabhängig
von der Ätiologie des Schockgeschehens werden die klassischen Mediatorsysteme der
Entzündung (Kinin-, Gerinnungs-, Histamin-, Komplementsystem und
Arachidonsäurekaskade) in Gang gesetzt, die sich gegenseitig verstärken. Dies führt zu
einer Aktivierung der pulmonalen Makrophagen und Granulozyten. Der kapilläre
Endothelzellverband wird über die Alteration von VE-Cadherin für diese Zellen permeabel
(= erhöhte Kapillarpermeabilität). Die Entzündungszellen und Erythrozyten gelangen in
den sonst nicht existenten Alveolarspalt und bilden damit das hämorrhagische interstitielle
Ödem (erst serös, dann serofibrinös) aus. Das Ödem bewirkt eine Reduzierung der
Lungencompliance, so dass die Atemarbeit erschwert wird. Dies äußert sich in einer
Hypoxämie und einer Hyperventilation mit respiratorischer Alkalose. Im Röntgenbild sind
die hilusnahen Gefäße spindelförmig aufgetrieben, die bilateralen Infiltrate repräsentieren
das proteinreiche Ödem (Hasleton und Roberts, 1999).
Kapitel 1 – Einleitung 30 Die Zellschädigung greift nachfolgend auch auf das alveoläre Epithel über. Da die
Alveolarepithelzellen Typ II kein Surfactant mehr produzieren, entstehen Atelektasen. Der
Zellverband zwischen Alveolarepithelzellen Typ I und II wird aufgelockert mit der Folge
eines alveolären Ödems.
Infolge dieser Endothel- und die Epithelzellschichtschädigung erreicht das fibrinreiche
Exsudat die Oberfläche der Alveolen. Dort bildet es zusammen mit den Zelltrümmern
bereits nach 24 Stunden hyaline Membranen (breite, PAS-positive Niederschläge)
(Hasleton und Roberts, 1999). Durch die die Alveolen tapetenartig auskleidenden hyalinen
Membranen wird der Gasaustausch weiter behindert, es kommt zur Hypoxie. Die Atemnot
nimmt zu und im Röntgenbild erscheinen beidseitige schleierartige Verschattungen der
Lungenfelder infolge Ausdehnung des Ödems in das alveoläre Interstitium.
Die Lungen sind makroskopisch dunkel, rötlich-blau und schwer (Abb. 10) – mit einem
Gewicht von 1000g und mehr. Die Schnittfäche zeigt ein hämorrhagisches Ödem
(Hasleton und Roberts, 1999).
Abb. 10: Links: makroskopisches Bild einer blutreichen Lunge bei ARDS; Mitte und rechts: histologisches Bild bei ARDS mit Ausbildung hyaliner Membranen, eines intravasalen Ödems und blutgefüllter Kapillaren
Nach ca. einer Woche beginnt die irreversible Phase des ARDS, die durch eine
sklerosierende Alveolitis bedingt ist. Die alveolokapilläre Membran wird reepithelialisiert
bzw. reendothelialisiert. Dadurch verbreitert sich die Alveolenwand und steht – in
Abhängigkeit von ihrer Breite – für den Gasaustausch nicht mehr zur Verfügung.
Zusätzlich zur Diffusionsstörung liegt eine Perfusionsstörung vor, da die Gefäße teilweise
durch Mikrothromben verstopft oder zerstört sind. Hieraus resultiert eine respiratorische
Globalinsuffizienz (Hypoxämie und Hyperkapnie) und eine respiratorische Azidose. Die
Proliferation interstitieller Myofibroblasten trägt einen weiteren Teil zur Fibrosierung bei.
Die Fibrosierung im Bereich der Alveolarwandungen ist im Röntgenbild anhand einer
kontinuierlichen Zunahme einer streifig-netzförmigen und reiserartigen Eintrübung und
Verdichtung der Lungen abzulesen (Müller und Grundmann, 1980).
Kapitel 1 – Einleitung 31 Die Lungen sind in diesem Stadium solide, fleischig und rötlich-grau (Hasleton und
Roberts, 1999).
Aus den beschriebenen Veränderungen ergeben sich verschiedene Befunde auf zellulärer
und subzellulärer Ebene (Abb. 11):
Das ARDS resultiert letztendlich aus der endothelialen Dysfunktion, die sich in
pulmonalen Mikrogefäßen entwickelt und in die vor allem Endothel-Leukozyten-
Interaktionen – insbesondere die Rekrutierung der zirkulierenden Leukozyten vom
Gefäßlumen in die Lungenalveolen – involviert sind (Carden et al., 1993; Grau et al., 1996;
Moss et al., 1996; Orfanos et al., 2004; Xiao et al., 1997).
Das Lungenendothel und dessen Permeabilität haben großen Anteil an der Entwicklung des
ARDS (Donnelly et al., 1994). Die Endothelzellauskleidung der Lungengefäße bildet
zwischen Blut und Interstitium eine semipermeable Barriere, welche beim ARDS zu
Schaden kommt, was wiederum zu einer gesteigerten Permeabilität mit Bildung eines
Ödems führt (Lewis und Martin, 2004; Matthay et al., 2003; Orfanos et al., 2004).
Die Schädigung der Endothelbarriere führt vor allem zu einer veränderten Zell-Zell-
Adhäsion. Diese ist der initiale Schritt für die Leukozytenmigration, die ihrerseits die
Permeabilität weiter verstärkt, sowie für den Durchtritt proteinreicher Flüssigkeit ins
Interstitium (Hasleton und Roberts, 1999). Dieser Prozess geschieht z. B. durch die
Hochregulation der endothelialen, aber auch leukozytären, Adhäsionsmoleküle (Adams
und Shaw, 1994). So aktiviert beispielsweise LPS Endothelzellen mit konsekutiver
Expression von Adhäsions- und Signal-Molekülen und lokaler PMN-Akkumulation (Hogg
und Doerschuk, 1995). Auch E-selectin, vWf und ICAM-1 sind bei ARDS-Patienten
erhöht (Moss et al., 1996). Adhäsionsmoleküle nehmen somit in der Pathogenese des
ARDS eine zentrale Stellung ein (Agouridakis et al., 2002).
Der Leukozyten-vermittelte Gewebeschaden ist eine Hauptkomponente des ARDS
(Bevilacqua, 1993; Bhatia et al., 2000; Weinacker und Vaszar, 2001). Die Aktivierung
zirkulierender Neutrophiler, die Adhäsion an und die Migration der Neutrophilen durch die
Oberfläche der Endothelzellschicht repräsentieren wichtige Schritte der Zellaktivierung, in
den Veränderungen der Endothelpermeabilität sowie in der Ausbildung eines pulmonalen
Ödem (Carden et al., 1998; Carden et al., 1993; Grau et al., 1996; Xiao et al., 1997).
Neutrophile reduzieren die endotheliale junktionale Integrität durch die Elastase-
vermittelte Proteolyse junktionaler Proteine wie VE-Cadherin. Im Einklang dazu steht,
dass bei ARDS-Patienten lösliches VE-Cadherin zu finden ist – untersucht an HUVEC von
Carden et al. (1998).
Kapitel 1 – Einleitung 32 Neben Neutrophilen, die eine Schlüsselrolle beim ARDS spielen, sind auch Eosinophile
und Makrophagen mit in die Pathogenese einbezogen (Albelda et al., 1994). Letztere sind
verantwortlich für ALI bei neutropenischen Patienten (Albelda et al., 1994). Die
Aktivierung dieser Zellen beim ARDS führt zu einer massiven Freisetzung von Zytokinen
(Grau et al., 1996), die beim ARDS als Signalmoleküle fungieren und die
inflammatorische Antwort auf lokaler und systemischer Basis initiieren und verstärken
(Bhatia und Moochhala, 2004; Park et al., 2001).
Der zytokininduzierte Zusammenbruch der mikrovaskulären Barrierenfunktion resultiert in
einem Lungenödem, assoziiert mit dem Syndrom des akuten Lungenversagen (Petrache et
al., 2003; Wong et al., 1999). In der Frühphase des ARDS sind verschiedene
inflammatorische Mediatoren in der bronchioloalveolären Lavage erhöht wie z. B.
Endotoxin-bindende Proteine, TNFa, IL-1, IL-6, Chemokine und adhäsive Moleküle
(Agouridakis et al., 2002). Die steigende endotheliale Lungenpermeabilität wird durch die
freigesetzten Zytokine induziert, aber auch andere Agenzien, Thrombin und mechanische
Reizung aktivieren das Endothel ähnlich den Zytokinen (Dudek und Garcia, 2001).
Somit koordinieren Zytokine, v. a. IL-1 und TNFa, sowie Endothelzellen, Leukozyten und
Adhäsionsmoleküle eine Kaskade von Interaktionen zwischen Leukozyten und
Endothelzellen, die in einem Gewebeschaden resultieren.
Abb. 11: Pathogenese des ARDS: Auslösendes Krankheitsereignis – Einwanderung von Zellen und Freisetzung von Zytokinen – Leukozytenaktivierung mit Durchwanderung derselben durch das instabile Endothel –> ARDS (Bhatia und Moochhala, 2004)
Kapitel 1 – Einleitung 33 1.7.3 Klinisches Bild
Charakteristisch für ein ARDS ist der Anstieg der Atemfrequenz gefolgt von in nur
wenigen Stunden auftretender Dyspnoe. Infolge intrapulmonaler Rechts-Links-Shunts
kommt es zu einer schweren (teils therapierefraktären) Hypoxämie mit deutlich reduzierter
Compliance. Auf Grund der peripheren Vasodilatation kommt es zu einem Blutdruckabfall
und evtl. einem Entgleiten in den Schockzustand – verbunden mit Organschäden.
1.7.4 Prognose
Die Letalität beträgt beim ARDS 20 - 30 %. Allerdings variiert die Letalität stark von der
Ätiologie. Alkoholanamnese und vorbestehende Lungenerkrankung sowie Rauchen
verschlechtern die Prognose. Die höchste Letalität (> 80 %) besteht bei einem ARDS durch
septisches Multiorganversagen.
1.7.5 IRDS
Das Atemnotsyndom des Neugeborenen (IRDS; Infant Respiratory Distress Syndrome) ist
eine restriktive Lungenerkrankung, die sich bei unreifen Neugeborenen infolge eines
absoluten oder relativen Surfactantmangels bildet. Das Surfactant (Surface Active Agent)
wird von den Pneumozyten Typ II gebildet und besteht überwiegend aus verschiedenen
Phospholipiden. Es trägt zur Stabilität des Alveolarsystems bei, indem es die
Oberflächenspannung der Alveolen reduziert, sodass sie nicht kollabieren. Beim IRDS
kommt es daher infolge des Surfactantmangels zum Alveolarkollaps in der Expiration, eine
reguläre Atmung des Kindes ist nicht möglich. Durch die versuchte Belüftung entsteht eine
Überdehnung der terminalen Bronchiolen, während die Kapillaren kollabiert bleiben und
Atelektasen ausgebildet werden. Gegebenenfalls treten sekundäre Schäden, z. B. durch
Sauerstofftoxizität, hinzu. Beim IRDS ist – wie auch beim ARDS – das führende
histologische Zeichen die Ausbildung sog. hyaliner Membranen.
Die Behandlung besteht in der Substitution mit natürlichem Surfactant und der
symptomatischen Therapie (Sauerstoffgabe) sowie der Prävention.
Risikofaktoren für die Ausbildung eines IRDS sind Frühgeburt, Diabetes mellitus der
Mutter und Stress während der Entbindung, der zur Azidose des Neugeborenen führt.
Das IRDS hat somit eine vollkommen andere Ätiopathogenese als das ARDS und darf
daher keinesfalls als "ARDS des Neugeborenen" bezeichnet werden.
Kapitel 1 – Einleitung 34
1.8 Endothelzellkulturen
Zellkulturen sind Kulturen lebender Zellen, die aus einem beliebigen Organ isoliert wurden
und sich unter sterilen Bedingungen in geeigneten Nährmedien in vitro durch Mitose
vermehren. Die Zellen werden in speziellen Kulturgefäßen ausgesät, in regelmäßigen
Abständen "geerntet" und in neue Kulturgefäße aufgeteilt. Die Vermehrung der Zellen
erfolgt in hinsichtlich Temperatur, Feuchtigkeit und pH-Wert körpersimulierenden
Inkubatoren, da nur eine "körperähnliche" Umgebung Wachstum und Differenzierung der
Zellen ermöglicht.
Die Verwendung von Gewebe-/Zellkulturen ist seit Beginn des 20. Jahrhunderts
dokumentiert: Harrison glückte 1907 die In-vitro-Kultivierung von Gewebe aus einer
Kaulquappen-Nervenfaser in Froschlymphe. In den frühen 70ern des letzten Jahrhunderts
wurden Methoden zur Kultivierung von Endothelzellen entwickelt.
Zellkulturen, entwickelt als Ersatz für Tierversuche, erlauben die Untersuchung zellulärer
Regulationsmechanismen unter standardisierten Bedingungen. Heute spielen Zellkulturen
u. a. in der Entwicklung und Erforschung von Arzneimitteln eine Rolle: So können anhand
von Zellkulturmodellen molekularpharmakologische Prüfungen durchgeführt werden, die
zum Verständnis der Wirkung von Arzneistoffen und Xenobiotika (= Substanzen wie
Antigene oder Toxine, die den Körper zu Abwehrreaktionen veranlassen) beitragen.
Darüber hinaus kann der Metabolismus und die Biotransformation bestimmter Substanzen
auf der In-vitro-Ebene ermittelt werden, was eine gezielte Planung toxikologischer
Prüfungen ermöglicht. Zellkulturen sind außerdem geeignet, den Wirkungsmechanismus
von Xenobiotica auf molekularer Ebene zu untersuchen (z. B. Enzyminduktion,
Protoonkogenexpression). Durch das Einschleusen von Genen in Zellen kann deren
Funktion analysiert werden. Viren und intrazelluläre Bakterien können ebenfalls mit Hilfe
der Zellkultur untersucht werden. Aus Gewebe isolierte Zellen haben inzwischen klinische
Relevanz in der Zell- und Stammzelltherapie sowie im "Tissue Engineering".
Die Zellkultur stößt allerdings an ihre Grenzen, wenn es darum geht, übergeordnete
systemische Prozesse in Organsystemen oder im Gesamtorganismus zu untersuchen.
Kapitel 1 – Einleitung 35
1.9 LPS
1.9.1 Charakterisierung
Das LPS (Lipopolysaccharid) – auch Endotoxin genannt – ist ein Bestandteil der Zellwand
gramnegativer Bakterien. Chemisch handelt es sich um ein Molekül, das aus Zuckern und
Fettsäuren besteht (Lipopolysaccharid). Es ist in höheren Konzentrationen sehr toxisch und
kann daher als wichtiger Virulenzfaktor aller gramnegativen Bakterien angesehen werden.
Als eine Hauptkomponente in der Pathogenese gramnegativer bakterieller Infektionen
(Morrison und Ryan, 1987) löst es im Menschen eine Vielzahl von Effekten aus wie
Fieber, Entzündung, septischer Schock, Blutdruckabfall oder die Freisetzung zytotoxischer
Botenstoffe. Im Extremfall kann es letal wirken. Im Menschen führt es zur Bildung von
Antikörpern, welche die schädlichen Wirkungen neutralisieren können.
1.9.2 Struktur
Das LPS weist drei Teilkomponenten auf (Abb. 12):
1. Das Lipid A, ein Phosphoglykolipid.
2. Eine relativ konstante Polysaccharid-Kernregion (Core): Die innere Kernregion, die mit
dem Lipid A in Verbindung steht, enthält "ausgefallene" Zucker, sowie drei teils
phosphorylierte Heptosen. Die daran anschließende äußere Kernregion besteht aus fünf
Hexosen.
3. Eine äußere Polysaccharidkette bestehend aus bis zu 25 sich wiederholenden Einheiten
von drei bis fünf verschiedenen Zuckerbausteinen, die von Keim zu Keim sehr variieren.
Diese nach außen ragenden Strukturen des LPS stellen die für die serologische Typisierung
wichtigen Antigene dar (sog. O-Antigene). Korrekt wird nur das Lipid A als Endotoxin
bezeichnet.
Kapitel 1 – Einleitung 36
Abb. 12: Schematische Struktur des LPS bestehend (von innen nach außen) aus Lipid A, Kernregion (mit dem inneren und äußeren Kern) und O-Antigen (Knierim, 2000)
1.9.3 Pathophysiologie
Wenn Gram-negative Bakterien sich vermehren oder sterben wird LPS – und somit Lipid
A – aus der Zellwand freigesetzt. Das Lipid A führt nun mit Hilfe von LBP
(Lipopolysaccharid bindendes Protein) zur Ausschüttung von proinflammatorischen
Zytokinen und Mediatoren aus Granulozyten, Endothelzellen, Lymphozyten, Monozyten
und Makrophagen. Dadurch werden die typischen Endotoxineffekte wie Akut-Phase-
Reaktion, Blutdruckabfall sowie Verbrauchskoagulopathie und Schock induziert. Diese
durch das LPS ausgelöste Kaskade ist entscheidend an der Entstehung der Sepsis beteiligt
(Pugin et al., 1993).
Das Lipopolysaccharid bindende Protein (LBP) ist ein Akut-Phase-Protein, das von
Hepatozyten synthetisiert und ins Blut abgegeben wird (Tobias et al., 1986). Die
Serumkonzentration steigt im septischen Schock an. LBP besitzt eine starke
Bindungsaffinität zu LPS. Niedrig konzentriertes LBP transportiert LPS an den zellulären
LBP-Rezeptor von z. B. Monozyten und Makrophagen und verstärkt so die Wirkung von
Kapitel 1 – Einleitung 37 LPS (Bannerman und Goldblum, 1999; Lamping et al., 1998). Beispielsweise wird
dadurch die Zytokinausschüttung von Monozyten um den Faktor 100 bis 1000 verstärkt.
Eine protektive Funktion von LBP im Bezug auf die Auslösung einer Sepsis wird durch die
Applikation hoher Konzentrationen von LBP erzielt (Lamping et al., 1998). Auch
Lipoproteine hoher Dichte (HDL) können LPS binden und inaktivieren. Bei der Interaktion
zwischen Lipoproteinen und LPS handelt es sich um eine physiologische Reaktion des
Organismus auf bakterielle Endotoxine bei Sepsis (Knierim, 2000).
1.9.4 Funktion
Das Lipopolysaccharid ist eine wichtige Komponente der äußeren Oberfläche von
gramnegativen Bakterien und zugleich ein potenter Aktivator von Zellen des
Immunsystems und des inflammatorischen Systems wie Makrophagen, Monozyten und
Endothelzellen (Heumann et al., 1998). Vor allem die Gefäßendothelzellen und
Makrophagen sind Ziele des LPS und verschiedener Zytokine (Mantovani et al., 1992;
Morrison und Ryan, 1987).
LPS induziert direkt am Endothel verschiedene Reaktionen (Bannerman und Goldblum,
1999): Die Aktivierung des Gefäßendothels durch LPS resultiert in einer endothelialen
Produktion und Sekretion von verschiedenen proinflammatorischen Molekülen
(Leukozytenadhäsionsmolekülen) sowie löslichen Zytokinen und Chemokinen (Morrison
und Ryan, 1987). Dazu gehört die gesteigerte Expression von u. a. Plasminogen Aktivator
Inhibitor Typ 1, IL-1, IL-6, IL-8, Tissue Factor, Zelladhäsionsmolekülen und NO
(Bannerman und Goldblum, 1999; Bauer et al., 2000). Endotoxine können auch die
Produktion und Freisetzung einer Reihe von Mediatoren wie Anaphylatoxine,
Prokoagulanzien, Interleukine, Leukotriene, Prostaglandine, Platelet Activating Factor,
TNF und Interferon induzieren (Morrison und Ryan, 1987). LPS aktiviert somit multiple
Mediatorsysteme, die zusammen mit ihren Nebenprodukten die Endothelzellfunktion
beeinflussen können (Bannerman und Goldblum, 1999).
LPS kann direkt und indirekt die Oberflächenexpression der Adhäsionsmoleküle – und
damit auch die Leukozytenadhärenz an der Endothelzelloberfläche – steigern (Bannerman
und Goldblum, 1999). Es interagiert direkt mit den Endothelzellen und führt über den
Verlust der endothelialen Barrierefunktion (in vivo und in vitro) und die Disruption der
Monolayerintegrität zu einer endothelialen parazellulären Transmigration (Bannerman und
Goldblum, 1999; Bannerman et al., 1998; Goldblum et al., 1994; Goldblum et al., 1993;
Szabo et al., 1998). Dies wurde in mikro- und makrovaskulären Endothelzellen für
Kapitel 1 – Einleitung 38 verschiedene Tierspezies sowie den Menschen nachgewiesen (Bannerman und Goldblum,
1999).
1.9.5 Bedeutung im Hinblick auf die Sepsis
Pathogenetisch von großer Bedeutung für die Entwicklung eines ARDS ist die
Endotoxämie (Meyrick et al., 1995). Die gramnegative Komponente, die für die
Endothelzellschädigung bei gramnegativer Sepsis verantwortlich ist, ist das LPS
(Bannerman und Goldblum, 1999; Bannerman et al., 1999). Dessen systemische
Freisetzung kann Lungenzellen schädigen und zu den pathomorphologischen Zeichen
eines ARDS mit steigender Kapillarpermeabilität, Leukozyteninfiltration, mikrozirkulärer
Stase und disseminierter intravasaler Gerinnung führen (Lehr und Arfors, 1994; Ulevitch et
al., 1975).
Das klinische Syndrom des septischen Schocks resultiert allerdings aus den kombinierten
Effekten der Mediatoren, die LPS-induziert u. a. vom Endothel und Makrophagen
freigesetzt werden (Morrison und Ryan, 1987).
Die Verabreichung von LPS an Tiere zeigt Endothelzellveränderungen wie bei Gram-
negativer Sepsis (Ulevitch et al., 1975). In Übereinstimmung mit klinischen
Beobachtungen an Sepsispatienten wurde in zahlreichen Tiermodellen beschrieben, dass
die Injektion von Endotoxin in einer Aktivierung und Adhäsion von Leukozyten an
Endothelzellen mit konsekutiver Transmigration und Gewebeschädigung resultiert (Lehr et
al., 2000).
Die Freisetzung von LPS bedingt also systemische Veränderungen, die in schweren Fällen
zum septischen Schock führen können (Haimovitz-Friedman et al., 1997; Heumann et al.,
1998; Morrison und Ryan, 1987; Opal und Cohen, 1999).
Eine zentrale Rolle beim septischen Schock spielt die Endothelzelldysfunktion
(Bannerman et al., 1998). LPS induziert über PTKs und Caspasen eine gesteigerte
Tyrosinphosphorylierung mit darausfolgendem Zerreißen von Zonulae Adhärentes-
Proteinen und damit eine Barrieredysfunktion sowie das Auseinanderweichen von
Endothelzellen (Abb. 13) (Bannerman et al., 1998). Bei LPS-exponierten Endothelzellen
kommt es dosis- und zeitabhängig zur Spaltung der Komponenten des Cadherin-Catenin-
Komplexes β- und γ-Catenin. Die anderen Komponenten des Komplexes, Cadherin, α-
Catenin und p120, bleiben intakt (Bannerman et al., 1998). Die Endothelzellen adhärieren
an der betroffenen Stelle nicht mehr aneinander und auch die Verbindung zum Zytoskelett
ist nicht mehr länger gegeben.
Kapitel 1 – Einleitung 39 Der resultierende Endothelschaden steuert zur Entwicklung eines Multiorganschadens –
einschließlich ARDS – bei (Bannerman und Goldblum, 1999; Faure et al., 2001).
LPS induziert auch eine disseminierte endotheliale Apoptose, die zum endotoxischen
Schock führt (Bannerman et al., 1998; Haimovitz-Friedman et al., 1997).
Des Weiteren besteht eine Synergie zwischen LPS und IFNγ bei der Induktion von mit
gramnegativer Sepsis assoziiertem Schock (Faure et al., 2001).
Abb. 13: Schema der LPS-induzierten Spaltung des Endothelmonolayers: LPS induziert über PTKs und Caspasen eine gesteigerte Tyrosinphosphorylierung –> Spaltung von Cadherin-Adhäsionen mit Barrieredysfunktion durch Auseinanderweichen von Endothelzellen (Bannerman et al., 1998)
Kapitel 1 – Einleitung 40
1.10 TNFα (TNF-alpha)
1.10.1 Charakterisierung
TNFα ist ein Mitglied der Familie der Zytokine, die die Expression von Akute Phase
Proteinen in der Leber induzieren. Ursprünglich wurde TNFα auf Grund seiner starken
Toxizität gegen Tumorzellen identifiziert und danach benannt (Carswell et al., 1975). Es
gibt verschiedene Synonyme für TNFα (Cachectin, Nekrosin, Haemorragic Factor,
Endogenous Pyrogen), die die zahlreichen Funktionen von TNFα widerspiegeln.
Das menschliche TNFα Gen liegt auf dem kurzen Arm des Chromosoms 6. Das komplette
Genprodukt ist ein nicht-glykosyliertes Protein, das aus 157 Aminosäuren besteht. TNFα
formt Dimere und Trimere.
1.10.2 Expression
TNFα wird von verschiedenen Zelltypen produziert. Die wichtigsten Zellen sind
Monozyten, Fibroblasten und Endothelzellen. Auch Makrophagen, T- und B-
Lymphozyten, neutrophile Granulozyten, glatte Muskelzellen, Chondrozyten,
Osteoblasten, Mastzellen, Gliazellen und Keratinozyten produzieren in stimuliertem
Zustand TNFα. Menschliche Milch enthält ebenfalls TNFα. Physiologische Stimuli für die
Synthese von TNFα sind IL-1, IL-2, Interferone, GM-CSF, Substanz P, Bradykinin,
Immunkomplexe, bakterielle Endotoxine (LPS), virale Infektionen, PDGF,
Cyclooxygenaseinhibitoren, PAF (Platelet Activating Factor), Histogranin und Oncostatin
M. In Endothelzellen und Fibroblasten kann auch durch IL-17 die TNFα -Synthese
induziert werden. TNFα kann abhängig vom Zelltyp seine eigene Synthese fördern oder
inhibieren. Die Produktion von TNFα wird durch IL-6, Vitamin D3, Prostaglandin E2,
Dexamethasone, Cyclosporin A und Antagonisten des PAF gehemmt.
1.10.3 Rezeptoren
Es existieren zwei verschiedene Rezeptoren (R): Der 55 kDa TNF-R1 (p55) und der 75
kDa TNF-R2 (p75). Sie werden auf allen somatischen Zelltypen mit Ausnahme von
Erythrozyten exprimiert. p55 wird auf Zellen exprimiert, die für die zytotoxische
Komponente von TNFα empfänglich sind. Daher spielt er eine nennenswerte Rolle in der
Abwehr von Mikroorganismen und ihren pathogenen Faktoren. p75 ist vor allem auf
Zellen myeloischen Ursprungs nachzuweisen, z. B. stimulierten T- und B-Lymphozyten.
Daraus ergeben sich die verschiedenen Funktionen von TNFα auf unterschiedlichen
Zelltypen. Interferon-α, -β und -γ induzieren die Expression der TNFα Rezeptoren.
Kapitel 1 – Einleitung 41 1.10.4 Funktionen
TNFα führt bei Tumoren zur Zytolyse und Zytostase von Tumorzellen (u. a. durch
Apoptose). Es steigert die Phagozytose und Zytotoxizität der Neutrophilen. Durch eine
Interaktion mit dem p55-Rezeptor kann TNFα Gefäßschäden an Endothelzellen induzieren
und so Tumorgefäße zerstören (Ferrero et al., 2004).
In vielen Zellen wie z. B. Fibroblasten, Makrophagen, Leukozyten oder Fettzellen führt
TNFα zur Induktion verschiedenster Prozesse.
Am Endothel wirkt TNFα oft zusammen mit IL-1. Hier hat es Einfluss auf die
Antikoagulation und Thrombose (Mantovani et al., 1997; Morrison und Ryan, 1987). Es
hemmt des Weiteren das Endothelzellwachstum in vitro und fördert die Angiogenese in
vivo. TNFα und IL-1 induzieren die Produktion von Prostaglandinen, Platelet-Activating-
Factor (PAF) und NO in Endothelzellen (Mantovani et al., 1997).
TNFα ist der bedeutendste Mediator der Wirtsabwehr gegen gramnegative Bakterien und
Parasiten. Es ist verantwortlich für verschiedene Reaktionen des Organismus bei
gramnegativer Sepsis:
1. TNFα induziert die Synthese neuer Oberflächenrezeptoren auf Endothelzellen.
Über den Rezeptor p55 führt es zu einer gesteigerten Expression der Zelladhäsions-
moleküle E-Selectin, VCAM-1 und ICAM-1 in HUVEC (Bevilacqua, 1993; Bevilacqua et
al., 1987; Rival et al., 1996). Die durch TNFα gesteigerte Expression von
Adhäsionsmolekülen (Jersmann et al., 2001) mit konsekutiver Zunahme der
Leukozytenadhäsion geht mit einer gesteigerten Permeabilität einher (Shaw et al., 2001a).
2. TNFα aktiviert Leukozyten, die nun Mikroorganismen leichter zerstören können.
3. TNFα stimuliert das Endothel, die mononukleären Phagozyten und andere Zelltypen zur
Produktion von Zytokinen (Hasleton und Roberts, 1999) und Chemokinen (Mantovani et
al., 1997). Zytokine sind essentielle Komponenten der eigenen Abwehr während
Verletzung, Entzündung und Immunantwort (Shaw et al., 2001a). Sie führen durch
Veränderungen in der Mikrovaskulatur über NO und Prostaglandine und durch eine
Induktion von Adhäsionsmolekülen und chemotaktischen zell- und gewebsspezifischen
Zytokinen zu einer Einwanderung der Leukozyten in die Lungen – bedingt durch
Chemotaxis, nachfolgende Endotheladhärenz und schließlich Transmigration (Hasleton
und Roberts, 1999; Mantovani et al., 1992).
TNFα ist eines der Zytokine, die NF κ-B (Nuclear Factor Kappa-B) aktivieren. NF κ-B ist
ein wichtiger Transkriptionsfaktor für die maximale Expression vieler Zytokine, die in die
Pathogenese von Entzündungskrankheiten involviert sind. NF κ-B ist auch an der
Kapitel 1 – Einleitung 42 Pathogenese des ARDS beteiligt und eine wichtige Teilkomponente bei der neutrophilen
Entzündungsreaktion (Hasleton und Roberts, 1999).
4. TNFα schützt die Zellen – ähnlich den Interferonen – gegen Viren.
5. TNFα induziert Fieber durch Freisetzung von IL-1 aus Makrophagen und wirkt auch
selbst pyrogen (Morrison und Ryan, 1987).
6. TNFα hemmt die Lipoproteinlipase in Adipozyten (klinisches Bild: Kachexie).
7. TNFα bildet bei einer akuten bakteriellen Infektion Akute Phase Proteine in der Leber.
8. TNFα hat Fibroblasten, Monozyten und Osteoklasten als Zielzellen bei Rheumatoider
Arthritis.
9. TNFα steuert die komplizierten Interaktionen zwischen verschiedenen Zellpopulationen.
So koordinieren beispielsweise Zytokine, vor allem IL-1 und TNFα, sowie Endothelzellen,
Leukozyten und Adhäsionsmoleküle, eine Kaskade von Interaktionen zwischen
Leukozyten und Endothelzellen. Dies resultiert schlussendlich in einem Gewebeschaden
(Agouridakis et al., 2002).
1.10.5 Bedeutung im Hinblick auf ARDS und Sepsis
TNFα wird als einer der Hauptmediatoren des septischen Schocks angesehen (Cohen,
2002; Putensen und Wrigge, 2000). Im Einklang damit steht, dass die zirkulierenden
TNFα-Level beim septischen Schock und dessen Vorstufen erhöht sind.
TNFα trägt wesentlich zur Endothelzellaktivierung und Barrierendysfunktion beim ARDS
bei, die von großer Bedeutung bei diesem Krankheitsbild sind:
In kultiviertem Endothel wurde gezeigt, dass inflammatorische Zytokine wie z. B. TNFα
und andere Gram-negative bakterielle Endotoxine das Endothel aktivieren (Bevilacqua et
al., 1985; Gamble et al., 1985; Petrache et al., 2003; Rival et al., 1996; Romer et al., 1995;
Schleimer und Rutledge, 1986). Die Endothelzellaktivierung führt über die Expression von
Adhäsionsmolekülen zur Anhaftung von Blutleukozyten an das Endothel (Bevilacqua et
al., 1985; Gamble et al., 1985; Rival et al., 1996; Schleimer und Rutledge, 1986) und über
den Verlust der Barrierenfunktion (Barrierendysfunktion) mit der Folge einer gesteigerten
Endothelzellpermeabilität zur Rekrutierung der Leukozyten in das umgebende Gewebe
und Bildung eines Lungenödems (Bevilacqua, 1993; Bevilacqua et al., 1987; Cohen, 2002;
Petrache et al., 2003; Rival et al., 1996; Schleimer und Rutledge, 1986; Shaw et al.,
2001a).
TNFα hat insbesondere einen großen Einfluss auf die VE-Cadherin-Expression und damit
die Endothelpermeabilität: Über die Tyrosinphosphorylierung von VE-Cadherin induziert
es die Verminderung von VE-Cadherin an den interzellulären Junktionen und führt damit
Kapitel 1 – Einleitung 43 zu interzellulären Lückenformationen (Petrache et al., 2003). Zu einer Reduktion von VE-
Cadherin an den interzellulären Zelljunktionen führen auch das Zusammenspiel von IFNγ
und TNFα (Rival et al., 1996), sowie die Adhäsion von polymorphkernigen Leukozyten
(PMN) an TNFα -stimulierte Endothelzellen (Allport et al., 1997; Del Maschio et al.,
1996). In Abwesenheit von Neutrophilen bleibt der VE-Cadherin/Catenin-Komplex an
TNFα-aktivierten Endothelzellen hingegen intakt (Allport et al., 1997). Die alleinige
Stimulation der Endothelzellen mit TNFα verändert nach Allport et al. (1997) die VE-
Cadherin- und die Cateninverteilung somit nicht.
Diese These wurde in anderen Experimenten widerlegt: In HUVEC induziert TNFα einen
Verlust von VE-Cadherin von den interzellulären Junktionen, verbunden mit
Veränderungen am Aktin-Zytoskelett (Wojciak-Stothard et al., 1998). TNFα löst die mit
einer Spaltung von VE-Cadherin assoziierte Leukozytenadhäsion entweder direkt oder
indirekt über eine Kaskade, einhergehend mit der aktinomyosin-vermittelten Kontraktion
von Stressfasern, aus (Wojciak-Stothard et al., 1998).
Durch diese Vorgänge wird die VE-Cadherin vermittelte Zell-Zell-Adhäsion gestört und
die Passage von Blutmakromolekülen und Zellen ins Interstitium gefördert (Wong et al.,
1999). Diese Veränderungen, die mit einer ansteigenden Endothelzell-Monolayer-
Permeabilität bzw. einer steigenden alveolar-kapillären Membranpermeabilität assoziiert
sind, werden durch TNFα wie auch durch Leukozytenaktivierung, Proteasen, freie
Radikale und Zytokine wie IFNγ induziert (Friedl et al., 2002; Hofmann et al., 2002;
Lampugnani et al., 1992; Minagar et al., 2003; Nwariaku et al., 2002; Petrache et al., 2003;
Rival et al., 1996; Shaw et al., 2001a; Wojciak-Stothard et al., 1998; Wong et al., 1999).
TNFα ist somit ein wichtiger Mediator des akuten Lungenschadens (Hasleton und Roberts,
1999). Für einen Zusammenhang zwischen TNFα und der Pathophysiologie der Sepsis
spricht auch, dass erhöhte Konzentrationen der proinflammatorischen Zytokine wie TNFα
und IL-1 in der BAL (bronchioloalveolären Lavage) und im Plasma von ARDS-Patienten
gefunden wurden (Agouridakis et al., 2002; Meduri et al., 1999). Dementsprechend
wurden auch erhöhte TNFα-Serumkonzentrationen bei Patienten mit Sepsis bzw.
Meningokokkenmeningitis und nach Infusion von E. coli-Endotoxin nachgewiesen.
1.10.6 Klinische Bedeutung
TNFα kommt bei Tumorpatienten (TNFα attackiert maligne Zellen), bei
therapieresistentem M. Crohn (TNFα-Antikörper) und rheumatischen Erkrankungen zum
Einsatz.
Kapitel 1 – Einleitung 44 1.11 IFNγ (Interferon-gamma)
1.11.1 Interferone
Interferone sind Proteine, die von den Zellen des Immunsystems als Antwort auf Viren,
Bakterien, Parasiten und Tumorzellen gebildet werden. Beim Menschen sind drei große
Interferon-Klassen bekannt: 1. Typ I Interferon (= Interferon α, β, ω, ε, κ, τ und δ), 2. Typ
II Interferon (= Interferon γ), 3. Typ III Inferferon (= Interferon λ).
1.11.2 Aufbau
Das IFNγ-Gen liegt auf Chromosom 12. Das Molekül ist ein Homodimer mit kompliziert
miteinander verlinkten Untereinheiten (Abb. 14). Jede Untereinheit besteht aus sechs α-
Helices sowie wenigen β-Faltstrukturen.
Der IFNγ-Rezeptor ist wie IFNγ ein Homodimer. Er ist auf der Zelloberfläche von T- und
B-Lymphozyten, Makrophagen, NK-Zellen und Fibroblasten lokalisiert. Durch
verschiedene Phosporylisierungsvorgänge kommt es zu einer erhöhten IFNγ-
Transkription.
Abb. 14: IFNγ-Homodimer Glykoprotein Struktur (zylinderförmige α-Helices mit farblicher Darstellung der beiden Untereinheiten)
Kapitel 1 – Einleitung 45 1.11.3 Funktion
IFNγ ist in die zell-vermittelte Regulation der Immun- und Entzündungsantwort – vor
allem auf Viren und Mykobakterien – involviert. Es wird von NK-Zellen, dendritischen
Zellen, zytotoxischen Zellen, TH0-Zellen und TH1-Zellen produziert (Morrison und Ryan,
1987).
Durch die vermehrte IFNγ-Synthese als Antwort auf Infektionen mit Mykobakterien und
Viren kommt es zu einer Verstärkung der Zytokinfunktion. In Konjugation mit Zytokinen
wie CD40 bindet IFNγ an Makrophagen und aktiviert diese (Morrison und Ryan, 1987),
die daraufhin in der Lage sind, Viren zu phagozytieren und damit zu eliminieren. IFNγ
erhöht die Produktion von MHCI und MHCII in Makrophagen (Mantovani et al., 1997;
Mantovani et al., 1992). Außerdem stimuliert es die Makrophagen zur Abtötung von
Bakterien.
Des Weiteren werden durch die unspezifische antivirale Aktivität die Ausbreitung von
Viren und die Virusreplikation gehemmt. Dadurch werden die Zellen – ohne zerstört zu
werden – vom Virus "befreit".
IFNγ fördert die Zelldifferenzierung von der Progenitor Zelle TH0 zu TH1-Zellen und
hemmt die Differenzierung in TH2-Zellen. Auch der Isotypenwechsel ("Switch") bei den
B-Zellen hin zu IgG wird vorangetrieben.
Zusätzlich spielt IFNγ eine Rolle bei der Vermittlung der Hypersensitivität.
IFNγ aktiviert des Weiteren vaskuläre Endothelzellen, fördert die Lymphozytenadhäsion
und weitere morphologische Veränderungen, die die Extravasation der Lymphozyten
ermöglichen. IFNγ rekrutiert zudem Leukozyten im Entzündungsgebiet und fördert damit
die Entzündungsreaktion.
1.11.4 Regulation
Für den Abbau von IFNγ und die Beendigung der Synthese gibt es zwei sich selbst
regulierende Wege: 1. Reduktion der Halbwertszeit der mRNA von IFNγ (bei Vorkommen
bestimmter Sequenzen auf der mRNA), 2. Transkription von IFNγ und eines weiteren
Proteins, dass die mRNA abbaut, durch aktivierte T-Zellen.
Durch das negative Feedback führt das aktivierende Signal für eine gesteigerte IFNγ-
Produktion gleichzeitig zur Senkung des IFNγ auf die Normalkonzentration.
Störungen in diesem System führen somit u. a. zu einem erhöhten Risiko viraler und
bakterieller Infektionen.
Kapitel 1 – Einleitung 46 1.11.5 Bedeutung im Hinblick auf die Sepsis
Während einer inflammatorischen Immunantwort nimmt das Endothel der postkapillären
Venolen des Systemkreislaufs – in der Lunge das Endothel der Kapillaren – an der
Rekrutierung zirkulierender Leukozyten durch Expression von Adhäsionsmolekülen sowie
der Sekretion von Chemokinen und Zytokinen teil (Wong et al., 1999).
IFNγ ist wie TNFα ein Zytokin, das an der körpereigenen Abwehrreaktion auf
Verletzungen und Entzündungsreize sowie der Immunantwort mitbeteiligt ist (Shaw et al.,
2001a). Die Behandlung kultivierter Endothelzellen mit inflammatorischen Zytokinen wie
IFNγ aktiviert das Endothel (Rival et al., 1996; Romer et al., 1995). Das führt u. a. zur
gesteigerten Expression von Zelladhäsionsmolekülen wie ICAM-1 (Dustin et al., 1986;
Mantovani et al., 1992) und E-Selectin (zusammen mit TNFα) (Bevilacqua, 1993). Die
Expression von Adhäsionsmolekülen und anderen Zytokinen (Morrison und Ryan, 1987)
erleichtert und unterstützt die Chemotaxis, Endotheladhärenz (Rival et al., 1996) und
Transmigration der Leukozyten in das Lungengewebe.
Gerade im Hinblick auf die Sepsis nehmen IFNγ und TNFα ähnliche Funktionen wahr
bzw. ergänzen sich: Die proinflammatorischen Zytokine IFNγ und TNFα aktivieren lokal
das Endothel, induzieren eine Leukozytenakkumulation durch eine erhöhte Expression und
Neuverteilung von Zelladhäsionsmolekülen und steigern die Endothelzellpermeabilität
(Bevilacqua, 1993; Rival et al., 1996; Shaw et al., 2001a).
TNFα und IFNγ vermindern die Intensität von VE-Cadherin und Cateninen an den
interzellulären Endotheljunktionen (Rival et al., 1996; Wong et al., 1999). Dies führt zu
einer Permeabilitätssteigerung (Wong et al., 1999). Da VE-Cadherin die Barrierenfunktion
des Endothels durch die Bildung interzellulärer Junktionen aufrecht erhält, kann der
Verlust von VE-Cadherin den Durchtritt von Blutbestandteilen, Zellen und Flüssigkeit
durch das Endothel nicht hemmen (Wong et al., 1999). IFNγ und TNFα – sowie
Leukozytenaktivierung, Proteasen, freie Radikale und weitere Zytokine – führen zu einer
höheren alveolar-kapillären Membranpermeabilität (Rival et al., 1996; Nwariaku et al.,
2002).
IFNγ steigert sowohl alleine als auch zusammen mit TNFα die Durchlässigkeit der Gefäße
für Zellen und Flüssigkeiten (Shaw et al., 2001a). Es hat somit großen Einfluss auf die
Expression von VE-Cadherin und die Gefäßpermeabilität. Dies ist für die Ausbildung eines
septischen Prozesses von Bedeutung.
Kapitel 1 – Einleitung 47
1.12 Fragestellung
In der vorliegenden Arbeit wurden die endotheliale Expression des Zelladhäsionsmoleküls
VE-Cadherin in formalin-fixiertem humanem Lungengewebe und die Expression von VE-
Cadherin in Zellkulturen untersucht.
VE-Cadherin ist ein kalziumabhängiges Zell-Zell-Adhäsionsmolekül, das an den lateralen
Zelljunktionen lokalisiert ist (Burns et al., 2003; Gao et al., 2000; Sandoval et al., 2001;
Schnittler et al., 1997; Stevens et al., 2000; Tiruppathi et al., 2002). Die auf die
endothelialen Zellgrenzen beschränkte Lokalisation von VE-Cadherin unterscheidet es von
den anderen Cadherinen (Lampugnani et al., 1992). Auf Grund dieser Lokalisation ergeben
sich für das Molekül Funktionen wie die Aufrechterhaltung der Integrität des endothelialen
Zellverbandes (Allport et al., 1997; Breviario et al., 1995; Burns et al., 2003; Dejana et al.,
1995; Gotsch et al., 1997; Gulino et al., 1998; Lampugnani et al., 1992; Del Maschio et al.,
1996; van Wetering et al., 2002) und die Regulation der Gefäßpermeabilität (Angst et al.,
2001; Breviario et al., 1995; Burns et al., 2003; Corada et al., 2001; Corada et al., 1999;
Dejana et al., 1999; Gao et al., 2000; Haselton und Heimark, 1997; Hordijk et al., 1999;
Iyer et al., 2004; Kevil et al., 1998; Lampugnani et al., 1995; Lampugnani et al., 1992;
Lum und Malik, 1996; Navarro et al., 1995; Stevens et al., 2000). Ein Verlust von VE-
Cadherin an den Endothelzelljunktionen führt dementsprechend zu einer Lockerung des
Zellverbandes mit Bildung von Lücken und einer gesteigerten Gefäßpermeabilität (van
Buul et al., 2002; Corada et al., 1999; Ferrero et al., 2004; Gotsch et al., 1997; Gulino et
al., 1998; Hordijk et al., 1999; Liao et al., 2002; Lim et al., 2001; Del Maschio et al., 1996;
Nwariaku et al., 2002; Pellegrino et al., 2004; Sandoval et al., 2001; Tinsley et al., 1999;
Wong et al., 1999). Die gesteigerte Gefäßpermeabilität ermöglicht flüssigen und festen
Blutbestandteilen sowie Leukozyten aus dem Blut ins umliegende Gewebe überzutreten
und führt damit zu einem Ödem (Corada et al., 1999; Gotsch et al., 1997; Hordijk et al.,
1999; Del Maschio et al., 1996; Nwariaku et al., 2002; van Wetering et al., 2002).
Die Bedeutung von VE-Cadherin bezüglich der Endothelintegrität und der
Gefäßpermeabilität wurde durch Inhibitionsversuche bewiesen: Die Blockierung von VE-
Cadherin mit dem Antikörper c175 bzw. dem Antikörper BV13 führte zu einer
gesteigerten endothelialen Endothelpermeabilität, begleitet von einer diffusen Verteilung
von VE-Cadherin an den Zellgrenzen (Corada et al., 2002; Corada et al., 1999; Hordijk et
al., 1999; Liao et al., 2002). In weiteren Studien mit Antikörpern gegen VE-Cadherin
wurde die Neutrophilenmigration beschleunigt und die Gefäßpermeabilität gesteigert
Kapitel 1 – Einleitung 48 (sowohl in vivo als auch in vitro), begleitet von einer verminderten Expression von VE-
Cadherin an den Zellgrenzen (Albuquerque und Flozak, 2002; Corada et al., 1999; Gotsch
et al., 1997; Gulino et al., 1998; Hordijk et al., 1999; Liao et al., 2002). Diese
Untersuchungen wurden an Zellen und Geweben unterschiedlicher Spezies, einschließlich
des Menschen, vorgenommen.
Aus den Untersuchungen kann man schließen, dass der Verlust der Zell-Zell-Kontakte
einhergehend mit Lückenbildung und ansteigender Permeabilität durch eine Veränderung
der Verteilung des Adhäsionsmoleküles VE-Cadherin bedingt ist (Pellegrino et al., 2003).
Die Kontrolle der VE-Cadherin vermittelten endothelialen Zell-Zell-Adhäsion ist bei
pathophysiologischen Prozessen wie Entzündung, Ödem und Tumorangiogenese wichtig.
Bei diesen Vorgängen ist die endotheliale Integrität, die stark von der Funktion des VE-
Cadherins abhängt, geschwächt (Nwariaku et al., 2002; van Wetering et al., 2002). Zu den
entzündlichen Vorgängen gehört auch das ARDS (Acute Respiratory Distress Syndrome),
bei dem Ödembildung und Leukozytenextravasation im Vordergrund stehen – vermittelt
über die gesteigerte Endothelpermeabilität.
Bisher liegen keine veröffentlichten Untersuchungen zur VE-Cadherin-Antigenexpression
entlang der humanen Lungenstrombahn vor. Da bisher auch noch keine Studien zum
Zusammenhang zwischen der Pathogenese des ARDS und der Expression von VE-
Cadherin im menschlichen Lungengewebe publiziert sind, ergeben sich folgende
Fragestellungen:
Liegt für das VE-Cadherin eine homogene oder heterogene Antigenexpression entlang der
humanen Lungenstrombahn vor, wie sie für andere Endothelmarker wie z. B. für vWf, E-
Selectin, VCAM oder ACE beschrieben ist (Müller et al., 2004; Müller et al., 2002)?
Wird diese Expression durch physiologische Faktoren wie "Alter" oder "Geschlecht"
beeinflusst bzw. verändert?
Lässt sich eine veränderte pulmonale VE-Cadherin-Antigenexpression bei septisch
bedingtem ARDS nachweisen?
In der vorliegenden Arbeit wurde die Expression des VE-Cadherin-Antigens in
regelrechtem Lungengewebe (gewonnen im Rahmen von Tumorlobektomien und
Probeexzisionen) und in Lungengewebe von Patienten, verstorben an einem durch
gramnegative Sepsis verursachten ARDS, immunhistochemisch untersucht,
mit den Zielen
Kapitel 1 – Einleitung 49
1. Charakterisierung der Antigenverteilung von VE-Cadherin in der humanen
Lungenstrombahn im Hinblick auf eventuelle Unterschiede zwischen den einzelnen
Gefäßtypen.
2. Vergleich der endothelialen VE-Cadherin-Antigenexpression zwischen Proben von
lungengesunden Patienten und Patienten mit septisch bedingtem ARDS.
3. Vergleich der endothelialen VE-Cadherin-Antigenexpession in humanem
Lungengewebe unter den Gesichtspunkten Geschlecht, Alter und Zeitspanne
zwischen Todeseintritt und Obduktionszeitpunkt.
Gleichzeitig wurde überprüft, ob – und wenn ja in wie weit – endotheliale Zellkulturen ein
geeignetes Modell darstellen, die in situ gefundenen Beobachtungen unter standardisierten
Bedingungen zu überprüfen. Dazu wurden Zellkulturen von HPMEC (Human Pulmonary
Microvascular Endothelial Cells, Modell für mikrovaskuläre pulmonale Endothelzellen)
und HUVEC (Human Umbilical Vein Endothelial Cells, Modell für makrovaskuläre
Endothelzellen) bezüglich der VE-Cadherin-Antigenexpression untersucht. Um den
Einfluss von LPS bei gramnegativer Sepsis bzw. von im Rahmen einer Sepsis freigesetzten
Zytokine zu untersuchen, wurden die Zellkulturen 4 bzw. 24 Stunden mit LPS, TNFα (in
verschiedenen Konzentrationen), IFNγ und einer Kombination aus TNFα plus IFNγ
stimuliert und die Expression des VE-Cadherin-Antigens immunhistochemisch
nachgewiesen.
Die Untersuchung dazu diente
1. dem semiquantitativen Nachweis der VE-Cadherin-Antigenexpression in
unstimulierten sowie mit LPS-, TNFα- und IFNγ-stimulierten Zellkulturen
(HPMEC und HUVEC).
2. der Überprüfung, in wieweit diese Zellkulturen als geeignetes Modell für die
Expression von VE-Cadherin in humanem endothelialen Lungengewebe gelten
können.
Kapitel 2 – Material und Methoden 50
2 Material und Methoden
2.1 Material
2.1.1 Lungengewebe
Untersucht wurden Lungengewebsproben von 78 Patienten. Dabei handelte es sich um
Lungengewebe von 20 an septischem Multiorganversagen verstorbenen Patienten sowie
von 58 Patienten, deren Lungengewebe morphologisch regelrecht war. Es wurde des
Weiteren Lungengewebe von drei Patienten mit IRDS untersucht; diese Proben wurden
aber auf Grund der vom ARDS divergierenden Ätiologie des IRDS nicht in die statistische
Auswertung miteinbezogen.
Die 58 morphologisch regelrechten Proben stammten von 41 Erwachsenen (Alter: 33 - 75
Jahre) und 17 Kindern (Alter: 1 Monat - 12 Jahre). Bei den Proben der Erwachsenen
handelte es sich um tumorfreie Abschnitte von bei Tumorlobektomien entnommenem
Gewebe. Diese Gruppe setzte sich aus 20 Männern (Alter: 34 - 75 Jahre) und 21 Frauen
(Alter: 33 - 74 Jahre) zusammen (Abb. 15 und Abb. 16). Die Proben aus den Kinderlungen
stammten von aus diagnostischen Gründen entnommenen Probeexzisionen. Es handelte
sich um Gewebe von acht Jungen (Alter: 1 Monat - 12 Jahre) und neun Mädchen (Alter: 2
Monate - 9 Jahre) (Abb. 17).
Die Proben der 20 Sepsis-Patienten stammten alle aus Obduktionsgut, davon elf Präparate
aus Obduktionsfällen des Institutes für Pathologie der Ruhr-Universität am Bergmannsheil
und neun weitere aus dem Sektionsgut der Rechtsmedizin Hamburg. Die Gruppe bestand
aus 13 männlichen Patienten (Alter: 3 Monate - 83 Jahre) und sieben weiblichen (Alter: 27
- 74 Jahre) (Abb. 18). In allen Fällen lag ein laborchemisch nachgewiesenes septisches
Multiorganversagen bei mikrobiologisch gesicherter gram-negativer Sepsis vor. Die
Obduktion erfolgte innerhalb von vier Tagen nach Todeseintritt (Abb. 19).
2.1.2 Zellkulturen
Für die Zellkulturen wurden Endothelzellen aus Tumorlobektomiepräparaten und
Nabelschnurgefäßen im Zellkulturlabor der Johannes Gutenberg Universität Mainz
kultiviert.
Kapitel 2 – Material und Methoden 51
Kontrollgruppe Männer
0
20
40
60
80
0 5 10 15 20 25
20 Patienten
Alt
er
[Jah
re]
Abb. 15: Altersverteilung der Männer (Kontrollgruppe)
Kontrollgruppe Frauen
0
20
40
60
80
0 5 10 15 20 25
21 Patientinnen
Alt
er
[Jah
re]
Abb. 16: Altersverteilung der Frauen (Kontrollgruppe)
Kontrollgruppe Kinder
0
5
10
15
0 5 10 15 20
17 Patienten
Alt
er
[Jah
re]
Abb. 17: Altersverteilung der Kinder (Kontrollgruppe)
Kapitel 2 – Material und Methoden 52
Patienten mit ARDS
0
20
40
60
80
100
0 5 10 15 20 25
20 Patienten
Alt
er
[Jah
re]
Abb. 18: Altersverteilung der Patienten mit septisch bedingtem ARDS
4
11
5
< 24 h
24 - 48 h
> 48 h
Abb. 19: Zeitspanne zwischen Todeseintritt und Obduktionszeitpunkt: Obduktion innerhalb von 24 Stunden (4 Patienten), innerhalb von 24 bis 48 Std. (11 Patienten), innerhalb von 48 bis 72 Std. (4 Patienten) und innerhalb von 72 bis 96 Std. (1 Patient)
Kapitel 2 – Material und Methoden 53
2.2 Methoden
2.2.1 Immunhistochemische Aufarbeitung
2.2.1.1 Vorbehandlung
Von den formalinfixierten, paraffineingebetteten Lungen wurden 3 - 4 µm dicke Schnitte
angefertigt und auf einen speziellen Kapillarspaltobjektträger der Firma DAKO,
Dänemark, aufgezogen. Anschließend wurden die Präparate über Nacht bei 60 °C im
Brutschrank gelagert, damit sie für die anschließende Mikrowellenbehandlung besonders
fest auf dem Objektträger haften und keine Wasserrückstände, die zur Zerstörung des
Präparates während der Hitzedemaskierung führen könnten, verbleiben. Danach erfolgte
die Entparaffinierung in Xylol (drei Mal für fünf Minuten) und die Rehydrierung in einer
absteigenden Alkoholreihe. Die Schnitte wurden anschließend für fünf Minuten in
destilliertes Wasser gestellt.
Da durch Formalinfixierung eine Proteinvernetzung im Gewebe stattfindet, musste eine
hitzeinduzierte Antigendemaskierung vorgenommen werden, damit der Antikörper gegen
VE-Cadherin auch solche Epitope erkennen konnte, die zuvor durch Vernetzungen
maskiert waren.
Für die dafür notwendige Mikrowellenbehandlung wurden die Objektträger in geeignete
Plastikküvetten mit EDTA (pH 8,0) gestellt. Bei 600 Watt erfolgte über fünf mal fünf
Minuten die Erwärmung, wobei darauf zu achten war, dass nach jedem Schritt genügend
EDTA-Puffer in die Küvetten nachgefüllt wurde, damit die Objektträger immer mit Puffer
bedeckt waren. Anschließend kühlten die Schnitte mindestens fünf Minuten aus, wurden
dann noch mal fünf Minuten in TbS-Puffer (pH 7,4) gespült und dann in PBS eingestellt.
Die endogene Peroxidase findet sich hauptsächlich in Granulozyten, Mastzellen,
Makrophagen und Erythrozyten, aber auch in Dünndarmgewebe und Nervenzellen. Das
Enzym bildet zusammen mit dem Substratpuffer, H2O2 als Katalysator und dem
Chromogen ein farbiges Endprodukt, das nicht vom Endprodukt der Reaktion mit dem
verwendeten ABC-System mit Peroxidase unterschieden werden kann. Durch Inkubation
der Präparate mit Wasserstoffperoxid vor der eigentlichen Färbung kann die endogene
Peroxidase eliminiert werden.
Das Blockieren der endogenen Peroxidase erfolgte durch eine 30minütige Behandlung in
1,5 ml 30%igem Wasserstoffperoxid auf 50 ml PBS. Nach einem Spülgang mit
Leitungswasser und destilliertem Wasser wurden die Schnitte erneut in PBS gestellt.
Kapitel 2 – Material und Methoden 54 Da die ABC-Methode (POX) angewandt wurde, mussten auch das endogene Avidin und
das endogene Biotin geblockt werden. Für die Blockade des endogenen Avidins und
Biotins wurde das Blocking-Kit benutzt, bestehend aus Lösung A (A für Avidin) und
Lösung B (B für Biotin) in der Verdünnung mit PBS/BSA 1%. Es wurden 100 µl Lösung
auf jeden Objektträger gegeben. Bei Raumtemperatur wurde für 15 Minuten mit Lösung A
und für 15 Minuten mit Lösung B in einer feuchten Kammer inkubiert. Zwischen den
beiden Schritten wurde stets mit PBS gespült.
2.2.1.2 VE-Cadherin-Färbung
Die Färbung zum Nachweis von VE-Cadherin erfolgte mittels der Avidin-Biotin-
Komplex-Methode mit Peroxidase (ABC-Methode (POX)). Diese Methode machte sich
die Affinität von Avidin zu Biotin zu Nutze.
Nach Zugabe von Normalserum, dem Primär-Antikörper und dem Sekundär-Antikörper
wurde der ABC-Komplex hinzugegeben. Letzterer bestand aus einem mit Biotin
markierten (biotinylierten) Brückenantikörper, der an den Sekundär-Antikörper band. An
den Brückenantikörper wiederum band sich der ABC-Komplex, bestehend aus drei
biotinylierten Enzymen, einem Avidin und zusätzlich einem Enzym, in diesem Fall
Peroxidase (Abb. 20). Die Peroxidase gewährleistete schließlich die Substrat-Chromogen-
Reaktion mit DAB.
Abb. 20: Schema der ABC-Methode: Darstellung des Primärantikörpers, des biotinylierten Brückenantikörpers und des ABC-Komplexes (Noll und Schaub-Kuhnen, 2000)
Es wurden jeweils 100 µl Antikörperlösung auf jeden Objektträger gegeben und dieser bei
Raumtemperatur in einer feuchten Kammer für die angegebene Zeit inkubiert. Zwischen
den Inkubationsvorgängen wurde ausgiebig mit PBS gespült, damit nicht bzw.
unspezifisch gebundene Antikörper vom Schnitt heruntergewaschen wurden und eine
nachfolgende spezifische Antikörperbindung gewährleistet werden konnte.
Zuerst wurde für 20 Minuten mit dem Normalserum vom Pferd inkubiert (Verdünnung
1 ml PBS/BSA 1% + 15 µl Normalserum). Das Normalserum wird auch als Non- oder
Kapitel 2 – Material und Methoden 55 Nicht-Immunserum bezeichnet. Es wurde so ausgewählt, dass es keine spezifischen
Antikörper gegen die gesuchten Antigene besaß. Deshalb richtete es sich nach der Spezies,
in der der Sekundär-Antikörper hergestellt wurde, weil "normale" (gesunde) Tiere keine
Autoantikörper bilden. Das Normalserum diente zur Absättigung von elektrostatischen
Ladungen der Proteine im Untersuchungsgut und verhinderte damit unspezifische
Anfärbungen. Auch das BSA (Rinderserumalbumin) erfüllte diese Funktion der
Abdeckung unspezifischer Bindungen. Anschließend wurde nicht mit PBS gespült, denn
sonst wäre der Ausgangszustand des Präparates wieder hergestellt worden und die
unspezifischen Ladungen hätten wieder von Immunglobulinen gebunden werden können.
Es folgte eine einstündige Inkubation mit dem Primärantikörper, in diesem Fall einem
monoklonalen gegen das VE-Cadherin gerichteter Antikörper von der Maus (Verdünnung
1:100 mit PBS/BSA 1%).
Nach dreimaliger Spülung mit PBS für ca. 5 Minuten schloss sich eine Inkubation für 30
Minuten mit dem Sekundär-Antikörper (anti-Maus aus dem Pferd) an.
Nach erneuter fünfminütiger Spülung mit PBS kam die POX-konjugierte ABC-Methode
(Avidin-Biotin-Complex mit Peroxidase konjugiert). Der ABC-Komplex wurde 30
Minuten vor Gebrauch angesetzt, anschließend wurden die Präparate für weitere 30
Minuten inkubiert.
2.2.1.3 Isotypkontrolle
An einem weiteren Präparat erfolgte eine Isotypkontrolle, mit Hilfe derer man
unspezifische Bindungen des Primärantikörpers detektieren kann. Das Präparat wurde wie
oben beschrieben behandelt. Statt des Primärantikörpers wurde aber ein Antikörper
derselben, jedoch nicht-immunisierten Tierart eingesetzt.
2.2.1.4 CD31-Färbung
Die Präparate der Sepsispatienten wurden zusätzlich mit einem Antikörper gegen CD31
gefärbt. Da CD31 spezifisch an Endothelzellen bindet, konnte auf diese Art und Weise die
Reaktivität des Gewebes überprüft werden.
Dieser Umstand kann darauf zurückgeführt werden, dass in normalen und in septischen
Lungen die Arterien, Venen und die prä- und post-Kapillaren mit Endothelzellen
ausgekleidet sind, die mit dem Antikörper gegen PECAM (= CD31) reagieren. Es gibt
keine Expressionsunterschiede für CD31 zwischen den Endothelzellen größerer Gefäße
und der Mikrovaskulatur oder zwischen normalen und septischen Lungen (Müller et al.,
2002).
Kapitel 2 – Material und Methoden 56 2.2.1.5 Farbentwicklung
Zur Farbentwicklung wurde DAB eingesetzt. In 15 ml Tris HCL Puffer (pH 7,4), einer
Tablette DAB und 12 µl Wasserstoffperoxid wurden die Präparate sieben Minuten
entwickelt. Es bildete sich ein brauner unlöslicher Farbkomplex, der durch das Wässern
unter fließendem Leitungswasser und anschließendes Einstellen in Aqua dest. noch in der
Färbung intensiviert wurde.
2.2.1.6 Gegenfärbung
Die Gegenfärbung der Präparate erfolgte in Hämalaun. Gebläut wurde mit Leitungswasser,
anschließend mit Aqua dest. Dann wurden die Schnittpräparate in einer aufsteigenden
Alkoholreihe dehydriert und über Xylol mit Eukitt eingedeckt.
Zusätzlich wurde von allen 78 (und den drei IRDS-) Präparaten eine HE- und ein EvG-
Färbung angefertigt.
2.2.2 Zellkultur
2.2.2.1 Kultivierung humaner pulmonaler mikrovaskulärer Endothelzellen (HPMEC)
Die Kultivierung der HPMEC (Human Pulmonary Microvascular Endothelial Cells)
erfolgte nach der von M. I. Hermanns entwickelten Methode (Hermanns, 1997): Zur
Isolierung des mikrovaskulären Endothels wurde Gewebe aus dem peripheren subpleuralen
Lungenparenchym entnommen und die Pleura abpräpariert. Für ca. zwei Stunden wurde
das Gewebe in einer Transportpufferlösung (Hepes-Puffer 25 mM, Penicillin/Streptomycin
(10U/10 µl/ml)) bei 4 °C gelagert.
Anschließend erfolgte die mechanische Zerkleinerung des Gewebes mit einer Schere.
Danach wurde das Gemisch mit PBS gewaschen, Erythrozyten und Debris wurden mit
einem Netz entfernt.
Es folgten nun mehrere Schritte, in denen das Gewebe mit Dispase (18 U/ml), Elastase
(40 U) und Trypsin (0,05 %) enzymatisch aufgespalten wurde. Die Dispase wirkt
unspezifisch und führt zu einer schonenden Dissoziation des Gewebes. Trypsin und
Elastase wirken sehr viel spezifischer, wobei letztere besonders die elastischen Fasern in
der Extrazellularmatrix der Alveolen verdaut. Es entstand eine Zellsuspension aus
sämtlichen Zellen des peripheren Lungengewebes. Mit Nylonnetzchen wurden
Gewebeklümpchen und größere Zellen herausgefiltert, die Endothelzellen blieben im
Filtrat erhalten. Um eine reine Kultur aus Endothelzellen zu erhalten, reichte dieser Schritt
nicht aus. Zur Herstellung einer Einzelzellsuspension wurden sogenannte
Kapitel 2 – Material und Methoden 57 immunomagnetische Partikel (Beads) eingesetzt. Bei diesen Beads handelt es sich um
kleine Polystyren-Kügelchen mit einem Eisenoxidkern, die mit einem spezifischen
Antikörper konjugiert sind. Der Antikörper und somit das ganze Kügelchen bindet an der
Zielzelle, die das entsprechende Antigen besitzt. Diese Methode funktioniert nur, wenn das
Antigen spezifisch auf den Zellen vorkommt, die isoliert werden sollen. Für die Isolation
der HPMEC wurden CD31 (PECAM-1)-Beads verwendet. Nach Bindung der Beads
erfolgte die positive Separation der Zellen mit Hilfe eines Magneten. Anschließend wurden
die Zellen auf einem mit Gelatine-beschichteten 6er Well ausgesät.
Die HPMEC wurden nun für fünf bis sieben Tage in dem Kulturmedium für HPMEC mit
PC + 15% FKS bFGF/Hep kultiviert, bis zu drei Mal weiter passagiert und maximal in
vierter Passage (P4) für den Versuch eingesetzt.
2.2.2.2 Kultivierung humaner Umbilicalvenen-Endothelzellen (HUVEC)
VE-Cadherin wird nicht nur an den Zellkontakten von Endothelzellen der Lunge
exprimiert, sondern auch von Hirngewebe, Nabelschnurvenen und anderen Gewebetypen.
Nabelschnurvenen sind vergleichsweise einfach zu beschaffen und zahlreich vorhanden.
Die Kulturen aus den isolierten Endothelzellen können als Modell für makrovaskuläre
Endothelzellen verwendet werden.
Die Isolation und Kultivierung der HUVEC (Human Umbilical Vein Endothelial Cells)
erfolgte nach den Methoden von Jaffe et al. (1973). Die nach der Geburt entnommenen
Nabelschnüre wurden in einer Pufferlösung (0.14 M NaCl, 0.004 M KCl, 0.001 M
Phosphatpuffer, pH 7.4, 0.011 M Glucose) bei 4 °C bis zu ihrer weiteren Verwendung
aufbewahrt. Die gesäuberte Vene wurde kanüliert und ebenfalls mit Puffer (s. o.) gespült.
Nach mehreren Spül- und Waschgängen wurde die Vene bei 37 °C für 15 Minuten mit 10
ml einer 0,2 %igen Collagenase-enthaltenden Lösung gefüllt (Jaffe et al., 1973). Die
Kollagenase-Lösung bewirkte das Ablösen der Endothelzellen von der darunter liegenden
Basalmembran (Bill, 2003). Nach diesem Vorgang wurden die Collagenase-Lösung und
die abgelösten Endothelzellen mit dem Puffer aus der Vene herausgespült und in fetales
Kälberserum (Fetal Calf Serum, FCS) und Medium 199 (TC 199) gegeben. Anschließend
wurde das Gemisch zentrifugiert und sedimentiert. Die Endothelzellen wurden in Medium
199 (TC199), bestehend aus 20 % FCS, Penicillin (200 U/ml), Streptomycin (200 µg/ml)
und L-Glutamin (2 mM) bei 37 °C und unter 5 % CO2 kultiviert (Jaffe et al., 1973).
Zusätzlich wurden die Zellen mit einem Wachstumsmedium ECGS (Endothelial Cell
Growth Supplement) versetzt. Eine Passage vor dem Versuch wurden die Zellen in PC +
15 % FKS bGFG/Hep gezogen.
Kapitel 2 – Material und Methoden 58 Der sich nach ungefähr fünf Tagen ausgebildete gleichmäßige Zellrasen wurde bis zu drei
Mal in Hepes-Puffer mit 0,01% EDTA und 0,1% Collagenase passagiert. Eine konfluente
P3 (dritte Passage) wurde mit 0,01 % EDTA und 0,1 % Collagenase abgelöst und auf 8-
Kammerglasobjektträgern (Lab-Teks), die mit humanem Fibronektin (1 µg/cm2)
beschichtet waren, in einer Zellzahl von 4 x 104 Zellen pro Well ausgesät. Die Zellen
wurden für 24 h bei 37 °C inkubiert. Der Mediumüberstand aus den Lab-Teks wurde
entfernt und durch frisches Medium (Kontrolle) oder Medium mit Stimulanzien ersetzt.
2.2.2.3 Stimulation
Die isolierten HPMEC und HUVEC wurden auf neun Lab-Teks mit je acht Wells pro Lab-
Tek ausgesät. Auf einem Lab-Tek wurden je vier Wells mit HPMEC und vier Wells mit
HUVEC bestückt. Die Zellen des ersten Wells blieben im Gegensatz zu den drei anderen
Wells unstimuliert. Die Stimulation erfolgte mit LPS, TNFα bzw. IFNγ. Die Fixierung
erfolgte nach vier Stunden und nach 24 Stunden (Abb. 21).
Die Stimulation der Zellkulturen erfolgte mit TNFα, LPS und IFNγ in folgenden
Konzentrationen:
TNFα 30, 150, 300 U/ml
LPS 1 µg/ml
IFNγ 10 ng/ml
IFNγ + TNFα 10 ng/ml IFNγ + 300 U/ml TNFα
Die folgenden Stimulanzien und die entsprechenden Vorverdünnungen wurden in
PC + 15 % FKS bFGF/Hep angesetzt:
TNFα 30, 150, 300 U/ml; IFNγ 10 ng/ml; IFNγ 10 ng/ml + TNFα 300 U/ml
Es wurde mit 500 µl pro Well stimuliert. Nach 4 h bzw. nach 24h wurde der Zellrasen mit
3,7 % PFA (Paraformaldehyd) in PBS-Puffer für 15 min. fixiert. Um den aktivierten
Zellrasen nicht zu verletzen, durfte vor der Fixierung nicht gespült werden. Nach 15 min.
wurden die fixierten Zellen drei Mal mit PBS gespült.
Kapitel 2 – Material und Methoden 59
1
HPMEC
PFA
VE-Cad 1:100
2
HPMEC
PFA
TNF-α 30 U/ml
VE-Cad 1:100
3
HPMEC
PFA
TNF-α 150 U/ml
VE-Cad 1:100
4
HPMEC
PFA
TNF-α 300 U/ml
VE-Cad 1:100
5
HUVEC
PFA
VE-Cad 1:100
6
HUVEC
PFA
TNF-α 30 U/ml
VE-Cad 1:100
7
HUVEC
PFA
TNF-α 150 U/ml
VE-Cad 1:100
8
HUVEC
PFA
TNF-α 300 U/ml
VE-Cad 1:100
1
HPMEC
PFA
VE-Cad 1:100
2
HPMEC
PFA
LPS
VE-Cad 1:100
3
HPMEC
PFA
IFN-γ
VE-Cad 1:100
4
HPMEC
PFA
IFN-γ / TNF-α
VE-Cad 1:100
5
HUVEC
PFA
VE-Cad 1:100
6
HUVEC
PFA
LPS
VE-Cad 1:100
7
HUVEC
PFA
IFN-γ
VE-Cad 1:100
8
HUVEC
PFA
IFN-γ / TNF-α
VE-Cad 1:100
Abb. 21: Belegungungsplan der Lab-Teks mit HPMEC und HUVEC: Stimulation mit TNFα, IFNγ und LPS bei einer Stimulationsdauer von 4 bzw. 24 h
2.2.2.4 Immunzytochemische Fluoreszenzfärbung
Zuerst erfolgte die Permeabilisierung mit 0,5 % Triton-x 100 für 10 min. Die
Permeabilisierung verringert die Quervernetzung der durch die Fixierung denaturierten
Proteine und macht die Zellmembran durchlässiger. Sie erleichtert somit die Erkennung
der für die Antikörper spezifischen Epitope. Anschließend wurde vier Mal mit PBS
gespült.
Über Nacht wurden die Wells bei 4 °C mit dem ersten Antikörper inkubiert. Der
Antikörper, anti-VE-Cadherin (Cadherin-5) mouse IgG (BD) wurde in der Verdünnung
1:100 aufgetragen. Es wurde nun einmal mit PBS gespült, einmal mit PBS/Triton-x 100
0,5% und noch vier Mal mit PBS. Es erfolgte dann die Inkubation mit dem zweiten
Kapitel 2 – Material und Methoden 60 Antikörper (Goat Anti Mouse IgG) mit Phalloidin TRITC in einer Verdünnung von
1:1000.
Die Lab-Teks wurden fünf Mal mit PBS gespült, in destilliertes Wasser eingestellt und
schließlich in Gel Mount (Eindeckmedium) eingedeckt. Sie wurden bei
4 °C im Dunkeln aufbewahrt.
Die Aussaat und die Färbung erfolgten im Juni 2004.
2.2.3 Antikörper
VE-Cadherin (Cadherin-5)
150 µg Catalog Number C26120-150 (old), 610252 (new); Mouse IgG1; Clone 75; Mol.
Weight 130; Pos. Control Human Endothelial; Firma BD Biosciences; Verdünnung 1:100
Sekundär-Ak
Biotinylated Anti-Mouse, IgG (H+L); Vector/Alexis BA-2000
Isotypkontrolle
Isotype control IgG1 (1B9); Prod. no. 2010; unconj.; 0,2 mg/200 µL; Fa. Dianova
Kapitel 2 – Material und Methoden 61
2.3 Auswertung
2.3.1 Auswertung der Lungengewebsproben
2.3.1.1 Färbungsintensität der Endothelzellen
Die endotheliale Expression des VE-Cadherin-Antikörpers in den immunhistochemisch
gefärbten Präparaten wurde lichtmikroskopisch semiquantitativ ausgewertet. Dazu wurde
in allen Präparaten die endotheliale Farbintensität pro mikrovaskulärem Gefäßtyp
(Arteriole, Kapillare, Venole) in jeweils 20 Gesichtsfeldern in zwei getrennten
Durchgängen bewertet. Bei den großen Gefäßen (Arterien und Venen) wurden jeweils alle
Gefäße pro Präparat bewertet. Aus den zwei Bewertungen wurde ein Durchschnittswert für
die Anfärbungsintensität der Endothelzellen gebildet.
Basierend auf den graduellen Unterschieden wurde jeweils pro Präparat und Gefäßtyp die
Färbeintensität und der Prozentsatz positiv gefärbter Endothelzellen mit einem Score
(angelehnt an den Immunoreaktivitätsscore nach Remmele et al. (1986)), bewertet. Für
jeden Patienten einer jeweiligen Gruppe (Gruppe der Sepsispatienten, Kontrollgruppen)
wurde aus den Anfärbungsscores für jeden Gefäßtyp ein Mittelwert durch Addition der
ermittelten Werte nach dem Score und Division durch die Anzahl der beurteilten Gefäße
errechnet. Die Mittelwerte und die Mediane der unterschiedlichen Gefäßtypen und
unterschiedlichen Gruppen wurden miteinander verglichen. Die statistische Auswertung
wurde unter Zuhilfenahme des Statistikprogramms SPSS vorgenommen.
Die Intensität der VE-Cadherin-Antigenexpression wurde anhand der Färbeintensität der
Endothelzellgrenzen pro Gesichtsfeld nach folgendem Schema bewertet (Tab. 1):
Tab. 1: Immunhistochemischer Score zur Auswertung der Lungenproben
0 negativ; keine Färbereaktion der Endothelzellen (Abb. 22)
1 schwach positiv; schwache Färbereaktion der Endothelzellen (Abb. 23)
2 mittelgradig positiv; mäßige Färbereaktion der Endothelzellen (Abb. 24)
3 stark positiv; starke Färbereaktion der Endothelzellen (Abb. 25)
Kapitel 2 – Material und Methoden 62
Abb. 22: Keine bzw. minimale Abb. 23: Schwache Expression des Expression des VE-Cadherin-Antigens VE-Cadherin-Antigens in humanem in humanem Lungengewebe (Score 0) Lungengewebe (Score 1)
Abb. 24: Deutliche Expression des Abb. 25: Sehr starke Expression VE-Cadherin-Antigens in humanem des VE-Cadherin-Antigens in humanem Lungengewebe (Score 2) Lungengewebe (Score 3)
Untersucht wurden auf diese Weise die Anfärbungsintensitäten des Antikörpers gegen VE-
Cadherin bei den 78 Lungenproben im Hinblick auf Unterschiede zwischen den einzelnen
pulmonalen Gefäßtypen. Die sich hieraus ergebenden Daten wurden unter folgenden
Gesichtspunkten analysiert: Unterschiede der Kontrollgruppe gegenüber Sepsisgruppe,
Unterschiede bezüglich Geschlecht, Alter und Obduktionszeitpunkt.
2.3.1.2 Einteilung der Patienten
Bei der Untersuchung nach geschlechtlichen Unterschieden wurden die 78 Patienten in
männlich (41 Patienten) und weiblich (37 Patienten) unterteilt. Zusätzlich wurden die
Kontrollgruppen der weiblichen (n = 21) und männlichen Patienten (n = 20) miteinander
verglichen.
Für die Untersuchung der Färbeintensität nach dem Alter wurden die 78 Patienten in vier
Gruppen eingeteilt, gestaffelt nach dem Alter zum Zeitpunkt der Probenentnahme bzw.
Kapitel 2 – Material und Methoden 63 zum Todeszeitpunkt (Tab. 2). Für die Untersuchung bezüglich der Zeitdauer zwischen Tod
und Obduktion wurden die 20 an ARDS verstorbenen Patienten in drei Gruppen
zusammengefasst (Tab. 3):
Tab. 2: Einteilung der 78 Patienten in vier Altersgruppen
Gruppe 1 0 bis 20 Jahre 18 Patienten
Gruppe 2 21 bis 40 Jahre 5 Patienten
Gruppe 3 41 bis 60 Jahre 24 Patienten
Gruppe 4 61 bis 83 Jahre 31 Patienten
Tab. 3: Einteilung der 20 Sepsispatienten nach dem Obduktionszeitpunkt in drei Gruppen
Gruppe 1 < 24 Stunden zwischen Tod und Obduktion 4 Patienten
Gruppe 2 24 bis 48 Stunden zwischen Tod und Obduktion 11 Patienten
Gruppe 3 > 48 Stunden zwischen Tod und Obduktion 5 Patienten
2.3.2 Auswertung der Zellkulturen
Bei den Zellkulturen mit den HUVEC und den HPMEC wurde jedes "Well" fotografisch
mit der 20er Vergrößerung der Immunofluoreszenz-Mikroskop-Kamera
(Absorptionsspektrum: 495 nm, Emissionsspektrum: 528 nm) digital dokumentiert und
ausgewertet. Pro Well wurden 20 Bilder erstellt, wobei jedes zweite Gesichtsfeld
dokumentiert wurde. Bei der Auswertung wurde jedes Foto virtuell in vier Felder unterteilt
und jedes Feld nach dem Score bewertet (Tab. 4). Die sich aus dem Score ergebenden
Bewertungen wurden addiert und anschließend durch die Anzahl der Felder (in diesem Fall
konstant vier Felder) geteilt, was zu einer "Gesamtnote" zwischen "0,0" und "3,0" führte.
Um eine Beeinflussung bei der Bewertung weitestgehend auszuschalten, erfolgte die
Auswertung in zwei getrennten Durchgängen anhand einer blinden und zufälligen
Reihenfolge der Bilder.
Tab. 4: Immunhistochemischer Score zur Auswertung der Zellkulturen
0 kein vorhandener Endothelverband (EV), nur Fragmente sichtbar (Abb. 26)
1 unterbrochener EV, schwach angefärbt (Abb. 27)
2 gering geschädigter EV, mäßig angefärbt (Abb. 28)
3 geschlossener EV, stark angefärbt (Abb. 29)
Kapitel 2 – Material und Methoden 64
Abb. 26: Kein Endothelverband Abb. 27: Endothelzellverband mit ausgebildet, teilweise noch deutlicher Lückenbildung (Score 1) Zellgrenzenfragmente sichtbar (Score 0)
Abb. 28: Endothelverband mit Abb. 29: Dichter Zellrasen mit geringer Lückenbildung (Score 2) intensiver und lückenloser Expression von VE-Cadherin (Score 3)
Kapitel 3 – Ergebnisse 65
3 Ergebnisse
3.1 In situ-Befunde
3.1.1 VE-Cadherin-Antigenexpression in den verschiedenen Gefäßtypen
3.1.1.1 Alle Proben
Bei der Untersuchung der Proben aller 78 Patienten stellte sich mit einer Signifikanz p =
0,0 für die einzelnen Gefäßtypen folgendes Bild dar:
Die Arterien, Arteriolen und Kapillaren zeigten eine kräftige endotheliale VE-Cadherin-
Expression, während die Venolen und Venen eine vergleichsweise schwache Expression
aufwiesen.
Der Median der Färbeintensität lag bei den Arterien, Arteriolen und Kapillaren in einem
Bereich zwischen 1,53 und 1,81. Bei den Venen und Venolen betrug der Median 0,27 bzw.
0,45 (Tab. 5). Die Werte zwischen dem 25%- und dem 75%-Quantil veranschaulichen,
dass die Werte für die Färbeintensität in den Arterien, Arteriolen und Kapillaren weiter um
den Mittelwert und Median streuten als bei den Venolen und Venen. Gleichzeitig
dokumentieren sie aber auch die intensivere Anfärbung der Endothelien in den arteriellen
Gefäßen und Kapillaren im Gegensatz zu den venösen Gefäßen (Abb. 30 und 31).
Dementsprechend zeigten die im Boxplot dargestellten Minimal- und Maximalwerte eine
breite Streuung der Färbeintensitäten bei den Arterien, Arteriolen und Kapillaren. In den
Venen und Venolen wurden sehr viel geringere Maximalwerte erreicht, der Minimalwert
lag hier bei 0,0.
Kapitel 3 – E
rgebnisse 66
Arterie Arteriole Kapillare Venole Vene Abb. 30: Endotheliale VE-Cadherin-Antigenexpression in den verschiedenen Gefäßtypen entlang der pulmonalen Lungenstrombahn (Arterien / Kapillaren > Arteriolen >> Venen / Venolen) in regelrechtem Lungengewebe.
Kapitel 3 – Ergebnisse 67
ARTERIEN ARTERIOLEN KAPILLAREN VENOLEN VENEN
0,00
0,50
1,00
1,50
2,00
2,50
3,00
Abb. 31: Endotheliale VE-Cadherin-Antigenexpression in den 78 untersuchten Proben mit intensiver Expression in den Arterien, Arteriolen und Kapillaren und vergleichsweise schwacher Expression in den Venolen und Venen
Dasselbe Verteilungsmuster bezüglich der VE-Cadherin-Expression in den Gefäßen zeigte
sich bei isolierter Betrachtung der Befunde unter dem Aspekt "Frauen" (Abb. 32),
"Männer" (Abb. 33), "Kinder" (Abb. 34) und "Patienten mit Sepsis" (Abb. 36). Diese
Ergebnisse für die einzelnen Gefäßtypen waren auch hier mit einer Signifikanz von p <
0,05 (pFrauen = 0,0; pMänner = 0,0; pKinder = 0,0 und pSepsispatienten ≤ 0,04) hochsignifikant.
Kapitel 3 – Ergebnisse 68
ARTERIEN ARTERIOLEN KAPILLAREN VENOLEN VENEN
0,00
0,50
1,00
1,50
2,00
2,50
3,00
Abb. 32: VE-Cadherin-Antigenexpression der verschiedenen Gefäßtypen in der "Kontrollgruppe Frauen": sehr intensive Antigenexpression in den arteriellen Gefäßen und Kapillaren sowie deutlich geringere Expression in den Venolen und Venen
ARTERIEN ARTERIOLEN KAPILLAREN VENOLEN VENEN
0,00
0,50
1,00
1,50
2,00
2,50
3,00
Abb. 33: VE-Cadherin-Antigenexpression in der "Kontrollgruppe Männer", analysiert nach Gefäßtypen: gleiches Verteilungsmuster wie bei der "Kontrollgruppe Frauen" (Abb. 32)
Kapitel 3 – Ergebnisse 69
ARTERIEN ARTERIOLEN KAPILLAREN VENOLEN VENEN
0,00
0,50
1,00
1,50
2,00
2,50
3,00
Abb. 34: VE-Cadherin-Antigenexpression in der "Kontrollgruppe Kinder", analysiert nach Gefäßtypen: gleiches Verteilungsmuster wie bei den "Kontrollgruppen Frauen" und "Männer" (Abb. 32 und 33) Betrachtet man die Expression des VE-Cadherin-Antigens, so fällt nicht nur die Stärke der
Expression auf, sondern auch eine charakteristische Anfärbung der die Gefäße
auskleidenden Zellen (Abb. 35). Die endothelialen Zellmembranen waren dort besonders
intensiv angefärbt, wo zwei Endothelzellen aneinander grenzen, d. h. an den
Endothelzelljunktionen.
Abb. 35: Endotheliale Expression von VE-Cadherin in arteriellen Gefäßen und Kapillaren: Anhand der arteriellen Endothelzellen wird die VE-Cadherin-Expression an den Endothelzelljunktionen besonders gut erkennbar
Kapitel 3 – Ergebnisse 70 3.1.1.2 Kontrollgruppe "Frauen" und "Männer"
Das gefäßtypische Verteilungsmuster trat bei den beiden Kontrollgruppen der Frauen (n =
21) und Männer (n = 20) (Abb. 32 und 33) besonders deutlich hervor: Die Endothelien der
arteriellen Gefäße und Kapillaren zeigten eine starke Anfärbung, die Endothelien der
Venen und Venolen hingegen eine wesentlich schwächere. Der Median lag bei den
arteriellen, arteriolären und kapillären Endothelien bei gesunden Frauen und Männern
zwischen 1,72 und 2,09. Bei den venolären und venösen Endothelien lag der Median
zwischen 0,30 und 0,58. Bei diesen beiden "gesunden" Patientengruppen streuten die
Werte im Vergleich zu allen 78 Patienten (Abb. 31) nur gering. Dementsprechend stellten
sich in der Boxplotdarstellung sowohl die 25%- und 75%-Quantile als auch die 5%- und
95%-Quantile sehr schmal dar (Abb. 32 und 33).
3.1.1.3 Kindergruppe
Bei den Proben morphologisch regelrechter Kinderlungen (n = 17) lag der Median für die
angefärbten Endothelzellmembranen der Arterien, Arteriolen und Kapillaren zwischen
1,55 und 2,00. Der Median der Venolen und Venen lag bei 0,35 bzw. 0,63. Bei den
Boxplots fand sich eine etwas größere Streuung innerhalb der 25%- und 75%-Quantile und
der 5%- und 95%-Quantile (Abb. 34).
Sowohl zahlenmäßig als auch graphisch stellte sich der für die Erwachsenen bereits
beschriebene Unterschied in der Färbeintensität zwischen den arteriellen Gefäßen und
Kapillaren (als Gefäßtypen mit hoher VE-Cadherin-Antigenexpression) und den venösen
Gefäßen (als Gefäßtypen mit niedriger VE-Cadherin-Antigenexpression) dar.
Betrachtet man die Mittelwerte (Tab. 6) der Färbeintensitäten, so unterstreichen die sich
dabei ergebenden Werte das gefäßtypische Verteilungsmuster mit starker Expression im
arteriellen Schenkel und den Kapillaren sowie schwacher VE-Cadherin-Expression im
venösen Schenkel der Strombahn. Die Mittelwerte aller 78 Proben in den arteriellen
Gefäßen und den Kapillaren lagen zwischen 1,34 und 1,58. In den venösen Gefäßen lag
der Mittelwert mit 0,32 bzw. 0,44 deutlich niedriger. Diese anhand des Mittelwertes
ermittelte Verteilung der Expressionsintensität zeigte sich auch bei einer isolierten
Betrachtung der Kontrollgruppe "Männer", der Kontrollgruppe "Frauen", der Gruppe
"Kinder" und der Gruppe der Patienten mit Sepsis.
Kapitel 3 – Ergebnisse 71 3.1.1.4 Patienten mit Sepsis
Bei der Gruppe der Patienten mit Sepsis war das bereits beschriebene endotheliale
Expressionsmuster von VE-Cadherin für alle Gefäßtypen ebenfalls erkennbar (Abb. 36 und
37). Dementsprechend waren auch der Median und der Mittelwert (Tab. 5 und 6) in den
Arterien, Arteriolen und Kapillaren größer als in den Venolen und Venen. Jedoch fiel die
Anfärbung aller Endothelzellen signifikant schwächer aus (p ≤ 0,04) als im gesunden
Lungengewebe.
ARTERIEN ARTERIOLEN KAPILLAREN VENOLEN VENEN
0,00
0,50
1,00
1,50
2,00
2,50
Abb. 36: endotheliale VE-Cadherin-Antigenexpression in den verschiedenen Gefäßtypen der Sepsispatienten: im Vergleich zu einer sehr schwachen Expression in Venen und Venolen deutlich kräftigere Antigenexpression in Arterien, Arteriolen und Kapillaren
Kapitel 3 – E
rgebnisse 72
Arterie Arteriole Kapillare Venole Vene Abb. 37: Darstellung der endothelialen VE-Cadherin-Antigenexpression in Lungengewebe mit Ausbildung eines septischen ARDS für die verschiedenen Gefäßtypen entlang des pulmonalen Gefäßbaumes (Arterien / Kapillaren > Arteriolen >> Venen / Venolen). Im Vergleich zu Abb. 14 zeigte sich eine schwächere Expression.
Kapitel 3 – Ergebnisse 73 Tab. 5: Mediane der verschiedenen Gruppen für jeden Gefäßtyp
alle
Patienten
Kontrollgruppe
Frauen
Kontrollgruppe
Männer
Gruppe der
Kinder
Sepsisfälle
Arterien 1,81 1,92 2,03 2,00 0,30
Arteriolen 1,55 1,72 1,84 1,55 0,12
Kapillaren 1,53 2,09 2,05 1,81 0,16
Venolen 0,27 0,30 0,47 0,35 0,00
Venen 0,45 0,45 0,58 0,63 0,01
Tab. 6: Mittelwerte der verschiedenen Gruppen für jeden Gefäßtyp
alle
Patienten
Kontrollgruppe
Frauen
Kontrollgruppe
Männer
Gruppe der
Kinder
Sepsisfälle
Arterien 1,58 1,90 2,02 1,89 0,55
Arteriolen 1,34 1,70 1,78 1,53 0,37
Kapillaren 1,49 1,91 1,98 1,68 0,44
Venolen 0,32 0,42 0,42 0,43 0,04
Venen 0,44 0,45 0,59 0,72 0,04
3.1.1.5 Patienten mit IRDS
Zusätzlich wurde Lungengewebe von drei IRDS-Patienten untersucht. Diese Ergebnisse
wurden auf Grund der kleinen Fallzahl dieser Gruppe nicht bei der Analyse der übrigen
"Kinderwerte" bzw. der Sepsispatienten berücksichtigt.
Es zeigten sich sehr unterschiedliche Färbungsintensitäten für die VE-Cadherin-
Antigenexpression bei den drei Patienten. Jedoch war auch hier das bereits mehrfach
beschriebene gefäßtypspezifische Expressionsmuster nachweisbar (Tab. 7).
Tab. 7: Medianwerte der VE-Cadherin-Expression in den drei IRDS-Lungenproben
Arterien Arteriolen Kapillaren Venolen Venen
Patient 1: 1.74 1.25 2.21 0.29 0.51
Patient 2: 0.68 0.39 0.64 0.10 0.20
Patient 3: 2.20 1.99 0.84 0.11 0.77
Kapitel 3 – Ergebnisse 74 3.1.1.6 Unterschiede zwischen den einzelnen Gefäßtypen
Zwischen den Arterien, Arteriolen und Kapillaren als Gefäßtypen mit hoher endothelialer
Expression von VE-Cadherin stellte sich kein signifikanter Unterschied dar (Abb. 30 - 34,
36 und 37; Tab. 5 und 6). Bei isolierter Betrachtung der Boxplots – und hier insbesondere
der Mediane der Gruppen der Frauen, Männer, Kinder und Sepsispatienten – fiel auf, dass
die Arterien und Kapillaren leichtgradig stärker angefärbt waren als die Arteriolen. Diese
Unterschiede in der VE-Cadherin-Expression zwischen Arterien, Arteriolen und Kapillaren
waren allerdings statistisch nicht signifikant (= Interpretation).
Bei den Venolen und Venen als Gefäßtypen mit niedriger endothelialer Expression von
VE-Cadherin konnte kein statistisch signifikanter Unterschied zwischen diesen beiden
Gefäßtypen gefunden werden, obwohl sich eine stärkere Anfärbung der Venen im
Gegensatz zu den Venolen (bei Betrachtung der Boxplots und Mediane, s. o.) darstellte.
Auch diese Unterschiede sind somit lediglich eine nicht signifikante Beobachtung.
3.1.2 VE-Cadherin-Expression der Sepsisgruppe im Vergleich zur Kontrollgruppe
3.1.2.1 Lungengewebe von Patienten mit Sepsis
Im Gegensatz zu den gesunden Proben (Abb. 32 bis 34) waren die Gefäßendothelien in den
Proben der Sepsispatienten (n = 20) mit dem Antikörper gegen VE-Cadherin sehr viel
schwächer angefärbt. Trotzdem fand sich auch hier eine statistisch signifikant stärkere VE-
Cadherin-Expression der Endothelzellen in den arteriellen Gefäßen und Kapillaren
gegenüber einer schwächeren Expression in den venösen Gefäßen (Signifikanz p ≤ 0,04).
Dieses Ergebnis verdeutlichten auch der Median, die Boxplots und der Mittelwert: Die
Werte des Medians bewegten sich für die Arterien, Arteriolen und Kapillaren zwischen
0,12 und 0,30. In den Venolen und Venen lag der Median annähernd bei 0,0. Für die
arteriellen Gefäße ließen die Boxplots eine geringe Streuung der Werte erkennen. Die
Maximalwerte waren vereinzelt recht hoch, während die Minimalwerte dagegen bei Null
lagen. Die bei Gesunden bereits schwach VE-Cadherin-exprimierenden venösen Gefäße
zeigten bei sehr niedrigen Maximalwerten fast gar keine Streuung (Abb. 36 und 37; Tab. 5
und 6).
Bei den Proben der Sepsispatienten lagen auch die Mittelwerte generell unter denen der
Kontrollgruppen der Männer, Frauen und Kinder: Bei den Arterien, Arteriolen und
Kapillaren lag der Mittelwert zwischen 0,37 und 0,55 – bei den Venolen und Venen bei
0,04.
Kapitel 3 – Ergebnisse 75 3.1.2.2 Vergleich der Gruppe "gesund" und "krank"
Bei der Gegenüberstellung der Gruppen nach dem Kriterium gesund – krank (= Sepsis)
(gesund: n = 58 Patienten; krank: n = 20 Patienten) zeigte sich für alle Gefäßtypen eine
deutlich schwächere endotheliale Expression von VE-Cadherin in den Proben mit Zeichen
eines akuten Lungenversagens (Abb. 38, 39 und 40). Dieser Unterschied war statistisch
hochsignifikant (p = 0,0). So differierten die Werte der Mediane erheblich (Abb. 18 und
Tab. 8): Bei den Sepsisfällen fanden sich in den arteriellen Gefäßen und den Kapillaren
Werte zwischen 0,12 und 0,3, bei der Kontrollgruppe lagen die Medianwerte zwischen
1,77 und 2,03. Die Mediane der venösen Endothelzellen lagen bei den Sepsispatienten um
0,0, bei der Kontrollgruppe zwischen 0,36 und 0,53 (Tab. 8)
Die 25%- und 75%-Quantile verdeutlichten für alle Endothelzellen, unabhängig vom
Gefäßtyp, eine sehr niedrige VE-Cadherin-Antigenexpression bei den Sepsisfällen und
eine im Vergleich dazu hohe VE-Cadherin-Antigenexpression bei der Kontrollgruppe
(Abb. 38). Sowohl bei den Proben mit Zeichen des septischen ARDS als auch bei den
Proben gesunder Patienten zeigten sich breite Boxplots (Ausnahme: venöse Gefäße der
Sepsisgruppe).
Die Mittelwerte (Tab. 8) der Färbeintensität zeigten dieselbe Verteilung, die auch schon
bei den Medianen deutlich geworden war. Bei den Sepsisfällen lagen in den Arterien,
Arteriolen und Kapillaren die Mittelwerte der endothelialen Färbeintensität zwischen 0,37
und 0,55, bei der Kontrollgruppe zwischen 1,68 und 1,94. Bei den Venolen und Venen
lagen die Mittelwerte bei den Sepsisfällen bei 0,04, bei der Kontrollgruppe zwischen 0,42
und 0,58.
Sowohl die Proben regelrechten Lungengewebes als auch die Proben der septisch
geschädigten Lungen wiesen das bereits für die Kontrollgruppen beschriebene Gefäßtyp-
spezifische Expressionsmuster auf.
Kapitel 3 – Ergebnisse 76
gesund krank
0,00
0,50
1,00
1,50
2,00
2,50
3,00ARTERIEN
ARTERIOLEN
KAPILLAREN
VENOLEN
VENEN
Abb. 38: Gegenüberstellung der VE-Cadherin-Antigenexpression in den Lungengefäßen gesunder Patienten ("gesund") und an gramnegativer Sepsis verstorbener Patienten ("krank"): deutliche Reduktion der VE-Cadherin-Expression in der Gruppe "krank"
Abb. 39: intensive endotheliale VE- Abb. 40: minimale endotheliale VE- Cadherin-Expression einer Arteriole bei Cadherin-Expression einer Arteriole bei einem lungengesunden Patienten einem Sepsispatienten
Kapitel 3 – Ergebnisse 77 3.1.2.3 Vergleich der VE-Cadherin-Werte Erwachsener mit regelrechtem Lungengewebe
und Erwachsener mit Zeichen eines septisch bedingten ARDS nach dem Kriterium
"gesund – krank"
Verglich man die VE-Cadherin-Antigenexpression in den Proben der Erwachsenen nach
dem Kriterium "gesund" und "krank" (41 gesunde Erwachsene und 19 Erwachsene mit
Sepsis), fanden sich hochsignifikante Unterschiede bezüglich der endothelialen
Expressionsintensität zwischen den beiden Gruppen (p = 0,0). So zeigte sich eine mehr als
vierfach höhere endotheliale VE-Cadherin-Expression in den Arterien, Arteriolen und
Kapillaren der Gesunden im Vergleich zu den Patienten mit einem ARDS. Auch die
Färbung der Venolen und Venen der gesunden Kontrollgruppe war deutlich intensiver als
die der Sepsisgruppe. Es zeigte sich bezüglich der verschiedenen Gefäßtypen wiederum
das bereits beschriebene Verteilungsmuster der VE-Cadherin-Expression.
Ein Vergleich der VE-Cadherin-Werte in Proben regelrechter Kinderlungen und
Kinderlungen mit ARDS wurde auf Grund der kleinen Fallzahlen nicht durchgeführt: Da
nur ein Präparat mit ARDS zur Verfügung stand, konnte keine (statistisch) relevante
Aussage getroffen werden.
Tab. 8: Median und Mittelwert der Sepsispatienten und der Kontrollpatienten
Median Mittelwert
Sepsisfälle Kontrollgruppe Sepsisfälle Kontrollgruppe
Arterien 0,30 2,00 0,55 1,94
Arteriolen 0,12 1,77 0,37 1,68
Kapillaren 0,16 2,03 0,44 1,87
Venolen 0,00 0,36 0,04 0,42
Venen 0,01 0,53 0,04 0,58
Kapitel 3 – Ergebnisse 78 3.1.3 Einfluss des Geschlechts auf die VE-Cadherin-Expression
Bei Vergleich der Proben nach dem Kriterium Geschlecht (Abb. 41 bis 45) fanden sich
keine statistisch signifikanten Unterschiede (p = 0,8) bezüglich der endothelialen
Expressionsintensität von VE-Cadherin zwischen "Frauen" und "Männern".
3.1.3.1 Gesamtkollektiv
Die 41 Proben männlicher und 37 Proben weiblicher Patienten zeigten keine Differenzen
bezogen auf die endotheliale Expressionsintensität in den verschiedenen Gefäßtypen bzw.
auf die Färbeintensität (Abb. 41). Die Boxplots wiesen eine große Streuung der Werte
innerhalb des 25%- und 75%-Quantils sowie innerhalb des 5%- und 95%-Quantils auf.
Sowohl in der Gruppe der Frauen als auch in der Gruppe der Männer waren die
Endothelzellen der Arterien, Arteriolen und Kapillaren wesentlich stärker angefärbt als die
der Venolen und Venen. Es bestand kein Unterschied in der Gesamtexpression von VE-
Cadherin (Abb. 42 und 43).
m w
0,00
0,50
1,00
1,50
2,00
2,50
3,00ARTERIEN
ARTERIOLEN
KAPILLAREN
VENOLEN
VENEN
Abb. 41: VE-Cadherin-Antigenexpression in den Gefäßen aller untersuchten Proben (n = 78) unter dem Gesichtspunkt "Geschlecht" (w = weiblich, m = männlich): kein Expressionsunterschied zwischen den Lungenproben von Männern und Frauen
Kapitel 3 – Ergebnisse 79
Abb. 42: arterioläreVE-Cadherin- Abb. 43: arterioläreVE-Cadherin- Antigenexpression in einer Probe der Antigenexpression in einer Probe der Kontrollgruppe "Männer" Kontrollgruppe "Frauen"
3.1.3.2 Kontrollgruppe
Bei Vergleich der Kontrollgruppe der Männer (n = 20) und der Kontrollgruppe der Frauen
(n = 21) war ebenfalls kein statistisch signifikanter Unterschied erkennbar (Abb. 44). Die
Boxplots zeigten – verglichen mit Abb. 41 – keine große Streuung innerhalb des 25%- und
75%-Quantils. Der Unterschied der VE-Cadherin-Expression zwischen Arterien,
Arteriolen und Kapillaren zu den Venolen und Venen war noch deutlicher ausgeprägt als
bei Mitberücksichtigung der Kinder und der Sepsispatienten (Abb. 41). Das
Verteilungsmuster der Expressionsintensität in den Gefäßen war bei Frauen und Männern
identisch, auch die Gesamtintensität der Färbungen war nahezu gleich.
Ebenfalls kein Unterschied in der Gesamtexpression des VE-Cadherin-Antigens zeigte sich
in der Gruppe der Kinder und bei den Proben aller gesunden Patienten im Bezug auf das
Merkmal "Geschlecht".
Kapitel 3 – Ergebnisse 80
m w
0,00
0,50
1,00
1,50
2,00
2,50
3,00ARTERIEN
ARTERIOLEN
KAPILLAREN
VENOLEN
VENEN
Abb. 44: VE-Cadherin-Expression in den Gefäßtypen der Kontrollgruppen "Männer" und "Frauen", untersucht nach dem Kriterium Geschlecht: keine Expressionsunterschiede zwischen den Geschlechtern, Beibehaltung des gefäßtypspezifischen Expressionsmusters
3.1.3.3 Gruppe der an septischem Multiorganversagen verstorbenen Patienten
Bei der Gegenüberstellung der Lungengewebsproben der an Sepsis verstorbenen Patienten
(13 Männer, 7 Frauen) bezüglich des Kriteriums Geschlecht war kein signifikanter
Unterschied nachweisbar. Die Boxplots und die Minimal- und Maximalwerte zeigten
allerdings bei der Gruppe der männlichen Patienten eine etwas breitere Streuung als bei der
Gruppe der weiblichen Patienten (Abb. 45). Auch hier war aber das zu Beginn
beschriebene Muster mit stärkerer Expression von VE-Cadherin in den arteriellen Gefäßen
sowie den Kapillaren und schwächerer Expression in den Venolen und Venen erkennbar.
Die Anfärbungsintensität war bei beiden Geschlechtern gleich ausgeprägt. Es ergab sich
somit kein Hinweis auf eine höhere Anfälligkeit oder eine schlechtere Prognose bezüglich
eines ARDS für eines der beiden Geschlechter.
Kapitel 3 – Ergebnisse 81
m w
0,00
0,50
1,00
1,50
2,00
2,50ARTERIEN
ARTERIOLEN
KAPILLAREN
VENOLEN
VENEN
Abb. 45: endotheliale VE-Cadherin-Antigenexpression in den verschiedenen Gefäßtypen der Sepsispatienten untersucht nach dem Kriterium Geschlecht: keine Expressionsunterschiede zwischen den Geschlechtern
3.1.4 Einfluss des Alters auf die VE-Cadherin-Expression
Der Vergleich der endothelialen Expression im Bezug auf das Kriterium Alter ließ keine
signifikanten Unterschiede (Signifikanz p = 0,4) der endothelialen Expressionsintensität
der Gefäßtypen oder der Gesamtexpression (d. h. der Stärke der Anfärbung des Gewebes
im Präparat) erkennen (Abb. 46 bis 51).
3.1.4.1 Untersuchung aller 78 Patienten, verteilt auf vier Altersgruppen
Bei Einteilung des Patientenkollektivs der 78 Patienten in vier Altersgruppen stellte sich
für jede Altersgruppe das oben beschriebene Expressionsmuster mit stärkerer Expression
von VE-Cadherin in den arteriellen Gefäßen sowie den Kapillaren und schwächerer
Expression in den Venolen und Venen dar (Abb. 46). Die 25%- und 75%-Quantile sowie
die 5%- und 95%-Quantile der Boxplots streuten sehr stark. Ein Einfluss des Alters auf die
Expression von VE-Cadherin stellte sich dementsprechend nicht dar (Abb. 47 bis 50).
Kapitel 3 – Ergebnisse 82
1 2 3 4
0,00
0,50
1,00
1,50
2,00
2,50
3,00ARTERIEN
ARTERIOLEN
KAPILLAREN
VENOLEN
VENEN
Abb. 46: VE-Cadherin-Antigenexpression in den in vier Altersklassen (1: bis 20 Jahre; 2: 21 bis 40 Jahre; 3: 41 bis 60 Jahre; 4: 61 bis 83 Jahre): kein signifikanter Expressionsunterschied zwischen den verschiedenen Altersgruppen
Abb. 47: kapillarendotheliale VE- Abb. 48: kapillarendotheliale VE- Cadherin-Antigenexpression in Cadherin-Antigenexpression in Lungenproben von Patienten der Gruppe 1 Lungenproben von Patienten der Gruppe 2
Kapitel 3 – Ergebnisse 83
Abb. 49: kapillarendotheliale VE- Abb. 50: kapillarendotheliale VE- Cadherin-Antigenexpression in Cadherin-Antigenexpression in Lungenproben von Patienten der Gruppe 3 Lungenproben von Patienten der Gruppe 4
3.1.4.2 Vergleich der Lungengewebsproben gesunder Erwachsener mit denen gesunder
Kinder
Bei der Gegenüberstellung der Proben der Erwachsenen (n = 41) und der Kinder (n = 17)
bezogen auf das Kriterium Alter fand sich kein signifikanter Unterschied (p = 0,5) der VE-
Cadherin-Expressionsintensität (Abb. 51). Auch hier zeigten die Boxplots sowie die
Minimal- und Maximalwerte eine große Streuung. Das Expressionsmuster bezüglich der
Gefäße war konstant.
Adulte Kinder
0,00
0,50
1,00
1,50
2,00
2,50
3,00ARTERIEN
ARTERIOLEN
KAPILLAREN
VENOLEN
VENEN
Abb. 51: VE-Cadherin-Antigenexpression lungengesunder Kinder und Erwachsener: keine signifikanten Expressionsunterschiede bezüglich des Merkmals Alter
Kapitel 3 – Ergebnisse 84 3.1.5 VE-Cadherin-Antigenexpression in Abhängigkeit vom Obduktionszeitpunkt
Bei Untersuchung der 20 Proben der an Sepsis verstorbenen Patienten auf einen
Zusammenhang zwischen der Zeitspanne Todeseintritt – Obduktionszeitpunkt und der
Expressionsstärke von VE-Cadherin zeigten alle Patienten das oben bereits beschriebene
Expressionsmuster mit stärkerer Expression des VE-Cadherin-Antigens in den arteriellen
Gefäßen sowie Kapillaren und schwächerer Expression in den Venolen und Venen (Abb.
52).
Es konnten keine signifikanten Unterschiede (p = 0,6) der VE-Cadherin-Antigenexpression
in Abhängigkeit der Zeitspanne zwischen Todeseintritt und Obduktionszeitpunkt gefunden
werden (Abb. 53 bis 55).
Die Gruppe 1 (weniger als 24 Stunden zwischen Todeseintritt und Obduktion, vier
Patienten) zeigte im Gegensatz zu Gruppe 2 (24 bis 48 Stunden zwischen Todeseintritt und
Obduktion, elf Patienten) zwar für die Arterien und Arteriolen eine etwas stärkere, aber
statistisch nicht signifikante, Expression von VE-Cadherin mit einer größeren Streuung
bezüglich Boxplots und Minimal- bzw. Maximalwerten. In Gruppe 3 (mehr als 48 Stunden
zwischen Todeseintritt und Obduktion, fünf Patienten) imponierte eine extrem breite
Streuung der Boxplots und Maximalwerte in den arteriellen Gefäßen und den Kapillaren.
Der Median lag in Gruppe 3 deutlich niedriger als in Gruppe 1 und 2.
Die Expressionsintensität von VE-Cadherin in Venolen und Venen lag in allen drei
Gruppen nahezu bei 0, eine nennenswerte Streuung der Werte konnte nicht beobachtet
werden.
Anhand der Boxplots lässt sich ablesen, dass nach einem Zeitraum zwischen Todeseintritt
und Obduktion von mehr als 48 Stunden die VE-Cadherin-Antigenexpression äußerst
variabel ist – wenngleich auch im Mittel die Expression abnimmt – und somit keine
forensischen Rückschlüsse auf den Zeitpunkt des Todeseintritts erlaubt.
Kapitel 3 – Ergebnisse 85
1 2 3
0,00
0,50
1,00
1,50
2,00
2,50ARTERIEN
ARTERIOLEN
KAPILLAREN
VENOLEN
VENEN
Abb. 52: Vergleich der VE-Cadherin-Expression in Lungenproben von Sepsispatienten (Obduktion < 24 h (1), 24 - 48 h (2), > 48 h (3) post mortem): keine statistisch signifikanten Unterschiede der VE-Cadherin-Expression in Abh. vom Obduktionszeitpunkt
Abb. 53: VE-Cadherin-Expression in Abb. 54: VE-Cadherin-Expression in Gewebe von Sepsispatienten Gewebe von Sepsispatienten (Obduktion < 24 h post mortem) (Obduktion 24 - 48 h post mortem)
Kapitel 3 – Ergebnisse 86
Abb. 55: VE-Cadherin-Expression in Gewebe von Sepsispatienten (Obduktion > 48 h post mortem)
3.1.6 Zusammenfassung der in situ-Ergebnisse
Bei allen 78 Patienten zeigte sich ein statistisch signifikantes Expressionsmuster mit
stärkerer Expression von VE-Cadherin in den arteriellen Gefäßen sowie den Kapillaren
und schwächerer Expression in den Venolen und Venen.
Die 20 Patienten mit einem septisch bedingten akuten Lungenversagen wiesen im
Gesamten eine sehr viel schwächere, ebenfalls statistisch signifikante, Expression von VE-
Cadherin auf als die 58 gesunden Patienten. Der Unterschied in der Expression der
verschiedenen Gefäßtypen änderte sich nicht.
Bezüglich des Geschlechts, des Alters und des Zeitraumes zwischen Tod und Obduktion
ließ sich kein signifikanter Unterschied der endothelialen Expressionsintensität von VE-
Cadherin feststellen.
Kapitel 3 – Ergebnisse 87
3.2 Zellkulturen
Untersucht wurde die Expression des VE-Cadherin-Antigens in Immunofluoreszenz-
gefärbten Zellkulturen (HPMEC und HUVEC).
3.2.1 Expression von VE-Cadherin in HPMEC
Die nicht stimulierten HPMEC exprimierten entlang der Zell-Zell-Grenzen deutlich mehr
VE-Cadherin als die stimulierten Endothelzellen. Dies korrelierte mit einer bei stimulierten
Endothelzellen reduzierten VE-Cadherin-Antigenexpression im Bereich der
Junktionszonen.
3.2.1.1 Unstimulierte HPMEC
Die unstimulierten HPMEC (Kontrolle) bildeten einen gleichmäßigen Zellrasen aus
mittelgroßen Zellen mit generalisierter Immunofluoreszenzfärbung (= Expression des VE-
Cadherin-Antigens) entlang der Zellgrenzen entsprechend einem dichtem
Endothelzellverband (Abb. 56). Die unstimulierten Endothelzellen waren durch die
Anfärbung des VE-Cadherin-Antigens an den Interzellularjunktionen mit indirekter
Darstellung der Zellgrenzen und Zellfortsätze deutlich voneinander abgrenzbar. Des
Weiteren präsentierte sich die Antigenexpression linear. Die unstimulierten HPMEC
wiesen Werte zwischen 2,23 und 2,71 (Tab. 9 und 10) auf, wobei "0" keine Anfärbung
bzw. nur noch Fragmente des Endothelzellverbandes vorhanden und "3" eine sehr starke
endotheliale Antigenexpression bei intaktem Endothelzellverband bedeutete.
Zusammenfassend imponierte bei den unstimulierten HPMEC ein lückenloser
Endothelverband.
3.2.1.2 Vierstündige Stimulation
Nach vierstündiger Inkubation mit LPS zeigten sich deutliche, teilweise innerhalb eines
Wells sich unterscheidende, Veränderungen.
An einigen Stellen waren die Zelljunktionen noch mit dem VE-Cadherin-Antikörper
angefärbt, an anderen Stellen konnte keine VE-Cadherin-Antigenexpression mehr
festgestellt werden (Abb. 57). Dementsprechend waren Lücken im
Endothelmonolayerverband erkennbar. In einigen Bereichen des Wells war die VE-
Cadherin-Expression nach Stimulation mit LPS noch stärker reduziert (Abb. 58). VE-
Cadherin war an den Zellgrenzen nur noch streifig oder, wenn überhaupt vorhanden,
punktförmig nachweisbar (im Gegensatz zur linearen Verteilung an den Zellgrenzen der
Kapitel 3 – Ergebnisse 88 unstimulierten HPMEC, Abb. 56). Dementsprechend waren zahlreiche Lücken im
Endothelmonolayer sichtbar, passend zu einer starken Reduktion der VE-Cadherin-
Antigenexpression. Die VE-Cadherin-Antigenexpression wurde im Mittel mit 1,4 bewertet
und lag damit deutlich niedriger als bei den unstimulierten Zellen (Tab. 9).
Insgesamt war die Anfärbung des VE-Cadherin-Antigens in stimulierten HPMEC weniger
intensiv als in der unstimulierten HPMEC-Zellkultur.
Abb. 56: Unstimulierte HPMEC: lückenlose membranäre Immunofluoreszenzanfärbung aller Endothelzellen mit dem Antikörper gegen VE-Cadherin
Abb. 57: HPMEC, nach vierstündiger LPS-Stimulation: streifige, lückenhafte Anfärbung der Endothelzellmembranen mit dem Antikörper gegen VE-Cadherin
Kapitel 3 – Ergebnisse 89
Abb. 58: HPMEC nach vierstündiger LPS-Stimulation: im Vergleich zu Abb. 57 noch stärkere Lückenbildung in der Immunofluoreszenzfärbung, entsprechend einer starken Reduktion des VE-Cadherin-Antigens an den Zellgrenzen
Nach vierstündiger Stimulation mit IFNγ konnte ebenfalls keine durchgehende bzw.
lineare Antigenexpression von VE-Cadherin mehr gefunden werden. An einigen Stellen
war sogar gar keine Expression mehr nachweisbar, einhergehend mit massiver
Lückenbildung im Zell-Zell-Verband. Die VE-Cadherin-Antigenexpression wurde im
Mittel mit 1,56 bewertet (Tab. 9).
Nach vierstündiger Stimulation mit IFNγ plus TNFα zeigte sich neben einer streifigen
Antigenexpression von VE-Cadherin eine teilweise auch vollkommen fehlende Expression
des VE-Cadherin-Antigens. Auffallend war, dass sich trotz Stimulation einige Zellgrenzen
erstaunlich intakt darstellten. Insgesamt ergab sich eine Bewertung der Antigenexpression
von 1,27 (Tab. 9).
Nach vierstündiger Stimulation mit TNFα (30 U/ml) zeigten sich im Vergleich zu den
unstimulierten Endothelzellen vermehrt Unterbrechungen der linearen VE-Cadherin-
Verteilung mit Bildung großer Lücken, vor allem an den trizellulären Ecken. Auch hier
imponierte die VE-Cadherin-Antigenexpression nicht linear, sondern gestreift.
Nach vierstündiger Stimulation mit TNFα (150 U/ml) war im Vergleich zu den
unstimulierten Zellkulturen nur noch wenig VE-Cadherin-Antigen an den Zell-Zell-
Grenzen nachweisbar. Dies entsprach einem deutlichen Auseinanderweichen der Zellen
und einem Zerreißen des Zellverbandes.
Kapitel 3 – Ergebnisse 90 Nach vierstündiger Stimulation mit TNFα (300 U/ml) zeigten sich – wie in den anderen mit
TNFα stimulierten Zellkulturen – eine streifige Anfärbung der Endothelzelljunktionen mit
dem Antikörper gegen VE-Cadherin und zahlreiche Unterbrechungen des Zellverbandes,
entsprechend einem "löchrigen" (durchlässigen) Endothelzellverband.
Die Bewertungen entsprechend des Scores lagen für die vierstündige Stimulation mit
TNFα in verschiedenen Konzentrationen zwischen 1,59 und 1,7 (Tab. 10).
Insgesamt zeigten sich keine bedeutsamen Unterschiede in der Schädigung des
Endothelzellverbandes in Abhängigkeit des Stimulans oder der Konzentration von TNFα
(Tab. 9 und 10).
3.2.1.3 24-stündige Stimulation
Während der unstimulierte Endothelzellmonolayer (Kontrolle) stark angefärbte und
lückenlose Zellgrenzen präsentierte, zeigten sich in den (unterschiedlich) stimulierten
Zellkulturen Veränderungen vergleichbar mit denen nach vierstündiger Stimulation (Tab.
IV und V). Die stimulierten Zellkulturen zeigten mittlere Werte zwischen 1,58 und 1,99.
Demgegenüber wiesen die unstimulierten Zellkulturen Werte von 2,63 und 2,71 auf. Die
Immunofluoreszenz-Färbung sowie die quantitativen Auswertungen belegten eine
interendotheliale Lückenbildung und eine insgesamt verminderte Anfärbungsintensität.
3.2.1.4 Zusammenfassung
Bei den unstimulierten Endothelzellen lag die VE-Cadherin-Antigenexpression im
Durchschnitt zwischen "2" (gering unterbrochener Endothelverband) und "3"
(geschlossener Endothelverband). Die stimulierten Zellen zeigten einen geschädigten
Endothelzellverband mit durchschnittlichen Werten zwischen "1" (unterbrochener
Endothelverband) und "2" (Tab. 9 und 10, Abb. 59 und 60).
Zwischen den unterschiedlichen Stimulanzien TNFα, LPS bzw. IFNγ zeichnete sich kein
Unterschied in der Stärke der Schädigung des Endothelzellzusammenhaltes ab (Tab. 9 und
10, Abb. 59 und 60). Bei Stimulation mit LPS ergaben sich für die Schädigung des
Endothelverbands Werte von 1,4 (4 h) und 1,58 (24 h) und bei Stimulation mit IFNγ Werte
von 1,56 (4 h) und 1,71 (24 h). Bei der Kombinationsstimulation mit IFNγ und TNFα
ergaben sich Werte von 1,27 (4 h) und 1,69 (24 h). Es zeigte sich tendenziell eine etwas
stärkere Schädigung des Endothels durch die Kombinationsstimulation als durch die
jeweilige Einzelstimulation mit TNFα oder IFNγ.
Auch die unterschiedlichen Konzentrationen von TNFα waren in ihrer Wirkung
vergleichbar (Tab. 10). Die Bewertungen anhand des Scores lagen zwischen 1,59 und 1,99
Kapitel 3 – Ergebnisse 91 und damit in einem sehr eingegrenzten Bereich. Eine Stimulation mit TNFα (30 U/ml)
führte bei einem mittleren Wert von 1,61 für 4 bzw. 24 Stunden teilweise sogar zu einer
größeren Endothelschädigung als die Stimulation mit TNFα (150 U/ml bzw. 300 U/ml),
bei der Werte zwischen 1,59 und 1,99 ermittelt wurden. Die Dauer der Stimulation (4 bzw.
24 Stunden) hatte ebenfalls keinen Einfluss auf den Grad der Minderung der VE-Cadherin-
Antigenexpression.
HPMEC (4h)
0,00
0,50
1,00
1,50
2,00
2,50
3,00
unstim
uliert
LPS
IFN
IFN +
TNF
TNF (3
0 U/m
l)
TNF (1
50 U
/ml)
TNF (3
00 U
/ml)
Abb. 59: VE-Cadherin-Antigenexpression in HPMEC nach vierstündiger Stimulation mit verschiedenen Stimulanzien: im Vergleich zur Kontrolle (unstimuliert) reduzierte Antigenexpression
Abb. 60: VE-Cadherin-Antigenexpression in HPMEC nach 24-stündiger Stimulation mit verschiedenen Stimulanzien: im Vergleich zur Kontrolle (unstimuliert) reduzierte Antigenexpression
HPMEC (24h)
0,00
0,50
1,00
1,50
2,00
2,50
3,00
unst
imul
iert
LPS
IFN
IFN +
TNF
TNF
(30
U/m
l)
TNF
(150
U/m
l)
TNF
(300
U/m
l)
Kapitel 3 – Ergebnisse 92 3.2.2 Expression von VE-Cadherin in HUVEC
Bei den HUVEC zeigte sich ein ähnliches Bild wie bei den HPMEC. Die unstimulierten
HUVEC zeigten eine deutlich stärkere VE-Cadherin-Antigenexpression an den
Endothelzellgrenzen als die stimulierten Zellen.
3.2.2.1 Unstimulierte HUVEC
Die unstimulierten HUVEC präsentierten sich als deutlich angefärbte Zellen mit intensiver,
lückenloser VE-Cadherin-Antigenexpression an den Zellgrenzen (Abb. 61). Durch die
Anfärbung des VE-Cadherin-Antikörpers an den interzellulären Junktionen wurden die
einzelnen Zellgrenzen deutlich und die Zellen präsentierten sich insgesamt als
geschlossener Endothelzellverband. Es zeigte sich eine lineare Anfärbung der Zellgrenzen.
Eine signifikante Lückenbildung war nicht vorhanden. Die unstimulierten Zellkulturen
wurden gemäß dem Score mit Werten zwischen 2,18 und 2,58 bewertet (Tab. 9 und 10).
3.2.2.2 Vierstündige Stimulation
Nach vierstündiger Stimulation mit LPS zeigte sich nur eine sehr schwache VE-Cadherin-
Immunofluoreszenz-Färbung. Die Zellgrenzen waren weder intensiv noch deutlich
angefärbt (Abb. 62). Bei hoher Vergrößerung zeigte sich meist keine lineare Verteilung der
VE-Cadherin-Expression, viel mehr waren kleine Lücken erkennbar. Die endotheliale VE-
Cadherin-Antigenexpression wurde im Mittel mit 1,62 bewertet (Tab. 9).
Nach vierstündiger Stimulation mit INFγ zeigte sich im ganzen Monolayer eine schwache
Anfärbung mit dem Antikörper gegen VE-Cadherin. Neben einer teils streifigen VE-
Cadherin-Antigenexpression waren zahlreiche Lücken erkennbar, manchmal waren auch
mehrere benachbarte Zellen gar nicht angefärbt (mittlerer Score-Wert: 1,28) (Tab. 9).
Die kombinierte Stimulation mit TNFα und IFNγ schädigte den Endothelverband stärker
als die alleinige Inkubation mit TNFα, jedoch etwas schwächer als die alleinige
Stimulation mit IFNγ. Entlang der Endothelzellmembranen zeigte sich eine punktförmige
oder streife Verteilung von VE-Cadherin (mittlerer Score-Wert 1,33) (Tab. 9).
Nach vierstündiger Stimulation mit TNFα (30 U/ml) bildeten sich ebenfalls zahlreiche
Lücken. Die Zellgrenzen waren infolge dessen punktförmig und insgesamt schwach mit
dem Antikörper gegen VE-Cadherin angefärbt. Nach Stimulation mit TNFα (150 U/ml)
war der Zellverband zwar noch erhalten, unterschied sich aber vom unstimulierten
Verband. Es zeigten sich mehr Lücken als in der unstimulierten Kultur. Nach Stimulation
mit TNFα (300 U/ml) zeigte sich eine deutliche Reduktion der VE-Cadherin-Expression an
den Zellgrenzen mit punktförmiger Verteilung des VE-Cadherin-Antigens. Bei den mit
Kapitel 3 – Ergebnisse 93 TNFα in verschiedenen Konzentrationen stimulierten HUVEC ergaben sich Bewertungen
zwischen 1,52 und 1,6 (Tab. 10). Ein deutlicher Expressionsunterschied abhängig von der
TNFα-Konzentration kann somit nicht beschrieben werden
Wie bei den HPMEC zeigten sich keine bedeutsamen Unterschiede in der Schädigung des
Endothelzellverbandes in Abhängigkeit des Stimulans oder der Konzentration von TNFα.
Abb. 61: Unstimulierte HUVEC: lückenloser Endothelverband mit intakter membranöser Anfärbung der Zellgrenzen mit dem Antikörper gegen VE-Cadherin
Abb. 62: HUVEC nach vierstündiger Stimulation mit LPS: nur noch schwache, lückenreiche Anfärbung der Zellmembran mit dem Antikörper gegen VE-Cadherin
Kapitel 3 – Ergebnisse 94 3.2.2.3 24-stündige Stimulation
Nach 24-stündiger Stimulation zeigten die HUVEC eine reduzierte VE-Cadherin-
Antigenexpression, die nahezu identisch war mit dem Expressionsmuster nach
vierstündiger Expression. Auch hier ergab sich keine Abhängigkeit der Expression des VE-
Cadherin-Antigens vom Stimulans oder der Konzentration von TNFα (Tab. 9 und 10).
3.2.2.4 Zusammenfassung
Bei den HUVEC zeigte sich zusammenfassend ein den HPMEC ähnliches Bild. In den
unstimulierten Zellen lag die VE-Cadherin-Antigenexpression zwischen "2" und "3". In
den stimulierten HUVEC zeigte sich eine Schädigung des Endothelzellverbandes (Score
zwischen "1" und "2") (Tab. 9 und 10, Abb. 63 und 64).
Die Stimulation mit LPS ergab Werte von 1,62 (4 h) und 1,93 (24 h) und die Stimulation
mit IFNγ Werte von 1,28 (4 h) und 1,22 (24 h). Die Kombinationsstimulation mit TNFα
und IFNγ ergab Werte von 1,33 (4 h) und 0,81 (24 h). Die jeweiligen Einzelstimulationen
ergaben tendenziell eine geringere Schädigung des Endothelzellverbandes.
Bezüglich der unterschiedlichen Konzentrationen von TNFα ergaben sich Werte, die sehr
nahe beieinander lagen, für die vierstündige Stimulation zwischen 1,52 und 1,6 und für die
Stimulation über 24 Stunden zwischen 1,44 und 1,49.
Die verschiedenen Stimulanzien, die Stimulationszeit und auch die unterschiedlichen
Konzentrationen von TNFα zeigten keine Unterschiede in der Stärke der Schädigung des
Endothelzellverbandes.
Abb. 63: VE-Cadherin-Antigenexpression in HUVEC nach vierstündiger Stimulation mit verschiedenen Stimulanzien: im Vergleich zur Kontrolle (unstimuliert) reduzierte Antigenexpression
HUVEC (4h)
0,00
0,50
1,00
1,50
2,00
2,50
unstim
uliert
LPS
IFN
IFN +
TNF
TNF (3
0 U/m
l)
TNF (1
50 U/m
l)
TNF (3
00 U/m
l)
Kapitel 3 – Ergebnisse 95
Abb. 64: VE-Cadherin-Antigenexpression in HUVEC nach 24-stündiger Stimulation mit verschiedenen Stimulanzien: im Vergleich zur Kontrolle (unstimuliert) reduzierte Antigenexpression Tab. 9: Ergebnisse der Immunofluoreszenz-Färbung für LPS, IFNγ und IFNγ/TNFα
PFA LPS IFNγ IFNγ / TNFα
HPMEC, 4h 2.23 1.4 1.56 1.27
HPMEC, 24 h 2.63 1.58 1.71 1.69
HUVEC, 4h 2.36 1.62 1.28 1.33
HUVEC, 24h 2.49 1.93 1.22 0.81
Tab. 10: Ergebnisse der Immunofluoreszenz-Färbung in Abhängigkeit von den unterschiedlichen Konzentrationen von TNFα PFA 30 U/ml TNFα 150 U/ml TNFα 300 U/ml TNFα
HPMEC, 4h 2.46 1.61 1.59 1.7
HPMEC, 24 h 2.71 1.61 1.89 1.99
HUVEC, 4h 2.18 1.6 1.52 1.56
HUVEC, 24h 2.58 1.46 1.44 1.49
3.2.3 Vergleich der VE-Cadherin-Antigenexpression bei HPMEC und HUVEC
Sowohl bei HUVEC als auch bei HPMEC war die VE-Cadherin-Antigenexpression an den
Zellgrenzen der unstimulierten Zellen deutlich stärker entwickelt als bei den stimulierten
Zellkulturen.
HUVEC (24h)
0,00
0,50
1,00
1,50
2,00
2,50
3,00
unstim
uliert
LPS
IFN
IFN +
TNF
TNF (3
0 U/m
l)
(150
U/m
l)
TNF (3
00 U/m
l)
Kapitel 3 – Ergebnisse 96 Eine Erhöhung der Stimulationszeit und der Konzentration von TNFα führten zu keiner
weiteren Reduktion der VE-Cadherin-Antigenexpression. Tendenziell führte die
Kombinationsstimulation von TNFα und IFNγ bei beiden Zelltypen zu einer etwas
erhöhten Endothelschädigung. Des Weiteren waren keine relevanten Unterschiede in der
Intensität der Stimulation zwischen den einzelnen Substanzen (TNFα, LPS bzw. IFN γ)
erkennbar.
Zwischen den HPMEC und den HUVEC konnten keine relevanten Unterschiede bezüglich
der Expressionsintensität des VE-Cadherin-Antigens festgestellt werden.
Anhand der Bilder zeigte sich aber eine unterschiedliche Verminderung der VE-Cadherin-
Expression. In den HPMEC entsprach die Verminderung im Wesentlichen der Bildung von
Zell-Zell-Lücken und Unterbrechung der VE-Cadherin-Antigenexpression entlang der
Zellgrenzen. Die geringe Anfärbungsintenstität der HPMEC nach Stimulation trat
demgegenüber eher in den Hintergrund.
In den HUVEC entsprach die reduzierte Expression einer extrem schwachen
Immunfluoreszenzreaktion der Endothelien. Eine Lückenbildung mit Unterbrechung der
VE-Cadherin-Antigenexpression war nicht so eindrücklich ausgebildet.
Kapitel 4 - Diskussion 97
4 Diskussion
4.1 Charakterisierung der VE-Cadherin-Antigenexpression entlang der
Lungenstrombahn
Alle 78 untersuchten Patienten zeigten eine kräftige endotheliale VE-Cadherin-
Antigenexpression in den arteriellen Gefäßen (Arterien und Arteriolen) sowie den
Kapillaren und eine im Vergleich dazu deutlich schwächere Expression in den Venolen
und Venen. Tendenziell – nicht signifikant – war die Expression in den Arterien und
Kapillaren stärker ausgeprägt als in den Arteriolen.
Dieses gefäßtypspezifische Expressionsmuster fiel auch bei der getrennten Untersuchung
der Lungengewebsproben der Gruppen der Frauen, Männer, Kinder und Sepsispatienten
auf. Die nicht-signifikante Beobachtung einer besonders starken Anfärbung der Arterien
und Kapillaren fand sich ebenfalls in allen vier Einzelgruppen.
Vergleichbare Untersuchungen zur VE-Cadherin-Expression in pulmonalen Endothelzellen
in situ sind bis dato nicht publiziert. Die hier für Lungengefäße erhobenen Befunde
korrelieren jedoch mit Untersuchungen von Endothelzellen muskulärer Arterien,
Arteriolen, Kapillaren, Venolen und Venen in verschiedenen Organen, darunter der Lunge,
für die die Expression von VE-Cadherin an den Zellgrenzen nachgewiesen wurde
(Lampugnani et al., 1992). Allerdings beschrieben Lampugnani et al. keine Unterschiede
zwischen den Endothelien verschiedener Gefäßtypen. Des Weiteren wurde von der
Forschergruppe eine VE-Cadherin-Expression in Makrophagen nachgewiesen
(Lampugnani et al., 1992). Diese wurde in der vorliegenden Untersuchung nicht
beobachtet. Allerdings wurde hier bei der Färbung des Gewebes die endogene Peroxidase
blockiert und so eine unspezifische Anfärbung der Makrophagen ausgeschlossen.
4.1.1 Heterogenität der Endothelzellen bezüglich Morphologie und Expression
funktionsbestimmender Moleküle
Die in der vorliegenden Arbeit sich darstellende Heterogenität der VE-Cadherin-
Expression in den Endothelzellen der verschiedenen pulmonalen Gefäßtypen korreliert mit
der für verschiedene Gefäßbahnabschnitte in der Literatur beschriebenen Heterogenität.
So wurde eine endotheliale Heterogenität der mikro- und makrovaskulären sowie
arteriellen und venösen Endothelzellen in verschiedenen Organen und Spezies, aber auch
in verschiedenen Kompartimenten im selben Organ beschrieben (Cines et al., 1998;
Kapitel 4 - Diskussion 98 Mantovani et al., 1997; Mantovani et al., 1992; Rajotte et al., 1998; Springer et al., 1995;
Thorin et al., 1997; Volk und Kox, 2000). Diese phänotypische Variation zwischen
Endothelzellen wird durch embryonale Differenzierungsunterschiede, Geschlecht, Alter
und Krankheiten erklärt (McCarron et al., 1994; Marín und Rodríguez-Martínez, 1999;
Risau, 1995).
Im Einzelnen unterscheiden sich Endothelzellen u. a. in ihrer Morphologie (Aird, 2003;
Cines et al., 1998; Murphy et al., 1999; Risau, 1995), Funktion, Expression von
Adhäsionsmolekülen (z. B. VE-Cadherin, ICAM-1, Leukozytenadhäsionsmoleküle) und
Syntheseprodukten, Zytokinen, Peptidsequenzen (molekulare Heterogenität) und
Proteinen, der Wachstumsrate und der Antwort auf endogene Faktoren (Cines et al., 1998;
Gräfe et al., 1994; Grau et al., 1996; Stevens et al., 2000). Daraus ergeben sich
unterschiedliche Antworten auf inflammatorische Signale (Stevens et al., 2000), so dass
abhängig von den endothelialen Eigenschaften bestimmte pathologische Vorgänge auf
einzelne Regionen beschränkt sein können und sich daraus charakteristische
Krankheitsbilder ergeben. Beispiele sind die arterielle und venöse Thrombose, die
Atherosklerose, die verschiedenen Vaskulitiden und die Tumormetastasierung (Cines et al.,
1998).
Analog zur heterogenen VE-Cadherin-Expression in den pulmonalen Gefäßen
unterscheidet sich die Expression anderer endothelialer Moleküle ebenfalls in ihrer
Intensität zwischen den verschiedenen Gefäßtypen: ACE wird sehr stark in pulmonalen
Kapillaren, gefolgt von Arterien und Arteriolen exprimiert, bei nur geringer Expression in
Venen und Venolen (Müller et al., 2004). Im Gegensatz dazu wird der vWf in den
Kapillaren nur sehr schwach exprimiert – mit zunehmendem Gefäßkaliber steigt seine
Expression an (Müller et al., 2002b). In postkapillären Venolen des Systemkreislaufs
finden sich vor allem P-Selectin, E-Selectin und VCAM-1. CD34 wird bevorzugt in
Kapillaren, CD36 in der Mikrovaskulatur exprimiert (Müller et al., 2002a; Springer et al.,
1995). Viele endothelfunktionsbestimmende Moleküle, unter ihnen vWf, Tissue Type
Plasminogen Activator, u-PA, Lu-ECAM-1 (Lung-Specific Endothelial Cell Adhesion
Molecule), Mad-CAM-1 (Mucosal Addressin Cell Adhesion Molecule-1), Granulocyte
Colony-Stimulating Factor, PECAM-1 und IL-6, werden nicht in allen Organen bzw.
Gefäßtypen endothelial exprimiert (Cines et al., 1998).
Analog zu der unterschiedlichen Expression endothelialer Moleküle treten auch bei der
Expression von Rezeptoren Unterschiede auf, die auf die unterschiedlichen Zelltypen und
Differenzierungsstadien zurückzuführen und für die Heterogenität der Endothelzellen
ursächlich sind (Faure et al., 2001).
Kapitel 4 - Diskussion 99 Die gefäßtyp- und organspezifische Expression endothelialer Moleküle und Rezeptoren
erklärt, dass grundlegende Funktionen des Endothels wie die Kontrolle der Hämostase, der
Gefäßtonus, die Zellbewegung, der Nährstoffaustausch, die Barrierenfunktion und
Angiogenese in verschiedenen Abschnitten des Gefäßbaumes unterschiedlich reguliert
werden können (Aird, 2003). Innerhalb kürzester Zeit können Endothelzellen auf äußere
oder innere Einflüsse segmentabhängig und damit sehr selektiv reagieren (Aird, 2003;
Khimenko und Taylor, 1999; Lamm et al., 1988; Parker und Yoshikawa, 2002).
4.1.2 Heterogenität des Endothels in Abhängigkeit von der endothelialen Barrierefunktion
Die Heterogenität des Endothels spiegelt sich auch in der gefäßtypspezifischen Regulation
der Blut-Gewebe-Schranke, die eine zentrale physiologische Funktion des Endothels
darstellt, wider.
Die hier nachgewiesene starke VE-Cadherin-Antigenexpression in den Arterien deutet auf
einen stabilen Endothelverband mit geringer Permeabilität hin, während die schwache
Antigenexpression in den venösen Lungengefäßen auf eine vergleichsweise höhere
Gefäßwandpermeabilität im venösen Schenkel des Lungenkreislaufs hinweist.
Vergleichbares haben Kevil et al. (1998) für den systemischen Kreislauf beschrieben: Das
arterielle Gefäßsystem befördert mit hohem Druck Blut und Plasmabestandteile – ein
Stoffaustausch ist hier nicht erwünscht. Um dies zu gewährleisten, ist eine geringe
Gefäßpermeabilität nötig. In den Venen des systemischen Kreislaufs existiert im
Gegensatz dazu eine höhere Permeabilität, der einen größeren Austausch löslicher Stoffe
erlaubt.
In vitro-Studien zeigten eine stärkere Expression und junktionale Organisation von
Cadherinen, vor allem von VE-Cadherin, in venösen im Gegensatz zu arteriellen
Endothelzellen (Kevil et al., 1998). Hingegen exprimierten beide Endothelzelltypen in vivo
VE-Cadherin in gleicher Weise. Diese Studie weist zum einen auf den Unterschied
zwischen in vitro- und in vivo-Experimenten hin. Der scheinbare Widerspruch zu den hier
präsentierten Ergebnissen, bei denen im menschlichen Lungengewebe die Arterien
eindeutig mehr VE-Cadherin exprimierten als die Venen, kann mit dem Unterschied
zwischen dem systemischen und dem pulmonalen Kreislauf erklärt werden. So
verwendeten Kevil et al. (1998) sowohl für die in vitro- als auch für die in vivo-Studien (en
face preparations) arterielle und venöse Nabelschnurgefäße, während in der vorliegenden
Arbeit Lungengewebe und HPMEC/ HUVEC untersucht wurden.
Dass Kevil et al. (1998) in vivo in venösen Endothelzellen eine schwächere, diffusere und
weniger organisierte Okkludin-Expression und in arteriellen Endothelzellen eine starke
Kapitel 4 - Diskussion 100 kontinuierliche interzelluläre Okkludin-Expression fanden, erklärten sie damit, dass die
Endothelbarriere in den Arterien mehr von Okkludin als von VE-Cadherin und die venöse
Barriere mehr von VE-Cadherin als von Okkludin abhängig ist. Daraus ergab sich im
Versuch eine unterschiedliche Ansprechbarkeit der beiden Gefäßtypen auf eine niedrige
extrazelluläre Calziumkonzentration sowie auf Cytochalasin D.
Ähnliche Ergebnisse erarbeiteten Corada et al. (1999), die in Gefäßendothelien von Herz
und Lunge nach Inkubation mit dem VE-Cadherin-Antikörper BV13 eine diffuse VE-
Cadherin-Neuverteilung in den Mikrogefäßen nachwiesen, mit Ausnahme der Arteriolen,
in denen sich das Verteilungsmuster infolge des Nebeneinanderbestehens von Tight- und
Adhärensjunktionen nicht änderte.
Weitere Untersuchungen ergaben eine Variation der Art der Endothelzelljunktionen
zwischen verschiedenen Segmenten des Gefäßbaumes (Aird, 2003). In Gefäßen mit einem
Durchmesser < 30 µm bildete das Lungenendothel eine eingeschränktere Barriere als das
arterielle oder venöse Endothel (Stevens et al., 2000). Dementsprechend unterschieden sich
in Ratten- und Kaninchenlungen Arterien und Venen bezüglich der pulmonalen
Endothelpermeabilität von den alveolären Kapillargefäßsegmenten (Albert et al., 1985;
Chetham et al., 1999; Kelly et al., 1998; Parker et al., 2002). Auch in verschiedenen
Organen existieren Unterschiede in der Ausprägung der Endothelzelljunktionen mit einem
durch Zonulae occludentes vernetzten kontinuierlichen Endothel im Gehirn und der
Netzhaut, einem diskontinuierlichen Endothel in der Leber, der Milz und den
Knochenmarksinusoiden sowie einem gefensterten Endothel in den Nieren, dem
Intestinaltrakt und den endokrinen Drüsen (Cines et al., 1998). In mesenterialen Venolen
wurde eine lockere, diskontinuierlich organisierte Verteilung von Zonulae occludentes
(Tight-Junktionen), in Arterien, Arteriolen und Kapillaren hingegen eine komplexe
Kombination von Zonulae occludentes mit Ausbildung einer weniger permeablen Barriere
gefunden (Adamson et al., 1998; Simionescu et al., 1975).
Obgleich die Variationen der Oberflächenbeschaffenheit der Endothelien, die von Region
zu Region unterschiedlich sind, sowie die stimulansbedingten Veränderungen der
Endothelzellen wichtig für die Funktion des Endothelmonolayers sind (Davies et al.,
2003), ist die Rolle der Heterogenität im Bezug auf die verschienen Gefäßbetten relativ
wenig untersucht (Cines et al., 1998; Lehr et al., 2000; Thorin et al., 1997).
Kapitel 4 - Diskussion 101 Die Literatur bestätigt somit die Heterogenität des Endothels bezüglich der Expression von
VE-Cadherin an den Interzellularjunktionen.
4.1.3 Einfluss eines Lungentumors auf die VE-Cadherin-Expression
41 Lungengewebeproben wurden im Rahmen von Tumorlobektomien gewonnen. Trotz der
mikroskopischen Begutachtung, dass es sich bei dem für die immunhistochemischen
Untersuchungen verwendeten Material um tumorfreies Gewebe handelt, ist zu diskutieren,
ob eine systemische Wirkung des Tumors die VE-Cadherin-Antigenexpression beeinflusst
hat. Vergleichende Studien über eine mögliche Beeinflussung der Expression der
Adhäsionsmoleküle in tumornahem, jedoch mikroskopisch tumorfreiem Gewebe sind bis
dato nicht veröffentlich worden. Vielmehr gelten Endothelzellkulturen, gewonnen aus im
Rahmen von Tumorlobektomien entnommenem Lungengewebe, als ideales
Untersuchungsgut. So nutzten z. B. Grau et al. (1996) für ihre Arbeit über die
Eigenschaften mikrovaskulärer Endothelzellen bei Patienten mit ARDS als Kontrollgruppe
eine Kultur MVEC (Pulmonary Microvascular Endothelial Cells) aus (makroskopisch
normalem) Lungengewebe, das im Rahmen einer Tumorlobektomie entnommen worden
war.
Corada et al. (2002) untersuchten die VE-Cadherin-Expression in Tumorgefäßen und
fanden in Tumorgefäßen schlecht organisierte Junktionen sowie eine hohe Permeabilität im
Vergleich zu den gesunden Gefäßen. Auch Tumorzellen sind (während der
Metastasierung) fähig, eine lokale Dissoziation mit Bildung von interzellulären Lücken
zwischen Endothelzellen herbeizuführen. Dies ermöglicht den Tumorzellen, in die
Blutzirkulation zu gelangen (Baumgartner et al., 2000). In den hier untersuchten
Lungengewebsproben konnte eine hierzu passende schwache Expression von VE-Cadherin
nicht gefunden werden.
Kapitel 4 - Diskussion 102
4.2 VE-Cadherin-Antigenexpression in regelrechtem Lungengewebe und
Lungengewebe bei septisch bedingtem ARDS
Die Lungenproben mit Zeichen eines ARDS zeigten bei Vergleich mit regelrechten
Lungen eine statistisch signifikante Reduktion der endothelialen VE-Cadherin-
Antigenexpression, wobei diese Reduktion in allen Gefäßtypen nachweisbar war. Dennoch
waren die Arterien, Arteriolen und Kapillaren – entsprechend dem im Gesunden
nachweisbaren gefäßtypspezifischen Verteilungsmuster von VE-Cadherin – nicht ganz so
schwach angefärbt wie die Venen und Venolen.
Die reduzierte VE-Cadherin-Antigenexpression bei Patienten mit septisch bedingtem
ARDS deutet auf eine Verminderung von VE-Cadherin an den endothelialen
Zelljunktionen hin. Dies entspricht der Hypothese, dass Zelladhäsionsmoleküle wie VE-
Cadherin bei ARDS vermindert exprimiert werden, dadurch die Endothelpermeabilität
gesteigert wird und eine Leukozytenextravasation und eine Ödembildung ermöglicht wird.
4.2.1 Zusammenhang zwischen verminderter VE-Cadherin-Expression und
Endothelpermeabilität
Vergleichbare Untersuchungen zur VE-Cadherin-Expression in Gefäßendothelien humaner
Lungen mit septisch bedingtem ARDS liegen derzeit nicht vor.
Zahlreiche Untersuchungen an Zellkulturen zeigten jedoch, dass die Adhäsion von
Leukozyten an Endothelzellen einen Verlust der VE-Cadherin vermittelten Zell-Zell-
Kontakte und einen Anstieg der Endothelpermeabilität induziert (Allport et al., 1997;
Carden et al., 1998; Hermant et al., 2003; Del Maschio et al., 1996; Rosengren et al., 1991;
Tinsley et al., 1999). Aus der gestörten Permeabilität resultiert die fast ungehinderte
Passage hochmolekularer Moleküle und Zellen, die im Weiteren zu einer Ödembildung
führt (Del Maschio et al., 1996; Lampugnani et al., 1992; Petrache et al., 2003).
Eine Exposition von Endothelzellen gegenüber Zytokinen wie TNFα, IFNγ und LPS (die
im Rahmen von Sepsis und ARDS eine Rolle spielen) führte ebenfalls zu einer Zerstörung
der VE-Cadherin-Immunolokalisation mit Bildung von Lücken und einer gestörten
Barrierefunktion (Bannerman et al., 1998; Nwariaku et al., 2002; Petrache et al., 2003;
Shaw et al., 2001a; Wong et al., 1999).
Carden et al. (1998) wiesen per ELISA einen signifikanten Anstieg des löslichem VE-
Cadherins im Plasma von ARDS-Patienten im Vergleich zu Gesunden nach, bedingt durch
die proteolytische Abspaltung des VE-Cadherin bei ARDS.
Kapitel 4 - Diskussion 103 Wong et al. (1999) fanden bei der Untersuchung der VE-Cadherin-Expression in
Mesenterialgefäßen der Ratte nach Zytokinexposition in den Arteriolen und Kapillaren nur
sehr wenige Lücken im Endothel, ganz im Gegensatz zu einer häufigen Lückenbildung in
den Venolen. Das zeigt, dass das endotheliale VE-Cadherin der Venolen zwar stärker von
den Zytokinen affektiert wird, die VE-Cadherin-Expression der Endothelzellen der
Arteriolen und Kapillaren aber ebenfalls betroffen ist. In den vorliegenden Untersuchungen
zeigte sich ein vergleichbares Ergebnis – bei septisch bedingtem ARDS reagierten alle
Gefäße mit einer VE-Cadherin-Reduktion.
Die Literatur bestätigt somit eine verminderte VE-Cadherin-Expression bei Patienten mit
einem ARDS.
4.2.2 Einfluss weiterer Faktoren auf die VE-Cadherin-Expression
Abgesehen von den bei ARDS vermehrt messbaren Zytokinen und Chemokinen, haben
auch weitere Faktoren Einfluss auf die VE-Cadherin-Expression: Externe Stimuli wie
Apo(a) (Pellegrino et al., 2003), Cadmium (Pearson et al., 2003), Thrombin
(Konstantoulaki et al., 2003; Lampugnani et al., 1992; Lim et al., 2001), Elastase (Carden
et al., 1998; Hermant et al., 2003; Lampugnani et al., 1992), oxidativer Stress (Kevil et al.,
1998a; Zhao et al., 2001), EGTA-Behandlung (Liao et al., 2002), erniedrigte
Kalziumkonzentration (Gao et al., 2000; Schnittler et al., 1997), Wasserstoffperoxid und
Diamid (Zhao et al., 2001) führen zu einer verminderten Expression von VE-Cadherin mit
Lückenbildung und verminderter junktionaler Integrität.
4.2.3 Reaktivität des septischen Lungengewebes
Die Reaktivität des Lungengewebes von an septischem ARDS verstorbenen Patienten
wurde durch die Anfärbung mit CD31 nachgewiesen. CD31 (= PECAM), ein pan-
endothelialer Marker für die morphologische Endothelintegrität (Müller et al., 2002), wird
sowohl in regelrechtem Lungengewebe als auch in Proben von Sepsispatienten in allen
Gefäßen gleichmäßig stark exprimiert (Müller et al., 2002). Die gleichmäßige Expression
von CD31 in den Gefäßtypen der untersuchten Lungengewebsproben belegt, dass die
reduzierte VE-Cadherin-Antigenexpression nicht Folge eines schlechten
Erhaltungszustands des Gewebes ist, sondern charakteristisch für die VE-Cadherin-
Expression bei ARDS ist. Die verminderte VE-Cadherin-Expression beruht daher nicht auf
einem defekten Endothel, sondern auf einer Reduktion der endothelialen Zelljunktionen in
Zusammenhang mit dem ARDS.
Kapitel 4 - Diskussion 104
4.3 VE-Cadherin-Antigenexpression bezogen auf Geschlecht und Alter
Der Vergleich der VE-Cadherin-Antigenexpression in den Lungenproben bezüglich des
Kriteriums Geschlecht wies keinerlei Unterschiede in der endothelialen Expression
zwischen Männern und Frauen auf. Es wurden ebenfalls keine Unterschiede der VE-
Cadherin-Antigenexpression zwischen den nach Alter gruppierten Patienten gefunden.
Zum Einfluss dieser beiden Kriterien auf den endothelialen Phänotyp gibt es nur sehr
wenige Untersuchungen. Das mag zum einen damit zusammenhängen, dass man bei der
Expression von Zelladhäsionsmolekülen keinen Unterschied zwischen den Geschlechtern
erwartet. Es hängt aber wohl auch damit zusammen, dass viele Studien an Zellkulturen
durchgeführt werden, bei denen eine Unterscheidung nach Alter und Geschlecht nicht
möglich ist.
In situ-Studien über einen Zusammenhang zwischen der VE-Cadherin-Expression und
Alter bzw. Geschlecht sind bisher nicht publiziert.
In der Literatur beziehen sich die Untersuchungen zu altersabhängigen Veränderungen der
Gefäße überwiegend auf Erkrankungen wie Atherosklerose, Hyalinose u. a.
Jedoch sind Variationen für die Expressionsintensität bestimmter Proteine in pulmonalen
Endothelzellen beschrieben, die sowohl durch das Geschlecht als auch durch das Alter
bedingt sind (Marín und Rodríguez-Martínez, 1999; Müller et al., 2004; Müller et al.,
2002a; Müller et al., 2002b; Müller et al., 2002c; Risau, 1995; Vuong und Berry, 2002). So
fanden Müller et al. (2002a und 2002c) bezüglich CD34 eine mit dem Alter zunehmende
endotheliale Expressionsintensität in Venen und Arterien sowie eine mit dem Alter
abnehmende Expressionsintensität in der pulmonalen Mikrovaskulatur, d. h. den Venolen,
Arteriolen und Kapillaren. Die Expression des vWf in humanen Lungenendothelzellen
nahm mit dem Alter zu (Müller et al., 2002b; Müller et al., 2002c). Des Weiteren wird
zwischen embryonalem und adultem ausdifferenziertem Endothel unterschieden (Risau,
1995). Zu diskutieren wäre hier, dass VE-Cadherin in Mausembryos bei der
Vaskulogenese von Bedeutung ist (Breviario et al., 1995; Vittet et al., 1997).
Die VE-Cadherin-Expression wurde ebenso wie die von ACE, CD34 und vWf durch das
Geschlecht nicht signifikant beeinflusst (Müller et al., 2004; Müller et al., 2002a; Müller et
al., 2002b).
Kapitel 4 - Diskussion 105
4.4 VE-Cadherin-Antigenexpression bezogen auf den Zeitraum zwischen
Todeseintritt und Obduktionszeitpunkt
Bei den Proben der Sepsispatienten – die alle obduziert wurden – wurde überprüft, ob die
Expression von VE-Cadherin mit zunehmendem Zeitraum zwischen Todeseintritt und
Obduktionszeitpunkt abnahm. Interessanterweise konnten keine signifikanten Unterschiede
in Abhängigkeit vom Obduktionszeitpunkt gefunden werden. Als signifikante
Beobachtung zu werten war, dass ein stark erniedrigter Median bei Patienten, deren
Lungenproben mehr als 48 Stunden nach dem Tod gewonnen wurden, zu beobachten war.
Bemerkenswert war auch, dass die Spannbreite der Werte nach diesem Zeitpunkt (> 48
Stunden) auffällig hoch war. Bei der Interpretation der Befunde muss berücksichtigt
werden, dass nur Proben von 20 Patienten zur Verfügung standen. Nach Einteilung in drei
Gruppen (je nach Zeitraum zusammengestellt in "Kleingruppen" von 4, 11 bzw. 5
Patienten) waren statistisch signifikante Aussagen schwierig. Insgesamt deuten die
Befunde darauf hin, dass die VE-Cadherin-Expression nach diesem Zeitraum individuell
unterschiedlich stark nachweisbar war. In jedem Fall zeigen die Befunde, dass VE-
Cadherin noch bis zu drei Tagen postmortal in formalinfixiertem Gewebe nachgewiesen
werden kann.
Tsokos et al. zeigten in Studien, dass endotheliale Adhäsionsmoleküle wie E-Selektin und
ICAM-1, ebenso wie zahlreiche andere Parameter, als immunhistochemische Marker für
die postmortale Diagnose der Sepsis geeignet sind (Tsokos et al., 2000; Tsokos und
Fehlauer, 2001; Tsokos, 2003). Der Aspekt einer evtl. rechtsmedizinisch relevanten
Veränderung der Expression von E-Selektin und ICAM-1 in Abhängigkeit des Zeitraumes
zwischen Tod und Obduktion wurde allerdings nicht diskutiert.
In der vorliegenden Arbeit wurde VE-Cadherin bei septischem ARDS im Vergleich zu
gesundem Lungengewebe vermindert nachgewiesen. Da aber keine Beziehung zwischen
der Zeitspanne zwischen Tod und Obduktionszeitpunkt und der Intensität der VE-
Cadherin-Antigenexpression nachweisbar war, liefern die vorliegenden Befunde keinen
Hinweis dafür, dass VE-Cadherin zur Bestimmung des Todeszeitpunkts innerhalb einer
Spanne von drei Tagen verwendet werden kann.
Kapitel 4 - Diskussion 106
4.5 IRDS
Bei den drei IRDS-Fällen zeigten zwei der Kinderlungen eine vergleichsweise intensive
Anfärbung der Endothelzellen mit dem Antikörper gegen VE-Cadherin, während die dritte
Lunge eine schwache immunhistochemische Reaktion aufwies (analog den Patienten mit
gramnegativer Sepsis). Die Zahl der hier untersuchten Proben ist für eine tendenzielle
Aussage zu klein. Dennoch sollte diskutiert werden, ob VE-Cadherin in den beiden Lungen
mit IRDS nicht vermindert exprimiert wurde, weil IRDS in erster Linie auf eine
Lungenunreife infolge ungenügender Bildung reifen Surfactants zurückzuführen ist. Eine
Ödembildung, die auf eine Störung der Permeabilität und damit auf eine evtl.
Verminderung von VE-Cadherin an den Zellgrenzen hinweist, tritt nicht auf. Bei der
IRDS-Lunge mit einer niedrigen VE-Cadherin-Expression wurde hingegen zusätzlich die
Diagnose einer bronchopulmonalen Dysplasie gestellt, die sich aus einem IRDS
entwickeln kann und bei der es auch zu einer (meist wieder abklingenden)
Entzündungsreaktion kommt. Da eine Entzündung mit einer verminderten Expression von
VE-Cadherin einhergeht, kann dies die verminderte VE-Cadherin-Antigenexpression bei
dieser IRDS-Lunge erklären.
Kapitel 4 - Diskussion 107
4.6 Kritische Anmerkungen zur VE-Cadherin-Untersuchung in situ
Die Bewertung der Lungenpräparate erfolgte semiquantitativ. Eine quantitative – und
damit objektivere – Untersuchung kann mittels DNA- oder RNA-Extraktion des VE-
Cadherin aus dem Gewebe erfolgen. Dass eine DNA- bzw. RNA-Extraktion aus
paraffiniertem Lungengewebe möglich ist, zeigten Shi et al. und Masuda et al. (Shi et al.,
2002; Masuda et al., 1999). Allerdings ergibt sich daraus der Nachteil, dass
morphologische Veränderungen nicht mehr sichtbar werden. Des Weiteren erlauben diese
quantitativen Methoden keinen Nachweis gefäßtypspezifischer Unterschiede der VE-
Cadherin-Expression.
Daher sollten für quantitative Untersuchungen der VE-Cadherin-Antigenexpression in
einer Folgestudie die hier verwendeten Methoden mit einer DNA- bzw. RNA-Bestimmung
nach Lasermikrodissektion kombiniert werden.
Vergleicht man in mehreren Lungenproben ein oder mehrere Merkmale, so sind
Unterschiede im Rahmen der natürlichen Schwankung von "echten", d. h. durch bestimmte
Einflussfaktoren hervorgerufene Veränderungen zu unterscheiden. "Natürliche"
Schwankungen der Probenwerte stechen bei einer kleinen Probenzahl stärker hervor. Je
größer die Anzahl der Proben, desto geringer ist der Einfluss der natürlichen
Schwankungen. Nicht signifikante Unterschiede kommen aber auch dadurch zu Stande,
dass es keine Unterschiede gibt.
Der Unterschied zwischen diesen beiden Fällen lässt sich an den Graphiken verdeutlichen.
Sind die Boxplots der Vergleichgruppen ähnlich hoch, so liegt kein Unterschied vor.
Streuen die Werte sehr stark und ist die Spannweite sehr groß, so ist – vor allem bei einer
geringen Probenzahl – der evtl. erkennbare Unterschied eher zufällig entstanden.
Kapitel 4 - Diskussion 108
4.7 VE-Cadherin-Antigenexpression in Zellkulturen (HPMEC und HUVEC)
In den Zellkulturen ergab sich eine kontinuierliche Antigenexpression von VE-Cadherin an
den Grenzen der unstimulierten Endothelzellen sowohl bei den HPMEC (= Modell für
mikrovaskuläre Endothelzellen) als auch bei den HUVEC (= Modell für makrovaskuläre
Endothelzellen).
Der Nachweis einer kontinuierlichen interendothelialen Expression von VE-Cadherin in
Endothelzellkulturen ist mehrfach beschrieben worden (Davies et al., 2003; Hordijk et al.,
1999; Lampugnani et al., 1992; Lim et al., 2001) und wurde bei zahlreichen
Zellkulturuntersuchungen zur VE-Cadherin-Expression unter externer Stimulation als
gegeben vorausgesetzt.
In der Literatur finden sich zudem Aussagen über Unterschiede zwischen mikro- und
makrovaskulären Endothelzellen: Mantovani et al. (1992) beschreiben bezüglich einer
Aktivierung durch Zytokine, dass die Ergebnisse in makrovaskulären Endothelzellen auf
mikrovaskuläre Endothelzellen übertragen werden können. Sie betonen jedoch, dass es
Unterschiede zwischen Endothelzellen aus verschiedenen anatomischen Regionen oder
von verschiedenen Kompartimenten desselben Organs in Bezug auf die Antwort auf
Zytokine gibt.
Mehrheitlich ist man jedoch der Meinung, dass zwischen HUVEC und HPMEC bzw.
makro- und mikrovaskulären Endothelzellen in vielen Aspekten Unterschiede bestehen
(Burns et al., 2003; Cines et al., 1998; Gräfe et al., 1994; Grau et al., 1996; Mantovani et
al., 1997; Mantovani et al., 1992; Risau, 1995; Springer et al., 1995; Stevens et al., 2000).
Das betrifft zum einen phänotypische/morphologische Unterschiede (Burns et al., 2003),
unterschiedliche biochemische Eigenschaften (Gräfe et al., 1994) und Unterschiede in der
Antigenexpression. So wird ICAM-1 in der Lunge in der Mikro- gegenüber der
Makrovaskulatur vermehrt exprimiert (Grau et al., 1996). Im Herzen zeigte sich u. a. eine
Heterogenität bezüglich der Expression von Bradykinin und Plasminogen Aktivator
Inhibitor-1 in mikro- und makrovaskulären Zellen (Gräfe et al., 1994). Unterschiede
zwischen HUVEC und Aortenzellen von Rindern (Friedl et al., 2003) und zwischen
PMECs (Human Pulmonary Microvascular Endothelial Cells) und PAECs (Rat Pulmonary
Arterial Endothelial Cells) (Wang et al., 2002) wurden insbesondere bezüglich der
Endothelpermeabilität und der Neutrophilenadhäsion nach Stimulation mit TNFα
beschrieben.
Kapitel 4 - Diskussion 109 Im Gesamten besteht zwar eine Heterogenität zwischen makro- und mikrovaskulären
Endothelzellen, endotheliale Marker – so auch das hier untersuchte VE-Cadherin – werden
aber mehrheitlich von beiden Zellformen exprimiert (Imaizumi et al., 1997; Zimmerman et
al., 1999). Dies erfordert somit in jedem Einzelfall eine Prüfung bezüglich der
Vergleichbarkeit von mikro- und makrovaskulären Endothelzellen.
Kapitel 4 - Diskussion 110
4.8 VE-Cadherin-Antigenexpression in unstimulierten Zellkulturen im Vergleich zu
stimulierten Zellkulturen
Wie auf Grund der in situ-Befunde erwartet, wiesen die stimulierten Zellkulturen
gegenüber den unstimulierten kultivierten Zellen eine verminderte Expression von VE-
Cadherin auf, einhergehend mit einer deutlichen Lückenbildung im Zellverband. Das VE-
Cadherin war an den Endothelzellgrenzen lediglich in Form eines unterbrochenen und
gestreift bzw. punktförmigen Musters nachweisbar.
In der Literatur finden sich vergleichbare in vitro-Ergebnisse: Hordijk et al. (1999)
beschrieben, dass das VE-Cadherin nach Stimulation "gestreift" oder "gezackt" exprimiert
wurde, während es vorher linear verteilt war. Sie sahen diese veränderte VE-Cadherin-
Expression durch einen Verlust der Aktinstressfasern bedingt. Auch Lampugnani et al.
(1992) berichteten, dass VE-Cadherin nach Stimulation mit TNFα und IFNγ nur noch
punktförmig an den Zell-Zell-Kontakten vorhanden war. Davies et al. (2003) zeigten eine
Veränderung der ehemals kontinuierlichen Struktur von VE-Cadherin entlang den
Zellrändern hin zu punktförmiger VE-Cadherin-Expression als Reaktion auf Shear Stress
(Davies et al., 2003). Ebenso beschrieben Lim et al. (2001) eine kontinuierliche Expression
von VE-Cadherin entlang der Zellgrenzen intakter Zellen, im Gegensatz zu einer
fleckförmigen Verteilung mit Bildung von Lücken zwischen Zellen, die mit Thrombin,
EGTA oder H2O2 stimuliert wurden. Viele Agenzien führen zu einer diffusen
Umverteilung von VE-Cadherin mit Bildung von Lücken ("gaps") einhergehend mit einer
reduzierten Expression von VE-Cadherin (Davies et al., 2003, Gulino et al., 1998; Hordijk
et al., 1999; Lampugnani et al., 1992; Lim et al., 2001; Navarro et al., 1995).
4.8.1 Analyse der Stimulationsfaktoren
Zwischen den mit LPS, TNFα und IFNγ stimulierten Kulturen war kein
Unterschied in der VE-Cadherin-Expression zu beobachten. Strieter et al. (1999)
begründen dies mit ähnlichen pathophysiologischen Effekten von TNFα und LPS.
4.8.1.1 Stimulation mit TNFα
Nach Stimulation der Zellkulturen (HPMEC und HUVEC) mit TNFα in verschiedenen
Konzentrationen (30, 150, 300 U/ml) und Stimulationszeiten von 4 bzw. 24 Stunden zeigte
sich, unabhängig von den Faktoren Konzentration und Zeit, im Vergleich zu den
Kapitel 4 - Diskussion 111 unstimulierten Zellkulturen eine verminderte Expression von VE-Cadherin an den
Endothelzellgrenzen, sowie die Ausbildung interendothelialer Lücken.
Zur Stimulation von Zellkulturen mit TNFα existieren zahlreiche Studien, die zu
unterschiedlichen Ergebnissen kommen: Dass das bei Sepsis und ARDS freigesetzte
Zytokin TNFα zu einer gesteigerten Permeabilität des Endothelzellmonolayer,
interzellulärer Lückenformation und Neuverteilung/Verlust von membranständigem VE-
Cadherin führt, wurde vielfach beschrieben (Friedl et al., 2002; Hofmann et al., 2002;
Nwariaku et al., 2002; Petrache et al., 2003; Wojciak-Stothard et al., 1998). Auch in der
vorliegenden Arbeit zeigte sich ein Zusammenhang zwischen TNFα-Stimulation und
verminderter VE-Cadherin-Expression.
Andere Studienergebnisse kommen zu dem Schluss, dass die Stimulation der
Endothelzellen mit TNFα die VE-Cadherin- und Cateninverteilung und die
Endothelpermeabilität nur in Anwesenheit von neutrophilen Granulozyten verändert, bei
alleiniger TNFα-Stimulation diese Veränderungen am Endothel jedoch nicht auftreten
(Allport et al., 1997; Friedl et al., 2003; Del Maschio et al., 1996). In einigen Experimenten
konnte eine Permeabilitätssteigerung nur im Zusammenspiel mit IFNγ nachgewiesen
werden (s. u.).
Bezüglich der Abhängigkeit der VE-Cadherin-Expression von der Dauer der Stimulation
fanden Del Maschio et al. (1996) keinen Unterschied zwischen einer Stimulation für 4, 6
oder 20 Stunden mit TNFα. Auch in der vorliegenden Arbeit ließ sich kein Unterschied
zwischen einer 4- bzw. 24-stündigen Stimulation belegen. Hieraus ist aber nicht ohne
weiteres abzuleiten, dass keine zeitabhängigen Unterschiede für die VE-Cadherin-
Expression bestehen. Wojciak-Stothard et al. (1998) beschrieben, dass eine Lückenbildung
frühestens 15 Minuten nach TNFα-Addition zu beobachten war, teilweise auch erst nach 1
- 1,5 Stunden. Es ist daher zu diskutieren, dass die Zeiträume, die von Del Maschio et al.
(1996) und in der vorliegenden Arbeit (mit 4 Stunden als kürzester Inkubationszeit)
gewählt wurden, keine direkte Aussage über eine variierende VE-Cadherin-Expression
infolge zeitabhängiger TNFα-Stimulation in den ersten vier Stunden zulassen. Jedoch kann
man ableiten, dass nach vierstündiger Stimulation im weiteren Verlauf der Zeitfaktor bei
der Stimulation mit TNFα keine Rolle mehr spielt.
4.8.1.2 Stimulation mit IFNγ
Wie bei TNFα führte auch die Stimulation mit IFNγ zu einer reduzierten VE-Cadherin-
Expression an den Endothelzellgrenzen der HPMEC und HUVEC. Wie bei TNFα konnte
Kapitel 4 - Diskussion 112 zeitunabhängig nach 4 bzw. 24 Stunden die Bildung von Lücken im Endothelzellverband
nachgewiesen werden. Dieses Ergebnis stimmt mit Befunden in der Literatur überein,
wobei Studien zu IFNγ und VE-Cadherin im Vergleich zur Literatur über TNFα und TNFα
plus IFNγ rar sind.
Vorbeschrieben ist, dass IFNγ allein signifikant die Expression von VE-Cadherin senkt mit
konsekutiver Bildung von Lücken im endothelialen Monolayer und zu einer gesteigerten
Permeabilität führt (Minagar et al., 2003; Shaw et al., 2001a). Die Bedeutung von IFNγ bei
der Migration von Neutrophilen zeigten Versuche mit IFNγ-defizienten Mäusen, die einen
Defekt der Neutrophilen-Migration aufwiesen (Doerschuk et al., 2000). Bezüglich des
Expressionsprofils bei Stimulation mit IFNγ sind keine Aussagen über die VE-Cadherin-
Expression in den ersten vier Stunden bekannt. Auch die vorliegende Arbeit erlaubt
hierüber keine Aussagen. Daher sollte in einer Folgestudie die Antigenexpression von VE-
Cadherin während der ersten vier Stimulationsstunden untersucht werden.
4.8.1.3 Stimulation IFNγ plus TNFα
Die Stimulation der Zellkulturen (HPMEC und HUVEC) mit TNFα plus IFNγ zeigte
unabhängig von einer Stimulation über 4 bzw. 24 Stunden ebenfalls eine verminderte VE-
Cadherin-Expression im Vergleich zu den unstimulierten Zellen. Dies äußerte sich auch in
der Bildung von Lücken ("gaps"). In der Literatur findet man eine Bestätigung dieser
Ergebnisse (Lampugnani et al., 1992; Mark und Miller, 1999; Rival et al., 1996; Shaw et
al., 2001a; Wong et al., 1999). Demnach aktivieren TNFα und IFNγ lokal das Endothel,
induzieren Leukozytenakkumulation, steigern die Endothelzellpermeabilität und führen
durch die Neuverteilung u. a. von VE-Cadherin zu dessen Abwesenheit an den lateralen
Junktionen der HUVEC-Monolayer. INFg alleine oder TNFα plus IFNγ steigern
signifikant die Permeabilität (Shaw et al., 2001a). TNFα alleine oder TNFα plus IFNγ
führen zu einem Anstieg der Neutrophilen- und Monozyten-Adhäsion und der
Transmigration (Mark und Miller, 1999; Wong et al., 1999).
Ebenso wirken TNFα und LPS an Endothelzellen synergistisch und potenzieren die
adhäsiven Eigenschaften dieser Zellen (Jersmann et al., 2001). Dabei ist zu
berücksichtigen, dass Endotoxine ihrerseits die Produktion von Zytokinen wie TNFα und
IFNγ induzieren (Carlos und Harlan, 1994; Cohen, 2002; Morrison und Ryan, 1987).
Im Gegensatz zu den hier präsentierten Ergebnissen fanden Wong et al. (1999) in ihren
Untersuchungen eine statistisch nicht-signifikante Dosis-abhängige Endothelantwort. So
stieg die Anzahl der affektierten Zellen in Abhängigkeit von der steigenden
Zytokinkonzentration von TNFα und IFNγ. In der vorliegenden Arbeit konnte jedoch eine
Kapitel 4 - Diskussion 113 tendenziell etwas stärkere Schädigung des Endothelzellverbandes durch die
Kombinationsstimulation (TNFα und IFNγ) im Vergleich zu den jeweiligen
Einzelstimulationen beobachtet werden.
4.8.1.4 Stimulation mit LPS
LPS führte ebenfalls zu einer von der Stimulationszeit von 4 bzw. 24 Stunden
unabhängigen Verminderung der VE-Cadherin-Lokalisation an den Zellgrenzen der
HPMEC und HUVEC sowie einer Lückenbildung im Zellmonolayer. Diese Ergebnisse
stehen im Einklang mit der Literatur: LPS (Lipopolysaccharid), das Endotoxin
gramnegativer Bakterien, induziert eine gesteigerte Endothelpermeabilität bereits nach
zweistündiger LPS-Exposition, die mit längerer Einwirkzeit zunimmt (Bannerman et al.,
1998; Goldblum et al., 1994). Die gesteigerte Permeabilität infolge des reduzierten
Endothelzellzusammenhaltes beruht dabei auf einer Dissoziation des Cadherin-Catenin-
Komplexes durch LPS, der Dosis- und Zeit-abhängig erfolgt (Bannerman und Goldblum,
1999; Bannerman et al., 1998). Die Dissoziation des Komplexes bedingt auch die
verminderte VE-Cadherin-Expression an den Zellgrenzen. Das VE-Cadherin ist nun nicht
mehr mit dem Zytoskelett verknüpft und kann zur Seite dissoziieren oder wird
internalisiert. Da schon nach zweistündiger LPS-Stimulation die Endothelpermeabilität
gesteigert wird und in der vorliegenden Arbeit nur die Stimulation über 4 bzw. 24 Stunden
untersucht wurde, kann hier nicht entschieden werden, wie das Expressionsprofil nach
Stimulation mit LPS in den ersten vier Stunden aussieht. Es kann jedoch festgestellt
werden, dass nach mehr als vier Stunden der Zeitfaktor keinen Einfluss auf die VE-
Cadherin-Antigenexpression hat.
4.8.2 Verbesserung der Zellkulturversuche
Die Ergebnisse der Zellkulturen stellen lediglich eine semiquantitative Beobachtung dar.
Eine quantitative Analyse der VE-Cadherin-Moleküle mittels ELISA (Enzyme-Linked
Immuno Sorbent Assay) bietet eine objektivere Quantifizierung, allerdings kann mit dieser
Methode das morphologische Bild der Endothelzellen – z. B. die Ausbildung von
Endothelzelllücken nicht beobachtet werden. Auch andere Methoden wie eine RNA-
(Northern Blot), DNA-Extraktion (Southern Blot) oder ein Proteinnachweis (Western Blot)
sind quantitativ verlässlicher. Western und Northern Blotting-Untersuchungen wurden von
Kevil et al. (1998) für VE-Cadherin durchgeführt. In einer Folgestudie sollten solche
quantitativen Untersuchungen der VE-Cadherin-Antigenexpression mit den hier
verwendeten (morphologischen) Methoden kombiniert werden.
Kapitel 4 - Diskussion 114 Um eine bessere Annäherung der Zellkulturen an die in situ-Verhältnisse zu erreichen,
züchteten Grau et al. (1996) Kulturen aus mikrovaskulären pulmonalen Zellen von an
ARDS verstorbenen Patienten. Eine weitere Verbesserung wäre die Kultivierung
pulmonaler Endothelzellen von an septischem ARDS erkrankten Patienten, gewonnen im
Rahmen einer bronchioloalveolären Lavage (BAL). Bei Entnahme der Zellen zu
verschiedenen Zeitpunkten und Stadien der Erkrankung könnten eine Verlaufskontrolle
erfolgen und evtl. weitere Pathomechanismen aufgedeckt werden. Dies ist allerdings aus
ethischen Gründen nicht zu empfehlen, da die BAL bei diesen schwerkranken Patienten
aus rein diagnostischen oder wissenschaftlichen Gründen in der Regel nicht durchgeführt
wird. Hingegen dürfte die vergleichende Untersuchung der VE-Cadherin-Expression
pulmonaler Endothelzellen von an ARDS verstorbenen Patienten im Gegensatz zu extern
stimulierten kultivierten Endothelzellen keinerlei ethische Probleme darstellen.
Kapitel 4 - Diskussion 115
4.9 Zellkulturen (HPMEC und HUVEC) als Modell für die VE-Cadherin-Expression
in humanem Lungengewebe
Die Ergebnisse der Untersuchungen an humanem Lungengewebe ergaben eine
abgeschwächte endotheliale VE-Cadherin-Expression bei Lungen mit septisch bedingtem
ARDS. Auch in den Zellkulturen fand sich nach Stimulation der Zellen mit LPS, TNFα
und IFNγ eine verminderte Expression von VE-Cadherin an den Zellgrenzen. Die
Zellkulturen erscheinen somit als geeignetes Modell der in vivo-Situation. Jedoch zeigte
sich bei Betrachtung der VE-Cadherin-Expression der gesunden und septischen Lungen
eine starke Expression in den Arterien, Arteriolen und Kapillaren und eine deutlich
schwächere Expression von VE-Cadherin in den Venolen und Venen.
In den Zellkulturen kann diese gefäßtypspezifisch unterschiedliche Expression nicht
nachgewiesen werden, da HPMEC (Human Pulmonary Microvascular Endothelial Cells)
eine Mischung verschiedener mikrovaskulärer Endothlzellen, d. h. Arteriolen, Kapillaren
und Venolen, darstellen. Der Unterschied der VE-Cadherin-Expression in situ zwischen
Arteriolen und Kapillaren auf der einen und den Venolen auf der anderen Seite war
hingegen beträchtlich. Die HUVEC (Human Umbilical Vein Endothelial Cells) sind
venöse Endothelzellen (der Nabelschnur), die 1. arterielles Blut führen und 2. als Modell
für Makrogefäße (Arterien und Venen) dienen, welche in situ ebenfalls einen deutlichen
Unterschied in der VE-Cadherin-Antigenexpression zeigten. Des Weiteren können
Kriterien wie Alter und Geschlecht an Zellkulturen, wenn überhaupt, dann nur
eingeschränkt untersucht werden. Das schränkt die Bedeutung der Zellkulturen bei
gewissen Fragestellungen ein.
Kevil et al. (1998) zeigten eine gleichmäßige interzelluläre Verteilung von VE-Cadherin in
venösen und arteriellen Endothelzellen des Menschen in vivo (= en face-Präparationen
menschlicher Nabelschnurvenen und -arterien), im Vergleich zu einer ausschließlich in den
Venen zu findenden interzellulären VE-Cadherin-Expression in vitro (= Zellkulturen aus
menschlichen Nabelschnurvenen und -arterien). Auch Lehr et al. (2000) fanden
Unterschiede in der Expression zwischen HUVEC und in situ-Endothelzellen für einige
Parameter, obgleich sie generell eine gute Übereinstimmung zwischen HUVEC und in
situ-Endothelzellen sahen.
Grau et al. (1996) züchteten MVEC (Pulmonary Microvascular Endothelial Cells) aus
ARDS-Lungen von frisch verstorbenen Patienten und Kontroll-MVEC mit dem Gedanken,
dass die Zellkulturen den Endothelzellen eines ARDS in situ entsprechen. Die
Kapitel 4 - Diskussion 116 Beobachtungen wurden jedoch ausschließlich an Zellkulturen erhoben und ermöglichen
daher keinen Vergleich mit in situ-Befunden.
Aufschlussreich wäre ein Vergleich von extern stimulierten primären endothelialen
Zellkulturen und Zellkulturen, gewonnen aus erkranktem Lungengewebe, sowie ein
Vergleich von Endothelzellkulturen und in situ-Lungenproben, welche beide aus derselben
Patientengruppe entnommen wurden. Aus den sich daraus ergebenden Ergebnissen
könnten Unterschiede und Übereinstimmungen zwischen den Zellkulturen und in situ-
Proben besser analysiert und Differenzen bezüglich VE-Cadherin-Expression aufgedeckt
werden.
Zusammenfassend ist festzustellen, dass kein isoliertes Zellmodell den in situ-Zustand
identisch wiedergeben kann. Die zurzeit vorhandenen in vitro-Modelle sind daher als
Annäherungen an die intakten in vivo-Endothelzellverbände zu verstehen (Albelda et al.,
1988). Jedoch bieten diese Zellkulturen den großen Vorteil, dass an ihnen in situ-
Beobachtungen unter standardisierten Bedingungen überprüft werden können. Man muss
sich dabei jedoch der Grenzen der Kultursysteme bewusst sein und ein geeignetes in vivo-
System zum Vergleich heranziehen (Friedl et al., 2003; Risau, 1995; Zimmerman et al.,
1999).
Kapitel 4 - Diskussion 117
4.10 Zusammenfassung
Die in situ-Ergebnisse mit einer verminderten Expression von VE-Cadherin in Lungen mit
durch gramnegative Sepsis bedingtem ARDS werden durch die Zellkulturversuche
bestätigt und stehen in Einklang mit der Literatur. Die reduzierte VE-Cadherin-Expression
und die daraus sich ergebende reduzierte endotheliale Zelladhäsion ist daher neben anderen
Kausalfaktoren als eine Teilursache der erhöhten Gefäßpermeabilität und der gesteigerten
Leukozytenextravasation bei dem Krankheitsbild des ARDS anzusehen.
Dies wirft die Frage nach der Regulation von VE-Cadherin und seinem Einfluss auf die
Transmigration von Leukozyten durch das Endothel sowie auf Unterschiede zwischen dem
Lungen- und Systemkreislauf auf.
Kapitel 4 - Diskussion 118
4.11 Regulation von VE-Cadherin
Das Zytoskelett ist an der Aufrechterhaltung des Cadherin-Catenin-Komplexes und an der
strukturellen Integrität der Monolayer beteiligt (Davies et al., 2003; Lim et al., 2001;
Petrache et al., 2003).
4.11.1 Pathomechanismus der Reduktion der VE-Cadherin-Antigenexpression
Für die veränderte Verteilung des VE-Cadherin werden folgende Strukturen und
Mechanismen diskutiert: An den Zonula Adhaerentes, der Region der Plasmamembran, die
die homotypische Zell-Zell-Adhäsion vermittelt, ist das transmembranäre Cadherin mit
dem darunterliegenden Aktinzytoskelett durch einen intrazellulären Komplex aus
zahlreichen Proteinen verknüpft (Alexander und Elrod, 2002; Dejana et al., 1995).
Während der ersten Stunden nach Auftreten eines "Störfaktors" (z. B. Zytokine,
Leukozyten, oxidativer Stress) dissoziieren periphere Aktin-Bänder und die Verteilung von
VE-Cadherin, Plakoglobin, α- und β-Catenin ändert sich von der kontinuierlichen Struktur
entlang den Zellrändern hin zu punktierten Komplexen, die nur in Gebieten des Kontaktes
zwischen angrenzenden Zellen ausgebildet werden (Davies et al., 2003; Lim et al., 2001).
Dieser Vorgang der interendothelialen Lückenbildung erfolgt nicht gleichmäßig an allen
Zell-Zell-Kontakten, sondern diskontinuierlich, wobei zahlreiche Kontaktzonen intakt
bleiben. Die "Auflösung" der Junktionen ist demnach nicht ein "Alles-oder-nichts-
Phänomen", sondern ein lokalisierter Prozess. Dieses Phänomen könnte durch die Existenz
von wenigstens zwei Typen von Adhärensjunktionen erklärt werden, die in verschiedenen
Zonen entlang der Zellgrenzen verteilt sind, wobei nur ein Typ für die Zerreißung anfällig
ist.
An Mesenterialvenen konnte gezeigt werden, dass die Veränderungen der VE-Cadherin-
Organisation mit Bildung von interzellulären Lücken dort stattfindet, wo auch
Plasmaproteine und das Zytoskelett verändert sind. Des Weiteren zeigte das
Aktinmikrofilament eine dem VE-Cadherin-Molekül sehr ähnlich lokalisierte Verteilung
(Wong et al., 1999). Dem widerspricht nicht, dass in den 90er Jahren des letzten
Jahrhunderts ein "neuer" Typ der Endothelzell-Junktion beschrieben wurde und zwar die
"Complexus Adhaerentes", bei der VE-Cadherin über γ-Catenin mit dem intermediären
Filamentzytoskelett verknüpft ist (Kowalczyk et al., 1998; Valiron et al., 1996). Telo' et al.
(1998) beschrieben ein Cadherin (VE-Cadherin 2), welches an den interzellulären
Junktionen vorhanden ist und adhäsive Eigenschaften besitzt. Es ist aber nicht an Catenine
Kapitel 4 - Diskussion 119 gebunden und zeigt nur eine schwache Assoziation mit dem Zytoskelett. Außerdem
beeinflusst das VE-Cadherin 2 nicht die parazelluläre Permeabilität, die Zellmigration und
das Zellwachstum. Die von Telo' et al. beschriebene schwache Assoziation des VE-
Cadherin 2 mit dem Zytoskelett, lässt keinen Rückschluss darüber zu, ob es sich dabei um
Aktin-abhängiges oder Aktin-unabhängiges VE-Cadherin handelt. Eine schwache bzw.
keine Verbindung mit dem Aktin-abhängigen Zytoskelett charakterisiert das über
Desmoplakin (Desmoplakin: kein Catenin) mit dem intermediären Filament verknüpfte
VE-Cadherin, das dementsprechend mit dem VE-Cadherin 2 übereinstimmen könnte.
Derzeit ist allgemein anerkannt, dass das VE-Cadherin sowohl an das Aktin als auch an
das intermediäre Filament-Zytoskelett (v. a. Vimentin) gebunden ist, an letzteres aber laut
Vincent et al. (2004) und Angst et al. (2001 und 2001a) über das Desmoplakin und nicht
über γ-Catenin (Kowalczyk et al., 1998; Lim et al., 2001).
Für eine unterschiedliche Empfindlichkeit zwischen dem Aktin-verknüpften und dem
Desmoplakin-verknüpften VE-Cadherin spricht auch die Studie von Lim et al. (2001). Sie
konnten zeigen, dass das membranäre, nicht mit dem Zytoskelett verankerte, VE-Cadherin
ein Ziel für die potenzielle Bildung interzellulärer Lücken ist. Verschwindet das
membranäre VE-Cadherin entzündungsbedingt von der Zellmembran, so wird es an den
verbleibenden Stellen des Zell-Zell-Kontakts zurückgezogen und Aktin-unabhängig, d. h.
über γ-Catenin oder Desmoplakin, mit dem Zytoskelett verknüpft.
Ob das an das intermediäre Filament gebundene VE-Cadherin tatsächlich anders auf eine
Stimulation mit Zerreißung des VE-Cadherin-Catenin-Komplexes reagiert, bleibt jedoch
weiter unklar.
4.11.2 Phosphorylierung und Dephosphorylierung
Hinter dem Phänomen des "Verschwindens" von VE-Cadherin von den endothelialen
Zelljunktionen stehen biochemische Veränderungen in Form äußerst komplizierter und
noch nicht endgültig erforschter Regulationsmechanismen. Einer davon ist die
Phosphorylierung bzw. Dephosphorylierung von VE-Cadherin, deren dynamisches
Gleichgewicht eine entscheidende Rolle für die Aufrechterhaltung und Regulation des VE-
Cadherin-Catenin-Komplexes und somit der VE-Cadherin-vermittelten Zell-Zell-Adhäsion
spielt (Alexander und Elrod, 2002; Dudek und Garcia, 2001; Gulino et al., 1998; Tinsley et
al., 1999).
Phosphorylierung des Cadherin-Catenin-Komplexes über die Tyrosinkinase führt zu einer
diffusen Verteilung von VE-Cadherin, einhergehend mit einer reduzierten Zell-Zell-
Adhäsion und einer gesteigerten Endothelpermeabilität (Guo et al., 2004; Konstantoulaki
Kapitel 4 - Diskussion 120 et al., 2003; Sandoval et al., 2001; Tinsley et al., 1999; Ukropec et al., 2000). Die
zytoplasmatischen Catenine dissoziieren vom VE-Cadherin in dünne Membranvorsprünge
in den interendothelialen Lücken. Daraus ergeben sich weitere Veränderungen am
Zytoskelett wie Aktinneuorganisation und Veränderungen der Zellgestalt der
Endothelzellen (Bannerman und Goldblum, 1999; Konstantoulaki et al., 2003).
Viele andere Eigenschaften, unter anderem aber die Auswirkung der Phosporylierung /
Dephosphorylierung auf das VE-Cadherin, wurden an CHO-Zellen (Chinese Hamster
Ovary Cells) erforscht, die erst nach Genimplantation VE-Cadherin exprimierten (VE-
Cadherin-Transfected Clones) (Breviario et al., 1995). Das hat den Vorteil, dass das
Modell sehr gut kontrolliert und eine Beeinflussung der Ergebnisse durch vorbestehendes
VE-Cadherin ausgeschlossen werden kann. Bei Experimenten an diesen Zellen konnte
gezeigt werden, dass die Expression von VE-PTP (Vascular Endothelial Protein Tyrosine
Phosphatase) über die Dephosphorylierung die VE-Cadherin-vermittelte
Barrierenintegrität des zellulären Monolayer steigert (Nawroth et al., 2002).
Was passiert mit dem VE-Cadherin, wenn es von den Zelljunktionen "verschwindet"?
Dazu wurden mehrere Theorien entwickelt wie die Internalisation/Endozytose, die
Proteolyse und die Diffusion von VE-Cadherin innerhalb der Plasmamembran mit
Spaltung des VE-Cadherin-Catenin-Komplexes.
4.11.3 Internalisation / Endozytose
Zahlreiche Autoren diskutieren in erster Linie eine Endozytose bzw. Internalisation des
VE-Cadherin-Moleküls (Gao et al., 2000; Gulino et al., 1998; Del Maschio et al., 1996;
Vincent et al., 2004). Nach Gulino et al. (1998) wird VE-Cadherin innerhalb des
Zytoplasmas verteilt und im endoplasmatischen Retikulum gespeichert. Die
Wiederherstellung von Zell-Zell-Kontakten erfolgt dementsprechend durch Rekrutierung
bestehender Moleküle oder ihrer Neusynthese. Gao et al. (2000) sind der Ansicht, dass
ungebundenes VE-Cadherin, das während der Entzündungsreaktion aus den Junktionen
freigesetzt worden ist, ins Zellinnere verlagert wird. Das intrazelluläre VE-Cadherin kann
während der Wiederausbildung der Adhärensjunktionen aber sehr schnell wieder zur
Verfügung gestellt werden. Die Reversibilität der Verlagerung von VE-Cadherin in die
Zelle spricht für Gao et al. (2000) gegen eine Entkopplung des Cadherins von den
Cateninen und damit gegen eine Internalisation der einzelnen Komplexkomponenten. Ihrer
Meinung nach wird der VE-Cadherin-Catenin-Komplex komplett ins Zellinnere verlagert.
Kapitel 4 - Diskussion 121 Bei Betrachtung der Lungenpräparate und der Zellkulturen fällt auf, dass in ARDS-Lungen
und in stimulierten Zellkulturen vergleichsweise weniger VE-Cadherin nachweisbar war.
Diese deutliche Reduktion von VE-Cadherin an den Zellgrenzen widerspricht der These,
dass das VE-Cadherin internalisiert wird, nicht.
4.11.4 Proteolyse
Von anderen Autoren wird eine Spaltung/Proteolyse des VE-Cadherin durch die
neutrophile Elastase berichtet (Carden et al., 1998; Hermant et al., 2003). Werden HUVEC
menschlicher neutrophiler Elastase ausgesetzt, kommt es zu einer Proteolyse von 141 kDa
VE-Cadherin, mit Bildung von 92- und 50-kDa-Fragmenten. Die Menge an intaktem VE-
Cadherin in HUVEC wurde durch die Exposition mit aktivierten Neutrophilen signifikant
reduziert (Carden et al., 1998). Gulino et al. (1998) hingegen sprechen nur von einer
Internalisation mit Speicherung des VE-Cadherin im endoplasmatischen Retikulum,
schließen aber eine endozytäre Degradation des VE-Cadherin-Komplexes aus. Unklar
bleibt, ob das VE-Cadherin dennoch an anderer Stelle gespalten wird. Da die Gruppe um
Gulino aber von einer anschließenden Neusynthese des Moleküls spricht, ist dies wohl so
zu verstehen.
Sowohl bei der Proteolyse als auch bei der Internalisation kommt es zu einer Reduktion
von VE-Cadherin an den Endothelzellgrenzen. Dementsprechend kann anhand den in der
vorliegenden Arbeit durchgeführten Untersuchungen keiner der beiden Mechanismen
ausgeschlossen werden.
4.11.5 Diffusion
Eine weitere Möglichkeit bestünde in der lateralen Diffusion der VE-Cadherin-Moleküle
innerhalb der Endothelzellmembran (Burns et al., 2003; Hermant et al., 2003; Hordijk et
al., 1999; Miao et al., 2005; Navarro et al., 1995; Shaw et al., 2001; Wong et al., 1999).
In der Real-Time Betrachtung der Transmigration von Leukozyten durch einen
Endothelmonolayer wurde keine Proteolyse von VE-Cadherin beobachtet, sondern eine
Zusammenballung von VE-Cadherin an den Zelljunktionen neben den gebildeten Lücken
beschrieben, gefolgt von einer posttransmigralen Rediffusion. Für diesen Prozess muss
sich VE-Cadherin allerdings vom Zytoskelett abkoppeln. Ansonsten wäre eine Diffusion
zur Seite nicht möglich. Dieser Prozess erfolgt entweder durch Signale der
transmigrierenden Leukozyten oder durch Neuordnung des Zytoskeletts (Shaw et al.,
2001). Diese Beobachtung stimmt mit der von Allport et al. (2000) überein, die von einem
Falltür-Mechanismus sprechen. Der Falltür-Mechanismus meint Folgendes: Der VE-
Kapitel 4 - Diskussion 122 Cadherin-Catenin-Komplex wird durch die migrierenden Leukozyten mechanisch zur Seite
gedrängt, so dass sie durch die interzellulären Lücken transmigrieren können. Nach der
Transmigration diffundieren die deplatzierten Moleküle zurück, um die Junktionen neu zu
konstituieren (Allport et al., 2000; Allport et al., 1997; Burns et al., 2003; Gao et al., 2000;
Hermant et al., 2003; Shaw et al., 2001).
Für diese Hypothese spricht, dass adhärente Neutrophile sehr schnell (< 2 Minuten)
migrieren und sich die endothelialen Junktionen deshalb während des Migrationsprozesses
sehr schnell öffnen und schließen müssen (Burns et al. 2003) – die Diffusion erlaubt diesen
Vorgang. Eine weitere Begründung liegt in der Beobachtung, dass eine Zytokin-induzierte
Zerreißung der interzellulären Junktionen zu einem diffusen, teils punktförmigen
Verteilungsmuster von VE-Cadherin führt (Davies et al., 2003; Wong et al., 1999). Daraus
kann geschlossen werden, dass VE-Cadherin nicht länger in interzellulären Junktionen
verankert ist, sondern in der Plasmamembran frei diffundiert und dort nachweisbar ist
(Wong et al., 1999). Dabei wird VE-Cadherin aber nicht proteolysiert, sondern bleibt als
komplettes Molekül erhalten.
Den Mechanismus erklären Wong et al. (1999) mit Zytokin-induzierten Veränderungen der
Affinität oder Konformation des Cadherin-Catenin-Komplexes (evtl. mit Zerreißung des
Komplexes (Allport et al., 2000; Carden et al., 1998; Lim et al., 2001), die zu einer
Entkopplung vom Zytoskelett führen, so dass VE-Cadherin innerhalb der Plasmamembran
oder dem Zytoplasma (falls es doch internalisiert wird) neu verteilt werden kann.
Der Nachweis einer verminderten VE-Cadherin-Expression in ARDS-Lungen und
stimulierten Zellkulturen steht im Widerspruch zur Hypothese der Diffusion des VE-
Cadherin in der Plasmamembran. Bei einer Umverteilung des VE-Cadherin und einer
Diffusion des Moleküls in der Plasmamembran müsste das Molekül auf Grund der weiter
bestehenden Membranlokalisation trotzdem anfärbbar sein.
4.11.6 Spaltung der Zell-Zell-Verbindungen
Diskutiert wird auch die Spaltung der Verknüpfung der extrazellulären Domänen zweier
bzw. mehrerer Cadherin-Moleküle. Dadurch kommt es zur Permeabilitätssteigerung, ohne
dass das VE-Cadherin seine Lokalisation ändert (Corada et al., 1999).
Diese Theorie ist allerdings nach den hier vorgelegten Befunden in Frage zu stellen, da
VE-Cadherin von den Zellgrenzen verschwindet und es auch optisch zu einer
Lückenbildung kommt. Nach der oben genannten Theorie ergäben sich optisch keine
Veränderungen der Membranfärbung.
Kapitel 4 - Diskussion 123 4.11.7 Gegenüberstellung der verschiedenen Theorien
Man ist sich derzeit uneinig darüber, ob eine Internalisation oder eine Neuverteilung von
VE-Cadherin auf der Zelloberfläche für die Beobachtung verantwortlich ist, dass nach
Stimulation VE-Cadherin-Aggregate an einigen Stellen vorhanden sind, an anderen Stellen
jedoch nicht (Gulino et al., 1998; Konstantoulaki et al., 2003).
Sowohl bei der Diffusion als auch bei der Internalisation von VE-Cadherin muss eine
Trennung des VE-Cadherin-Catenin-Komplexes vom Zytoskelett erfolgen. Bei der
Diffusion von VE-Cadherin in der Plasmamembran führt eine Rediffusion zur Schließung
der Lücken, bei der Internalisation muss das Molekül bzw. der Molekül-Komplex
exozytiert oder sogar neu synthetisiert werden.
Die Beobachtungen der Leukozytentransmigration mittels Falltürmechanismus stützen die
These der Diffusion (Allport et al., 2000; Allport et al., 1997; Burns et al., 2003; Gao et al.,
2000; Hermant et al., 2003; Shaw et al., 2001). Des Weiteren ist die Sequestration
(Rückzug) von VE-Cadherin an die verbleibenden Zell-Zell-Kontakte energetisch sehr
günstig, da für diesen Vorgang nur eine einfache Diffusion in der flüssigen Membran
vonnöten ist. Das Zurückziehen des VE-Cadherins zu den verbleibenden Zell-Zell-
Kontakten spielt außerdem eine Rolle bei der strukturellen Verstärkung und der
Aufrechterhaltung der Kapillarintegrität. Der verstärkende Effekt ist notwendig, um der
allumfassenden Reduktion der Zell-Zell-Kontakte während der Lückenbildung
vorzubeugen (Lim et al., 2001).
Andere Strategien für die Lückenbildung, wie die Proteolyse oder Internalisation sind
weniger effizient und die Neubildung der Barrierenfunktion würde die Proteinsynthese
oder aktive Externalisation des Proteins erfordern. Gegen eine Proteolyse spricht auch,
dass eine TNFα-induzierte Neuverteilung von VE-Cadherin in HUVEC-
Endothelzellmonolayern ohne Änderung des gesamten zellulären VE-Cadherin-
Vorkommens erfolgt (Nwariaku et al., 2002).
Kapitel 4 - Diskussion 124
4.12 Leukozytentransmigration
1875 demonstrierte Julius Arnold mit Zinnober-Injizierung die Endothelzellgrenzen. Mehr
als 100 Jahre später wurde bestätigt, dass Neutrophile vor allem an den interendothelialen
Junktionen vom Blut ins Gewebe gelangen (Albelda et al., 1994; Burns et al., 2003; Dudek
und Garcia, 2001).
4.12.1 Transmigration
Die Leukozyten migrieren vorzugsweise an Stellen, wo drei Endothelzellen aneinander
stoßen (trizelluläre Ecken), denn sowohl Zonulae occludentes (Tight Junctions) als auch
Adhäerensjunktionen sind an diesen Stellen im Kultursystem diskontinuierlich und stellen
damit eine mögliche Durchtrittspforte für Leukozyten dar (Allport et al., 2000; Burns et al.,
2003; Gopalan et al., 2000; Shaw et al., 2001; Zhao et al., 2001). In vivo existieren im
Endothel teilweise vorbestehende interendotheliale Lücken, durch die die Neutrophilen in
den interstitiellen Raum transmigrieren (Behzad et al., 1996; Shaw et al., 2001). Die
Neutrophilen inserieren dabei einen Pseudopod in den interendothelialen Spalt. Das
Endothelzytoskelett bildet sich um und die interendotheliale Junktion separiert (Burns et
al., 2003). Andere Autoren beschreiben den Vorgang zur Induktion der Lücken im
Endothel folgendermaßen: Die Leukozytenadhäsion triggert intrazelluläre Signale, die zu
einer Destabilisierung von VE-Cadherin-Komplexen führt und den Leukozyten eine
Migration durch die entstandenen Lücken erlaubt (Shaw et al., 2001). VE-Cadherin und
die Catenine verschwinden von den Zell-Zell-Kontakten als Antwort auf die Adhäsion von
Neutrophilen am Endothelzellmonolayer (Allport et al., 2000; Allport et al., 1997; Gotsch
et al., 1997; Del Maschio et al., 1996). Das bestätigen Untersuchungen an Endothelzellen:
Die Mengen an nativem β-Catenin, VE-Cadherin, Plakoglobin und p120 waren in TNFα-
aktivierten Endothelzellen, die mit Neutrophilen für 3 Minuten – dann hat nur eine
Adhäsion, keine Transmigration stattgefunden – inkubiert wurden, dramatisch vermindert.
α-Catenin war nicht betroffen. Nach 10 Minuten Neutrophileninkubation fanden Adhäsion
und Transmigration statt, die Menge jeder Komponente, ausgenommen α-Catenin, sanken
dramatisch oder waren nicht mehr nachweisbar (Allport et al., 1997; Del Maschio et al.,
1996).
4.12.2 "real time"-Transmigration
Die Transmigration wurde von Shaw et al. (2001) mittels Neutrophiler und Monozyten an
HUVEC untersucht: Die HUVEC wurden mit VEcadGFP (VE-Cadherin/Green
Kapitel 4 - Diskussion 125 Fluorescent Fusion Protein Construct) inkubiert, anschließend wurden die
Neutrophilen/Monozyten hinzugegeben, so dass auf diese Weise das VE-Cadherin und
Veränderungen in der Struktur der Endotheljunktionen unter dem Mikroskop beobachtet
werden konnten. Es fand sich eine Transmigrationen vor allem an den Zellgrenzen, also
parazellulär. Konnte ein Granulozyt an eine kontinuierliche Junktion mit VEcadGFP
andocken, dann wurde in der Junktion eine Lücke geformt, durch die der PMN
transmigrierte. Teilweise migirierte der PMN auch durch vorbestehende Lücken.
Monozyten verhielten sich ähnlich. Nach der Leukozytentransmigration durch eine Lücke
füllte VEcadGFP die Lücke wieder aus und verschloss diese. Im Durchschnitt fand dieser
Vorgang innerhalb von fünf Minuten nach einer Transmigration statt. Interessanterweise
wurden auf die Weise auch schon vorher existierende Lücken verschlossen. Es konnte
auch beobachtet werden, dass neben neugebildeten Lücken eine Ansammlung von VE-
Cadherin zu finden war, die nach der Transmigration zurück diffundierte. Aus diesen
Vorgängen kann man schließen kann, dass endotheliale Junktionsproteine wie das VE-
Cadherin nicht fixiert, sondern dynamisch sind (Shaw et al., 2001).
4.12.3 Einfluss auf das Lungengewebe
Dementsprechend führen nicht nur vom Organismus systemisch freigesetzte Zytokine oder
von Bakterien freigesetztes LPS zu einer verminderten VE-Cadherin-Expression,
verbunden mit gesteigerter endothelialer Permeabilität und Leukozyteninvasion in den
Entzündungsherd. Auch die Leukozyten selber induzieren solche Vorgänge – vor allem die
PMNs (polymorphonukleären Leukozyten = Granulozyten). Es konnte gezeigt werden,
dass im gesunden Lungengewebe PMNs zu einer Disruption der Endothelzellbarriere und
des VE-Cadherin-Moleküls führen (Allport et al., 1997; Carden et al., 1998; Hermant et
al., 2003; Lucchesi, 1990; Del Maschio et al., 1996; Rosengren et al., 1991; Tinsley et al.,
1999). Granulozyten können proteolytische Enzyme freisetzen, die zur Zerstörung des VE-
Cadherin-Catenin-Komplexes führen. Sie setzen aber auch Zytokine frei. Dies könnte die
Schädigung des Endothelmonolayers erklären.
Zum Einfluss von adhärenten Neutrophilen auf VE-Cadherin gibt es unterschiedliche
Hypothesen: Einerseits wird diskutiert, dass die VE-Cadherin-Moleküle trotz Stimulation
mit TNFα bei Fehlen von adhärenten Neutrophilen intakt bleiben (Allport et al., 2000;
Allport et al., 1997; Del Maschio et al., 1996). Das würde bedeuten, dass die Neutrophilen
die Hauptursache für die Bildung der Endothellücken sind. Andererseits ist zu überlegen,
ob die Zerstörung der endothelialen Barriere auch in Abwesenheit von Leukozyten durch
Zytokin-Stimulation von statten geht und nicht mit der Anwesenheit von Mastzellen und
Kapitel 4 - Diskussion 126 Leukozyten im Interstitium korreliert (Albelda et al., 1994; Wong et al., 1999). Dies wurde
in der vorliegenden Arbeit gezeigt. Im humanen Organismus spielen generell beide
Faktoren, d. h. Neutrophile und Zytokine, eine Rolle. Welches Element den Hauptanteil
stellt, kann man auf diese Art und Weise nicht beantworten.
Bei den in der hier vorgestellten Arbeit eingesetzten Zellkulturen wurde der Einfluss der
Leukozyten und speziell der PMNs nicht untersucht. Die Zellkulturen wurden vielmehr
isoliert mit Zytokinen und LPS stimuliert. In einer weiteren Untersuchung wäre mittels
Kokultur der Einfluss von Leukozyten auf die Zellkulturen zu untersuchen.
Kapitel 4 - Diskussion 127
4.13 Vergleich systemischer Kreislauf zu Lungenkreislauf
Bei der Wichtung der Literatur zur hier beobachteten reduzierten VE-Cadherin-Expression
und der daraus resultierenden Leukozytenextravasation (Engelhardt und Wolburg, 2004)
muss der Unterschied zwischen systemischem Kreislauf und Lungenkreislauf
berücksichtigt werden. Daher dürfen Studien an Endothelzellen des systemischen
Kreislaufs nicht ohne weiteres mit Studien an pulmonalen Endothelien verglichen werden
(Burns et al., 2003).
Der Hauptgrund dafür ist die Tatsache, dass die Neutrophilenmigration in der Lunge in den
Kapillaren stattfindet, während dieser Vorgang im systemischen Kreislauf in den
postkapillären Venolen von statten geht (Burns et al., 2003; Hogg und Doerschuk, 1995).
Die Mechanismen in den großen Gefäßen, um Neutrophile über Adhäsionsmoleküle aus
dem Blut abzufangen, sind im alveolären Kapillarbett nicht notwendig. Da die
Durchmesser der Neutrophilen (6 - 8 µm) gleich wie oder größer als die Durchmesser
vieler Kapillarsegmente (2 - 15 µm) sind und ungefähr 50 % der Kapillarsegmente
während der Passage eine Deformierung der Neutrophilen erfordern (Doerschuk et al.,
1993; Doerschuk et al., 1990; Downey et al., 1990; Downey und Worthen, 1988; Gebb et
al., 1995), wird ein enger Kontakt der intrazellulären Leukozyten mit dem Lungenendothel
sicher gestellt (Kuebler et al., 1997). Des Weiteren werden die Zellen während einer
Entzündungsreaktion durch bestimmte Faktoren an einer Deformation und damit einer
Passage des Blutgefäßes gehindert (Buttrum et al., 1994; Doerschuk et al., 1999; Downey
et al., 1990; Erzurum et al., 1992; Inano et al., 1992). Als Folge bleiben die Neutrophilen
im Kapillarbett stecken. Dieser Vorgang wird durch Adhäsionsmoleküle auf den
Leukozyten und endothelialen Adhäsionsmolekülen unterstützt – doch handelt es sich
vorwiegend um andere Moleküle als im Systemkreislauf (Albelda et al.,1994; Burns et al.,
2003; Carlos und Harlan, 1994; Doerschuk et al., 2000; Gimbrone et al., 1997; Kuebler et
al., 1997; DeLisser und Albelda, 1998; Springer, 1995). Hinzu kommt, dass verglichen mit
dem Blut in den großen Gefäßen der meisten Gefäßbetten, das Blut im komplexen
pulmonalen Kapillarnetzwerk 50mal mehr Neutrophile enthält, sowie weit mehr
Lymphozyten und Monozyten als im systemischen Kreislauf (Doerschuk et al., 1990).
Diese Unterschiede der beiden Kreisläufe müssen auch im Bezug auf die Zellkulturen
berücksichtigt werden, da HPMEC aus humanen mikrovaskulären Lungenendothelien,
HUVEC hingegen aus humanen Nabelschnurvenen gewonnen werden.
Kapitel 4 - Diskussion 128
4.14 Ausblick
Auf Grund der Bedeutung des VE-Cadherins für die Aufrechterhaltung des Zellverbandes
– der Verlust wird beim ARDS deutlich – ist ein therapeutischer Eingriff in VE-Cadherin-
vermittelte Prozesse zu diskutieren. Beispielsweise könnte in die bei ARDS auftretende
Destabilisierung des Cadherin-Catenin-Komplexes, der schließlich zerfällt und damit zu
einer Lückenbildung im Endothelverband führt, eingegriffen werden. Eine Verhinderung
dieser Prozesse erhielte gegebenenfalls die Endothelintegrität.
Sowohl die Mikrozirkulation als auch die Leukozytentransmigration sind eng an die
Endothelintegrität und den Cadherin-Catenin-Komplex geknüpft, so dass ein Eingriff in
diese Vorgänge von therapeutischem Nutzen sein könnte (Burns et al., 2003; Lee und
Downey, 2001; Lehr et al., 2000).
Ein weiterer Ansatzpunkt könnte die Verknüpfung von VE-Cadherin mit dem Zytoskelett
darstellen. Die Zelladhäsion wird durch die Bindung der VE-Cadherin-Moleküle an das
Zytoskelett bestimmt (Baumgartner et al., 2000). Jeder Mechanismus, der die Anbindung
der Cadherine an das Zytoskelett verändert (z. B. durch Phosphorylierungsvorgänge oder
Aktinpolymerisation), könnte Einfluss auf die Mobilität der Cadherine in der
Plasmamembran und damit auch auf die Anzahl der geknüpften Adhäsionen nehmen.
Aus der Kenntnis des bidirektionalen Signalweges zwischen dem Cadherin-Catenin-
Komplex und dem Aktin-Zytoskelett ergeben sich folgende Überlegungen: In die
endotheliale Zell-Zell-Adhäsion kann zum einen durch Rezeptor-Aktivierung und zum
anderen mit Hilfe von Aktin-modifizierenden Agenzien eingegriffen werden, woraus sich
dann veränderte endotheliale Eigenschaften in der Permeabilität und der
Leukozytentransmission ergeben (Hordijk et al., 1999).
Nwariaku et al. (2002) sehen eine Therapiemöglichkeit in der Modulation der
Phosphorylierung der Adhärensjunktion. Diese Überlegungen basieren auf einer Studie, in
der die Substitution eines Tyrosinkinaseinhibitors in Ratten der Dysfunktion von Leber
und Herz vorbeugt (Jarrar et al., 2000). Dieser Ansatz wird durch Angst et al. (2001)
bestätigt, die vor allem den VE-Cadherin-β-Catenin-Komplex als Ziel
permeabilitätssteigernder Agenzien sehen; bekannterweise führt die Phosphorylierung von
β-Catenin zu einer Dissoziation des Komplexes.
Die Herunterregulation der Expression induzierbarer endothelialer Genprodukte ist ein
weiterer Therapieansatz (Luscinskas und Gimbone, 1996).
Kapitel 5 – Zusammenfassung 129
5 Zusammenfassung
VE-Cadherin in humanen Lungen mit septisch bedingtem ARDS und endothelialen
Zellkulturen
In der vorliegenden Arbeit erfolgte die Charakterisierung des VE-Cadherins – eines
ausschließlich auf Endothelzellen exprimierten Zelladhäsionsmoleküls – in der
menschlichen Lungenstrombahn sowie in Endothelzellkulturen. Untersucht wurde die VE-
Cadherin-Expression in Lungen mit septisch bedingtem ARDS im Vergleich zu
regelrechtem, entzündungsfreiem Lungengewebe sowie in unstimulierten und mit LPS,
TNFα und IFNγ stimulierten Zellkulturen.
Immunhistochemisch wurden 78 humane Lungenpräparate (58 regelrechte
Lungengewebsproben, 20 Proben mit septischem ARDS) und Zellkulturen (HPMEC und
HUVEC) mit einem monoklonalen Antikörper gegen VE-Cadherin gefärbt.
Es ergaben sich folgende Ergebnisse:
1. Es bestand eine statistisch signifikante gefäßtypspezifische Heterogenität der
endothelialen VE-Cadherin-Expression in der menschlichen Lunge mit einer
starken VE-Cadherin-Antigenexpression in Arterien, Arteriolen und Kapillaren und
einer vergleichsweise schwachen Expression in Venolen und Venen.
2. In Lungenproben mit septisch bedingtem ARDS lag eine im Vergleich zum
regelrechten Lungengewebe statistisch signifikant schwächere VE-Cadherin-
Antigenexpression vor, bei Erhalt des im regelrechten Lungengewebe
nachgewiesenen gefäßtypspezifischen Expressionsmusters. Das
gefäßtypspezifische VE-Cadherin-Expressionsmuster in der menschlichen Lunge
wurde somit durch pathophysiologische Bedingungen eines septischen ARDS nicht
beeinflusst.
3. Die Faktoren Geschlecht, Alter und Zeitraum zwischen Todeseintritt und
Obduktionszeitpunkt hatten keinen signifikanten Einfluss auf die VE-Cadherin-
Expression.
4. In den mit LPS-, TNFα- und IFNγ-stimulierten Zellkulturen zeigte sich –
korrespondierend zu den in situ-Befunden – sowohl für HPMEC als auch HUVEC
Kapitel 5 – Zusammenfassung 130
eine reduzierte VE-Cadherin-Antigenexpression mit, im Gegensatz zu den
unstimulierten Zellkulturen, Bildung von "Gaps" (Lücken) im Endothelzellverband.
Die verminderte VE-Cadherin-Expression in Lungen mit septisch bedingtem ARDS ist als
Ursache einer gesteigerten Endothelpermeabilität und daraus resultierenden
Transmigration von Leukozyten sowie weiterer Blutbestandteile aus dem Gefäß in das
entzündete Gewebe einzustufen. Damit erlangt VE-Cadherin bzw. seine verminderte VE-
Cadherin-Expression die Bedeutung eines wichtigen Pathogenesefaktors in der
Entwicklung des septisch bedingten ARDS. Die Ergebnisse der Untersuchung der VE-
Cadherin-Expression in Zellkulturen bestätigen diese in situ-Ergebnisse.
Die Zellkulturen (HPMEC und HUVEC) sind somit als ein geeignetes Modell für
Untersuchungen der VE-Cadherin-Expression in der menschlichen Lunge bei septischem
ARDS unter standardisierten Bedingungen anzusehen.
Auf Grund der ubiquitären Verteilung des VE-Cadherins ist bei derzeitigem Wissenstand
zur VE-Cadherin-Expression in situ (diese Arbeit ist einer der ersten Arbeiten zu VE-
Cadherin in menschlichem Lungengewebe) eine Beeinflussung der VE-Cadherin-
Expression im Sinne eines therapeutischen Eingreifens in die Pathogenese des ARDS noch
nicht in greifbarer Nähe.
Kapitel 6 – Literaturverzeichnis 131
6 Literaturverzeichnis
Aberle, H., Butz, S., Stappert, J., Weissig, H., Kemler, R., Hoschuetzky, H. (1994). Assembly of the cadherin-catenin complex in vitro with recombinant proteins. J Cell Sci. 107, 3655-3663 Adams, D. H., Shaw, S. (1994). Leucocyte-endothelial interactions and regulation of leucocyte migration. Lancet. 343, 831-836 Adamson, R. H., Liu, B., Fry, G. N., Rubin, L. L., Curry, F. E. (1998). Microvascular permeability and number of tight junctions are modulated by cAMP. Am J Physiol. 274, 1885-1894 Agouridakis, P., Kyriakou, D., Alexandrakis, M. G., Prekates, A., Perisinakis, K., Karkavitsas, N., Bouros, D. (2002). The predictive role of serum and bronchoalveolar lavage cytokines and adhesion molecules for acute respiratory distress syndrome development and outcome. Respir Res. 3, 25 Aird, W. C. (2003). Endothelial cell heterogeneity. Crit Care Med. 31, 221-230 Albelda, S. M., Smith, C. W., Ward, P. A. (1994). Adhesion molecules and inflammatory injury. FASEB J. 8, 504-512 Albelda, S. M., Sampson, P. M., Haselton, F. R., McNiff, J. M., Mueller, S. N., Williams, S. K., Fishman, A. P., Levine, E. M. (1988). Permeability characteristics of cultured endothelial cell monolayers. J Appl Physiol. 64, 308-322 Albert, R. K., Kirk, W., Pitts, C., Butler, J. (1985). Extra-alveolar vessel fluid filtration coefficients in excised and in situ canine lobes. J Appl Physiol. 59, 1555-1559 Albuquerque, M. L., Flozak, A. S. (2002). Wound closure in sheared endothelial cells is enhanced by modulation of vascular endothelial-cadherin expression and localization. Exp Biol Med (Maywood). 227, 1006-1016 Alexander, J. S., Elrod, J. W. (2002). Extracellular matrix, junctional integrity and matrix metalloproteinase interactions in endothelial permeability regulation. J Anat. 200, 561-574 Allport, J. R., Muller, W. A., Luscinskas, F. W. (2000). Monocytes induce reversible focal changes in vascular endothelial cadherin complex during transendothelial migration under flow. J Cell Biol. 148, 203-216 Allport, J. R., Ding, H., Collins, T., Gerritsen, M. E., Luscinskas, F. W. (1997). Endothelial-dependent mechanisms regulate leukocyte transmigration: a process involving the proteasome and disruption of the vascular endothelial-cadherin complex at endothelial cell-to-cell junctions. J Exp Med. 186, 517-527 Anastasiadis, P. Z., Reynolds, A. B. (2000). The p120 catenin family: complex roles in adhesion, signaling and cancer. J Cell Sci. 113, 1319-1334 Angst, B. D., Marcozzi, C., Magee, A. I. (2001). The cadherin superfamily: diversity in form and function. J Cell Sci. 114, 629-641 Angst, B. D., Marcozzi, C., Magee, A. I. (2001a). The cadherin superfamily. J Cell Sci. 114, 625-626 Baker, D. P., Van Lenten, B. J., Fogelman, A. M., Edwards, P. A., Kean, C., Berliner, J. A. (1984). LDL, scavenger, and beta-VLDL receptors on aortic endothelial cells. Arteriosclerosis. 4, 248-255 Bannerman, D. D., Goldblum, S. E. (1999). Direct effects of endotoxin on the endothelium: barrier function and injury. Lab Invest. 79, 1181-1199
Kapitel 6 – Literaturverzeichnis 132 Bannerman, D. D., Sathyamoorthy, M., Goldblum, S. E. (1998). Bacterial lipopolysaccharide disrupts endothelial monolayer integrity and survival signaling events through caspase cleavage of adherens junction proteins. J Biol Chem. 273, 35371-35380 Bar, R. S., Hoak, J. C., Peacock, M. L. (1978). Insulin receptors in human endothelial cells: identification and characterization. J Clin Endocrinol Metab. 47, 699-702 Bauer, P., Lush, C. W., Kvietys, P. R., Russell, J. M., Granger, D. N. (2000). Role of endotoxin in the expression of endothelial selectins after cecal ligation and perforation. Am J Physiol Regul Integr Comp Physiol. 278, 1140-1147 Baumgartner, W., Gruber, H. J., Hinterdorfer, P., Drenckhahn, D. (2000). Affinity of Trans-interacting VE-cadherin Determined by Atomic Force Microscopy. Single Mol. 1 2, 119-122 Behzad, A. R., Chu, F., Walker, D. C. (1996). Fibroblasts are in a position to provide directional information to migrating neutrophils during pneumonia in rabbit lungs. Microvasc Res. 51, 303-316 Bevilacqua, M. P. (1993). Endothelial-leukocyte adhesion molecules. Annu Rev Immunol. 11, 767-804 Bevilacqua, M. P., Pober, J. S., Mendrick, D. L., Cotran, R. S., Gimbrone, M. A. Jr. (1987). Identification of an inducible endothelial-leukocyte adhesion molecule. Proc Natl Acad Sci U S A. 84, 9238-9242 Bevilacqua, M. P., Pober, J. S., Wheeler, M. E., Cotran, R. S., Gimbrone, M. A. Jr. (1985). Interleukin 1 acts on cultured human vascular endothelium to increase the adhesion of polymorphonuclear leukocytes, monocytes, and related leukocyte cell lines. J Clin Invest. 76, 2003-2011 Bhatia, M., Moochhala, S. (2004). Role of inflammatory mediators in the pathophysiology of acute respiratory distress syndrome. J Pathol. 202, 145-156 Bhatia, M., Brady, M., Shokuhi, S., Christmas, S., Neoptolemos, J. P., Slavin, J. (2000). Inflammatory mediators in acute pancreatitis. J Pathol. 190, 117-125 Bienz, M., Clevers, H. (2000). Linking colorectal cancer to Wnt signaling. Cell. 103, 311-320 Bill, Anke (2003). Untersuchung der Wirkung von modifizierten LDL auf die Stickstoffmonoxidsynthase in Endothelzellen (Praktikumsbericht). Friedrich-Schiller Universität Jena, Vaskuläre Medizin Bogen, S., Pak, J., Garifallou, M., Deng, X., Muller, W. A. (1994). Monoclonal antibody to murine PECAM-1 (CD31) blocks acute inflammation in vivo. J Exp Med. 179, 1059-1064 Breviario, F., Caveda, L., Corada, M., Martin-Padura, I., Navarro, P., Golay, J., Introna, M., Gulino, D., Lampugnani, M. G., Dejana, E. (1995). Functional properties of human vascular endothelial cadherin (7B4/cadherin-5), an endothelium-specific cadherin. Arterioscler Thromb Vasc Biol. 15, 1229-1239 Brinton, E. A., Kenagy, R. D., Oram, J. F., Bierman, E. L. (1985). Regulation of high density lipoprotein binding activity of aortic endothelial cells by treatment with acetylated low density lipoprotein. Arteriosclerosis. 5, 329-335 Burns, A. R., Smith, C. W., Walker, D. C. (2003). Unique Structural Features That Influence Neutrophil Emigration Into the Lung. Physiol Rev. 83, 309-336 Buttrum, S. M., Drost, E. M., MacNee, W., Goffin, E., Lockwood, C. M., Hatton, R., Nash, G. B. (1994). Rheological response of neutrophils to different types of stimulation. J Appl Physiol. 77, 1801-1810 van Buul, J. D., Voermans, C., van den Berg, V., Anthony, E. C., Mul, F. P., van Wetering, S., van der Schoot, C. E., Hordijk, P. L. (2002). Migration of human hematopoietic progenitor cells across bone marrow endothelium is regulated by vascular endothelial cadherin. J Immunol. 168, 588-596 Carden, D., Xiao, F., Moak, C., Willis, B. H., Robinson-Jackson, S., Alexander, S. (1998). Neutrophil elastase promotes lung microvascular injury and proteolysis of endothelial cadherins. Am J Physiol. 275, 385-392
Kapitel 6 – Literaturverzeichnis 133 Carden, D. L., Young, J. A., Granger, D. N. (1993). Pulmonary microvascular injury after intestinal ischemia-reperfusion: role of P-selectin. J Appl Physiol. 75, 2529-2534 Carlos, T. M., Harlan, J. M. (1994). Leukocyte-endothelial adhesion molecules. Blood. 84, 2068-2101 McCarron, R. M., Wang, L., Siren, A. L., Spatz, M., Hallenbeck, J. M. (1994). Monocyte adhesion to cerebromicrovascular endothelial cells derived from hypertensive and normotensive rats. Am J Physiol. 267, 2491-2497 Carswell, E. A., Old, L. J., Kassel, R. L., Green, S., Fiore, N., Williamson, B. (1975). An endotoxin-induced serum factor that causes necrosis of tumors. Proc Natl Acad Sci U S A. 72, 3666-3670 Caveda, L., Martin-Padura, I., Navarro, P., Breviario, F., Corada, M., Gulino, D., Lampugnani, M. G., Dejana, E. (1996). Inhibition of cultured cell growth by vascular endothelial cadherin (cadherin-5/VE-cadherin). J Clin Invest. 15, 886-893 Chetham, P. M., Babal, P., Bridges, J. P., Moore, T. M., Stevens, T. (1999). Segmental regulation of pulmonary vascular permeability by store-operated Ca2+ entry. Am J Physiol. 276, 41-50 Cines, D. B., Pollak, E. S., Buck, C. A., Loscalzo, J., Zimmerman, G. A., McEver, R. P., Pober, J. S., Wick, T. M., Konkle, B. A., Schwartz, B. S., Barnathan, E. S., McCrae, K. R., Hug, B. A., Schmidt, A. M., Stern, D. M. (1998). Endothelial cells in physiology and in the pathophysiology of vascular disorders. Blood. 91, 3527-3561 Cohen, J. (2002). The immunopathogenesis of sepsis. Nature. 420, 885-891 Corada, M., Zanetta, L., Orsenigo, F., Breviario, F., Lampugnani, M. G., Bernasconi, S., Liao, F., Hicklin, D. J., Bohlen, P., Dejana, E. (2002). A monoclonal antibody to vascular endothelial-cadherin inhibits tumor angiogenesis without side effects on endothelial permeability. Blood. 100, 905-911 Corada, M., Liao, F., Lindgren, M., Lampugnani, M. G., Breviario, F., Frank, R., Muller, W. A., Hicklin, D. J., Bohlen, P., Dejana, E. (2001). Monoclonal antibodies directed to different regions of vascular endothelial cadherin extracellular domain affect adhesion and clustering of the protein and modulate endothelial permeability. Blood. 97, 1679-1684 Corada, M., Mariotti, M., Thurston, G., Smith, K., Kunkel, R., Brockhaus, M., Lampugnani, M. G., Martin-Padura, I., Stoppacciaro, A., Ruco, L., McDonald, D. M., Ward, P. A., Dejana, E. (1999). Vascular endothelial-cadherin is an important determinant of microvascular integrity in vivo. Proc Natl Acad Sci U S A. 96, 9815-9820 Davies, P. F., Zilberberg, J., Helmke, B. P. (2003). Spatial microstimuli in endothelial mechanosignaling. Circ Res. 92, 359-370 Dejana, E., Bazzoni, G., Lampugnani, M. G. (1999). Vascular endothelial (VE)-cadherin: only an intercellular glue? Exp Cell Res. 252, 13-19 Dejana, E. (1996). Endothelial adherens junctions: implications in the control of vascular permeability and angiogenesis. J Clin Invest. 98, 1949-1953 Dejana, E., Corada, M., Lampugnani, M. G. (1995). Endothelial cell-to-cell junctions. FASEB J. 9, 910-918 Doerschuk, C. M., Tasaka, S., Wang, Q. (2000). CD11/CD18-dependent and -independent neutrophil emigration in the lungs: how do neutrophils know which route to take? Am J Respir Cell Mol Biol. 23 133-136. Doerschuk, C. M., Mizgerd, J. P., Kubo, H., Qin, L., Kumasaka, T. (1999). Adhesion molecules and cellular biomechanical changes in acute lung injury: Giles F. Filley Lecture. Chest. 116, 37-43 Doerschuk, C. M., Beyers, N., Coxson, H. O., Wiggs, B., Hogg, J. C. (1993). Comparison of neutrophil and capillary diameters and their relation to neutrophil sequestration in the lung. J Appl Physiol. 74, 3040-3045
Kapitel 6 – Literaturverzeichnis 134 Doerschuk, C. M., Downey, G. P., Doherty, D. E., English, D., Gie, R. P., Ohgami, M., Worthen, G. S., Henson, P. M., Hogg , J. C. (1990). Leukocyte and platelet margination within microvasculature of rabbit lungs. J Appl Physiol. 68, 1956-1961 Donnelly, S. C., Haslett, C., Dransfield, I., Robertson, C. E., Carter, D. C., Ross, J. A., Grant, I. S., Tedder, T. F. (1994). Role of selectins in development of adult respiratory distress syndrome. Lancet. 344, 215-219 Downey, G. P., Doherty, D. E., Schwab, B. 3rd, Elson, E. L., Henson, P. M., Worthen, G. S. (1990). Retention of leukocytes in capillaries: role of cell size and deformability. J Appl Physiol. 69, 1767-1778 Downey, G. P., Worthen, G. S. (1988). Neutrophil retention in model capillaries: deformability, geometry, and hydrodynamic forces. J Appl Physiol. 65, 1861-1871 Dudek, S. M., Garcia, J. G. (2001). Cytoskeletal regulation of pulmonary vascular permeability. J Appl Physiol. 91, 1487-1500 Dustin, M. L., Rothlein, R., Bhan, A. K., Dinarello, C. A., Springer, T. A. (1986). Induction by IL 1 and interferon-gamma: tissue distribution, biochemistry, and function of a natural adherence molecule (ICAM-1). J Immunol. 137, 245-254 Engelhardt, B., Wolburg, H. (2004). Transendothelial migration of leukocytes: through the front door or around the side of the house? Eur J Immunol. 34, 2955-2963 Eppihimer, M. J., Wolitzky, B., Anderson, D. C., Labow, M. A., Granger, D. N. (1996). Heterogeneity of expression of E- and P-selectins in vivo. Circ Res. 79, 560-569 Erzurum, S. C., Downey, G. P., Doherty, D. E., Schwab, B. 3rd, Elson, E. L., Worthen, G. S. (1992). Mechanisms of lipopolysaccharide-induced neutrophil retention. Relative contributions of adhesive and cellular mechanical properties. J Immunol. 149, 154-162 Faure, E., Thomas, L., Xu, H., Medvedev, A., Equils, O., Arditi, M. (2001). Bacterial lipopolysaccharide and IFN-gamma induce Toll-like receptor 2 and Toll-like receptor 4 expression in human endothelial cells: role of NF-kappa B activation. J Immunol. 166, 2018-2024 Ferber, A., Yaen, C., Sarmiento, E., Martinez, J. (2002). An octapeptide in the juxtamembrane domain of VE-cadherin is important for p120ctn binding and cell proliferation. Exp Cell Res. 274, 35-44 Ferrero, E., Scabini, S., Magni, E., Foglieni, C., Belloni, D., Colombo, B., Curnis, F., Villa, A., Ferrero, M. E., Corti, A. (2004). Chromogranin A protects vessels against tumor necrosis factor alpha-induced vascular leakage. FASEB J. 18, 554-556 Fielding, C. J., Vlodavsky, I., Fielding, P. E., Gospodarowicz, D. (1979). Characteristics of chylomicron binding and lipid uptake by endothelial cells in culture. J Biol Chem. 254, 8861-8868 Fishman, A. P., Fishman, M. C., Freeman, B. A., Gimbrone, M. A., Rabinovitch, M., Robinson, D., Gail, D. B. (1998). Mechanisms of proliferative and obliterative vascular diseases. Insights from the pulmonary and systemic circulations. Am J Respir Crit Care Med. 158, 670-674 Friedl, J., Turner, E., Alexander, H. R. Jr. (2003). Augmentation of endothelial cell monolayer permeability by hyperthermia but not tumor necrosis factor: evidence for disruption of vascular integrity via VE-cadherin down-regulation. Int J Oncol. 23, 611-616 Friedl, J., Puhlmann, M., Bartlett, D. L., Libutti, S. K., Turner, E. N., Gnant, M. F., Alexander, H. R. (2002). Induction of permeability across endothelial cell monolayers by tumor necrosis factor (TNF) occurs via a tissue factor-dependent mechanism: relationship between the procoagulant and permeability effects of TNF. Blood. 100, 1334-1339 Gamble, J. R., Harlan, J. M., Klebanoff, S. J., Vadas, M. A. (1985). Stimulation of the adherence of neutrophils to umbilical vein endothelium by human recombinant tumor necrosis factor. Proc Natl Acad Sci U S A. 82, 8667-8671
Kapitel 6 – Literaturverzeichnis 135 Gao, X., Kouklis, P., Xu, N., Minshall, R. D., Sandoval, R., Vogel, S. M., Malik, A. B. (2000). Reversibility of increased microvessel permeability in response to VE-cadherin disassembly. Am J Physiol Lung Cell Mol Physiol. 279, 1218-1225 Gebb, S. A., Graham, J. A., Hanger, C. C., Godbey, P. S., Capen, R. L., Doerschuk, C. M., Wagner, W. W. Jr. (1995). Sites of leukocyte sequestration in the pulmonary microcirculation. J Appl Physiol. 79, 493-497 Gibofsky, A., Jaffe, E. A., Fotino, M., Becker, C. G. (1975). The identification of HL-A antigens on fresh and cultured human endothelial cells. J Immunol. 115, 730-733 Gimbrone, M. A. Jr., Nagel, T., Topper, J. N. (1997). Biomechanical activation: an emerging paradigm in endothelial adhesion biology. J Clin Invest. 100, 61-65 Goldblum, S. E., Brann, T. W., Ding, X., Pugin, J., Tobias, P. S. (1994). Lipopolysaccharide (LPS)-binding protein and soluble CD14 function as accessory molecules for LPS-induced changes in endothelial barrier function, in vitro. J Clin Invest. 93, 692-702 Goldblum, S. E., Ding, X., Brann, T. W., Campbell-Washington, J. (1993). Bacterial lipopolysaccharide induces actin reorganization, intercellular gap formation, and endothelial barrier dysfunction in pulmonary vascular endothelial cells: concurrent F-actin depolymerization and new actin synthesis. J Cell Physiol. 157, 13-23 Gopalan, P. K., Burns, A. R., Simon, S. I., Sparks, S., McIntire, L. V., Smith, C. W. (2000). Preferential sites for stationary adhesion of neutrophils to cytokine-stimulated HUVEC under flow conditions. J Leukoc Biol. 68, 47-57 Gory-Faure, S., Prandini, M. H., Pointu, H., Roullot, V., Pignot-Paintrand, I., Vernet, M., Huber, P. (1999). Role of vascular endothelial-cadherin in vascular morphogenesis. Development. 126, 2093-2102 Gotsch, U., Borges, E., Bosse, R., Boggemeyer, E., Simon, M., Mossmann, H., Vestweber, D. (1997). VE-cadherin antibody accelerates neutrophil recruitment in vivo. J Cell Sci. 110, 583-588 Gräfe, M., Auch-Schwelk, W., Graf, K., Terbeek, D., Hertel, H., Unkelbach, M., Hildebrandt, A., Fleck, E. (1994). Isolation and characterization of macrovascular and microvascular endothelial cells from human hearts. Am J Physiol. 267, 2138-2148 Grau, G. E., Mili, N., Lou, J. N., Morel, D. R., Ricou, B., Lucas, R., Suter, P. M. (1996). Phenotypic and functional analysis of pulmonary microvascular endothelial cells from patients with acute respiratory distress syndrome. Lab Invest. 74, 761-770 Grissom, C. K., Zimmerman, G. A., Whatley, R. E. (1997). Endothelial selectins in acute mountain sickness and high-altitude pulmonary edema. Chest. 112, 1572-1578 Gulino, D., Delachanal, E., Concord, E., Genoux, Y., Morand, B., Valiron, M. O., Sulpice, E., Scaife, R., Alemany, M., Vernet, T. (1998). Alteration of endothelial cell monolayer integrity triggers resynthesis of vascular endothelium cadherin. J Biol Chem. 273, 29786-29793 Guo, M., Wu, M. H., Granger, H. J., Yuan, S.Y. (2004). Transference of recombinant VE-cadherin cytoplasmic domain alters endothelial junctional integrity and porcine microvascular permeability. J Physiol. 554, 78-88 Haimovitz-Friedman, A., Cordon-Cardo, C., Bayoumy, S., Garzotto, M., McLoughlin, M., Gallily, R., Edwards, C. K. 3rd, Schuchman, E. H., Fuks, Z., Kolesnick, R. (1997). Lipopolysaccharide induces disseminated endothelial apoptosis requiring ceramide generation. J Exp Med. 186, 1831-1841 Harris, E. S., McIntyre, T. M., Prescott, S. M., Zimmerman, G. A. (2000). The leukocyte integrins. J Biol Chem. 275, 23409-23412 Haselton, F. R., Heimark, R. L. (1997). Role of cadherins 5 and 13 in the aortic endothelial barrier. J Cell Physiol. 171, 243-251
Kapitel 6 – Literaturverzeichnis 136 Hasleton, P. S., Roberts, T. E. (1999). Adult respiratory distress syndrome - an update. Histopathology. 34, 285-294 Heimark, R. L., Degner, M., Schwartz, S. M. (1990). Identification of a Ca2(+)-dependent cell-cell adhesion molecule in endothelial cells. J Cell Biol. 110, 1745-1756 Henninger, D. D., Panes, J., Eppihimer, M., Russell, J., Gerritsen, M., Anderson, D. C., Granger, D. N. (1997). Cytokine-induced VCAM-1 and ICAM-1 expression in different organs of the mouse. J Immunol. 158, 1825-1832 Hermanns, Maria Iris (1997). Isolierung und Kultivierung humaner pulmonaler mikrovaskulärer Endothelzellen (HP-MEC) (Diplomarbeit). Rheinisch-Westfälische Technische Hochschule (RWTH) Aachen, Mathematisch-Naturwissenschaftliche Fakultät. Hermant, B., Bibert, S., Concord, E., Dublet, B., Weidenhaupt, M., Vernet, T., Gulino-Debrac, D. (2003). Identification of proteases involved in the proteolysis of vascular endothelium cadherin during neutrophil transmigration. J Biol Chem. 278, 14002-14012 Herren, B., Levkau, B., Raines, E. W., Ross, R. (1998). Cleavage of beta-catenin and plakoglobin and shedding of VE-cadherin during endothelial apoptosis: evidence for a role for caspases and metalloproteinases. Mol Biol Cell. 9, 1589-1601 Heumann, D., Glauser, M. P., Calandra, T. (1998). Molecular basis of host-pathogen interaction in septic shock. Curr Opin Microbiol. 1, 49-55 Hofmann, S., Grasberger, H., Jung, P., Bidlingmaier, M., Vlotides, J., Janssen, O. E., Landgraf, R. (2002). The tumour necrosis factor-alpha induced vascular permeability is associated with a reduction of VE-cadherin expression. Eur J Med Res. 7, 171-176 Hogg, J. C., Doerschuk, C. M. (1995).Leukocyte traffic in the lung. Annu Rev Physiol. 57, 97-114 Hordijk, P. L., Anthony, E., Mul, F. P., Rientsma, R., Oomen, L. C., Roos, D. (1999). Vascular-endothelial-cadherin modulates endothelial monolayer permeability. J Cell Sci. 112, 1915-1923 Hudry-Clergeon, H., Stengel, D., Ninio, E., Vilgrain, I. (2005). Platelet-activating factor increases VE-cadherin tyrosine phosphorylation in mouse endothelial cells and its association with the PtdIns3'-kinase. FASEB J. 19, 512-520 Imaizumi, T., Albertine, K. H., Jicha, D. L., McIntyre, T. M., Prescott, S. M., Zimmerman, G. A. (1997). Human endothelial cells synthesize ENA-78: relationship to IL-8 and to signaling of PMN adhesion. Am J Respir Cell Mol Biol. 17, 181-192 Inano, H., English, D., Doerschuk, C. M. (1992). Effect of zymosan-activated plasma on the deformability of rabbit polymorphonuclear leukocytes. J Appl Physiol. 73, 1370-1376 Iyer, S., Ferreri, D. M., DeCocco, N. C., Minnear, F. L., Vincent, P. A. (2004). VE-cadherin-p120 interaction is required for maintenance of endothelial barrier function. Am J Physiol Lung Cell Mol Physiol. 286, 1143-1153 Jaffe, E. A. (1987). Cell biology of endothelial cells. Hum Pathol. 18, 234-239 Jaffe, E. A., Nachman, R. L., Becker, C. G., Minick, C. R. (1973). Culture of human endothelial cells derived from umbilical veins. Identification by morphologic and immunologic criteria. J Clin Invest. 52, 2745-2756 Jarrar, D., Wang, P., Song, G. Y., Cioffi, W. G., Bland, K. I., Chaudry, I. H. (2000). Inhibition of tyrosine kinase signaling after trauma-hemorrhage: a novel approach for improving organ function and decreasing susceptibility to subsequent sepsis. Ann Surg. 231, 399-407 Jersmann, H. P., Hii, C. S., Ferrante, J. V., Ferrante, A. (2001). Bacterial lipopolysaccharide and tumor necrosis factor alpha synergistically increase expression of human endothelial adhesion molecules through activation of NF-kappaB and p38 mitogen-activated protein kinase signaling pathways. Infect Immun. 69, 1273-1279
Kapitel 6 – Literaturverzeichnis 137 Kelly, J. J., Moore, T. M., Babal, P., Diwan, A. H., Stevens, T., Thompson, W. J. (1998). Pulmonary microvascular and macrovascular endothelial cells: differential regulation of Ca2+ and permeability. Am J Physiol. 274, 810- 819 Kevil, C. G., Okayama, N., Trocha, S. D., Kalogeris, T. J., Coe, L. L., Specian, R. D., Davis, C. P., Alexander, J. S. (1998). Expression of zonula occludens and adherens junctional proteins in human venous and arterial endothelial cells: role of occludin in endothelial solute barriers. Microcirculation. 5, 197-210 Kevil, C. G., Ohno, N., Gute, D. C., Okayama, N., Robinson, S. A., Chaney, E., Alexander, J. S. (1998a). Role of cadherin internalization in hydrogen peroxide-mediated endothelial permeability. Free Radic Biol Med. 24, 1015-1022 Khimenko, P. L., Taylor, A. E. (1999). Segmental microvascular permeability in ischemia-reperfusion injury in rat lung. Am J Physiol. 276, 958-960 Knierim, Jan Holger (2000). Charakterisierung LPS-inhibierender Effekte von Lipoproteinen und Lipopolysaccharid bindendem Protein (LBP) in murinem Serum (Dissertation). Medizinische Fakultät der Humboldt-Universität zu Berlin. Kremmidiotis, G., Baker, E., Crawford, J., Eyre, H. J., Nahmias, J., Callen, D. F. (1998). Localization of human cadherin genes to chromosome regions exhibiting cancer-related loss of heterozygosity. Genomics. 49, 467- 471 Konstantoulaki, M., Kouklis, P., Malik, A. B. (2003). Protein kinase C modifications of VE-cadherin, p120, and beta-catenin contribute to endothelial barrier dysregulation induced by thrombin. Am J Physiol Lung Cell Mol Physiol. 285, 434-442 Kowalczyk, A. P., Navarro, P., Dejana, E., Bornslaeger, E. A., Green, K. J., Kopp, D. S., Borgwardt, J. E. (1998). VE-cadherin and desmoplakin are assembled into dermal microvascular endothelial intercellular junctions: a pivotal role for plakoglobin in the recruitment of desmoplakin to intercellular junctions. J Cell Sci. 111, 3045-3057 Kuebler, W. M., Kuhnle, G. E., Groh, J., Goetz, A. E. (1997). Contribution of selectins to leucocyte sequestration in pulmonary microvessels by intravital microscopy in rabbits. J Physiol. 501, 375-386 Lambert, O., Taveau, J. C., Him, J. L., Al Kurdi, R., Gulino-Debrac, D., Brisson, A. (2005). The basic framework of VE-cadherin junctions revealed by cryo-EM. J Mol Biol. 346, 1193-1196 Lamm, W. J., Luchtel, D., Albert, R. K. (1988). Sites of leakage in three models of acute lung injury. J Appl Physiol. 64, 1079-1083 Lamping, N., Dettmer, R., Schroder, N. W., Pfeil, D., Hallatschek, W., Burger, R., Schumann, R. R. (1998). LPS-binding protein protects mice from septic shock caused by LPS or gram-negative bacteria. J Clin Invest. 101, 2065-2071 Lampugnani, M. G., Corada, M., Caveda, L., Breviario, F., Ayalon, O., Geiger, B., Dejana, E. (1995). The molecular organization of endothelial cell to cell junctions: differential association of plakoglobin, beta-catenin, and alpha-catenin with vascular endothelial cadherin (VE-cadherin). J Cell Biol. 129, 203-217 Lampugnani, M. G., Resnati, M., Raiteri, M., Pigott, R., Pisacane, A., Houen, G., Ruco, L. P., Dejana, E. (1992). A novel endothelial-specific membrane protein is a marker of cell-cell contacts. J Cell Biol. 118, 1511-1522 Lee, W. L., Downey, G. P. (2001). Neutrophil activation and acute lung injury. Curr Opin Crit Care. 7, 1-7 Lehr, H. A., Bittinger, F., Kirkpatrick, C. J. (2000). Microcirculatory dysfunction in sepsis: a pathogenetic basis for therapy? J Pathol. 190, 373-386 Lehr, H. A., Arfors, K. E. (1994). Mechanisms of tissue damage by leukocytes. Curr Opin Hematol. 1, 92-99 Lewis, C. A., Martin, G. S. (2004). Understanding and managing fluid balance in patients with acute lung injury. Curr Opin Crit Care. 10, 13-17
Kapitel 6 – Literaturverzeichnis 138 Liao, F., Doody, J. F., Overholser, J., Finnerty, B., Bassi, R., Wu, Y., Dejana, E., Kussie, P., Bohlen, P., Hicklin, D. J. (2002). Selective targeting of angiogenic tumor vasculature by vascular endothelial-cadherin antibody inhibits tumor growth without affecting vascular permeability. Cancer Res. 62, 2567-2575 Lim, M. J., Chiang, E. T., Hechtman, H. B., Shepro, D. (2001). Inflammation-induced subcellular redistribution of VE-cadherin, actin, and gamma-catenin in cultured human lung microvessel endothelial cells. Microvasc Res. 62, 366-382 DeLisser, H. M., Albelda, S. M. (1998). The function of cell adhesion molecules in lung inflammation: more questions than answers. Am J Respir Cell Mol Biol. 19, 533-536 Lucchesi, B. R. (1990). Modulation of leukocyte-mediated myocardial reperfusion injury. Annu Rev Physiol. 52, 561-576 Lum, H., Malik, A. B. (1996). Mechanisms of increased endothelial permeability. Can J Physiol Pharmacol. 74, 787-800 Luscinskas, F. W., Gimbrone, M. A. Jr. (1996). Endothelial-dependent mechanisms in chronic inflammatory leukocyte recruitment. Annu Rev Med. 47, 413-421 Mantovani, A., Bussolino, F., Introna, M. (1997). Cytokine regulation of endothelial cell function: from molecular level to the bedside. Immunol Today. 18, 231-240 Mantovani, A., Bussolino, F., Dejana, E. (1992). Cytokine regulation of endothelial cell function. FASEB J. 6, 2591-2599 Marin, J., Rodriguez-Martinez, M. A. (1999). Age-related changes in vascular responses. Exp Gerontol. 34, 503-512 Mark, K. S., Miller, D. W. (1999). Increased permeability of primary cultured brain microvessel endothelial cell monolayers following TNF-alpha exposure. Life Sci. 64, 1941-1953 Del Maschio, A., Zanetti, A., Corada, M., Rival, Y., Ruco, L., Lampugnani, M. G., Dejana, E. (1996). Polymorphonuclear leukocyte adhesion triggers the disorganization of endothelial cell-to-cell adherens junctions. J Cell Biol. 135, 497-510 Masuda, N., Ohnishi, T., Kawamoto, S., Monden, M., Okubo, K. (1999). Analysis of chemical modification of RNA from formalin-fixed samples and optimization of molecular biology applications for such samples. Nucleic Acids Res. 27, 4436-4443 Matthay, M. A., Zimmerman, G. A., Esmon, C., Bhattacharya, J., Coller, B., Doerschuk, C. M., Floros, J., Gimbrone, M. A. Jr., Hoffman, E., Hubmayr, R. D., Leppert, M., Matalon, S., Munford, R., Parsons, P., Slutsky, A. S., Tracey, K. J., Ward, P., Gail, D. B., Harabin, A. L. (2003). Future research directions in acute lung injury: summary of a National Heart, Lung, and Blood Institute working group. Am J Respir Crit Care Med. 167, 1027-1035 Meduri, G. U., Kanangat, S., Stefan, J., Tolley, E., Schaberg, D. (1999). Cytokines IL-1beta, IL-6, and TNF-alpha enhance in vitro growth of bacteria. Am J Respir Crit Care Med. 160, 961-967 Meyrick, B., Berry, L. C. Jr., Christman, B. W. (1995). Response of cultured human pulmonary artery endothelial cells to endotoxin. Am J Physiol. 268, 239-244 Miao, H., Hu, Y. L., Shiu, Y. T., Yuan, S., Zhao, Y., Kaunas, R., Wang, Y., Jin, G., Usami, S., Chien, S. (2005). Effects of flow patterns on the localization and expression of VE-cadherin at vascular endothelial cell junctions: in vivo and in vitro investigations. J Vasc Res. 42, 77-89 Minagar, A., Long, A., Ma, T., Jackson, T. H., Kelley, R. E., Ostanin, D. V., Sasaki, M., Warren, A. C., Jawahar, A., Cappell, B., Alexander, J. S. (2003). Interferon (IFN)-beta 1a and IFN-beta 1b block IFN-gamma-induced disintegration of endothelial junction integrity and barrier. Endothelium. 10, 299-307 Morrison, D. C., Ryan, J. L. (1987). Endotoxins and disease mechanisms. Annu Rev Med. 38, 417-432
Kapitel 6 – Literaturverzeichnis 139 Moss, M., Gillespie, M. K., Ackerson, L., Moore, F. A., Moore, E. E., Parsons, P. E. (1996). Endothelial cell activity varies in patients at risk for the adult respiratory distress syndrome. Crit Care Med. 24, 1782-1786 Müller, A. M., Gruhn, K., Lange, S., Franke, F. E., Müller, K. M. (2004). Angiotensin converting enzyme (ACE, CD143) in the regular pulmonary vasculature. Pathologe. 25, 141-146 Müller, A. M., Cronen, C., Muller, K. M., Kirkpatrick, C. J. (2002). Heterogeneous expression of cell adhesion molecules by endothelial cells in ARDS. J Pathol. 198, 270-275 Müller, A. M., Nesslinger, M., Skipka, G., Müller, K. M. (2002a). Expression of CD34 in pulmonary endothelial cells in vivo. Pathobiology. 70, 11-17
Müller, A. M., Skrzynski, C., Skipka, G., Müller, K. M. (2002b). Expression of von Willebrand factor by human pulmonary endothelial cells in vivo. Respiration. 69, 526-533 Müller, A. M., Skrzynski, C., Nesslinger, M., Skipka, G., Müller K. M. (2002c). Correlation of age with in vivo expression of endothelial markers. Exp Gerontol. 37, 713-719 Müller, K. M., Grundmann, E. (1980). Pathologisch-anatomische Veränderungen nach „akutem Lungenversagen“ In: Lawin P, Wendt M (Hrsg.): Aktuelle Probleme der Intensivbehandlung II, Band 17, 2. Auflage. Thieme Verlag Stuttgart New York Muller, W. A., Weigl, S. A., Deng, X., Phillips, D. M. (1993). PECAM-1 is required for transendothelial migration of leukocytes. J Exp Med. 178, 449-460 Murphy, T. J., Thurston, G., Ezaki, T., McDonald, D. M. (1999). Endothelial cell heterogeneity in venules of mouse airways induced by polarized inflammatory stimulus. Am J Pathol. 155, 93-103 Mutunga, M., Fulton, B., Bullock, R., Batchelor, A., Gascoigne, A., Gillespie, J. I., Baudouin, S. V. (2001). Circulating endothelial cells in patients with septic shock. Am J Respir Crit Care Med. 163, 195-200 Navarro, P., Caveda, L., Breviario, F., Mandoteanu, I., Lampugnani, M. G., Dejana, E. (1995). Catenin-dependent and -independent functions of vascular endothelial cadherin. J Biol Chem. 270, 30965-30972 Nawroth, R., Poell, G., Ranft, A., Kloep, S., Samulowitz, U., Fachinger, G., Golding, M., Shima, D. T., Deutsch, U., Vestweber, D. (2002). VE-PTP and VE-cadherin ectodomains interact to facilitate regulation of phosphorylation and cell contacts. EMBO J. 21, 4885-4895 Nelson, W. J., Nusse, R. (2004). Convergence of Wnt, beta-catenin, and cadherin pathways. Science. 303, 1483-1487 Noll und Schaub-Kuhnen (2000). Praxis der Immunhistochemie. Urban und Fischer Verlag München Jena
Nollet, F., Kools, P., van Roy, F. (2000). Phylogenetic analysis of the cadherin superfamily allows identification of six major subfamilies besides several solitary members. J Mol Biol. 299, 551- 572 Noris, M., Morigi, M., Donadelli, R., Aiello, S., Foppolo, M., Todeschini, M., Orisio, S., Remuzzi, G., Remuzzi, A. (1995). Nitric oxide synthesis by cultured endothelial cells is modulated by flow conditions. Circ Res. 76, 536-543 Nwariaku, F. E., Liu, Z., Zhu, X., Turnage, R. H., Sarosi, G. A., Terada, L. S. (2002). Tyrosine phosphorylation of vascular endothelial cadherin and the regulation of microvascular permeability. Surgery. 132, 180-185 Opal, S. M., Cohen, J. (1999). Clinical gram-positive sepsis: does it fundamentally differ from gram-negative bacterial sepsis? Crit Care Med. 27, 1608-1616 Orfanos, S. E., Mavrommati, I., Korovesi, I., Roussos, C. (2004). Pulmonary endothelium in acute lung injury: from basic science to the critically ill. Intensive Care Med. 30, 1702-1714
Kapitel 6 – Literaturverzeichnis 140 Park, W. Y., Goodman, R. B., Steinberg, K. P., Ruzinski, J. T., Radella, F. 2nd, Park, D. R., Pugin, J., Skerrett, S. J., Hudson, L. D., Martin, T. R. (2001). Cytokine balance in the lungs of patients with acute respiratory distress syndrome. Am J Respir Crit Care Med. 164, 1896-1903 Parker, J. C., Yoshikawa, S. (2002). Vascular segmental permeabilities at high peak inflation pressure in isolated rat lungs. Am J Physiol Lung Cell Mol Physiol. 283, 1203-1209 Pearson, C. A., Lamar, P. C., Prozialeck, W. C. (2003). Effects of cadmium on E-cadherin and VE-cadherin in mouse lung. Life Sci. 72, 1303-1320 Pellegrino, M., Furmaniak-Kazmierczak, E., LeBlanc, J. C., Cho, T., Cao, K., Marcovina, S. M., Boffa, M. B., Cote, G. P., Koschinsky, M. L. (2004). The apolipoprotein(a) component of lipoprotein(a) stimulates actin stress fiber formation and loss of cell-cell contact in cultured endothelial cells. J Biol Chem. 279, 6526-6533 Petrache, I., Birukova, A., Ramirez, S. I., Garcia, J. G., Verin, A. D. (2003). The role of the microtubules in tumor necrosis factor-alpha-induced endothelial cell permeability. Am J Respir Cell Mol Biol. 28, 574-581 Pugin, J., Schurer-Maly, C. C., Leturcq, D., Moriarty, A., Ulevitch, R. J., Tobias, P. S. (1993). Lipopolysaccharide activation of human endothelial and epithelial cells is mediated by lipopolysaccharide-binding protein and soluble CD14. Proc Natl Acad Sci U S A. 90, 2744-2748 Putensen, C., Wrigge, H. (2000). Ventilator-associated systemic inflammation in acute lung injury. Intensive Care Med. 26, 1411-1413 Rajotte, D., Arap, W., Hagedorn, M., Koivunen, E., Pasqualini, R., Ruoslahti, E. (1998). Molecular heterogeneity of the vascular endothelium revealed by in vivo phage display. J Clin Invest. 102, 430-437 Remmele, W., Hildebrand, U., Hienz, H. A., Klein, P. J., Vierbuchen, M., Behnken, L. J., Heicke, B., Scheidt, E. (1986). Comparative histological, histochemical, immunohistochemical and biochemical studies on oestrogen receptors, lectin receptors, and Barr bodies in human breast cancer. Virchows Arch. 409, 127-147 Risau, W. (1995). Differentiation of endothelium. FASEB J. 9, 926-933 Rival, Y., Del Maschio, A., Rabiet, M. J., Dejana, E., Duperray, A. (1996). Inhibition of platelet endothelial cell adhesion molecule-1 synthesis and leukocyte transmigration in endothelial cells by the combined action of TNF-alpha and IFN-gamma. J Immunol. 157, 1233-1241 Romer, L. H., McLean, N. V., Yan, H. C., Daise, M., Sun, J., DeLisser, H. M. (1995). IFN-gamma and TNF-alpha induce redistribution of PECAM-1 (CD31) on human endothelial cells. J Immunol. 154, 6582-6592 Rosengren, S., Olofsson, A. M., von Andrian, U. H., Lundgren-Akerlund, E., Arfors, K. E. (1991). Leukotriene B4-induced neutrophil-mediated endothelial leakage in vitro and in vivo. J Appl Physiol. 71, 1322-1330 Sacco, P. A., McGranahan, T. M., Wheelock, M. J., Johnson, K. R. (1995). Identification of plakoglobin domains required for association with N-cadherin and alpha-catenin. J Biol Chem. 270, 20201-20206 Sandoval, R., Malik, A. B., Minshall, R. D., Kouklis, P., Ellis, C. A., Tiruppathi, C. (2001). Ca(2+) signalling and PKCalpha activate increased endothelial permeability by disassembly of VE-cadherin junctions. J Physiol. 533, 433-445 Schleimer, R. P., Rutledge, B. K. (1986). Cultured human vascular endothelial cells acquire adhesiveness for neutrophils after stimulation with interleukin 1, endotoxin, and tumor-promoting phorbol diesters. J Immunol. 136, 649-654 Schnittler, H. J., Püschel, B., Drenckhahn, D. (1997). Role of cadherins and plakoglobin in interendothelial adhesion under resting conditions and shear stress. Am J Physiol. 273, 2396-2405
Kapitel 6 – Literaturverzeichnis 141 Shapiro, L., Fannon, A. M., Kwong, P. D., Thompson, A., Lehmann, M. S., Grubel, G., Legrand, J. F., Als-Nielsen, J., Colman, D. R., Hendrickson, W. A. (1995). Structural basis of cell-cell adhesion by cadherins. Nature. 374, 327-337 Shatos, M. A., Orfeo, T., Doherty, J. M., Penar, P. L., Collen, D., Mann, K. G. (1995). Alpha-thrombin stimulates urokinase production and DNA synthesis in cultured human cerebral microvascular endothelial cells. Arterioscler Thromb Vasc Biol. 15, 903-911 Shaw, S. K., Bamba, P. S., Perkins, B. N., Luscinskas, F. W. (2001). Real-time imaging of vascular endothelial-cadherin during leukocyte transmigration across endothelium. J Immunol. 167, 2323-2330 Shaw, S. K., Perkins, B. N., Lim, Y. C., Liu, Y., Nusrat, A., Schnell, F. J., Parkos, C. A., Luscinskas, F. W. (2001a). Reduced expression of junctional adhesion molecule and platelet/endothelial cell adhesion molecule-1 (CD31) at human vascular endothelial junctions by cytokines tumor necrosis factor-alpha plus interferon-gamma Does not reduce leukocyte transmigration under flow. Am J Pathol. 159, 2281-2291 Shi, S. R., Cote, R. J., Wu, L., Liu, C., Datar, R., Shi, Y., Liu, D., Lim, H., Taylor, C. R. (2002). DNA extraction from archival formalin-fixed, paraffin-embedded tissue sections based on the antigen retrieval principle: heating under the influence of pH. J Histochem Cytochem. 50, 1005-1011 Simionescu, M., Simionescu, N., Palade, G. E. (1976). Segmental differentiations of cell junctions in the vascular endothelium. Arteries and veins. J Cell Biol. 68, 705-723 Simionescu, M., Simionescu, N., Palade, G. E. (1975). Segmental differentiations of cell junctions in the vascular endothelium. The microvasculature. J Cell Biol. 67, 863-885 Springer, T. A. (1995). Traffic signals on endothelium for lymphocyte recirculation and leukocyte emigration. Annu Rev Physiol. 57, 827-72 Stevens, T., Garcia, J. G., Shasby, D. M., Bhattacharya, J., Malik, A. B. (2000). Mechanisms regulating endothelial cell barrier function. Am J Physiol Lung Cell Mol Physiol. 279, 419-422 Strieter, R. M., Kunkel, S. L., Keane, M. P., Standiford, T. J. (1999). Chemokines in lung injury: Thomas A. Neff Lecture. Chest. 116, 103-110 Sui, X. F., Kiser, T. D., Hyun, S. W., Angelini, D. J., Del Vecchio, R. L., Young, B. A., Hasday, J. D., Romer, L. H., Passaniti, A., Tonks, N. K., Goldblum, S. E. (2005). Receptor protein tyrosine phosphatase micro regulates the paracellular pathway in human lung microvascular endothelia. Am J Pathol. 166, 1247-1258 Suzuki, S., Sano, K., Tanihara, H. (1991). Diversity of the cadherin family: evidence for eight new cadherins in nervous tissue. Cell Regul. 2, 261-270 Swerlick, R. A., Lee, K. H., Wick, T. M., Lawley, T. J. (1992). Human dermal microvascular endothelial but not human umbilical vein endothelial cells express CD36 in vivo and in vitro. J Immunol. 148, 78-83 Szabo, A., Salzman, A. L., Szabo, C. (1998). Poly (ADP-ribose) synthetase activation mediates pulmonary microvascular and intestinal mucosal dysfunction in endotoxin shock. Life Sci. 63, 2133-2139 Telo', P., Breviario, F., Huber, P., Panzeri, C., Dejana, E. (1998). Identification of a novel cadherin (vascular endothelial cadherin-2) located at intercellular junctions in endothelial cells. J Biol Chem. 273, 17565-17572 Thoreson, M. A., Anastasiadis, P. Z., Daniel, J. M., Ireton, R. C., Wheelock, M. J., Johnson, K. R., Hummingbird, D. K., Reynolds, A. B. (2000). Selective uncoupling of p120(ctn) from E-cadherin disrupts strong adhesion. J Cell Biol. 148, 189-202 Thorin, E., Shatos, M. A., Shreeve, S. M., Walters, C. L., Bevan, J. A. (1997). Human vascular endothelium heterogeneity. A comparative study of cerebral and peripheral cultured vascular endothelial cells. Stroke. 28, 375-381 Thorin, E., Atkinson, J. (1994). Modulation by the endothelium of sympathetic vasoconstriction in an in vitro preparation of the rat tail artery. Br J Pharmacol. 111, 351-357
Kapitel 6 – Literaturverzeichnis 142 Thurston, G., McLean, J. W., Rizen, M., Baluk, P., Haskell, A., Murphy, T. J., Hanahan, D., McDonald, D. M. (1998). Cationic liposomes target angiogenic endothelial cells in tumors and chronic inflammation in mice. J Clin Invest. 101, 1401-1413 Thurston, G., Murphy, T. J., Baluk, P., Lindsey, J. R., McDonald, D. M. (1998a). Angiogenesis in mice with chronic airway inflammation: strain-dependent differences. Am J Pathol. 153, 1099-1112 Tinsley, J. H., Breslin, J. W., Teasdale, N. R., Yuan, S. Y. (2005). PKC-dependent, burn-induced adherens junction reorganization and barrier dysfunction in pulmonary microvascular endothelial cells. Am J Physiol Lung Cell Mol Physiol. 289, 217-223 Tinsley, J. H., Wu, M. H., Ma, W., Taulman, A. C., Yuan, S. Y. (1999). Activated neutrophils induce hyperpermeability and phosphorylation of adherens junction proteins in coronary venular endothelial cells. J Biol Chem. 274, 24930-24934 Tiruppathi, C., Minshall, R. D., Paria, B. C., Vogel, S. M., Malik, A. B. (2002). Role of Ca2+ signaling in the regulation of endothelial permeability. Vascul Pharmacol. 39, 173-185 Tobias, P. S., Soldau, K., Ulevitch, R. J. (1986). Isolation of a lipopolysaccharide-binding acute phase reactant from rabbit serum. J Exp Med. 164, 777-793 Tsokos, M. (2003). Immunohistochemical detection of sepsis-induced lung injury in human autopsy material. Leg Med (Tokyo). 5, 73-86 Tsokos, M., Fehlauer, F. (2001). Post-mortem markers of sepsis: an immunohistochemical study using VLA-4 (CD49d/CD29) and ICAM-1 (CD54) for the detection of sepsis-induced lung injury. Int J Legal Med. 114,
291-294 Tsokos, M., Fehlauer, F., Püschel, K. (2000). Immunohistochemical expression of E-selectin in sepsis-induced lung injury. Int J Legal Med. 113, 338-342 Ukropec, J. A., Hollinger, M. K., Salva, S. M., Woolkalis, M. J. (2000). SHP2 association with VE-cadherin complexes in human endothelial cells is regulated by thrombin. J Biol Chem. 275, 5983-5986 Ulevitch, R. J., Cochrane, C. G., Henson, P. M., Morrison, D. C., Doe, W. F. (1975). Mediation systems in bacterial lipopolysaccharide-induced hypotension and disseminated intravascular coagulation. I. The role of complement. J Exp Med. 142, 1570-1590 Valiron, O., Chevrier, V., Usson, Y., Breviario, F., Job, D., Dejana, E. (1996). Desmoplakin expression and organization at human umbilical vein endothelial cell-to-cell junctions. J Cell Sci. 109, 2141-2149 Venkiteswaran, K., Xiao, K., Summers, S., Calkins, C. C., Vincent, P. A., Pumiglia, K., Kowalczyk, A. P. (2002). Regulation of endothelial barrier function and growth by VE-cadherin, plakoglobin, and beta-catenin. Am J Physiol Cell Physiol. 283, 811-821 Vincent, P. A., Xiao, K., Buckley, K. M., Kowalczyk, A. P. (2004). VE-cadherin: adhesion at arm's length. Am J Physiol Cell Physiol. 286, 987-997 Vittet, D., Buchou, T., Schweitzer, A., Dejana, E., Huber, P. (1997). Targeted null-mutation in the vascular endothelial-cadherin gene impairs the organization of vascular-like structures in embryoid bodies. Proc Natl Acad Sci U S A. 94, 6273-6278 Volk, T., Kox, W. J. (2000). Endothelium function in sepsis. Inflamm Res. 49, 185-198 Vuong, P. N., Berry, C. (2002). The pathology of vessels. Springer Verlag Paris Berlin Heidelberg Wang, Q., Pfeiffer, G. R. 2nd, Stevens, T., Doerschuk, C. M. (2002). Lung microvascular and arterial endothelial cells differ in their responses to intercellular adhesion molecule-1 ligation. Am J Respir Crit Care Med. 166, 872-877 Ward, P. A., Hunninghake, G. W. (1998). Lung inflammation and fibrosis. Am J Respir Crit Care Med. 157,
123-129
Kapitel 6 – Literaturverzeichnis 143 Weinacker, A. B., Vaszar, L. T. (2001). Acute respiratory distress syndrome: physiology and new management strategies. Annu Rev Med. 52, 221-237 van Wetering, S., van Buul, J. D., Quik, S., Mul, F. P., Anthony, E. C., ten Klooster, J. P., Collard, J. G., Hordijk, P. L. (2002). Reactive oxygen species mediate Rac-induced loss of cell-cell adhesion in primary human endothelial cells. J Cell Sci. 115, 1837-1846 Wojciak-Stothard, B., Entwistle, A., Garg, R., Ridley, A. J. (1998). Regulation of TNF-alpha-induced reorganization of the actin cytoskeleton and cell-cell junctions by Rho, Rac, and Cdc42 in human endothelial cells. J Cell Physiol. 176, 150-165 Wong, R. K., Baldwin, A. L., Heimark, R. L. (1999). Cadherin-5 redistribution at sites of TNF-alpha and IFN-gamma-induced permeability in mesenteric venules. Am J Physiol. 276, 736-748 Xiao, K., Allison, D. F., Buckley, K. M., Kottke, M. D., Vincent, P. A., Faundez, V., Kowalczyk, A. P. (2003). Cellular levels of p120 catenin function as a set point for cadherin expression levels in microvascular endothelial cells. J Cell Biol. 163, 535-545 Xiao, F., Eppihimer, M. J., Young, J. A., Nguyen, K., Carden, D. L. (1997). Lung neutrophil retention and injury after intestinal ischemia/reperfusion. Microcirculation. 4, 359-367 Yanagisawa, M., Kurihara, H., Kimura, S., Tomobe, Y., Kobayashi, M., Mitsui, Y., Yazaki, Y., Goto, K., Masaki, T. (1988). A novel potent vasoconstrictor peptide produced by vascular endothelial cells. Nature. 332, 411-415 Yap, A. S., Niessen, C. M., Gumbiner, B. M. (1998). The juxtamembrane region of the cadherin cytoplasmic tail supports lateral clustering, adhesive strengthening, and interaction with p120ctn. J Cell Biol. 141, 779-789 Zhao, X., Alexander, J. S., Zhang, S., Zhu, Y., Sieber, N. J., Aw, T. Y., Carden, D. L. (2001). Redox regulation of endothelial barrier integrity. Am J Physiol Lung Cell Mol Physiol. 281, 879-886 Zimmerman, G. A., Albertine, K. H., Carveth, H. J., Gill, E. A., Grissom, C. K., Hoidal, J. R., Imaizumi, T., Maloney, C. G., McIntyre, T. M., Michael, J. R., Orme, J. F., Prescott, S. M., Topham, M. S. (1999). Endothelial activation in ARDS. Chest. 116, 18-24
Kapitel 7 – Danksagung 144
7 Danksagung
Frau PD Dr. med. Müller danke ich herzlich für die Überlassung des Themas. Mein
besonderer Dank gilt ihrer hervorragenden Betreuung, ihrer Geduld und ihrem Verständnis
für mein Studium und meine privaten Interessen.
Herrn Prof. Dr. med. Müller danke ich für die Bereitstellung der Institutseinrichtungen.
Meinen Eltern danke ich für die finanzielle Unterstützung meines Studiums und meiner
Doktorarbeit.
Herrn Prof. Dr. med. Kirkpatrick, Direktor des Instituts für Pathologie der Johann-
Gutenberg-Universität Mainz, danke ich für die Bereitstellung der Einrichtungen des
Zellkulturlabors. Vielen Dank für die Unterstützung durch das ganze Team.
Herrn PD Dr. med. Tsokos danke ich für die Überlassung der Lungengewebsproben von
an septischem ARDS verstorbenen Patienten.
Frau Dipl.-Biolog. Stockmann danke ich für die Einarbeitung in die Immunofluoreszenz-
Fotographie.
Herrn PD Dr. med. Lange und Herrn Dipl.-Stat. Holland-Letz danke ich für die
hervorragende statistische Beratung.
Frau Cornelia Troske danke ich für ihre Unterstützung bei fototechnischen Problemen.
Meinen Freunden danke ich für das Verständnis, die Unterstützung und die schöne Zeit
während des Studiums.
Kapitel 8 – Lebenslauf 145
8 Lebenslauf
Name: Herwig
Vorname: Martina Christina
Geburtsdatum: 01.02.1981
Geburtsort: Dortmund
Familienstand: ledig
Konfession: römisch-katholisch
Eltern: Dr. med. Burckhardt Herwig, Arzt für Innere Medizin
Liselotte Herwig (geb. Kaufmann), Hausfrau
Schullaufbahn: 1987 - 1991 Aplerbecker-Mark-Grundschule in Dortmund
1991 - 2000 Stadtgymnasium Dortmund (Abiturnote 1,3)
Fremdsprachen: 1. Fremdsprache: Latein (1991); Abschluss: Latinum
2. Fremdsprache: Englisch (1993)
3. Fremdsprache: Alt-Griechisch (1995); Abschluss: Graecum
Studium: 2000 bis jetzt Medizinstudium an der Ruhr-Universität Bochum
2002 Physikum
2003 1. Staatsexamen (2,0)
2005 2. Staatsexamen (1,66)
Famulaturen: Institut für Pathologie (BG-Kliniken Bergmannsheil, Bochum)
Knappschaftskrankenhaus Bochum-Langendreer, Augenklinik
Wiener Gebietskrankenkasse, Augenambulanz
Wiener Gebietskrankenkasse, Gastroenterologische Ambulanz
Unfallkrankenhaus Wien-Meidling
Krankenhaus Bethanien (Dortmund), Innere Medizin
Praxis für Allgemeinmedizin in Schwerte
Praxis für Unfallchirurgie in Dortmund
Praktisches Jahr: 1. Tertial: Chirurgie, Knappschaftskrankenhaus Bochum
2. Tertial: Augenheilkunde, Universitätsspital Basel
3. Tertial: Innere Medizin, Knappschaftskrankenhaus Bochum
Recommended