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Verona, Verona, 23 Maggio 2012 23 Maggio 2012
Strategia diStrategia di testingtesting per lper l’’identificazione delle identificazione delle sostanze in fase disostanze in fase di Joint SubmissionJoint Submission e/oe/o InquiryInquiry
((casecase studiesstudies) )
Sergio Sergio FasanFasanCoordinatore Team REACH CHELABCoordinatore Team REACH CHELAB
SERVIZI CHELAB per il REACH TESTINGSERVIZI CHELAB per il REACH TESTINGTEST/STUDI TEST/STUDI CHIMICOCHIMICO--FISICIFISICI
Detmn sostanze pericolose soggette a Restrizione e/o Autorizzazione (SVHC) in articoli
Testi Chimico-Fisici per identificazione/caratterizzazione delle sostanze (All. VI)
Test/Studi Chimico-Fisici per la registrazione/classificazione delle sostanze (All. VII-IX)
STUDI TOSSICOLOGICISTUDI TOSSICOLOGICIAllegati Allegati VIIVII--VIII REACH
STUDI ECOTOSSICOLOGICISTUDI ECOTOSSICOLOGICIAllegati Allegati VIIVII--VIII REACH
VIII REACHBuona Pratica di Laboratorio
VIII REACHBuona Pratica di Laboratorio
IDENTIFICAZIONE IDENTIFICAZIONE E REGISTRAZIONE DELLE SOSTANZEE REGISTRAZIONE DELLE SOSTANZE
Reperimento e valutazione Reperimento e valutazione INFORMAZIONI DISPONIBILI INFORMAZIONI DISPONIBILI
IDENTIFICAZIONE IDENTIFICAZIONE DELLE SOSTANZE DELLE SOSTANZE
DATI BIBLIOGRAFICIhandbook, database,
dati storici
DATI SPERIMENTALI test interni ed esterni
ADATTAMENTOADATTAMENTO
modelli QSPR/(Q)SAR
read-across / grouping
DATI NON SPERIMENTALI
DATA GAP ANALYSISDATA GAP ANALYSISIntegrated StrategyIntegrated Strategy ofof TestingTesting
cfr. RIP 3.3-2: Technical Guidance Document to Industry on the Information Requirements for REACH
IDENTIFICAZIONE DELLE SOSTANZE
L’identificazione delle sostanze è un prerequisito ai fini della verifica della sameness
Molto spesso è stata sottostimata l’importanza della caratterizzazione analitica delle sostanze
Nei primi 5 mesi del 2009 circa 100 inquiries (23%) su 450 sono state respinte dall’ECHA (1) a causa di:
dossier incompleto per mancanza di dati spettraliIdentificazione della sostanza non sufficientemente
descritta
(1) ECHA: 2nd CARACAL Meeting, 15-16th June 2009 – Ref CA/57/2009
TECNICHE ANALITICHE TECNICHE ANALITICHE –– DATI SPETTRALI (1) DATI SPETTRALI (1)
Categoria Metodi ApplicazioneSpettroscopia di Massa
MS (EI, CI, ESI, APCI, FAB, ecc)tandem MS (MSn)HRMSICP-MSTOF (ESI, MALDI)
sostanze organiche e inorganiche
Spettroscopia vibrazionale
FTIRATR-FTIRFluorescenza Vis-NIRRamanRaman confocale
sostanze organiche e inorganiche
TECNICHE ANALITICHE TECNICHE ANALITICHE –– DATI SPETTRALI (2) DATI SPETTRALI (2)
Categoria Metodi ApplicazioneSpettroscopia Elettronica
UV-VisFluorescenza
prevalentemente sostanze organiche
Analisi strutturale
prevalentemente sostanze organiche
NMR in stato solido o liquido di vari nuclei:1H13C19F29Siin 1 o 2 dimensioni (COSY, NOESY ecc., se appropriato)
TECNICHE ANALITICHE TECNICHE ANALITICHE –– COMPOSIZIONE / PUREZZA (1) COMPOSIZIONE / PUREZZA (1)
Categoria Metodi Applicazionesostanze organiche (einorganiche) volatili e semivolatili
Tecniche separative e cromatografiche
Gascromatografia accoppiata a detector FID, MS, MS/MS, ICP-MS, ecc.
Cromatografia Liquida (LC) accoppiata a detector UV-VIS, MS, MS/MS, NMR, RID, ELSD, ecc.
Cromatografia Ionica accoppiata a detector PAD, EC, UV-Vis, MS, ecc.
GPC/SEC (RID, ELSD, UV-Vis, MS, viscosimetrico, NMR)
Elettroforesi Capillareaccoppiata a detector UV-Vis, MS
sostanze organiche (einorganiche)
sostanze organiche einorganiche
macromolecole e sostanze polimeriche
TECNICHE ANALITICHE TECNICHE ANALITICHE –– COMPOSIZIONE / PUREZZA (2) COMPOSIZIONE / PUREZZA (2)
Categoria Metodi ApplicazioneAnalisi elementare
Tecniche di combustioneICP-MSICP-OESAAS (fiamma, fornetto di grafite, FIAS)SEM-EDXXRF
sostanze organiche einorganiche
TECNICHE ANALITICHE TECNICHE ANALITICHE –– ALTRE INFORMAZIONI (1)ALTRE INFORMAZIONI (1)
Categoria Metodi ApplicazioneAnalisi di chimica umida
Titolazioni (volumetriche, potenziometriche, complessometriche, iono-selettive)Analisi gravimetricheAcqua Karl-Fischer
acidi e basi, ioniforme idrate (acqua K-F)
Microscopia SEMTEMInterferometria (surface profiling)SPMAFMLM fluorescence microscopy
granulometria, caratteristiche superficiali e distribuzione delle sostanze
TECNICHE ANALITICHE TECNICHE ANALITICHE –– ALTRE INFORMAZIONI (2)ALTRE INFORMAZIONI (2)
Categoria Metodi ApplicazioneAnalisi Termica TGA
DSCpunti di fusione e di ebollizione (conferma purezza)
Analisi morfologica
sostanze cristalline e/o polimorfiche
XRDTEM
Analisi chirale sostanze chirali PolarimetriaCromatografia enantioselettivaElettroforesi capillareNMR
Misura di proprietàbiologiche
enzimiAttività enzimaticaAmino Analyzer (profilo amminoacidico)
TECNICHE ANALITICHE TECNICHE ANALITICHE –– ALTRE INFORMAZIONI (3)ALTRE INFORMAZIONI (3)
Categoria Metodi ApplicazioneAnalisi dei materiali e di proprietàchimico-fisiche specifiche
proprietà strutturali e morfologiche, proprietàchimico-fisiche specifiche
FormaDurezzaCapacità di rigonfiamentoDensitàArea superficialeIndice di rifrazionepunto di fusione e di ebollizioneMALLSCESECGranulometria laser DLS (Dynamic Light Scattering)
RACCOMANDAZIONI
Tutte le analisi devono essere effettuate sullo stesso lotto di materiale predisposto dal fabbricante (o deve essere fornita una giustificazione se si procede in altro modo) nel caso di lotti omogenei, o su un campione rappresentativo (es. mix di più lotti) nel caso di lotti non omogenei (es. nel caso di sostanze UVCB)
Tutti i solventi/reattivi utilizzati per l'analisi dovrebbero essere spettroscopicamente puri
Gli strumenti utilizzati per le analisi devono essere calibratiperiodicamente secondo procedure adeguate preferibilmente codificate
Se una particolare tecnica di analisi non può essere utilizzata, bisognerebbe fornire una giustificazione valida
GIUSTIFICAZIONE NEL CASO DI MANCANZA DATI ANALITICI – Esempio 2 (ZOLFO)
CONCAWE - Guidance On Analytical Requirements For Sulfur - Completion Of Reach Registration Dossiers
ESEMPIO DI STRATEGIA DI TESTING PER SOSTANZE MONOCOSTITUENTIESEMPIO DI STRATEGIA DI TESTING PER SOSTANZE MONOCOSTITUENTI
Purezza ImpurezzeCategoria Dati Spettrali
Sostanze Organiche
- Spettro UV-Vis- Spettro IR- Spettro 1H-NMR (o 13C-NMR)- Spettro MSx sostanze polimorfe: - Spettro XRD
- GC o LC (MS) (con eventuale derivatizzazione)x sostanze chirali: - Analisi cromatografica enantioselettivax sostanze idrate o in soluzione- Acqua K-F
x imp. organiche:GC o LC (MS) x imp. inorganiche:ICP-MS / AA...
Sostanze Inorganiche
- Spettro IR- Spettro UV-Vis (se applicabile e pertinente)x sostanze cristalline: - Spettro XRD
TitolazioneAnalisi elementare: XRF, AA-Fiamma, ICP-OESx sostanze idrate o in soluzione- Acqua K-F
x imp. organiche: TOCx imp. inorganiche: ICP-MS / AAx anioni: IC (PO4
3-, SO42-, ecc.)
ISE (Br-, F-)...
CARATTERIZZAZIONE SOSTANZE MONCOSTITUENTI INORGANICHEEsempio 2 – Acido Cloridrico 40%
Fonte: CHLORIDE (HCl) – REACH CONSORTIUM, Recommendation on Analytical Methods for Substance Identification & Determination of Composition / Purity of HCl (2010)
CARATTERIZZAZIONE SOSTANZE MONCOSTITUENTI INORGANICHE Esempio 3 – Analisi XRD Gel di silice (CAS 112926-00-8)
L’analisi XRPD del gel di silice (figura sotto) può risultare utile per dimostrare che la sostanza in esame NON è cristallina:
Spettro XRD del Quarzo (CAS 14808-60-7)Spettro XRD del gel di silice (CAS 112926-00-8)
CARATTERIZZAZIONE SOSTANZE MONOCOSTITUENTI ORGANICHE Esempio 1 – Analisi LC-MS Reactive Black 5 (Criteri di Sameness)
CARATTERIZZAZIONE SOSTANZE MONCOSTITUENTI ORGANICHE Esempio 1 – Analisi HPLC-UV Reactive Black 5
Sostanza di riferimento (LR)
Sostanza in esame (registrante)
STRATEGIA DI TESTING STRATEGIA DI TESTING –– SOSTANZE MULTICOSTITUENTI SOSTANZE MULTICOSTITUENTI
In funzione della natura chimica e della complessità delle sostanza multicostituente considerata è possibile adottare 2 strategie di testing:
1.Applicazione di tecniche accoppiate (“hyphenated”) per la separazioneed analisi simultanea dei costituenti principali e delle impurezze
Esempi: oli essenziali, derivati del petrolio,
2.Analisi della massa di reazione senza separazione fisica dei costituenti
CARATTERIZZAZIONE SOSTANZE MULTICOSTITUENTI/UVCBEsempio 1 – Ceneri da Carbone (componenti principali)
CARATTERIZZAZIONE SOSTANZE MULTICOSTITUENTI /UVCBEsempio 1 – Ceneri da Carbone (impurezze)
ICP-MS
CI
CV-AACI
ICP-MS
ICP-MS
CARATTERIZZAZIONE SOSTANZE MONCOSTITUENTIEsempio 2 – Analisi GC/MS di oli essenziali
Confronto tra profili cromatografici ottenuti mediante GC/MS relativi ad un olio essenziale di coriandolo semi genuino (A) e un prodotto importato dichiarato “estratto di coriandolo” (B) ma che è stato identificato come a linalolo di sintesi.
CASE STUDY 1: CARATTERIZZAZIONE DI UNA SOSTANZA CASE STUDY 1: CARATTERIZZAZIONE DI UNA SOSTANZA MULTICOSTITUENTE A BASE DI GLICOSIDIMULTICOSTITUENTE A BASE DI GLICOSIDI
IDENTIFICAZIONE SOSTANZA:Classif. sostanza: massa di reazione di [costituente A] e [costituente B] (*) EC#: N/A (*)CAS#: N/A (*)Formula di struttura: N/A (*)
Descrizione sostanza come riportata dal fabbricante:“miscela di due isomeri in rapporto ca 1:1” (costituente principale 1 e 2)liquido viscoso con contenuto di sostanza solida pari al 70%p/p ca
(*) informazioni riservate
CASE STUDY 1: CARATTERIZZAZIONE DI UNA MISCELA DI GLUSOSIDICASE STUDY 1: CARATTERIZZAZIONE DI UNA MISCELA DI GLUSOSIDISTRATEGIA DI TESTING INIZIALESTRATEGIA DI TESTING INIZIALE
ImpurezzeDati Spettrali Purezza
- GC-MS(con derivatizzazione)
- Acqua K-F
- GC-MS
- HS-GC/FID(solventi residui)
- Spettro MS
- Spettro IR
- Spettro 1H-NMR
- Spettro 13C-NMR
CASE STUDY 1: RISULTATI PRELIMINARICASE STUDY 1: RISULTATI PRELIMINARI
Le analisi preliminari hanno evidenziato quanto segue:- Spettri NMR:Risulta presente in quantità significative (>0,1%) una sostanza organica non identificata di natura aromatica- Analisi GC/MS:La sostanza contiene quantità (>10%) significative di mono e disaccaridi e i costituenti principali non risultano presenti in quantità equivalenti
- La sostanza NON può essere classificata come sostanza multicostituente a base di 2 costituenti principali ma verosimilmente come SOSTANZA UVCB (es. prodotto di reazione di [nome delle materie prime utilizzate per la sintesi])- Necessari test supplementari per caratterizzare completamente la sostanza- Cambio SIEF di riferimento?- Modifica C&L?
CONCLUSIONI
CASE STUDY 1: CARATTERIZZAZIONE DI UNA MISCELA DI GLUSOSIDICASE STUDY 1: CARATTERIZZAZIONE DI UNA MISCELA DI GLUSOSIDISTRATEGIA DI TESTING FINALESTRATEGIA DI TESTING FINALE
ImpurezzeDati Spettrali Purezza
- GC-MS (con derivatizzazione)
- Acqua K-F
- GC-MS
- HS-GC/FID(solventi residui)
- CI-PAD(zuccheri liberi)
- TOCSY 2D(identificazione impurezza sconosciuta: PTSA)
- HPLC-UV(conferma identità e quantificazione impurezza sconosciuta: PTSA)
- Spettro MS
- Spettro IR
- Spettro 1H-NMR
- Spettro 13C-NMR
CASE STUDY 1: IDENTIFICAZIONE IMPUREZZA SCONOSCIUTA CASE STUDY 1: IDENTIFICAZIONE IMPUREZZA SCONOSCIUTA MEDIANTE TOCSY 2DMEDIANTE TOCSY 2D
L'analisi TOCSY 2D ha confermato che l'impurezza sconosciuta potrebbe essere ricondotta ad una delle seguenti strutture:
Le strutture più probabili in base allo spettro NMR dell’impurezza sono risultate le forme V, VI e VIII (per confronto con gli spettri NMR simulati).In base alle informazioni fornite a posteriori dal fabbricante relativamente al processo di produzione è stata confermata la presenza di acido para-toluensolfonico (PTSA) utilizzato come catalizzatore nel processo di sintesi (da confermare sperimentalmente mediante analisi HPLC)
CASE STUDY 2: ANALISI CHIRALE SOSTANZA MULTICOSTITUENTECASE STUDY 2: ANALISI CHIRALE SOSTANZA MULTICOSTITUENTE(D(D--Alletrina)Alletrina)
OBIETTIVO: Determinazione distribuzione stereoisomerica
IDENTIFICAZIONE SOSTANZA:Nome sostanza: Allethrin (BIOCIDA)EC#: 209-542-4CAS#: 584-79-2Formula molecolare: C19H26O3
Purezza: >97% p/p (somma di isomeri cis e trans)Peso Molecolare Relativo: 302.41Formula di struttura:
8 STEREOISOMERI DELL’ALLETRINA (3 centri stereogenici)
CASE STUDY 2: ANALISI CHIRALE SOSTANZA MULTICOSTITUENTECASE STUDY 2: ANALISI CHIRALE SOSTANZA MULTICOSTITUENTE(D(D--Alletrina)Alletrina)
ANALISI CIS/TRANS (ACHIRALE)
Pompa isocratica
Colonna di silice
Pompaquaternaria Colonna chirale
Rivelatore
min0 5 10 15 20 25
mAU
0
25
50
75
100
125
150
175
VWD1 A, Wavelength=225 nm (11110401.D)
CIS
TRANS
Fonte: F.Mancini et al.,Stereoselective determination of allethrin by two-dimensional achiral/chiral liquid chromatography with ultraviolet/circular dicroism detection, J.Chrom.A, 1046 (2004) 67-73
CARICAMENTO
Pompa binariaColonna di silice
Pompa quaternaria
Rivelatore
Colonna chirale
min0 5 10 15 20 25
mAU
0
25
50
75
100
125
150
175
VWD1 A, Wavelength=225 nm (11110401.D)
ANALISI CHIRALEPompa isocratica Colonna di silice
Rivelatore
Pompa quaternariaColonna chirale
RISOLUZIONE STEREOISOMERI CIS RISOLUZIONE STEREOISOMERI TRANS
CASE STUDY 3: IDENTIFICAZIONE E CARATTERIZZAZIONE ALCOL CASE STUDY 3: IDENTIFICAZIONE E CARATTERIZZAZIONE ALCOL ETOSSISOLFATI (AES)ETOSSISOLFATI (AES)
Gli alcoli etossisolfati (AES) sono prodotti mediante solfatazione di alcol etossilati (AE) che sono sintetizzati per addizione catalitica di ossido di etilene (EO) a miscele di alcoli alifatici derivati dal petrolio o da oli vegetali.Gli AE commerciali sono miscele complesse di catene alchiliche lineari e/o ramificate con un numero di atomi di C variabile tra 6 e 18 e un grado di etossilazione variabile tra 1 e >25, anche se solo gli AE con basso grado di etossilazione (EO 1-3) vengono generalmente solfatati per ottere gli AES.
CASE STUDY 3: IDENTIFICAZIONE E CARATTERIZZAZIONE AESCASE STUDY 3: IDENTIFICAZIONE E CARATTERIZZAZIONE AES
Strategia di testing indicata dall’European Association of SurfactantProducers (CESIO)
Dati Spettrali1.Spettro UV-Vis2.Spettro IR3.Spettro 1H-NMR 4.Spettro 13C-NMR
Identificazione1. Analisi GC dopo idrolisi (grado di etossilazione)NB: applicabile per catene alchiliche ramificate
2. Analisi GC dopo idrolisi e derivatizzazione con HI (distribuzione catene alchiliche)
3. Analisi LC-ESI-MS (mod. negativa) del prodotto tal quale (grado di etossilazione nel caso di catene alchiliche)
CASE STUDY 3: IDENTIFICAZIONE AES CASE STUDY 3: IDENTIFICAZIONE AES (Alcol C12(Alcol C12--C14 Etossisolfato, sale di Sodio)C14 Etossisolfato, sale di Sodio)
IDENTIFICAZIONE SOSTANZA:Nome sostanza: Alcohols, C12-14, ethoxylated, sulfates, sodium saltsEC#: 500-234-8 (NO LONGER POLYMER)CAS#: 68891-38-3Formula di struttura:
CASE STUDY 3: DETERMINAZIONE GRADO DI ETOSSILAZIONE MEDIOCASE STUDY 3: DETERMINAZIONE GRADO DI ETOSSILAZIONE MEDIO(Alcol C12(Alcol C12--C14 Etossisolfato, sale di Sodio)C14 Etossisolfato, sale di Sodio)
1. Analisi GC dopo idrolisi acida per la determinazione della distribuzione degli alcoli liberi ed etossilati
Il metodo consente di distinguere gli alcol etossilati con catena alchilica lineare e ramificata aventi lo stesso numero di atomi di C
H2SO4
ANALISI GC DI AES A CATENA LINEARE DOPO IDROLISIANALISI GC DI AES A CATENA LINEARE DOPO IDROLISI
C12
C14 C12EO1
C16
C14EO1
C12EO2
C16EO1
C14EO2
C12EO2
C16EO2
C14EO3
C12EO4
C16EO3
C14EO4
C12EO5
C14EO5 C12EO6
CASE STUDY 3: DISTRIBUZIONE CATENE ALCHILICHECASE STUDY 3: DISTRIBUZIONE CATENE ALCHILICHE
2. Analisi GC dopo idrolisi acida e derivatizzazione con HI per la determinazione della distribuzione degli alcoli
H2SO4
HI
CASE STUDY 3: ANALISI LCCASE STUDY 3: ANALISI LC--MS (GRADO DI ETOSSILAZIONE MEDIO)MS (GRADO DI ETOSSILAZIONE MEDIO)
3. Analisi LC-ESI-MS del prodotto tal quale
NB: Il metodo NON consente di distinguere gli alcol etossilati con catena alchilica lineare e ramificata aventi lo stesso numero di atomi di C.
CASE STUDY 4: IDENTIFICAZIONE ALCHIL BENZEN SOLFONATO DI CASE STUDY 4: IDENTIFICAZIONE ALCHIL BENZEN SOLFONATO DI SODIOSODIO
IDENTIFICAZIONE SOSTANZA:Nome sostanza: benzene sulfonic acid,
4-C10-13-sec-alkyl-derivatives sodium salt solutionEC#: 270-115-0CAS#: 68411-30-3Formula di struttura:
CASE STUDY 4: IDENTIFICAZIONE ALCHIL BENZEN SOLFONATO DI CASE STUDY 4: IDENTIFICAZIONE ALCHIL BENZEN SOLFONATO DI SODIOSODIO
Analisi GC dopo derivatizzazione con Anidride Trifluoroacetica e KI in DMF
KI / DMF
Anidride Trifluoroacetica
CASE STUDY 4: IDENTIFICAZIONE ALCHIL BENZEN SOLFONATO DI CASE STUDY 4: IDENTIFICAZIONE ALCHIL BENZEN SOLFONATO DI SODIOSODIO
REPORTS: INFORMAZIONI MINIME – Identificazione della sostanza
Dati identificativi della sostanza:nome chimico e commerciale della sostanzanr. CAS/CEformula di struttura e formula bruta (se applicabili)provenienza (es. stabilimento UE o extra UE)numero di lottoeventuali identificatori specifici (es. codici interni del fabbricante, codici internazionali, ecc.)ID campione assegnato dal laboratorio
Forma fisica e purezza in %p/p della sostanza in esame
Forma in cui è presenta il campione in esame (es. solido, liquido, soluzione, ecc.)
REPORTS: INFORMAZIONI MINIME – Procedura analitica
Tipo di strumento utilizzato (nome del produttore e modello)
Condizioni di prova applicate:reattivi e solventi materiali utilizzatimateriali di riferimentomodalità di preparazione del campione di provacondizioni operative strumentali modalità di elaborazione dei dati (se pertinente)altre informazioni specifiche richieste dal metodo (es. OECD)
REPORTS: INFORMAZIONI MINIME – Controlli di Qualità
Calibrazione effettuata sulle apparecchiature (se pertinente)
Informazioni su eventuali standard di riferimento interni utilizzati (es. TMS nell’analisi H-NMR) e dove appaiono negli spettri o negli output strumentali (se pertinente)
Il numero delle prove in doppio eseguite e se il risultato riportato è un valore medio (se pertinente)
REPORTS: INFORMAZIONI MINIME – Output sperimentali
Un titolo e un numero di riferimento unico per tutti gli spettri. Tutti gli assi devono essere chiaramente etichettati e le scale specificate. Devono essere segnalate eventuali espansioni di scala.
La data dell’analisi e codice identificativo (es. nome file)
Devono essere chiaramente identificati i segnali /picchi assegnati alla sostanza per ciascuno spettro e/o tracciato cromatografico. Ciascun segnale mancante o spurio deve essere giustificato .
REPORTS: INFORMAZIONI MINIME – Laboratorio di Analisi
Il nome del laboratorio di analisi responsabile dell’effettuazione della prova e il nome dell'analista (e del Resp. di Laboratorio)
Eventuali accreditamenti e/o riconoscimenti del laboratorio di testing ed eventuali standard di qualità applicabiti (es. BPL)
Tutti i riferimenti bibliografici appropriati che supportano le tecniche e i metodi utilizzati e/o che forniscono spettri di riferimento per il confronto dei dati spettrali
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