Susceptibiliteitsbepaling van planktonische en sessiele Burkholderia cepacia complex cellen Katrien...
Preview:
Citation preview
- Dia 1
- Susceptibiliteitsbepaling van planktonische en sessiele
Burkholderia cepacia complex cellen Katrien De Visschere
- Dia 2
- Inleiding Burkholderia cepacia complex: Burkholderia cepacia
complex: 17 nauw verwante species 17 nauw verwante species
Gram-negatieve bacterin Gram-negatieve bacterin Kunnen ernstige
infecties veroorzaken bij mucoviscidosepatinten Kunnen ernstige
infecties veroorzaken bij mucoviscidosepatinten Behandeling
moeilijk door grote resistentie Behandeling moeilijk door grote
resistentie stammen vormen goed biofilms verhoogde resistentie
stammen vormen goed biofilms verhoogde resistentie
- Dia 3
- Inleiding Mucoviscidose Mucoviscidose Autosomaal recessieve
aandoening Autosomaal recessieve aandoening Ongeneeslijk
Ongeneeslijk Secreties van kliercellen zijn minder vloeibaar o.a.
problemen met luchtwegen en spijsvertering Secreties van
kliercellen zijn minder vloeibaar o.a. problemen met luchtwegen en
spijsvertering Infectie met B. cepacia complex bacterin: cepacia
syndroom : dodelijk geleidelijk achteruitgang in longfunctie
Infectie met B. cepacia complex bacterin: cepacia syndroom :
dodelijk geleidelijk achteruitgang in longfunctie
- Dia 4
- Inleiding Biofilms Biofilms Microbile gemeenschap van sessiele
cellen Microbile gemeenschap van sessiele cellen Vastgehecht op een
substraat, een oppervlak of aan elkaar Vastgehecht op een
substraat, een oppervlak of aan elkaar Ingebed in een
extracellulaire matrix Ingebed in een extracellulaire matrix
Sessiele cellen vertonen in het algemeen een grotere resistentie
tegen antimicrobile agentia dan planktonische cellen Sessiele
cellen vertonen in het algemeen een grotere resistentie tegen
antimicrobile agentia dan planktonische cellen
- Dia 5
- Onderzoek Wat? Wat? Gevoeligheid van planktonische cellen en
sessiele cellen (biofilms) van 33 Burkholderia cepacia complex
stammen t.o.v. 6 antibiotica bepalen ceftazidime, ciprofloxacine,
meropenem, minocycline, tobramycine, trimethoprim-sulfamethoxazole
(1-19) Gevoeligheid van planktonische cellen en sessiele cellen
(biofilms) van 33 Burkholderia cepacia complex stammen t.o.v. 6
antibiotica bepalen ceftazidime, ciprofloxacine, meropenem,
minocycline, tobramycine, trimethoprim-sulfamethoxazole (1-19)
Experimenten op jonge en oude culturen Experimenten op jonge en
oude culturen Planktonische cellen Planktonische cellen Jonge
culturen: minimaal inhiberende concentratie (MIC) Jonge culturen:
minimaal inhiberende concentratie (MIC) Oude culturen: afdoding
stationaire fase cultuur Oude culturen: afdoding stationaire fase
cultuur Sessiele cellen Sessiele cellen Jonge culturen: minimaal
biofilm inhiberende concentratie (MBIC) Jonge culturen: minimaal
biofilm inhiberende concentratie (MBIC) Oude culturen: afdoding
mature biofilm Oude culturen: afdoding mature biofilm
- Dia 6
- Onderzoek Waarom? Waarom? Vergelijken groei-inhibitie bij jonge
planktonische cellen en biofilms door antibiotica Vergelijken
groei-inhibitie bij jonge planktonische cellen en biofilms door
antibiotica Vergelijken afdoding van planktonische cellen in de
stationaire fase en mature biofilms door antibiotica Vergelijken
afdoding van planktonische cellen in de stationaire fase en mature
biofilms door antibiotica
- Dia 7
- Methoden Jonge planktonische cellen: Verse reincultuur
kiemsuspensie (OD: 0,05) in MH 1x 50x verdunnen Kuipjes van
antibiotica-microtiterplaat (96 kuipjes, bodem: plat) vullen met MH
1x en verdunde kiemsuspensie 20u incubatie (37C) Absorptie in elk
kuipje meten met VICTOR 2TM Bepaling minimaal inhiberende
concentratie (MIC) Kuipjes zonder groei 100L uitplaten
(strijkplaatmethode) Na 48u incubatie (37C): groei nagaan Bepaling
minimaal bactericide concentratie (MBC)
- Dia 8
- Methoden Jonge biofilms: Verse reincultuur startsuspensie in MH
1x Nacht incubatie in warmwaterbad (37C) Startsuspensie
werksuspensie (OD: 0,05) Kuipjes van microtiterplaat (96 kuipjes,
bodem: rond) vullen met MH 1x en werksuspensie (100L) 4u incubatie
(37C) 3x spoelen met fysiologisch water Kuipjes vullen met 100L MH
2x Antibiotica toevoegen (100L)
- Dia 9
- Methoden Jonge biofilms: 20u incubatie (37C) Spoelen met
fysiologisch water CellTiterBlue toevoegen (detectie levende
cellen) 1u incubatie (37C) Fluorescentie meten met VICTOR 2TM
Bepalen minimaal biofilm inhiberende concentratie (MBIC)
- Dia 10
- Methoden Mature biofilms: Verse reincultuur kiemsuspensie in MH
1x Nacht incubatie in warmwaterbad (37C) Kiemsuspensie
startsuspensie (OD: 0,05) Siliconeschijfjes in microtiterplaat (24
kuipjes) brengen Kuipjes vullen met MH 1x en startsuspensie 4u
incubatie (37C) 3x spoelen met fysiologisch water Kuipjes vullen
met MH 1x 20u incubatie (37C) 3x spoelen met fysiologisch
water
- Dia 11
- Methoden Mature biofilms: Overbrengen in
antibiotica-microtiterplaat concentraties antibiotica: 10 x MIC,
tobramycine: 4 x MIC 20u incubatie (37C) 3 x wassen met
fysiologisch water Schijfjes overbrengen in falconbuisjes Buisjes 3
x vortexen en soniceren (cellen losmaken) Kiemsuspensie wordt 7
maal 1:10 verdund 1mL per verdunning uitplaten (plaatgietmethode)
Kolonies tellen na 48u incubatie Bepalen reducties in
log(KVE)/schijfje
- Dia 12
- Resultaten: MIC MIC vs. de klinisch haalbare
antibioticaconcentratie in het sputum van mucoviscidosepatinten
(KHCS) MIC vs. de klinisch haalbare antibioticaconcentratie in het
sputum van mucoviscidosepatinten (KHCS) MIC KHCS MIC > KHCS
ceftazidime63,7%36,4% ciprofloxacine50,0%50,0% meropenem63,6%36,4%
minocycline87,9%12,1% tobramycine92,4%7,6% TMP-SMX (1-19)
21,278,8%
- Dia 13
- Resultaten: MBC Hoe verhoudt de MBC zich tot de MIC? Hoe
verhoudt de MBC zich tot de MIC? Grote spreiding MBC t.o.v. MIC
Grote spreiding MBC t.o.v. MIC uitzondering: tobramycine (kleine
spreiding) mediaanspreiding ceftazidime4 1 - 64 ciprofloxacine2 1 -
32 meropenem 2 - 4 1 - 64 minocycline32 1 - 512 tobramycine2 1 - 4
TMP-SMX (1-19) 8 1 - 64
- Dia 14
- Relatie MBIC vs. MIC: Relatie MBIC vs. MIC: De MBICs zijn
vergelijkbaar met de MICs voor het grootste deel van de stammen De
MBICs zijn vergelijkbaar met de MICs voor het grootste deel van de
stammen MBIC vergeleken met MIC MBIC < 1/2 x MIC 1/2 x MIC MBIC
2 x MIC MBIC > 2 x MIC ceftazidime21,2%75,8%3,0%
ciprofloxacine0,0%84,8%15,2% meropenem9,1%78,8%12,1%
minocycline1,5%77,3%21,2% tobramycine6,1%80,3%13,6% TMP-SMX (1-19)
9,1%71,2%29,7%
- Dia 15
- Reductie in aantal cellen bij mature biofilms De onderzochte
antibiotica veroorzaken bij alle stammen reductie De onderzochte
antibiotica veroorzaken bij alle stammen reductie Mate van
reductie: vertoont een grote variatie Mate van reductie: vertoont
een grote variatie Tobramycine is het meest werkzame antibioticum
met een paar uitzonderingen Tobramycine is het meest werkzame
antibioticum met een paar uitzonderingen Mate van biofilmvorming ,
cellen die overblijven na behandeling met antibiotica Mate van
biofilmvorming , cellen die overblijven na behandeling met
antibiotica B. multivorans LMG 13010 0,0 1,0 2,0 3,0 4,0 5,0 6,0
7,0 8,0 9,0 groeicontrole ceftazidime ciprofloxacine meropenem
minocycline tobramycine TMP-SMX aantal cellen (log(KVE)/schijfje)
B. pyrrocinia LMG 14191 0,0 1,0 2,0 3,0 4,0 5,0 6,0 7,0 8,0 9,0
groeicontrole ceftazidime ciprofloxacine meropenem minocycline
tobramycine TMP-SMX aantal cellen (log(KVE)/schijfje)
- Dia 16
- Conclusie Jonge culturen Jonge culturen MIC: vergelijking met
klinisch haalbare antibioticaconcentratie in het sputum van
mucoviscidosepatinten: voor veel antibiotica is deze concentratie
onvoldoende om groei-inhibitie te veroorzaken MIC: vergelijking met
klinisch haalbare antibioticaconcentratie in het sputum van
mucoviscidosepatinten: voor veel antibiotica is deze concentratie
onvoldoende om groei-inhibitie te veroorzaken MBC: variabel t.o.v.
MIC (uitzondering: tobramycine) MBC: variabel t.o.v. MIC
(uitzondering: tobramycine) MBIC: vergelijkbaar met MIC bijna alle
MBICs liggen binnen de range [1/2 2] x MIC MBIC: vergelijkbaar met
MIC bijna alle MBICs liggen binnen de range [1/2 2] x MIC
- Dia 17
- Conclusie Oude culturen Oude culturen Reductie in aantal cellen
bij mature biofilms: vertoont een grote variatie tobramycine is het
meest werkzame antibioticum mate van biofilmvorming , cellen die
overblijven na behandeling met antibiotica Reductie in aantal
cellen bij mature biofilms: vertoont een grote variatie tobramycine
is het meest werkzame antibioticum mate van biofilmvorming , cellen
die overblijven na behandeling met antibiotica
- Dia 18
- Toekomstperspectieven Experimenten op planktonische cellen in
een stationaire fasecultuur moeten nog uitgevoerd worden:
Experimenten op planktonische cellen in een stationaire fasecultuur
moeten nog uitgevoerd worden: Antibioticaconcentraties: 10 x MIC,
behalve tobramycine: 4 x MIC Antibioticaconcentraties: 10 x MIC,
behalve tobramycine: 4 x MIC
- Dia 19
- Met dank aan: Prof. Nelis en Prof. Coenye Apr. E. Peeters Apr.
B. Quartier
- Dia 20
- Zijn er nog vragen?