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TESTES SOROLÓGICOS PRIMÁRIOS:

REAÇÕES COM ANTICORPOS MARCADOS

Utilização de anticorpos em Ensaios Sorológicos 1954: Teste

de Imunofluorescência (Weller & Coons); 1959:

Radioimunoensaio (Yalow & Berson)

Anos 60: enzimas conjugadas a antígenos e anticorpos (Nakane

& Pierce, 1967; Avrameas, 1969)

Anos 70: ELISA (Engvall & Perlmann, 1971); produção de

anticopos monoclonais (Kohler & Milstein, 1975)

desenvolvimento de novos testes (kits comerciais)

Métodos colorimétricos, radioativos, fluorescentes,

quimioluminescentes, etc.

Agentes infecciosos, anticorpos, hormônios, alérgenos,

poluentes, etc.

Ronald & Stimson, 1998

INTRODUÇÃO

Anticorpos conjugados com fluorocromos

Fluorocromos: substâncias que absorvem luz de menor

e, quando excitados com luz ultravioleta, emitem luz de

maior (fluorescência)

Mais utilizados: isiotiocianato de fluoresceína e rodamina

(absorvem em diferentes, mas emitem luz na faixa do

visível)

Teste direto pesquisa de antígenos (células ou tecidos)

Teste indireto pesquisa de anticorpos, ou de antígenos

Referência para sorodiagnóstico de várias doenças que

acometem os animais, como para a raiva, toxoplasmose,

leishmaniose, leptospirose.

REAÇÃO DE IMUNOFLUORESCÊNCIA

REAÇÃO DE IMUNOFLUORESCÊNCIA

Luz Incidente

(Excitação)

Luz Emitida

IMUNOFLUORESCÊNCIA

Reação de Imunofluorescência Indireta

Figure 3.6a

Fig 3.6b

Principle of

Immunofluorescence

IMUNOFLUORESCÊNCIA

1

2

3

1: Vero não-infectada + soro positivo para

Coronavírus (Sars)

2: Vero infectada + soro positivo para

Coronavírus

3: Esfregaço de sangue com formas de

tripanossoma

Reação de

Imunofluorescência Direta

para o Diagnóstico do Vírus

da Raiva

FIGURE 1 - Photomicrographs of direct immunofluorescence reactions in the presence (A and B) of

rabies virus antigens in the brain tissue samples subjected to cryopreservation at -20°C for up to 2 years

(immunofluorescence microscope equipped with 400X magnification; Carl Zeiss, Germany). A:

Cryopreservation in 68% SUC for 1 year demonstrating very abundant antigens in all fields of view,

uncountable (++++). B: Cryopreservation in 68% SUC for 2 years demonstrating few antigens, 1 or more

particles in less than 100% but more than 50% of the fields of view (++). SUC: sucrose Source:

LABOVIR-UECE, 2012.

Reação de

Imunofluorescência Indireta

para o Diagnóstico do Vírus

da Leucemia Felina

Vantagens: limiar de detecção; específica; reprodutível;

simples execução; determinação de classes e subclasses de

anticorpos

Desvantagens: microscópio de fluorescência; diminuição

da fluorescência sob irradiação; subjetividade na leitura;

ausência de automação

IMUNOFLUORESCÊNCIA

Identificação e separação de células baseadas na

dispersão de luz e fluorescência sob feixe de laser

Estudo de populações de leucócitos luz dispersa

tamanho e forma da célula

Identificação de populações e/ou subpopulações de

linfócitos T e B

FACS (fluorescence-activated cell sorter) separação de

uma única célula

Barrientos et al., 2000

CITOMETRIA DE FLUXO

Schematic representation of a flowcytometer. For details please see text. (1) Forward-scatter detector, (2) side-

scatter detector, (3) fluorescence detector, (4) filters and mirrors, and (5) charged deflection plates.

Anti-CD Linfocitário

Citômetro de Fluxo

Schematic representation of a flowcytometer. For details please see text. (1) Forward-scatter detector, (2) side-

scatter detector, (3) fluorescence detector, (4) filters and mirrors, and (5) charged deflection plates.

Anti-CD Linfocitário

Citômetro de Fluxo

T CD4+

/ CD3+

T CD4+

/ CD3+

T CD8+

/ CD3+

T CD4+ T CD3+

T CD8+

T CD4+

Mab

anti-CD4+

Mab

anti-CD3+

Mab

anti-CD8+

Gating strategy to define lymphocyte subsets. (i) Histogram (univariate) plot of CD3 expression; this one-

dimensional graph corresponds to a typical bar chart and is called “histogram” in flow cytometry. (ii)

Pseudocolor plot of CD3 versus CD4. This display gives a better view on the distribution of CD3 expression

than the histogram, in particular for **CD3 low expressing cells; note both axes are logarithmic, unlike the

linear axes of scatter plots in Figure 2. (iii) Cartoon detailing interpretation of quadrant gates of (ii). CD3+CD4+

cells are displayed in the top right quadrant (46.2% of lymphocytes). CD, cluster of differentiation.

Como são detectados / mensurados os

níveis de Anticorpos em Fluidos

Biológicos?

Enzyme-Linked Immunosorbent Assay Anticorpos

conjugados com enzimas conversão de substrato

incolor em produto colorido

Enzimas mais utilizadas (+ de 25): Peroxidase; Fosfatase

Alcalina, -Galactosidase e Glicose Oxidase

Suportes sólidos: microplacas de poliestireno e

polivinilcloreto (interação hidrofóbica)

Método direto antígenos

Método indireto anticorpos

Sandwich e Competitivo antígenos e anticorpos

Ferreira e Ávila, 1996; Butler, 2000

ELISA

ELISA

Desnaturação das proteínas

adsorvidas (>90%)

Anticopos de captura: 10 a 25%

funcionais Ag capturados são

10x mais funcionais do que os

adsorvidos na placa

Entretanto, 6% necessários para

o desenvolvimento do teste

FIGURE 6-10Variations in the enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) technique, similar to

RIA except using an Enzyme (alkaline ⓟ, horseradish peroxidase, & β-galactosidase): safer & less costly.

to detect Ab

to detect Ag

to detect Ag

6. ELISA

ELISA INDIRETO

Lavagens

Antígeno

Fonte de proteínas

estranhas ao sistema

LavagensLavagens

Soro anti

Conjugado anti

Lavagens

ELISA DIRETO COM ANTICORPO DE CAPTURA

Lavagens

Antígeno

Fonte de proteínas

estranhas ao sistema

LavagensLavagensLavagens

Conjugadoanti

Soro anti

ELISA INDIRETO COM ANTICORPO DE CAPTURA

Lavagens

Conjugado anti B

Antígeno (/?)

Fonte de proteínas

estranhas ao sistema

LavagensLavagensLavagensLavagens

Soro anti (espécie A) Soro anti (espécie B) (/?)

ELISA

Transferência de proteínas separadas por eletroforese do

gel de poliacrilamida para membranas ELISA

Resolução obtida pela separação eletroforética de mistura

de proteínas + especificidade de anticorpos usados como

sondas para a detecção de Antígenos

Suportes: membranas de nitrocelulose (interações

hidrofóbicas); nylon, polyvinyldifluoride (PVDF) alta

capacidade de ligação a proteínas

Quantificação de bandas por densitometria

Stott, 2000

IMMUNOBLOTTING (Western blotting)

IMMUNOBLOTTING (Western blotting)

IMMUNOBLOTTING (Western blotting)

IMMUNOBLOTTING (Western blotting)

IMMUNOBLOTTING (Western blotting)

DOT-ELISA reação imunoenzimática sobre membranas

Qualitativa ou semi-quantitativa: rápida e simples

Proteínas solúveis, fungos, protozoários, bactérias e vírus

Stott, 2000

IMMUNO-DOT

IMMUNO-DOT

Detecção e localização de antígenos celulares/teciduais

Anticorpos conjugados com enzimas conversão de

substrato incolor em produto colorido (deposição pode ser

observada diretamente ao microscópio óptico)

Enzimas mais utilizadas: Peroxidase; Fosfatase Alcalina,

-Galactosidase e Glicose Oxidase

Método direto Acs primários conjugados (detecção de

antígenos)

Método indireto Acs secundários conjugados (detecção

de antígenos ou anticorpos)

Desvantagens: atividade enzimática endógena,

armazenamento inadequado dos conjugados

Ferreira & Ávila, 1996; Kumar, 2000

IMUNOHISTOQUÍMICA / IMUNOCITOQUÍMICA

Detecção de bacilos nas

vilosidades intestinais

IMUNOHISTOQUÍMICA

H2O2 + DAB H2O + 1/2 O2 + DAB (Oxidada = COR)

Peroxidase

IMUNOHISTOQUÍMICA

H2O2 + DAB H2O + 1/2 O2 + DAB (Oxidada = COR)

Peroxidase

IMUNOHISTOQUÍMICAMétodo ABC

Ags em Células / Tecidos Ags em Células / Tecidos

Ags em Células / Tecidos Ags em Células / Tecidos

H2O2 + DAB H2O + 1/2 O2 + DAB (Oxidada = COR)

Peroxidase

Substrato Produto

Peroxidase

3,3´-Diaminodenzidine tetrahydrochloride (DAB) Marrom

4-Chloro-1-naphthol (CN) Azul

P-Phenylenediamine dihydrochloride Azul-preto

Fosfatase alcalina

5-Bromo-4-chloro-3-indoxyl phosphate (BCIP), nitroblue tetrazolium (NBT) Azul-preto

-Galactosidase

5-Bromo-4-chloro-3-indolyl- -D-galactosidase (IbGa) Azul

Glicose Oxidase

Glicose/trinitroblue tetrazolium (TNBT)Marrom

Kumar, 2000

IMUNOHISTOQUÍMICA

IMUNOMIGRAÇÃO RÁPIDA

IMUNOMIGRAÇÃO RÁPIDA

IMUNOMIGRAÇÃO RÁPIDA

NASA

IMUNOMIGRAÇÃO RÁPIDA

IMUNOMIGRAÇÃO RÁPIDA

Limiar de detecção: nano ou picogramas

Quantificação de hormônios, drogas, marcadores

tumorais, alérgenos, anticorpos e antígenos microbianos

Quantidade de reagente marcado (Ag ou Ac) quantifica o

Ag ou Ac não-marcado na amostra competição

Marcação com radioisótipos (125I e 131I)

Determinação de curvas-padrão

Desvantagens: custo, vida média dos reagentes e risco

operacional

Ferreira & Ávila, 1996

RADIOIMUNOENSAIO

RADIOIMUNOENSAIO

Ac + Ag* AcAg*

Lembrando o equilíbrio!

AcAg* + Ag AcAg* + AcAg + Ag*

RADIOIMUNOENSAIO

Curva-padrão

LIMIAR DE DETECÇÃO

Rose et al, 1997

REFERÊNCIAS

http://webmed.unipv.it/immunology/agabint.html

http://www.med.sc.edu:85/book/immunol-sta.htm

http://www.biointeractive.org/

Diagnóstico Laboratorial das Principais Doenças

Infecciosas e Auto-Imunes. A. W. Ferreira; S. L. M. Ávila.

Editora Guanabara Koogan, 1996.