Presented by:Yus Efendi

ZulpikarZuly Asrizar

SOUTHERN BLOTTINGTeknik ini dikembangkan oleh EM Southern pada

tahun 1975.Southern blot digunakan untuk mendeteksi

keberadaan suatu bagian tertentu dari DNA dalam sampel.

DNA terdeteksi dapat menjadi sebuah gen tunggal, atau dapat menjadi bagian dari bagian yang lebih besar dari DNA seperti genom virus.

Kunci dari metode ini adalah hibridisasi.Hibridisasi-proses pembentukan molekul DNA

beruntai ganda antara probe DNA beruntai tunggal dan DNA beruntai tunggal sasaran pasien.

PRINCIPLE1. Campuran molekul dipisahkan.2. Molekul-molekul yang bergerak pada matriks.3. Probe ditambahkan ke matriks untuk

mengikat molekul.4. Setiap probe terikat kemudian dihapus.5. Tempat di mana probe dihubungkan sesuai

dengan lokasi dari molekul target bergerak.

APPARATUS

Steps in southern blotting1. DNA dicerna dengan

pembatasan endonuklease. Tinggi berat molekul DNA dicerna menjadi fragmen-framen yang lebuh kecil.DNA dicerna dengan pembatasan endonuklease. Tinggi berat molekul DNA dicerna menjadi fragmen-framen yang lebih kecil.

2. DNA ini kemudian dipisahkan oleh ukuran dengan elektroforesis pada gel agarosa.

CONT…….3. Selembar membran nilon atau

nitroselulosa (ungu) ditempatkan di atas gel agarosa dalam larutan buffer. Ini dianggap sebagai blotting atau mentransfer panggung. Tekanan diberikan secara merata ke gel baik menggunakan sedotan atau dengan menempatkan tumpukan kertas handuk dan berat di atasmembran dan gel untuk memastikan bahkan kontak antara gel dan membran. Buffer transfer oleh kapiler dari wilayah potensi air yang tinggi kepada daerah potensial air rendah (biasanya kertas filter dan kertas tisu) yang kemudian digunakan untuk memindahkan DNAdari gel ke membran. Membran bermuatan positif (ungu) biasanya digunakan yang memungkinkan DNA untuk mengikat dengan afinitas tinggi untuk ion membrane melalui interaksi antarabermuatan negatif DNA dan membrane bermuatan positif. 

CONT…….4. Nitroselulosa membran

dipanggang oleh paparan suhu tinggi (60-100° C). Membran nilon terpapar radiasi UV. Langkah-langkah ini digunakan untuk memastikan permanen dan kovalen crosslink DNA hadir dalam band ke membrane. 

5. Membran dihadapkan pada radiolabeled probe.Probe ini beruntai tunggal fragmen DNA yang memiliki urutan minat Anda yang ingin Anda mendeteksi. Probe ini diinkubasi dengan membrane dan diperbolehkan berhibridasi dengan DNA pada membrane. Probe biasanya radiolabeled sehingga mereka dapat dideteksi pada film, namun baru juga digunakan probe yang non-radioaktif seperti neon atau chromogenic pewarna. Setelah hibridasi, kelebihan terikat probe dicuci jauh dari membran, meninggalkan probe terikat secara khusus. 

6. Pola hibridisasi dideteksi oleh visualisasi pada film sinar-X oleh autoradiografi dalam kasus radioaktif atau fluorescent probe, atau perkembangan warna pada membran jika metode deteksi chromogenic dimanfaatkan. 

CONT…….