View
55
Download
12
Category
Preview:
DESCRIPTION
các bạn liên hệ email: alone.hope.hhtp@gmail.com or sms via 0949 278 109 ( không nhận cuộc gọi ) để có thể có được file.Ngoài ra nhận tải mọi tài liệu ở trang http://125.235.10.97/opacdigital/ ( thư viện đại học dược hà nội.
Citation preview
BỘ Y TẾ
TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI
NGUYỄN THỊ HẢI YẾN
TỔNG QUAN VỀ ỨNG DỤNG SINH HỌC PHÂN TỬ TRONG NHẬN DIỆN
THẢO DƯỢC
KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP DƯỢC SĨ
HÀ NỘI - 2013
BỘ Y TẾ
TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI
NGUYỄN THỊ HẢI YẾN
TỔNG QUAN VỀ ỨNG DỤNG SINH HỌC PHÂN TỬ TRONG NHẬN DIỆN
THẢO DƯỢC
KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP DƯỢC SĨ
Người hướng dẫn:
TS. Phùng Thanh Hương
Nơi thực hiện:
Bộ môn Hóa sinh
HÀ NỘI – 2013
LỜI CẢM ƠN
Trong quá trình học tập và hoàn thành khóa luận này, tôi đã nhận được sự
giúp đỡ và hướng dẫn quý báu của các thầy cô, gia đình và bạn bè. Với lòng
kính trọng và biết ơn sâu sắc nhất, tôi xin được gửi lời cảm ơn tới:
- Ban giám hiệu, các thầy, cô giáo trường Đại học Dược Hà Nội đã tận tình
dạy dỗ và tạo điều kiện giúp tôi hoàn thành khóa học này.
- Các thầy, cô trong bộ môn Hóa sinh đã tạo điều kiện thuận lợi cho tôi
hoàn thành khóa luận.
Tôi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới Tiến sĩ Phùng Thanh Hương –
người thầy kính mến đã hết lòng giúp đỡ, dạy bảo, động viên và tạo mọi điều
kiện cho tôi trong suốt quá trình học tập và nghiên cứu đề tài.
Tôi xin gửi lời cảm ơn chân thành tới gia đình đã luôn bên cạnh động viên
và ủng hộ tôi trong suốt khóa học.
Cuối cùng, tôi xin cảm ơn bạn bè đã giúp đỡ và động viên tôi trong thời
gian qua.
Tôi xin trân trọng cảm ơn!
Hà Nội, ngày 7 tháng 5 năm 2013
Tác giả
Nguyễn Thị Hải Yến
MỤC LỤC
DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT
DANH MỤC BẢNG VÀ HÌNH ẢNH
ĐẶT VẤN ĐỀ….…………………………………………………………………...1
Chương 1. Tổng quan về hiện trạng nghiên cứu và thực hành
nhận diện thảo dược……………………………………………………………..…..3
1.1. Sự cần thiết của việc nhận diện thảo dược………………………………...……3
1.2. Các phương pháp thường được sử dụng trong nhận diện thảo dược……...…….4
1.2.1. Phương pháp hình thái……………………………………………………...4
1.2.2. Phương pháp vi học…………………………………………………...……5
1.2.3. Phương pháp phân tích hóa học…………………………………………….6
Chương 2. Các kĩ thuật sinh học phân tử ứng dụng trong
nhận diện thảo dược………………………………..………………………………..9
2.1. Các marker dựa trên phản ứng khuếch đại chuỗi (PCR)……………….….……9
2.1.1. Kĩ thuật PCR sử dụng các mồi ngẫu nhiên (RP-PCR)………..………..….10
2.1.2. Kĩ thuật sự đa hình chiều dài của các đoạn ADN
có thể khuếch đại trực tiếp (DALP)…..…………………………………...13
2.1.3. Kĩ thuật sự đa hình chiều dài các đoạn được khuếch đại (AFLP)……...…14
2.1.4. Kĩ thuật sự đa hình các trình tự khuếch đại được phân cắt (CAPS)………18
2.1.5. Kĩ thuật phân tích các trình tự lặp đơn giản (SSR)……………………..…20
2.1.6. Kĩ thuật sự đa hình trình tự giữa các vùng lặp (ISSR)…………………….22
2.1.7. Kĩ thuật khuếch đại trực tiếp vùng ADN tiểu vệ tinh (DAMD)…………..25
2.1.8. Kĩ thuật khuếch đại vùng đặc trưng (SCAR)…………………………...…27
2.1.9. Kĩ thuật sự đa hình hình dạng sợi đơn (SSCP)…………………………....31
2.1.10. Kĩ thuật khuếch đại hệ thống đột biến bền vững (ARMS)
và multiplex-ARMS (MARMS)………………………………………………….33
2.2. Các marker thu được bằng phương pháp giải trình tự ADN…………………..38
2.2.1 Vùng phiên mã nội (ITS)………………………………………….………40
2.2.2. Vùng trnH – psbA…………………………………………………………42
2.2.3. Maturase K (matK)…………………………………...……………………43
2.2.4. Tiểu đơn vị lớn của ribulose-biphosphat carboxylase (vùng rbcL)……….44
2.2.5. Các trình tự ADN khác dùng trong nhận diện thảo dược…………………45
2.3. Phương pháp ADN microarray…………………………………..………...…..47
2.3.1. Kĩ thuật microarray sử dụng mẫu dò là các oligonucleotid………….....…47
2.3.2. Kĩ thuật microarray sử dụng mẫu dò là gen……………...……………..…49
Chương 3. Bàn luận…………………………………………………………..……51
3.1. Đánh giá về các phương pháp nhận diện thảo dược sử dụng
công cụ sinh học phân tử…………………………………………………...….51
3.2. Đánh giá thực tế việc nhận diện thảo dược ở Việt Nam……………………….56
KẾT LUẬN…………………………………………………………………...……59
ĐỀ XUẤT……………………………………………...…………………………..59
DANH MỤC BẢNG VÀ HÌNH ẢNH
Bảng Tên Trang
1 Trình tự mồi SCAR dùng cho phản ứng khuếch đại PCR 29
2 So sánh một số kĩ thuật khác nhau sử dụng công cụ sinh học
phân tử để nhận diện thảo dược
55
Hình
1 Nguyên tắc của kĩ thuật sự đa hình các đoạn ADN được khuếch
đại ngẫu nhiên – RAPD
11
2 Nghiên cứu RAPD với các loài S. angustifolia, S. acutifolia,
S. sophera, S. tora
12
3 Nguyên tắc của kĩ thuật AFLP 16
4 Nguyên tắc của kĩ thuật CAPS 18
5 Nghiên cứu CAPS trên các sản phẩm PCR với cặp mồi ITS1,
ITS5 và được cắt bằng enzym giới hạn EaeI
19
6 Nguyên tắc của kĩ thuật phân tích các trình tự lặp lại đơn giản
SSR
21
7 Nguyên tắc của kĩ thuật ISSR – PCR 23
8 Dấu vân tay ISSR của R. palmatum, R. officinale và R.
tanguticum sử dụng mồi UBC-811
24
9 Trình tự của tiểu vệ tinh Pge2 26
10 Nguyên tắc của kĩ thuật SCAR (sử dụng mồi SCAR đặc hiệu 27
từ marker RAPD)
11 Trình tự của đoạn ADN đặc trưng cho loài Panax
notoginseng
28
12 Nguyên tắc của kĩ thuật SSCP 32
13 Sơ đồ vùng ITS và vị trí các mồi được sử dụng 34
14 Sản phẩm thu được sau phản ứng khuếch đại đặc trưng allel
của năm loài thuộc chi Citrus
35
15 Mồi đặc hiệu được thiết kế dựa vào sự khác nhau về trình tự
gen matK giữa năm loài thuộc chi Panax
36
16 Mồi đặc hiệu được thiết kế dựa vào sự khác nhau về trình tự
gen 18S rADN giữa năm loài thuộc chi Panax
37
17 Đơn vị lặp lại 18S – 26S của ADN ribosom 41
18 Nguyên tắc của kĩ thuật microarray với mẫu dò là
oligonucleotid hoặc gen để nhận diện thảo dược
48
DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT
Ký hiệu Tiếng Anh Tiếng Việt
A Adenine
ADN 2’- deoxyribonucleic acid Axít 2’- deoxyribonucleic
AFLP Amplified fragment length
polyphorphism
Kĩ thuật sự đa hình chiều dài
các đoạn được khuếch đại
AP-PCR Arbitrarily primed- Polymerase
chain reaction
Kĩ thuật PCR với mồi tùy
chọn
ARMS Amplification refractory mutation
system
Kĩ thuật khuếch đại hệ thống
đột biến bền vững
AS-PCR Allele specific - Polymerase chain
reaction
Kĩ thuật khuếch đại đặc trưng
cho allel
ATP-P33 Adenosine triphosphate -
phosphorus 33
BSA Bovine serum albumin Albumin huyết thanh bò
C Cytosine
CAPS Cleaved amplified polymorphism
sequence
Kĩ thuật sự đa hình các trình
tự khuếch đại được phân cắt
CTAB Cetyltrimethylammonium bromide
DAF DNA amplification fingerprinting Kĩ thuật vân tay khuếch đại
ADN
DALP Direct amplification of length
polymorphisms
Kĩ thuật sự đa hình chiều dài
của các đoạn ADN có thể
khuếch đại trực tiếp
DAMD Directed amplification of
minisatellite - region DNA
Kĩ thuật khuếch đại trực tiếp
vùng ADN tiểu vệ tinh
G Guanine
IR Infrared Vùng hồng ngoại
ISSR Inter-simple sequence repeat
polymorphism
Kĩ thuật sự đa hình trình tự
giữa các vùng lặp
ITS Internal trancribed spacer Vùng phiên mã nội
MARMS Multiplex amplification refractory
mutation system
matK Maturase K
PCR Polymerase chain reaction Phản ứng khuếch đại chuỗi
rADN DNA ribosome ADN ribosom
RAPD Random amplified polymorphic
DNA
Kĩ thuật sự đa hình các đoạn
ADN được khuếch đại ngẫu
nhiên
rbcL Ribulose-bisphosphat carboxylase
RFLP Restriction fragment length
polymorphism
Kĩ thuật sự đa hình chiều dài
các đoạn giới hạn
RP-PCR Random primed - Polymerase chain
reaction
Kĩ thuật PCR dùng mồi ngẫu
nhiên
SCAR Sequence characterized amplified Kĩ thuật khuếch đại vùng đặc
regions trưng
SNP Single-nucleotide polymorphism Sự đa hình đơn nucleotid
SSCP Single strand conformation
polymorphism
Sự đa hình hình dạng sợi đơn
SSR Simple sequence repeats Các trình tự lặp đơn giản
T Thymine
UV Ultraviolet Vùng tử ngoại
WHO World Health Organization Tổ chức Y tế thế giới
1
ĐẶT VẤN ĐỀ
Từ thời cổ đại, con người đã biết sử dụng thảo dược để chữa bệnh. Trong vài
thập kỉ gần đây, mặc dù thuốc có nguồn gốc hóa dược được ưa chuộng do có nhiều
ưu điểm, thuốc có nguồn gốc từ thảo dược vẫn có những đóng góp quan trọng trong
lĩnh vực chăm sóc sức khỏe con người. Theo thống kê của tổ chức y tế thế giới
(WHO), có đến 80% dân số thế giới sử dụng thảo dược để chăm sóc sức khỏe, đặc
biệt là ở các nước đang phát triển [44]. Xu hướng sử dụng các thuốc này hiện nay
ngày càng phát triển. Thị phần thảo dược của toàn thế giới đạt khoảng 60 tỉ đôla
mỗi năm và con số này không ngừng tăng lên với tỉ lệ tăng 6,4% / năm [53]. Tuy
nhiên, bên cạnh sự tăng lên về nhu cầu sử dụng thảo dược, một vấn đề nghiêm trọng
xuất hiện trên thị trường dược phẩm là sự nhầm lẫn, giả mạo các vị thuốc một cách
vô tình hoặc do cố ý. Việc sử dụng các thảo dược giả mạo có thể dẫn đến làm mất
tác dụng điều trị và gây những hậu quả không mong muốn nghiêm trọng, thậm chí
là tử vong. Do đó, việc nhận diện chính xác cây thuốc, vị thuốc là một bước quan
trọng để đảm bảo hiệu quả điều trị. Các thảo dược giả mạo có thể là các loài họ
hàng gần của cây thuốc hoặc các loài từ các họ khác. Do đó, việc nhận diện thảo
dược liên quan đến việc xác định chính xác loài dùng làm thuốc và phân biệt nó với
các loài có thể gây nhầm lẫn hoặc giả mạo đồng thời phát hiện nếu có sự có mặt của
loài giả mạo.
Hiện nay, có nhiều phương pháp khác nhau được sử dụng để nhận diện thảo
dược. Phương pháp nhận diện dựa vào hình thái tuy đơn giản nhưng lại phụ thuộc
rất nhiều vào kinh nghiệm của người nhận diện và không thể nhận diện được thảo
dược ở dạng đã sơ chế. Phương pháp vi học có thể khắc phục được nhược điểm của
phương pháp hình thái nhưng việc nhận diện lại không thể thực hiện được khi thảo
dược ở dạng dịch chiết và khi phải tiến hành với số lượng lớn các mẫu. Các phương
pháp dựa vào thành phần hóa học là một công cụ mạnh trong nhận diện thảo dược
và hoàn toàn có thể thực hiện khi thảo dược ở dạng dịch chiết. Tuy nhiên, nhược
điểm chung của các phương pháp hóa học là phụ thuộc vào thành phần hóa học của
cây mà thành phần này lại thay đổi rất nhiều tùy theo môi trường, điều kiện thu hái
2
và bảo quản. Phương pháp nhận diện thảo dược nhờ sử dụng công cụ sinh học phân
tử ra đời đã khắc phục được nhược điểm của các phương pháp phân tích hóa học.
Phân tử ADN tương đối bền vững và ít bị ảnh hưởng bởi môi trường do đó phương
pháp này đem lại một công cụ tiên tiến, chính xác và hiệu quả trong nhận diện thảo
dược.
Tại Việt Nam, việc ứng dụng công cụ sinh học phân tử trong nhận diện thảo
dược vẫn còn mới mẻ và có rất ít nghiên cứu sử dụng công cụ sinh học phân tử
trong nhận diện các thảo dược lưu hành trong nước. Do đó, đề tài này được thực
hiện với mục đích:
- Tìm hiểu nguyên tắc của các kĩ thuật sinh học phân tử được sử dụng để nhận
diện thảo dược.
- Bước đầu đánh giá ưu nhược điểm và khả năng áp dụng của từng kĩ thuật
sinh học phân tử trong nhận diện thảo dược.
3
Chương 1. Tổng quan về hiện trạng nghiên cứu và thực hành nhận diện thảo
dược
1.1. Sự cần thiết của việc nhận diện thảo dược
Nhận diện thảo dược là khái niệm liên quan đến việc xác định chính xác loài
dùng làm thuốc và phân biệt nó với các loài có thể gây nhầm lẫn hoặc giả mạo đồng
thời phát hiện nếu có sự có mặt của loài giả mạo. Việc nhận diện thảo dược là một
yêu cầu cấp thiết khi mà tình trạng giả mạo vẫn đang là một vấn đề nghiêm trọng
tồn tại trên thị trường dược phẩm thế giới. Sự giả mạo có thể là do vô tình khi dùng
nhầm lẫn các các thảo dược có tên hoặc kiểu hình tương tự nhau hoặc do người kinh
doanh cố tình giả mạo nhằm thu được lợi nhuận cao hơn. Tuy nhiên, dù là nguyên
nhân nào thì đều có thể dẫn đến hậu quả làm mất tác dụng điều trị và gây những tác
dụng không mong muốn nghiêm trọng, thậm chí là dẫn đến tử vong. Tại Mỹ, Trung
tâm chăm sóc sức khỏe California đã báo cáo về một trường hợp bị nhiễm độc do
dùng Clematis chinensis bị lẫn với Podophyllum emodi. Trong Podiphyllum emodi
có chứa podophyllotoxin là một hoạt chất có độc tính. Hậu quả trên bệnh nhân này
là bệnh lý trên thần kinh ngoại biên theo bệnh nhân đến suốt đời [41]. Ở Bỉ, trong
suốt giai đoạn 1990 - 1992, sự nhầm lẫn giữa một thảo dược có độc tính là
Aristolochia fangchi dùng thay thế cho Stephania tetrandra đã làm cho hơn 100 phụ
nữ bị suy thận [13]. Năm 2004, ở Hồng Kông có một báo cáo về độc tính do dùng
thảo dược mà nguyên nhân là do sự nhầm lẫn một thảo dược được kê trong đơn.
Bệnh nhân đã được kê Aristolochia mollissima thay vì Solanum lytatum. Trên thực
tế, hai loại thuốc này có nguồn gốc và tác dụng dược lý khác nhau, điểm chung duy
nhất là cùng có tên thông dụng là “Baimaoteng”. Sự nhầm lẫn này đã dẫn đến hậu
quả làm suy giảm chức năng thận và ung thư đường tiết niệu trên bệnh nhân [81].
Bên cạnh đó, năm 2004, ở Mỹ và các nước châu Âu như Hà Lan, Pháp, Tây Ban
Nha, các báo cáo về tình trạng ngộ độc ở trẻ em sau khi dùng một loại trà có nguồn
gốc từ Illicium verum không ngừng được tăng lên. Những trẻ bị ngộ độc thấy xuất
hiện tình trạng co giật, buồn nôn, bồn chồn, nhãn cầu chuyển động nhanh. Nguyên
4
nhân được xác định là do Illicium anisatum đã được dùng thay thế cho Illicium
verum khi sản xuất loại trà này [63]. Do những tác dụng không mong muốn nêu trên
nên việc nhận diện chính xác thảo dược đã và đang là một yêu cầu cấp thiết. Có
nhiều phương pháp đã được sử dụng trong nhận diện thảo dược từ đơn giản đến
phức tạp, từ các phương pháp truyền thống đến các phương pháp hiện đại. Phương
pháp nhận diện dựa vào hình thái là phương pháp đầu tiên được sử dụng, tiếp đó là
phương pháp vi học, phương pháp phân tích hóa học và phương pháp dựa vào công
cụ sinh học phân tử.
1.2. Các phương pháp thường được sử dụng trong nhận diện thảo dược
1.2.1. Phương pháp hình thái
Phương pháp hình thái là phương pháp dựa vào các đặc điểm hình thái tổng
quát để nhận diện cây thuốc và các bộ phận của nó. Phương pháp truyền thống yêu
cầu sử dụng hầu hết các giác quan (quan sát, sờ nắn, nếm, ngửi) để nhận biết một
dược liệu [81]. Đây là phương pháp đầu tiên được áp dụng trong nhận diện thảo
dược và cho đến nay vẫn đang được áp dụng rộng rãi trên toàn thế giới.
Đối với một cây thuốc, các đặc điểm dùng để định danh bao gồm các đặc
điểm như: cây gỗ hay cây thảo, kích thước, hình dạng lá (ví dụ như mép lá có răng
cưa hay gợn sóng, lá chia thùy hay không chia thùy), đặc điểm cụm hoa (như dạng
chùm, bông, tán), đặc điểm hình thái học thực vật (như dạng bầu trên, bầu dưới hay
bầu giữa, hình dạng và số lượng nhị, số lượng lá noãn trong mỗi bầu và số lượng
hạt trong mỗi lá noãn) và đặc điểm của rễ bao gồm cấu trúc rễ và dạng rễ (như rễ
chùm, thân rễ hay thân hành) [63].
Đối với một dược liệu từ thực vật, những căn cứ quan trọng để nhận diện là
dựa vào hình thái, kích thước, màu sắc và đặc điểm về mùi vị [81]. Ví dụ như để
nhận diện được rễ của loài Ligusticum chuanxiong, Dược điển Trung Quốc 10 đã sử
dụng các đặc điểm hình thái, màu sắc, mùi vị để mô tả như sau: rễ có các mấu
không đều, đường kính 2 – 7 cm, bên ngoài có màu vàng nâu, thô ráp và khô lại, với
5
nhiều vòng giống nhau và lớn dần, có các vết lõm, mùi thơm, vị đắng, cay, để lại
cảm giác tê nóng sau đó thì hơi ngọt [69]. Bên cạnh cách thức mô tả như trong
Dược điển, còn có nhiều cách mô tả trong đời thường như thân rễ Polygonati như
đầu gà trống, rễ Codonopsis pilosulae như đầu sư tử, thân rễ Coptidis như cựa gà…
Đây là những cách mô tả rất sinh động giúp dễ dàng nhận diện được vị dược liệu
quan tâm [81].
Phương pháp nhận diện thảo dược dựa vào hình thái là phương pháp đơn
giản nhất, nhanh và dễ thực hiện. Tuy nhiên, nó phụ thuộc rất nhiều vào kinh
nghiệm của người nhận diện và khó phân biệt các cây thuốc có quan hệ họ hàng gần
như các cây cùng một chi hay họ có hình thái bên ngoài tương tự nhau [81]. Bên
cạnh đó, việc nhận biết thảo dược ở dạng bột bằng phương pháp hình thái là không
thể thực hiện được. Phương pháp vi học ra đời có thể giúp khắc phục được nhược
điểm này.
1.2.2. Phương pháp vi học
Phương pháp vi học liên quan đến việc sử dụng kính hiển vi để nghiên cứu
cấu trúc đặc điểm bên trong cây thuốc và đặc điểm tế bào. Khi thảo dược ở dạng
chế biến hoặc dạng khô, đặc điểm hình thái bị thay đổi. Phương pháp vi học thích
hợp cho việc nhận diện thảo dược trong quá trình chế biến như dạng nguyên liệu đã
bị cắt chẻ hoặc ở dạng bột. Nó cũng rất có ích trong việc nhận diện các loài có kiểu
hình tương tự nhau [81].
Một ví dụ sử dụng phương pháp vi học để nhận diện thảo dược là trường hợp
ở loài Illicium verum. Quả của Illicium verum có tác dụng trừ hàn, kích thích tiêu
hóa, giảm khó tiêu. Ở Mỹ và các nước phương Tây, loại thuốc này được sử dụng
dành cho trẻ em ở dạng trà gói để chữa đau bụng. Tuy nhiên, một số lượng lớn trẻ
sơ sinh sau khi sử dụng loại trà này xuất hiện triệu chứng thần kinh kích thích do
Illicium anisatum đã được dùng thay thế cho Illicium verum. Illicium anisatum chứa
các sesquiterpenes có độc tính như anisatin, neoanisatin, và 2-oxyneoanisatin sẽ gây
6
ngộ độc cho người sử dụng. Hai loài này có thể phân biệt với nhau qua hình dạng,
màu sắc, vị, mùi, số lượng nang. Tuy nhiên, rất khó để phân biệt chúng khi ở dạng
bột. Phương pháp vi học đã được sử dụng để phân biệt hai loài này. Dưới ánh sáng
huỳnh quang, hai loài bộc lộ sự khác nhau về đặc điểm tế bào ở vỏ quả ngoài nang.
Nang của Illicium verum có các tế bào hình đa giác với lớp màng ngoài có vằn, kích
thước thay đổi chiều dài từ 250 – 300 µm và chiều rộng 100 µm, có màu nâu xanh
dưới kính hiển vi huỳnh quang tại vùng UV bước sóng 330 – 380 µm. Trái lại, nang
của Illicium anisatum có thành mỏng hơn. Tế bào lớp ngoài của nang có chiều dài
từ 15 – 20 µm, có hình trứng hoặc hình thuôn và khác nhau đáng kể về kích thước,
chúng có màu xanh vàng nhẹ dưới kính hiển vi huỳnh quang tại vùng UV bước
sóng 330 – 380 µm. Sự khác nhau này là đặc điểm rất quan trọng để nhận biết được
hai loài Illicium verum và Illicium anisatum [63].
Phương pháp vi học là phương pháp rất thông dụng để nhận diện thảo dược.
Nó có mặt trong Dược điển của nhiều nước như Dược điển Anh, Dược điển thảo
dược Mỹ, Dược điển Nhật Bản, Dược điển thảo dược Hàn Quốc… Phương pháp
này đơn giản, dễ thực hiện, khắc phục được nhược điểm của phương pháp hình thái
là có thể xác định thảo dược đã được chế biến hoặc ở dạng bột. Tuy nhiên, nó cũng
có nhược điểm là không thể xác định chính xác các loài của một hỗn hợp có quá
nhiều thành phần, đồng thời nó không thể giúp phân biệt loài khi ở dạng dịch chiết
[81]. Phương pháp phân tích hóa học có thể giúp giải quyết được các khó khăn này.
1.2.3. Phương pháp phân tích hóa học
Phương pháp phân tích hóa học là phương pháp căn cứ vào đặc điểm về
thành phần hóa học của một dược liệu để xác định dược liệu đó. Các phương pháp
phân tích hóa học thường được sử dụng là phương pháp sắc ký, phương pháp điện
di và phương pháp quang phổ [81].
Phương pháp sắc ký được sử dụng để thu được dấu vân tay sắc ký của một
thảo dược. Dấu vân tay sắc ký là sắc ký đồ của các hoạt chất và các thành phần hóa
7
học đặc trưng có trong dịch chiết của cây đó. Dựa vào dữ liệu của dấu vân tay sắc
ký thu được có thể xác định được cây thuốc ngay cả khi lượng mẫu là khác nhau
hoặc có thể xác định sự tương đồng hoặc khác biệt giữa các mẫu khác nhau. Tuy
nhiên, dịch chiết của một cây thuốc chứa hàng trăm hoạt chất khác nhau. Một số
hoạt chất lại tồn tại với tỉ lệ khác nhau trong các mẫu của cùng một loại thảo dược.
Do vậy, điều quan trọng là cần phải chọn phương pháp sắc ký tin cậy để thể hiện
thành phần hoạt chất và các thành phần hóa học đặc trưng trong cây thuốc [52].
Phương pháp điện di mao quản cũng được sử dụng trong nghiên cứu thảo
dược do có khả năng tách tốt [31]. Dấu vân tay đặc trưng của Flos carthami [16] và
Gingo biloba [71] đã được xây dựng để nhận diện hai loài này ở dạng thảo dược
thô đồng thời giúp phân biệt với loài giả mạo, thay thế.
Ngoài ra phương pháp sắc ký và điện di, phương pháp quang phổ cũng được
sử dụng trong nhận diện thảo dược. Nguyên tắc chung của các kĩ thuật là sử dụng
phương pháp thăm dò nghiên cứu quang phổ điển hình của toàn bộ các chất hóa học
được chiết xuất từ mẫu quan tâm. Các phương pháp thường dùng là phổ khối, phổ
cộng hưởng từ hạt nhân proton và phổ hồng ngoại (IR) [63].
Các kĩ thuật dựa trên phân tích thành phần hóa học của cây là những công cụ
rất hữu ích trong nhận diện thực vật. Tuy nhiên, nhược điểm lớn nhất của các kĩ
thuật này là phụ thuộc vào thành phần hóa học của cây, nhưng thành phần hóa học
của cây chịu ảnh hưởng rất nhiều bởi môi trường sống, vào giai đoạn sinh trưởng và
phát triển. Đồng thời, nó còn phụ thuộc vào quá trình thu hái và điều kiện bảo quản
mẫu. Trong điều kiện bảo quản không tốt, mẫu có thể bị phân hủy làm biến đổi các
thành phần hóa học trong đó, dẫn đến việc nhận diện là không thể [26].
Với sự phát triển của sinh học phân tử và di truyền học thực vật trong những
năm gần đây, công cụ di truyền được xem như là một phương pháp đáng tin cậy
trong nhận diện nguyên liệu có nguồn gốc thực vật ở cấp độ ADN. Phương pháp
này tỏ ra chính xác, thuận tiện, đặc hiệu và ổn định. Hơn nữa, một lượng nhỏ mẫu là
8
đủ cho nghiên cứu ADN. Trái ngược với các dấu vân tay hóa học chịu ảnh hưởng
nhiều bởi giai đoạn sinh trưởng, phát triển, điều kiện môi trường, điều kiện thu hái,
làm khô và bảo quản, ADN là một đại phân tử tương đối bền vững, ít chịu ảnh
hưởng của các yếu tố bên ngoài, có thể thu được từ mẫu tươi, mẫu đã làm khô, thậm
chí là cả ở mẫu đã qua chế biến. Bên cạnh đó, các ADN không đặc trưng cho mô
nên có thể thăm dò ở bất kì giai đoạn sinh trưởng nào của cây [26]. Do đó, công cụ
sinh học phân tử rất hữu ích và thích hợp cho nhận diện thảo dược.
9
Chương 2. Các kĩ thuật sinh học phân tử ứng dụng trong nhận diện thảo dược
Trong sinh học phân tử, việc nhận diện thảo dược được thực hiện dựa vào
các marker di truyền (hay các marker ADN). Marker ADN có thể được hiểu là đoạn
ADN đặc trưng thể hiện sự khác biệt ở cấp độ bộ gen. Các marker này có thể thu
được nhờ sử dụng các phương pháp như phương pháp PCR, phương pháp giải trình
tự ADN và phương pháp ADN microarray [78].
2.1. Các marker dựa trên phản ứng khuếch đại chuỗi (PCR)
Phản ứng khuếch đại chuỗi (Polymerase chain reaction-PCR) là một kĩ thuật
cơ bản của sinh học phân tử. Đây là một phản ứng khuếch đại ADN ở bên ngoài cơ
thể sống. Trước đây, để giải quyết những trở ngại về số lượng vật chất di truyền cần
có, các kĩ thuật tạo dòng in vitro thường được sử dụng để tạo số lượng lớn vật chất
di truyền. Tuy nhiên, kĩ thuật này đòi hỏi thao tác rất phức tạp và tốn rất nhiều thời
gian. Kĩ thuật PCR ra đời đã khắc phục những khuyết điểm của phương pháp hiện
có. Áp dụng kĩ thuật PCR cho phép làm tăng nhanh lượng vật chất di truyền trong
thời gian ngắn [2].
Về nguyên tắc, phản ứng PCR là một phản ứng chuỗi, trong đó một phân tử
ADN được sử dụng để từ đó tạo ra hai bản sao, sau đó là bốn, tám…Sự nhân đôi
liên tục được thực hiện nhờ enzym ADN polymerase [33]. Tất cả các ADN
polymerase khi hoạt động tổng hợp một mạch ADN mới đều cần sự hiện diện của
những mồi chuyên biệt. Mồi là những đoạn ngắn, có khả năng bắt cặp bổ sung với
một đầu của mạch khuôn và ADN polymerase sẽ kéo dài mồi để hình thành mạch
mới [2].
Trên cơ sở kĩ thuật PCR, bằng việc sử dụng các mồi khác nhau sẽ thu được
các marker ADN khác nhau. Các mồi sử dụng có thể là mồi ngẫu nhiên, không yêu
cầu thông tin trước về bộ gen hoặc các mồi đặc hiệu khuếch đại một vùng nhất định
trên bộ gen mà thông tin về bộ gen cần được biết trước [26]. Sau bước khuếch đại
10
nhờ PCR sử dụng các mồi đặc trưng cho từng kĩ thuật, các sản phẩm thu được sẽ
được điện di trên gel để thu được sản phẩm khuếch đại và đánh giá kích thước [78].
2.1.1. Kĩ thuật PCR sử dụng các mồi ngẫu nhiên (RP-PCR)
Kĩ thuật PCR dùng mồi ngẫu nhiên (Random-primed PCR – RP-PCR) là kĩ
thuật mà trong đó phản ứng khuếch đại được xảy ra trong điều kiện nhiệt độ gắn
mồi thấp, sử dụng một hoặc hai mồi ngẫu nhiên trong mỗi phản ứng PCR để tạo ra
các đoạn ADN đặc trưng. Các mồi này sẽ gắn vào các vị trí ngẫu nhiên trên ADN
khuôn để khuếch đại. Sự đa hình được đánh giá bằng sự có mặt hoặc không có mặt
của một băng điện di nhất định [78].
Trong kĩ thuật RP-PCR bao gồm: kĩ thuật PCR với mồi tùy chọn (Arbitrarily
primed-PCR – AP-PCR), kĩ thuật sự đa hình các đoạn ADN được khuếch đại ngẫu
nhiên (random amplified polymorphic DNA – RAPD) và kĩ thuật vân tay khuếch
đại ADN (DNA amplification fingerprinting – DAF). Với các kĩ thuật khác nhau thì
mồi được sử dụng có chiều dài khác nhau. Kĩ thuật DAF có tính nghiêm ngặt thấp
nhất do sử dụng mồi có chiều dài 5 – 8 nucleotid, tiếp đó là RAPD sử dụng mồi có
chiều dài 10 nucleotid, AP-PCR sử dụng mồi có chiều dài khoảng 20 nucleotid [78].
Kĩ thuật DAF do sử dụng các mồi ngắn nên mô hình các băng thu được là rất phức
tạp [57]. Khi chiều dài của mồi tăng lên, số lượng vị trí gắn trên bộ gen mục tiêu
giảm đi do giảm cơ hội tìm thấy các vị trí mục tiêu tương đồng hoặc gần tương
đồng trên bộ gen [29].
Trong ba kĩ thuật trên, kĩ thuật RAPD được ứng dụng rộng rãi nhất do sự sẵn
có của mồi RAPD trên thị trường [55]. Mồi RAPD có chiều dài 10 nucleotid thường
chứa hàm lượng GC từ 50% đến 80% vì trong quá trình lai ADN, nếu hàm lượng
GC nhỏ hơn 50 % thì sẽ không chịu được nhiệt độ của quá trình tổng hợp chuỗi
[19].
11
Hình 1. Nguyên tắc của kĩ thuật sự đa hình các đoạn ADN được khuếch đại
ngẫu nhiên – RAPD [8]
Một trong các ứng dụng kĩ thuật RAPD trong nhận diện thảo dược là trường
hợp của Senna angustifolia. Mục đích của nghiên cứu là nhận diện Senna
angustifolia và phân biệt nó với các loài thân thuộc là S. acutifolia, S.tora và
S.sophera. Trong nghiên cứu này, 32 mồi RAPD được sử dụng để khuếch đại ADN
chiết từ các mẫu, sau đó sản phẩm được điện di trên gel agarose và hiện màu bằng
ethidium bromid dưới ánh sáng UV. Trong 32 mồi được sử dụng có sáu mồi thu
được các băng đặc trưng cho loài. Dựa trên điện di đồ thu được thì thấy bốn loài
khác nhau và cho thấy sự đa hình cao (Hình 2). Do đó, kĩ thuật này thích hợp để
phân biệt các loài Senna có kiểu hình giống nhau được bán trên thị trường [37].
12
Hình 2. Nghiên cứu RAPD với các loài S. angustifolia, S. acutifolia, S. sophera,
S. tora [37]
Mồi OPC-3 (hàng: 1–8), mồi OPC-4 (hàng: 9–16). S. angustifolia (hàng: 1, 2, 9,
10), S. acutifolia (hàng: 3, 4, 11, 12), S. sophera (hàng: 5, 6, 13, 14), S. tora (hàng:
7, 8, 15, 16). Thang ADN 100 bp và 1 kb .
Qua nghiên cứu này, kĩ thuật RAPD bộc lộ ưu điểm là nhanh, dễ thực hiện.
Bên cạnh đó, lượng mẫu yêu cầu là rất nhỏ, tính bằng đơn vị nanogram (lượng
ADN cần là 30ng/µl), trong thử nghiệm không sử dụng bất kì chất phóng xạ nào
nên rất an toàn. Ngoài ra, kĩ thuật RAPD còn không yêu cầu bất kì thông tin nào của
bộ gen cần nghiên cứu.
Bên cạnh những ưu điểm trên, RAPD cũng cho thấy nhược điểm là độ lặp lại
(reproducibility) thấp. Phản ứng RAPD-PCR chịu ảnh hưởng rất nhiều về điều kiện
phản ứng, độ sạch của mẫu. Trong nghiên cứu với Senna angustifolia và các loài
thân thuộc, để khắc phục nhược điểm này, các tác giả chỉ xem xét các băng rõ ràng
và tin cậy. Cùng với đó, quá trình chuẩn hóa quy trình chiết ADN từ mẫu và lựa
13
chọn các thông số kĩ thuật thích hợp cho phản ứng cũng được thực hiện. Các ADN
thu trong nghiên cứu được làm sạch khỏi các chất chuyển hóa thứ cấp bằng phương
pháp CTAB cải tiến của Khan và cộng sự [37]. Áp dụng phương pháp chiết tách
này cho thấy ADN thu được có độ tinh sạch và chất lượng cao, tỉ lệ hấp thụ
A260/A280 là 1,8 – 2,0 [39]. Tiếp đó là quá trình chuẩn hóa điều kiện của phản
ứng. Phản ứng PCR được thực hiện với nồng độ MgCl2 khác nhau 0,5mM, 1mM,
1,5mM đồng thời giữ nguyên các thông số khác. Nồng độ MgCl2 1,5mM được xác
định là tối ưu nhất đã được sử dụng trong phản ứng khuếch đại. Ban đầu phản ứng
khuếch đại được thử với nồng độ enzym là 0,9 đơn vị Taq polymerase nhưng quá
trình thực hiện không cho kết quả tốt. Do đó, lượng enzym này được giảm xuống
0,5 đơn vị cho mỗi 25µl dung dịch phản ứng. Trong các thử nghiệm PCR, nhiệt độ
gắn mồi là 360C được xác định. Quá trình biến tính ADN là một quá trình nghiêm
ngặt trong PCR. Trong hầu hết các phản ứng khuếch đại, thời gian ủ để thực hiện
quá trình biến tính ADN là một phút ở nhiệt độ 940C. Cùng với đó, với mỗi mẫu
quá trình được làm ba lần để đảm bảo độ tin cậy của thử nghiệm [37].
Mặc dù tồn tại nhược điểm nêu trên, nhưng do có ưu điểm là nhanh và đơn
giản, kĩ thuật RAPD vẫn được ứng dụng rộng rãi để phân biệt các loài dùng làm
thuốc với loài giả mạo thuộc các chi như Echinacea, Typhonium, Dendrobium và
các sản phẩm từ nó, rễ của Astragalus, loài Dendrobium officinale, Tinospora
cordifolia, Piper nigrum, Mimosae tenuiflorae, Rahmannia glutinosa [37],
Glycirrhiza glabra [38], Cuscuta reflexa và Cuscuta chinensis [35], Ruta
graveolens [36] và Picrorhiza kurrooa và loài giả mạo [29].
2.1.2. Kĩ thuật sự đa hình chiều dài của các đoạn ADN có thể khuếch đại trực
tiếp (DALP)
Kĩ thuật sự đa hình chiều dài của các đoạn ADN có thể khuếch đại trực tiếp
(Direct amplification of length polymorphisms – DALP) được sử dụng để thu được
dấu vân tay ADN của bộ gen và cho phép giải trình tự trực tiếp sản phẩm thu được
nếu cần. Hai mồi được sử dụng, trong đó một mồi xuôi bao gồm phần trung tâm là
14
mồi giải trình tự phổ biến M13 (universal M13 sequencing primer) và các trình tự
ngẫu nhiên. Một mồi ngược chỉ bao gồm mồi M13. Cặp mồi này giúp tạo ra mô
hình nhiều băng rất phức tạp. Các sản phẩm PCR được thăm dò trên gel
polyacrylamid biến tính. Do sự thiết kế đặc biệt của mồi, mỗi băng của các mô hình
khác nhau có thể được giải trình tự trực tiếp với mồi giải trình tự chung khi cần thiết
[58].
Một ví dụ sử dụng kĩ thuật DALP để nhận diện cây thuốc là ở loài Panax
ginseng. Sâm là một loại dược liệu quý nên sự giả mạo thường xuyên xảy ra. Rất
nhiều nghiên cứu với nhiều kĩ thuật khác nhau đã được khai thác nhằm phân biệt
các loài Panax. Ngoài RAPD, kĩ thuật DALP cũng đã được khai thác trong nhận
diện Panax ginseng và Panax quinquefolius. Trong nghiên cứu sử dụng DALP,
phản ứng khuếch đại được thực hiện với mồi xuôi là (5’-GTT TTC CCA GTC ACG
ACG C-3’) và mồi ngược là (5’-AAC AGC TAT GAC CAT GA-3’). Một trong hai
mồi được đánh dấu bằng ATP-P33. Kết quả thu được cho thấy một đoạn đặc hiệu
636 bp chỉ xuất hiện ở mẫu Panax ginseng nhưng không xuất hiện tại mẫu Panax
quinquefolius [25].
Như vậy sử dụng DALP có thể giúp phân biệt được hai loài sâm với nhau.
Cũng như các kĩ thuật RP-PCR, kĩ thuật này có ưu điểm là không yêu cầu bất kì
thông tin nào về bộ gen cần nghiên cứu. Hơn thế nữa, do sử dụng mồi dài hơn cũng
như mức độ chính xác yêu cầu cao hơn, kĩ thuật này cho thấy độ tin cậy cao hơn so
với các kĩ thuật RP-PCR.
2.1.3. Kĩ thuật sự đa hình chiều dài các đoạn được khuếch đại (AFLP)
Kĩ thuật sự đa hình chiều dài các đoạn được khuếch đại (Amplified fragment
length polyphorphism – AFLP) là kĩ thuật liên quan đến sự khuếch đại toàn bộ các
đoạn ADN giới hạn từ ADN bộ gen sau khi đã được cắt nhờ các enzym giới hạn
[60].
AFLP là sự kết hợp giữa kĩ thuật sự đa hình chiều dài các đoạn giới hạn
(Restriction fragment length polymorphism – RFLP) và kĩ thuật PCR. RFLP là một
15
kĩ thuật dựa trên kĩ thuật lai phân tử. Trong RFLP, đoạn ADN được cắt bằng enzym
giới hạn sau đó điện di trên gel agarose. Các băng ADN đa hình được chuyển lên
màng lai và lai với mẫu dò được đánh dấu hóa học. Sự đa dạng được đánh giá bằng
sự có mặt hoặc vắng mặt của các băng [26].
Trong kĩ thuật AFLP, ADN bộ gen sẽ được cắt nhờ các enzym giới hạn tại
nhiều vị trí giới hạn khác nhau ở nhiều locus để tạo ra các đoạn giới hạn có đầu
dính, các enzym cắt được sử dụng là sự kết hợp giữa một enzym cắt hiếm (rare
cutter) (EcoRI hoặc PstI) với một enzym cắt thường (frequent cutter) (MseI hoặc
TaqI). ADN cần phải tinh sạch khỏi các chất ức chế ảnh hưởng đến enzym giới hạn.
Sau đó, các đoạn giới hạn sẽ được gắn với các adaptor ở cuối đoạn tạo ra trình tự đã
biết cho phản ứng khuếch đại PCR tiếp theo. Sau khi thực hiện bước gắn adaptor,
phản ứng khuếch đại ban đầu được thực hiện sử dụng mồi có bổ sung thêm một
nucleotid chọn lọc. Kế đó, phản ứng khuếch đại chọn lọc được thực hiện với mồi bổ
sung thêm 3 nucleotid chọn lọc, một trong hai mồi được đánh dấu huỳnh quang
hoặc phóng xạ. Quá trình khuếch đại được thực hiện trong điều kiện nghiêm ngặt.
Sản phẩm PCR được điện di trên gel agarose hoặc gel polyacrylamid biến tính với
thiết bị tự ghi phóng xạ, hiện màu bằng AgNO3 hoặc dùng máy giải trình tự tự động
[60].
16
Hình 3. Nguyên tắc của kĩ thuật AFLP [60]
Kĩ thuật AFLP đã được nghiên cứu trong nhận diện các loài thuộc chi
Swertia. Nghiên cứu được thực hiện nhằm phân biệt loài Swertia chirayita với các
loài cùng chi là Swertia angustifolia, Swertia bimaculata, Swertia ciliata, Swertia
cordata và Swertia alata thông qua các marker AFLP đặc trưng. Sau khi chiết tách
được ADN của các loài này, các đoạn ADN được cắt bằng enzym EcoRi và Tru9I,
quá trình gắn adaptor được thực hiện đồng thời trong một hỗn hợp phản ứng. Phản
ứng được ủ qua đêm ở nhiệt độ phòng. Quá trình khuếch đại ban đầu được thực
hiện với mồi MseI gắn thêm nucleotid C ở đầu 3’ và mồi EcoRI gắn thêm nucleotid
A ở đầu 3’. Bước khuếch đại tiếp theo sử dụng mồi MseI 5’-[Primer-Cxx]-3’ và mồi
17
EcoRI 5’-[Primer-Axx]-3’, trong đó mồi EcoRI được đánh dấu huỳnh quang. Sản
phẩm PCR được điện di trên gel polyacrylamid. Kết quả thu được cho thấy trong 64
cặp mồi được sử dụng thì có 46 cặp tạo các băng ADN. Trong tổng số 5312 băng
thì có đến 5304 băng đa hình. Trong các băng này, 743 băng đặc trưng cho các loài
khác nhau được nghiên cứu. Các đoạn đặc trưng cho sáu loài nghiên cứu đã được
xây dựng dựa vào nghiên cứu này cho thấy AFLP hoàn toàn có thể sử dụng để nhận
biết Swertia chirayita và các loài họ hàng của nó [51].
Trong nghiên cứu trên có một số điểm đặc biệt. Thứ nhất là trong hỗn hợp
phản ứng cắt và gắn adaptor, ngoài các thành phần thông thường còn có sự có mặt
của albumin huyết thanh bò (bovine serum albumin – BSA). BSA được cho vào
nhằm mục đích ngăn cản các thành phần lẫn trong ADN chưa tinh sạch gắn vào
enzym, có thể ngăn cản hoạt động của enzym [42]. Thứ hai là một trong hai mồi
dùng trong bước khuếch đại chọn lọc cần phải được đánh dấu để phục vụ cho bước
tiếp theo là thăm dò các đoạn AFLP trên gel polyacrylamid. Thứ ba là nhiệt độ gắn
mồi là 560C. Nhiệt độ này cao hơn so với kĩ thuật RAPD. Đây chính là ưu điểm của
phương pháp AFLP so với RAPD vì nhiệt độ phản ứng thấp sẽ làm giảm tính đặc
hiệu của phản ứng.
So sánh kĩ thuật AFLP và kĩ thuật RAPD cho thấy kĩ thuật AFLP đáng tin
cậy hơn và có tính lặp lại cao hơn. Đồng thời, số lượng băng ADN đa hình thu được
trong một loài với kĩ thuật AFLP lớn hơn so với kĩ thuật RAPD [45]. Tuy nhiên,
RAPD lại nhanh, đơn giản và quá trình thực hiện không trải qua nhiều bước phức
tạp như kĩ thuật AFLP. Một nhược điểm nữa của AFLP so với RAPD là phương
pháp này còn sử dụng gel polyacrylamid kết hợp hiện hình bằng muối bạc đồng thời
sử dụng phương pháp thăm dò bằng huỳnh quang do đó sẽ làm chi phí cao hơn và
tốn công sức hơn RAPD.
Kĩ thuật AFLP ngoài sử dụng để nhận diện Swertia chirayita còn được sử
dụng để nhận diện các loài thuộc chi Zingiber là Zingiber officinale, Z. montanum
và Z. zerumbet [22].
18
2.1.4. Kĩ thuật sự đa hình các trình tự khuếch đại được phân cắt (CAPS)
Kĩ thuật sự đa hình các trình tự khuếch đại được phân cắt (Cleaved amplified
polymorphism sequence – CAPS), với tên gọi ban đầu PCR-RFLP, là sự kết hợp
của kĩ thuật PCR với kĩ thuật RFLP. Quá trình tạo marker CAPS được thực hiện
qua hai bước. Đầu tiên, một trình tự xác định được khuếch đại sử dụng mồi đặc
hiệu. Tiếp theo, sản phẩm thu được sẽ được cắt bằng enzym giới hạn, thường là
enzym nhận biết đặc hiệu bốn base. Các đoạn cắt ra sẽ được tách trên gel agarose
[26].
Cả hai kĩ thuật CAPS và AFLP có điểm giống nhau là dựa trên hai kĩ thuật
RFLP và PCR. Tuy nhiên, điểm khác nhau giữa CAPS và AFLP là thứ tự thực hiện
của hai kĩ thuật này. Trong kĩ thuật AFLP, bước cắt bằng bằng enzym giới hạn được
thực hiện trước, tiếp đó là bước khuếch đại PCR. Trái lại, trong kĩ thuật CAPS bước
khuếch đại lại được thực hiện trước, kế đó mới là bước cắt bằng enzym giới hạn.
Hình 4. Nguyên tắc của kĩ thuật CAPS [6]
Một ví dụ sử dụng CAPS trong nhận diện cây thuốc là ở loài Paris
polyphylla var. yunnanensis. Trong nghiên cứu này, kĩ thuật CAPS đã được sử
dụng nhằm mục đích phân biệt loài P. polyphylla var. yunnanensis với các loài
19
thân thuộc có kiểu hình giống nhau và việc nhầm lẫn thường xuyên xảy ra. Mẫu
dùng để khuếch đại được lấy từ 12 loài bao gồm Paris polyphylla var. yunnanensis
và 11 loài thân thuộc là P. dunniana, P. daliensis, P. vietnamensis, P. mairei, P.
cronquistii, P. delavayi var. delavayi, P. thibeitca, P. fargessi, P. delavayi var.
petiolata, P. marmomata và P. axialis. Phản ứng khuếch đại được thực hiện sử
dụng hai mồi là ITS1 và ITS5 để khuếch đại toàn bộ vùng ITS. Các trình tự thu
được sau đó được đem so sánh và kết quả thu được cho thấy Paris polyphylla var.
yunnanensis có một vị trí đặc trưng (C/GGCCA) có thể cắt được bằng enzym giới
hạn EaeI tại vị trí 200. Nghiên cứu trên 11 loài còn lại không thấy có vị trí này.
Điều này cho thấy rằng vùng ITS của Paris polyphylla var. yunnanensis có thể được
cắt thành 2 đoạn trong khi ở các loài còn lại thì không. Sau khi được phân cắt nhờ
enzym giới hạn, hai đoạn thu được từ mẫu Paris polyphylla var. yunnanensis và các
mẫu cho kết quả âm tính được quan sát thấy trên bản điện di trên gel. Do có kích
thước khác nhau nên hai đoạn này có thể phân tách nhau trên gel agarose 1,5% điện
di. Như vậy, việc nhận diện Paris polyphylla var. yunnanensis bằng CAPS là có thể
thực hiện được [49].
Hình 5. Nghiên cứu CAPS trên các sản phẩm PCR với cặp mồi ITS1, ITS5 và
được cắt bằng enzym giới hạn EaeI [49]
1. Paris daliensis; 2. P. vietnamensis; 3. P. mairei; 4. P. cronquistii; 5. P.
delavayi var.delavayi; 6. P. thibeitca; 7. P. fargessi; 8. P. delavayi var. petiolata; 9.
P. marmomata;10. P. axialis; 11. P. dunniana; 12. P. polyphylla var.
yunnanensis; M: Thang ADN.
20
Nghiên cứu tương tự được thực hiện với Actinidia macrosperma là một dược
liệu nổi tiếng về tác dụng kháng ung thư cùng với các loài giả mạo với nó là A.
valvata và A. melanandra. Nghiên cứu này được thực hiện dựa trên trình tự trnK,
là một trình tự ADN lục lạp. Do Actinidia macrosperma có mô hình điện di trên gel
đặc trưng sau khi cắt bằng enzym nên việc nhận diện nó cũng có thể được thực hiện
nhờ kĩ thuật CAPS [80].
Qua các nghiên cứu trên có thể thấy rằng khả năng của kĩ thuật này trong
thăm dò đa dạng ADN là không cao như phương pháp AFLP vì sự thăm dò bằng
CAPS yêu cầu cần có sự thay đổi nucleotid ảnh hưởng đến vị trí giới hạn thì mới có
thể thực hiện được. Nghiên cứu trên thực hiện được là vì có các sự thay đổi vị trí cắt
giới hạn cần thiết. Nếu không có những sự thay đổi này thì việc áp dụng CAPS
trong nhận diện là không thể thực hiện được. Cũng có thể thấy rằng trong các
nghiên cứu trên, việc lựa chọn vùng nghiên cứu của tác giả là hợp lý. Vùng ITS của
ADN ribosom và vùng trnK của ADN lục lạp là hai vùng mà sự đa hình thường
xuyên xảy ra. Sự lựa chọn vùng nghiên cứu hợp lý đã đóng góp vào thành công của
các nghiên cứu.
Ngoài nhận diện hai loài trên. CAPS còn được ứng dụng để nhận diện nhiều
loài khác thuộc các chi Alisma, Angelica, Sinopodophyllum và Dysosma, Ephedra,
Fritillaria, Artemisia, Panax, Atractylodes, Glehnia, Astragalus, Den-drobium,
Duboisia và Codonopsis [26].
2.1.5. Kĩ thuật phân tích các trình tự lặp đơn giản (SSR)
Các ADN siêu vệ tinh là các trình tự ADN lặp lại song song, với các đơn vị
lặp lại dài 1 – 6 bp, phân bố trên khắp bộ gen [26]. Đặc điểm nổi bật của các siêu vệ
tinh là tính không vững bền. Tần số đột biến của các siêu vệ tinh cao, nằm trong
khoảng 10-2 đến 10-6 tại mỗi locus trong mỗi thế hệ do đột biến thêm vào hoặc mất
đi các đơn vị lặp lại, xuất hiện do trượt lỗi trong quá trình sao chép (ADN
replication slippage) và tái tổ hợp. Do đó, số lượng các đơn vị lặp lại tại mỗi vị trí
trong bộ gen là khác nhau giữa các loài [56]. Trái ngược với các trình tự siêu vệ
tinh, các đoạn ADN nằm cạnh chúng lại có sự bảo tồn cao giữa các cá thể trong
21
cùng một loài và đôi khi là giữa các loài khác nhau [59]. Sự khác nhau về số lượng
các đoạn lặp lại ở siêu vệ tinh và sự bảo tồn của các vị trí bên cạnh nó chính là cơ sở
để tạo ra các marker về sự đa dạng sử dụng trong sinh học phân tử.
Trong kĩ thuật phân tích các trình tự lặp đơn giản (Simple sequence repeats
analysis – SSR), các siêu vệ tinh được khuếch đại nhờ sử dụng mồi là trình tự ở
vùng bên cạnh các siêu vệ tinh này. Các mồi PCR được thiết kế đặc hiệu với một vị
trí trên bộ gen. Cặp mồi đặc hiệu có thể sử dụng được cho mỗi cá thể trong loài và
tạo ra nhiều sản phẩm với kích thước khác nhau ứng với mỗi chiều dài khác nhau
của các siêu vệ tinh [8].
Hình 6. Nguyên tắc của kĩ thuật phân tích các trình tự lặp lại đơn giản SSR [6]
Nghiên cứu SSR đã được ứng dụng trong nhận diện các loài sâm. Trong
nghiên cứu SSR, Panax ginseng cho thấy mô hình điện di khác nhau so với Panax
22
quinquefolius. Hơn nữa, kĩ thuật này còn có thể giúp nhận diện giữa loài Panax
quinquefolius được trồng với loài này mọc ở trong tự nhiên [40].
Nhìn chung sử dụng SSR trong nhận diện cây thuốc đã đem lại một công cụ
hiệu quả, chính xác và có độ tin cậy cao trong nhận diện cây thuốc. Tuy nhiên, sử
dụng phương pháp này cũng tồn tại những nhược điểm là tốn kém và tốn công sức
khi phải nghiên cứu các đoạn thu được trên gel polyacrylamid, hiện màu bằng muối
bạc vì các đoạn ADN thu được có sự sai khác nhau rất ít về kích thước [28].
2.1.6. Kĩ thuật sự đa hình trình tự giữa các vùng lặp (ISSR)
Kĩ thuật sự đa hình trình tự giữa các vùng lặp (inter-simple sequence repeat
polymorphism – ISSR) là một kĩ thuật sử dụng PCR để khuếch đại đoạn ADN nằm
giữa hai vùng siêu vệ tinh có trình tự giống nhau nhưng định hướng ngược chiều
nhau. Khoảng cách giữa hai vùng này phải nằm trong khoảng có thể khuếch đại
được. Mồi được sử dụng là các trình tự ADN có chiều dài từ 15 – 30 bp bổ sung với
2 siêu vệ tinh kế tiếp nhau, do đó giúp khuếch đại đoạn ADN ở giữa [60]. Thông
thường, các mồi sử dụng trong phản ứng khuếch đại này thường được gắn thêm một
mỏ neo là các nucleotid chọn lọc ở đầu 3’ hoặc 5’ để ngăn cản mồi gắn vào trình tự
nằm giữa hai siêu vệ tinh, từ đó, có thể làm giảm số băng ADN thu được khi mồi
gắn vào vùng siêu vệ tinh có đơn vị lặp lại chứa hai nucleotid [78]. Sản phẩm thu
được có thể được thăm dò bằng điện di trên gel agarose hoặc điện di trên gel
polyacrylamid [60].
Hai kĩ thuật SSR và ISSR đều liên quan đến siêu vệ tinh. Tuy nhiên, trình tự
mồi và đoạn ADN mục tiêu thu ở hai kĩ thuật là khác nhau. Kĩ thuật SSR dùng các
mồi bổ sung với trình tự bên cạnh các siêu vệ tinh để thu được các đoạn ADN mục
tiêu chính là các đoạn siêu vệ tinh. Trái lại, kĩ thuật ISSR sử dụng mồi là các trình
tự lặp lại, bổ sung với hai siêu vệ tinh, đoạn ADN mục tiêu nằm giữa hai siêu vệ
tinh đó. Hay nói cách khác, đoạn ADN mục tiêu trong kĩ thuật ISSR là đoạn nằm
ngoài đoạn siêu vệ tinh.
23
Hình 7. Nguyên tắc của kĩ thuật ISSR – PCR [60]
Tái hiện quá trình khuếch đại với một mồi đơn (AG)8
(a) Mồi (AG)n không gắn mỏ neo có thể bắt cặp ở bất cứ vị trí nào trên vùng lặp
lại (TC)n của phân tử ADN khuôn dẫn đến việc tạo ra kết quả nhiễu trên băng
điện di ADN
(b) Mồi (AG)n gắn thêm 2 nucleotid (NN) tại đầu 3’ được bắt cặp với vùng đặc
hiệu trên phân tử ADN khuôn tạo dạng băng sạch trên điện di đồ.
(c) Mồi (AG)n được gắn thêm 2 nucleotid (NN) tại đầu 5’ bắt cặp với vùng đặc
trưng trên phân tử ADN khuôn tạo băng có kích thước lớn hơn.
24
Kĩ thuật ISSR đã được áp dụng để nhận diện các loài Rheum officinale,
Rheum palmatum và Rheum tanguticum. Các loài này có kiểu hình về cây cũng như
sản phẩm chế biến rất giống nhau, do đó việc nhầm lẫn thường xuyên xảy ra.
Nghiên cứu ISSR được thực hiện sử dụng 15 mồi chọn lọc và tạo ra 132 đoạn ADN
đa hình. Số lượng vị trí được thăm dò với mỗi mồi là từ 7 đến 14 vị trí và kích
thước sản phẩm thay đổi từ 200 – 1700bp. Điều này cho thấy các trình tự ADN nằm
giữa các vùng siêu vệ tinh rất mở rộng và có độ phân tán cao trong các bộ gen của
ba loài này. Trong 15 mồi này, 3 mồi tạo ra các băng có độ đa hình cao và đáng tin
cậy trong ba loài được lựa chọn để tạo ra các marker đặc hiệu trong nhận diện
chúng (Hình 8). Việc nhận diện ba loài này bằng phương pháp ISSR là hoàn toàn có
thể [72].
Hình 8. Dấu vân tay ISSR của R. palmatum, R. officinale và R. tanguticum sử
dụng mồi UBC-811 [72]
R. palmatum (hàng1 – 5), R. officinale (hàng 6 – 10) và R. tanguticum (hàng 11 –
15), M: thang ADN 2000 bp.
Trong nghiên cứu này, nhiệt độ gắn mồi dao động từ 51 – 560C tùy thuộc
vào mồi được sử dụng. Nhiệt độ gắn mồi là một yếu tố rất quan trọng trong phản
ứng khuếch đại. Nhiệt độ thấp sẽ dẫn đến những bắt cặp sai của mồi, trong khi đó,
nhiệt độ cao có thể tăng sự gắn đặc hiệu, nhưng lại giảm mức độ gắn giữa mồi và
mẫu. Nhược điểm của phương pháp ISSR là độ tin cậy thấp do kết quả phụ thuộc
vào nồng độ Mg2+ và nhiệt độ gắn mồi. Do đó, trong nghiên cứu này, các nhiệt độ
25
51, 52, 53 và 560C đã được thử nghiệm với tất cả các mồi để chọn ra nhiệt độ cho
kết quả tối ưu nhất. Một điều đáng lưu ý nữa là để việc nhận diện hiệu quả và kiểm
soát sự biến dị cá thể, chỉ các băng chọn lọc có mặt ở tất cả năm cá thể trong mỗi
loài mới được chọn lựa để nghiên cứu.
Nhìn chung, cũng như RAPD và AFLP, phương pháp này có ưu điểm là
không yêu cầu phải biết trước thông tin về bộ gen. So với RAPD, phương pháp này
cũng đơn giản và nhanh nhưng lại cho độ chính xác cao hơn RAPD. So với AFLP,
ISSR có ưu điểm là đơn giản hơn, dễ thực hiện hơn và không cần phải giải trình tự.
Do đó, sử dụng ISSR trong nhận diện thảo dược, đặc biệt là trong những mẫu nhiều
thành phần, thì chi phí sẽ thấp hơn so với sử dụng kĩ thuật AFLP.
Do những ưu điểm của nó, ISSR còn được dùng để nhận diện nhiều loài khác
như các loài thuộc chi Cistanche bao gồm Cistanche deserticola, C. tubulosa, C.
salsa và C. sinensis [62], các loài thuộc các chi Dendrobium, Fritillaria, Salvia,
Vitex, Cannabis, Rhodiola và Houttuynia [26].
2.1.7. Kĩ thuật khuếch đại trực tiếp vùng ADN tiểu vệ tinh (DAMD)
Tiểu vệ tinh cũng là một loại ADN lặp lại song song có mặt trong bộ gen của
sinh vật nhân chuẩn. Chúng tương tự như siêu vệ tinh ngoại trừ các đơn vị lặp lại
dài hơn 10bp. Các tiểu vệ tinh cho thấy sự đa dạng chiều dài các allel. Kĩ thuật
khuếch đại trực tiếp vùng ADN tiểu vệ tinh (Directed amplification of minisatellite-
region DNA – DAMD) là kĩ thuật liên quan đến việc khuếch đại vùng giàu tiểu vệ
tinh với mức độ nghiêm ngặt khá cao nhờ sử dụng mồi đặc hiệu là trình tự trung
tâm của đoạn lặp lại song song [30], [78].
Kĩ thuật này được khai thác để nhận diện Panax ginseng và Panax
quinquefolius. Trong nghiên cứu với hai loài này, phản ứng khuếch đại được thực
hiện với mồi Pge2 là trình tự tiểu vệ tinh ở trung tâm dài 22 bp. Kết quả thu được
cho thấy bên cạnh các băng có mặt ở cả hai loài sâm thì có ba băng 990, 1490 và
1640 bp đặc trưng chỉ có mặt Panax quinquefolius nhưng không thấy ở Panax
26
ginseng. Nghiên cứu này cho thấy bằng việc sử dụng mồi tiểu vệ tinh Pge2 (Hình 9)
có thể giúp phân biệt P. ginseng và P. quinquefolius [24].
Hình 9. Trình tự của tiểu vệ tinh Pge2 [24]
Bên cạnh sử dụng để nhận biết hai loài sâm ở trên, kĩ thuật DAMD còn được
sử dụng nhằm mục đích nhận diện năm loài Salvia là Salvia tomentosa, Salvia
sclarea, Salvia virgata, Salvia fruticosa và Salvia dichroantha. Trong nghiên cứu
này, 22 mồi có trình tự giống vùng trung tâm tiểu vệ tinh được sử dụng để khuếch
đại các mẫu từ năm loài Salvia cùng với mẫu từ hai loài khác là Origanum
majorona và Sideritis pisidica. Điểm đặc biệt của phản ứng khuếch đại này là sử
dụng nhiệt độ gắn mồi cao ngay từ đầu là 600C, sau đó giảm dần nhiệt độ xuống
550C nhằm mục đích loại trừ việc thu được các sản phẩm khuếch đại không chính
xác. Sau bước giảm nhiệt độ, nhiệt độ gắn mồi được áp dụng ở 550C. Kết quả thu
được 70 marker đặc hiệu cho các loài có kích thước từ 186 – 2000 bp. Trong các
marker đặc hiệu thu được thì S. virgata có 20 marker đặc hiệu, S. tomentosa có 9
marker đặc hiệu, S. fruticosa có 13 marker đặc hiệu, S. dichroantha có 11 marker
đặc hiệu và S. sclarea có 17 marker đặc hiệu [30].
Kết quả trên cho thấy có thể sử dụng kĩ thuật DAMD để nhận diện các loài
Salvia khác nhau. So với RAPD, phương pháp này tỏ ra có độ tin cậy cao hơn do sử
dụng nhiệt độ gắn mồi cao làm tăng tính đặc hiệu của phản ứng gắn mồi.
27
2.1.8. Kĩ thuật khuếch đại vùng đặc trưng (SCAR)
Kĩ thuật khuếch đại vùng đặc trưng (Sequence characterized amplified
regions – SCAR) là một kĩ thuật mà trong đó các đoạn ADN đặc trưng cho một vị
trí xác định trên bộ gen được khuếch đại nhờ phản ứng PCR sử dụng cặp mồi đặc
hiệu [6]. Mồi SCAR là các đoạn oligonucleotid có chiều dài 15 – 30 bp được thiết
kế dựa vào các đoạn đa hình thu được sau các phản ứng RAPD-PCR [6], ISSR-PCR
[6] hoặc AFLP-PCR [45]. Để thu được mồi, các đoạn đa hình này được nhân dòng
và giải trình tự. Trình tự này được dùng để thiết kế mồi. Sự đa hình được đánh giá
bằng sự có mặt hay vắng mặt của đoạn SCAR trên băng điện di [6].
Hình 10. Nguyên tắc của kĩ thuật SCAR (sử dụng mồi SCAR đặc hiệu từ
marker RAPD) [61]
28
Kĩ thuật AFLP-SCAR đã được áp dụng để phân biệt Panax notoginseng với
các loài khác trong chi Panax là Panax ginseng, Panax japonicus, Panax
quinquefolius. Đầu tiên, phản ứng khuếch đại AFLP-PCR được thực hiện với các
loài này. Một băng AFLP rõ ràng và đặc trưng cho Panax notoginseng được tạo ra.
Sau khi tách và giải trình tự đoạn AFLP này thu được một trình tự PNG8 dài 509bp.
Dựa trên trình tự PNG8, hai mồi đặc hiệu cho Panax notoginseng là PNG8-1 và
PNG8-2 đã được thiết kế, từ đó lần lượt cho các đoạn ADN dài 402 và 260 bp.
Nghiên cứu này đã thành công trong việc xây dựng mô hình băng khuếch đại đặc
trưng của Panax notoginseng so với các loài Panax ginseng, Panax japonicus,
Panax quinquefolius. Từ đó, cho thấy việc nhận diện Panax notoginseng sử dụng
mồi SCAR đặc hiệu là hoàn toàn có thể [45].
Hình 11. Trình tự của đoạn ADN đặc trưng cho loài Panax notoginseng [45]
Tổng chiều dài của đoạn ADN (PNG8) là 509 bp. Mồi được thiết kế cho phản ứng
PCR được gạch chân và đặt tên là PNG 8-1 (-----) và PNG 8-2 (–––)
29
Bảng 1. Trình tự mồi SCAR dùng cho phản ứng khuếch đại PCR [45]
Marker SCAR Trình tự (5’ đến 3’)
PNG 8-1 Xuôi: CTCCGACAAGGGTGGCTGGAA
Ngược: GCCACTTCCAACAATGATACCAT
PNG 8-2 Xuôi: CTTAGACCAAAGCCTCAGCA
Ngược: GAGGGTGGGAGGAGGTAAA
Sau bước khuếch đại sử dụng mồi SCAR đặc hiệu, sản phẩm thu được sau đó
được điện di trên gel agarose, hiện màu bằng ethidium bromid. Sự có mặt hoặc vắng
mặt của các băng thu được được so sánh với các mẫu của các loài khác. Trong quá
trình thực hiện phản ứng khuếch đại SCAR, việc tối ưu hóa các các điều kiện là cần
thiết để đảm bảo độ tin cậy của nghiên cứu. Hai nhiệt độ 580C và 620C lần lượt
được thử nghiệm. Nhiệt độ 620C cho thấy tối ưu hơn cho nhận diện P. notoginseng
với các loài khác do cho các băng rõ nét hơn. Do đó, điều kiện tối ưu được lựa chọn
là 5 phút 950C, 32 chu kì với 30 giây tại 950C, 30 giây tại 620C và 30 giây tại 720C
và cuối cùng là giai đoạn kéo dài trong 10 phút ở 720C. So sánh với marker AFLP,
marker SCAR ổn định hơn, rõ ràng hơn và đặc biệt là thuận tiện hơn trong thực
hành. Do đó, việc chuyển từ marker AFLP sang SCAR đem lại một phương pháp
hiệu quả hơn để nhận diện các loài thảo dược khác nhau.
Các mồi SCAR cũng có thể được xây dựng từ các đoạn RAPD đa dạng.
Trường hợp Phyllanthus amarus là ví dụ. Phyllanthus amarus là một loài cây được
sử dụng rộng rãi trong y học cổ truyền tại Thái Lan do có tác dụng lợi tiểu, chữa các
bệnh về gan và các bệnh truyền nhiễm do virus. Hai loài thân thuộc của Phyllanthus
amarus là Phyllanthus debilis và Phyllanthus urinaria với tác dụng khác và ít hiệu
quả hơn thường dễ bị nhầm lẫn với Phyllanthus amarus do có kiểu hình tương tự.
Đầu tiên, khuếch đại RAPD-PCR được thực hiện để thu được các marker RAPD
30
đặc trưng cho từng loài. Từ các marker RAPD đặc trưng, các mồi SCAR đã được
xây dựng. Các mồi này khuếch đại cho các đoạn SCAR 408, 501 và 319 bp lần lượt
đặc trưng cho từng loài Phyllanthus amarus, Phyllanthus debilis và Phyllanthus
urinaria. Nghiên cứu tính hiệu lực của mồi SCAR được thực hiện với mỗi loài với
các mồi SCAR riêng. Sau đó, mồi SCAR của một loài được được dùng để kiểm tra
một hỗn hợp ADN vẫn cho băng đặc hiệu của các loài đó cho thấy việc sử dụng kĩ
thuật SCAR trong nhận diện ba loài Phyllanthus này là rất hiệu quả [68].
Trong nghiên cứu trên, có thể thấy rằng chỉ cần dựa vào kết quả nghiên cứu
RAPD là đã có thể nhận diện và phân biệt ba loài Phyllanthus với nhau. Tuy nhiên,
kĩ thuật RAPD lại có nhược điểm là độ lặp lại thấp. Việc chuyển marker RAPD
thành SCAR, do sử dụng mồi dài hơn, đặc hiệu nên độ tin cậy của phản ứng PCR
được tăng lên đáng kể. Kĩ thuật SCAR ra đời giúp khắc phục nhược điểm của
RAPD, đem lại một phương pháp tin cậy để nhận diện thảo dược.
Bên cạnh các đoạn AFLP và RAPD, các mồi SCAR còn có thể được thiết kế
từ các đoạn ISSR đa dạng. Trường hợp Sinocalycanthus chinensis là một ví dụ.
Loài cây này vừa có tác dụng làm cảnh, vừa được sử dụng từ lâu đời trong y học cổ
truyền. Tuy nhiên, S. chinensis, một số loài thuộc chi Chimonanthus và loài
Calycanthus floridus trên thị trường dễ bị nhầm lẫn do hạt của chúng có kiểu hình
tương tự nhau. Đầu tiên, kĩ thuật ISSR đã được áp dụng với S. chinensis và các loài
thuộc chi Chimonanthus và Calycanthus floridus. Kết quả thu được một băng ADN
đặc trưng 748 bp cho tất cả các mẫu Sinocalycanthus chinensis. Từ kết quả này cho
thấy, bản thân việc sử dụng kĩ thuật ISSR đã có thể nhận diện được loài
Sinocalycanthus chinensis. Tuy nhiên, do độ lặp lại của ISSR thấp nên phương pháp
SCAR đã được sử dụng để tăng độ tin cậy trong việc xác định các cây thuốc. Từ
đoạn 748bp đặc trưng thu được, mồi SCAR dài 25bp đã được thiết kế. Cùng với đó,
điều kiện nhiệt độ gắn mồi cũng được thử nghiệm từ 60 – 650C để lựa chọn ra nhiệt
độ tối ưu nhất là 650C. Với mồi dài hơn (25bp) và nhiệt độ gắn mồi cao (650C),
SCAR marker rất hiệu quả để nhận diện Sinocalycanthus chinensis [77].
31
Nhìn chung, quá trình tạo ra mồi SCAR là một quá trình phức tạp. Tuy
nhiên, khi đã có mồi SCAR đặc hiệu thì việc nhận diện thảo dược lại trở nên dễ
dàng. So với tất cả các kĩ thuật RAPD, AFLP và ISSR, SCAR tỏ ra là một kĩ thuật
ưu việt nhất, chính xác nhất. Do các ưu điểm của nó, ngoài các ví dụ nêu trên, kĩ
thuật này còn được sử dụng nhiều trong nhận diện các thảo dược khác như Bacopa
monnieri [74], Atractylodes lancea [64], Clematidis armandii và Clematidis
montana với các loài giả mạo với chúng [23] và đặc biệt kĩ thuật SCAR còn được
dùng để nhận biết hai loài giả mạo trong bột nghệ Curcuma longa là Curcuma
zedoaria và Curcuma malabarica. Việc có thể phát hiện một lượng nhỏ hai loài này
trong bột nghệ (10g/1kg bột nghệ) cho thấy hiệu lực cao của kĩ thuật SCAR [17].
2.1.9. Kĩ thuật sự đa hình hình dạng sợi đơn (SSCP)
Sự đa hình hình dạng sợi đơn (Single strand conformation polymorphism –
SSCP) là kĩ thuật dựa trên việc phân tích sự di chuyển của các trình tự ADN sợi đơn
sau khi biến tính trong quá trình điện di trên gel polyacryamid trung tính. Mục đích
của việc phân tích này nhằm thăm dò các đa dạng được tạo ra bởi sự gấp lại khác
nhau của các ADN sợi đơn do những khác biệt không dễ phát hiện trong trình tự
(thường là một cặp base duy nhất). Sự thay đổi một base làm thay đổi cấu trúc ba
chiều của các sợi ADN, dẫn đến sự di chuyển khác nhau giữa chúng [6].
Nghiên cứu SSCP tỏ ra là một công cụ mạnh trong nghiên cứu sự phức tạp
của các sản phẩm PCR. Hai sợi ADN bắt nguồn từ một sản phẩm PCR thường chạy
tách nhau trên các gel SSCP, do đó đem lại hai cơ hội để thăm dò được sự đa dạng
[6].
32
Hình 12. Nguyên tắc của kĩ thuật SSCP [6]
Kĩ thuật SSCP đã được ứng dụng để nghiên cứu loài Astragalus
membranaceus trên thị trường Đài Loan. Astragalus membranaceus là một dược
liệu được sử dụng trong dược cổ truyền. Trên thị trường, dược liệu này thường bị
thay thế bằng Hedysarum polybotrys do Hedysarum polybotrys có giá rẻ hơn
Astragalus membranaceus. Kĩ thuật SSCP được thực hiện trên các sản phẩm PCR
từ vùng ITS1 của ADN ribosom để từ đó phân biệt hai loài này. Sau khi các đoạn
ITS1 được khuếch đại, chúng được điện di trên gel agarose 2% và được đánh giá là
dài khoảng 300bp. Do các sản phẩm đều có chiều dài xác định khoảng 300bp nên
việc phân biệt các sản phẩm trên gel không thực hiện được. Các sản phẩm này sau
đó được tách ra khỏi gel và được nghiên cứu nhờ SSCP. Kết quả cho thấy một mô
33
hình dấu vân tay khác biệt có thể giúp phân biệt Astragalus membranaceus với
Hedysarum polybotrys. Trong nghiên cứu này, SSCP đã đem lại thành công trong
việc phân biệt hai loài Astragalus membranaceus và Hedysarum polybotrys [15].
Nghiên cứu này thực hiện vào năm 1999, kĩ thuật SSCP trong nghiên cứu
được đánh giá là kĩ thuật triển vọng, hứa hẹn sẽ được ứng dụng nhiều trong tương
lai. Nhưng cho đến nay, việc ứng dụng SSCP trong nhận diện thảo dược vẫn chỉ
dừng lại ở nghiên cứu này. Nguyên nhân giới hạn khả năng ứng dụng của nó có thể
là do việc phát triển marker SSCP rất tốn công sức, tốn kém và không thể tự động
hóa được.
2.1.10. Kĩ thuật khuếch đại hệ thống đột biến bền vững (ARMS) và multiplex-
ARMS (MARMS)
Kĩ thuật khuếch đại hệ thống đột biến bền vững (Amplification refractory
mutation system – ARMS) (còn gọi là kĩ thuật khuếch đại đặc trưng cho allel AS-
PCR) là một công cụ hữu ích để thăm dò bất kì đột biến nào liên quan đến sự thay
đổi một nucleotid duy nhất (SNPs) [26]. Sự đa hình đơn nucleotid (SNPs) là sự
khác nhau về một nucleotid trong trình tự gen của các cá thể trong một quần thể.
Các SNP tạo thành các marker phân tử mở rộng nhất và phân bố rộng khắp trong bộ
gen. Sự xuất hiện và phân bố của chúng là khác nhau giữa các loài [6].
Trong kĩ thuật ARMS, phản ứng khuếch đại chỉ xảy ra khi mẫu có chứa các
allel mục tiêu và không khuếch đại các allel khác. Sau phản ứng, dựa vào sự có mặt
hay không của sản phẩm PCR để đánh giá sự có mặt hay vắng mặt của allel mục
tiêu. Cách đơn giản nhất là sử dụng điện di trên gel agarose và chất nhuộm màu
ethidium bromid [26].
Kĩ thuật ARMS đã được áp dụng trong nghiên cứu các loài Citrus. Trần bì là vị
thuốc quan trọng trong y học cổ truyền, được lấy từ vỏ quả của hai loài Citrus
reticulata và Citrus unshiu. Tuy nhiên trên thị trường nó thường bị giả mạo bằng vỏ
của Citrus japonica, C. maxima và C. trifoliata. Nghiên cứu ARMS đã được thực
hiện để nhận diện Citrus reticulata và Citrus unshiu đồng thời phân biệt chúng với
các loài giả mạo. Đầu tiên vùng ITS của các loài này được khuếch đại sử dụng mồi
34
ITSPF (5′-TACCGATTGAATGGTCCG-3′) và ITSPR (5′-
ATATGCTTAAACTCAGCG GGT-3′). Giải trình tự sản phẩm PCR và đem so
sánh vùng ITS của các loài cho thấy hai SNP đặc trưng cho hai loài C. reticulata và
C. unshiu tại vị trí số 99 và 551. Tại vị trí 190 có SNP đặc trưng cho C. unshiu. Tại
vị trí 99 và 51, nucleotid là T ở C. reticulata và C. unshiu nhưng là C ở các loài
Citrus khác. Từ đó, mồi đặc hiệu được thiết kế cho C. unshiu ở vị trí 190. Vị trí 99
T được sử dụng để thiết kế mồi chung cho hai loài C. reticulata và C. unshiu vì
không có SNP nào đặc trưng cho C. reticulata. Dựa vào các SNP này, hai mồi unsF
và retF lần lượt được thiết kế cho C. unshiu và C. reticulata. Mồi citR được thiết kế
là mồi ngược cho cả hai mồi unsF và retF [70]. Có một điểm đặc biệt trong quá
trình thiết kế mồi là mồi unsF có một nulceotid G được thay thế bằng C và ở mồi
retF nucleotid C được thay thế bằng T. Mục đích của sự thay thế này là nhằm tạo là
các bắt cặp sai nhân tạo để đạt được độ đặc hiệu cần thiết.
Hình 13. Sơ đồ vùng ITS và vị trí các mồi được sử dụng [70]
Tiếp đó, phản ứng khuếch đại được thực hiện ngoài ba mồi đặc hiệu unsF,
retF và citR còn sử dụng thêm mồi thông thường ITSPF làm chứng dương cho các
loài khác. Nhiệt độ gắn mồi được sử dụng là 620C. Kết quả cho thấy tất cả các mẫu
cho băng ADN 717 bp với mồi ITSPF và citR. Tuy nhiên, chỉ C. reticulata và C.
unshiu thu được các băng ADN đặc trưng 483 bp. Đoạn ADN đặc trưng 395 bp
được khuếch đại nhờ mồi unsF và citR chỉ đạt được khi có C. unshiu (Hình 14)
[70].
35
Hình 14. Sản phẩm thu được sau phản ứng khuếch đại đặc trưng allel của năm
loài thuộc chi Citrus [70]
Hàng M: thang ADN 1 kb; hàng 1 – 3: C. reticulata; hàng 4 – 6: C. unshiu; hàng 7
– 9: C. maxima; hàng 10 – 12: C. japonica; hàng 12 – 15: C. trifoliata
Từ kết quả đạt được cho thấy C. reticulata và C. unshiu có thể dễ dàng phân
biệt với ba loài Citrus còn lại. Độ đặc hiệu allel mong muốn đã đạt được bằng cách
đưa vào một đột biến nhân tạo. Quá trình nhận diện nhanh chóng, đơn giản. Tuy
nhiên, việc nhận diện các loài cũng có giới hạn khi chỉ dừng lại ở hai loài C.
reticulata và C. unshiu. Việc nhận diện từng loài trong ba loài Citrus giả mạo là
không thể thực hiện được. Kĩ thuật MARMS – multiplex ARMS có thể khắc phục
được nhược điểm này của ARMS.
Một ví dụ của MARMS là trong nghiên cứu nhằm nhận diện các loài Panax
khác nhau. Trước MARMS, rất nhiều kĩ thuật khác như RAPD, AFLP và SCAR đã
được ứng dụng trong nhận diện các loài trong chi Panax. Tuy nhiên, nếu như các kĩ
thuật này chỉ chú trọng làm thế nào để phân biệt Panax ginseng với Panax
quinquefolius thì MARMS lại cho phép xác định đồng thời nhiều vị trí SNP khác
nhau và có thể nhận diện được 5 loài Panax khác nhau là Panax ginseng, Panax
japonicus, Panax quinquefolius, Panax notoginseng và Panax vietnamensis. Trong
nghiên cứu này, dựa vào việc so sánh các trình tự của vùng gen 18 rADN và gen
matK của lục lạp, các mồi đặc hiệu được thiết kế dựa vào các SNP. Phản ứng
khuếch đại sử dụng hai cặp mồi được thực hiện với tất cả các ADN từ các mẫu, sau
đó sản phẩm thu được được kiểm tra bằng điện di trên gel agarose. Kết quả cho thấy
36
phản ứng khuếch đại với bộ mồi của Panax ginseng thu được hai đoạn 640 bp và
249 bp chỉ với mẫu Panax ginseng. Trái lại chỉ thu được đoạn 649 bp nếu chỉ có P.
japonica và P. quinquefolius và không có băng ADN nào nếu là P. notoginseng và
P. vietnamensis. Khi sử dụng bộ mồi của P. japonicus, hai đoạn 249 bp và 649 bp
thu được với P. japonicus, trái lại một hoặc không đoạn nào thu được với các loài
còn lại. Kết quả tương tự với các trường hợp sử dụng mồi đặc hiệu với P.
quinquefolius, P. vietnamensis, P. notoginseng [82].
Hình 15. Mồi đặc hiệu được thiết kế dựa vào sự khác nhau về trình tự gen
matK giữa năm loài thuộc chi Panax [82]
37
Hình 16. Mồi đặc hiệu được thiết kế dựa vào sự khác nhau về trình tự gen 18S
rADN giữa năm loài thuộc chi Panax [82]
Nghiên cứu trình tự 18S và matK thấy P. ginseng và P. japonicus có trình tự
gen matK giống nhau, P. quinquefolius và P. vietnamensis có trình tự 18S giống
nhau. Điều này cho thấy việc chỉ sử dụng ARMS ở vùng gen 18S hay matK thì
không thể phân biệt hoàn toàn năm loài này. Trái lại, khi sử dụng MAMRS thì việc
phân biệt rõ ràng năm loài Panax là hoàn toàn có thể. Hơn nữa, sử dụng cặp mồi
tương ứng với mỗi vùng gen 18S và matK với vị trí khác nhau, tiến hóa khác nhau,
kiểu di truyền khác nhau giúp cho phản ứng khuếch đại có tính đặc hiệu cao. Do đó,
MARMS tỏ ra là một kĩ thuật có độ tin cậy cao trong nhận biệt năm loài Panax này
[82].
Qua các nghiên cứu trên sử dụng kĩ thuật ARMS và MARMS có thể thấy
rằng ARMS là một kĩ thuật rất đơn giản, đáng tin, hiệu quả. So với các kĩ thuật
khác, kĩ thuật này có nhiều ưu điểm vượt trội. Trong hai thập kỉ qua, cùng với sự
phát triển không ngừng của sinh học phân tử, rất nhiều kĩ thuật đã được sử dụng để
nhận diện thảo dược. Các kĩ thuật có độ lặp lại thấp như RAPD và ISSR dễ bị ảnh
hưởng bởi sự thoái biến của ADN do đó không thích hợp cho nghiên cứu thảo dược
ở dạng đã chế biến. Kĩ thuật SSR giới hạn trong nghiên cứu thảo dược vì kích thước
38
giữa các allel sai khác nhau rất ít nên cần nghiên cứu bằng điện di trên gel
polyacrylamid, rất tốn thời gian và công sức. Kĩ thuật ARMS ra đời cho mang lại
một công cụ hữu ích, nhanh chóng và có độ tin cậy cao để nhận diện loài thảo dược
mong muốn. Ưu điểm lớn nhất của kĩ thuật này là bước khuếch đại và bước nhận
diện được kết hợp với nhau. Sự nhận diện sự có mặt hay vắng mặt của sản phẩm
PCR cũng đồng thời là nhận diện sự có mặt hay không của các allel mục tiêu. Cùng
với đó sự thăm dò kết quả chỉ cần nghiên cứu bằng điện di trên gel, không cần
nghiên cứu trình tự của sản phẩm PCR. Điều này cho thấy ARMS là một kĩ thuật
đơn giản, đáng tin cậy, hiệu quả, tiện lợi và có tính ứng dụng cao. Đây là một kĩ
thuật có triển vọng ứng dụng trong nhận diện thảo dược.
Nhìn chung, sự ra đời của các marker dựa trên PCR đã khắc phục được
những nhược điểm khi nhận diện thảo dược dựa vào đặc điểm hình thái, đặc điểm vi
học hay các dấu vân tay hóa học. Phương pháp này ngoài mang ưu điểm chung của
các phương pháp dựa trên ADN thì còn có ưu điểm khác là sử dụng lượng mẫu nhỏ
và đa số là quá trình thực hiện rất đơn giản, dễ thao tác. Tuy nhiên phương pháp
marker dựa trên PCR cũng có nhược điểm là phản ứng khuếch đại chịu ảnh hưởng
của các yếu tố ức chế. Cùng với đó là vấn đề nhiễm nấm của dược liệu nếu bảo
quản không tốt sẽ cho các kết quả không chính xác nếu điều kiện phản ứng không
đủ nghiêm ngặt chính xác. Để khắc phục tất cả các nhược điểm trên thì việc chuẩn
hóa các điều kiện trong phản ứng khuếch đại là bước rất quan trọng để thu được
một kết quả tin cậy. Cùng với đó, mẫu ADN cũng cần đảm bảo độ tinh sạch cao. Sự
ra đời của các kĩ thuật dùng mồi đặc hiệu và có điều kiện nghiêm ngặt cao cũng đã
khắc phục được những nhược điểm của các kĩ thuật sử dụng mồi ngẫu nhiên và có
độ chính xác thấp.
2.2. Các marker thu được bằng phương pháp giải trình tự ADN
Các marker thu được bằng phương pháp giải trình tự hay còn gọi là các mã
vạch ADN là các trình tự ADN ngắn từ một vùng nhất định của bộ gen được sử
dụng để xác định loài [47]. Để thu được các mã vạch ADN này, toàn bộ ADN bộ
gen được chiết tách. Tiếp sau đó là bước khuếch đại PCR và giải trình tự ADN tại
39
vùng mang mã vạch sử dụng mồi chọn lọc. Giải trình tự ADN là sự xác định vị trí
của các base nitơ – A (adenine), G (guanine), C (cytosine) và T (thymine) có mặt
trong đoạn ADN mục tiêu [8]. Có nhiều phương pháp khác nhau để giải trình ADN
như phương pháp enzym của Sanger, phương pháp hóa học của Maxam – Gilbert và
phương pháp pyrosequencing [18].
Số lượng các vùng ADN có thể giải trình tự tăng lên nhanh chóng cùng với
sự phát hiện ngày càng nhiều các gen có thể đóng vai trò là các marker phân tử.
Vùng gen ở nhân và lục lạp được ưu tiên sử dụng. Do lục lạp có kích thước nhỏ và
các gen mục tiêu thường chỉ có một bản sao duy nhất nên việc nghiên cứu được
thực hiện dễ dàng hơn [63]. Theo mã vạch của hệ thống dữ liệu sự sống (The
Barcode of Life Data Systems) thì có đến 1 100 000 mã vạch ADN được sử dụng
cho 95 000 loài [47]. Cách đây khoảng 10 năm, theo số liệu tại GenBank thì có tới
180 000 trình tự mã vạch ADN dùng cho các loại thực vật [47]. Để chuẩn hóa việc
sử dụng các mã vạch ADN trên toàn thế giới, các nhà khoa học đã cố gắng tìm ra
các vùng ADN thích hợp để tạo mã vạch cho tất cả các loài. Sau khi đánh giá kĩ
lưỡng và đưa vào áp dụng, tiêu chuẩn của một mã vạch thích hợp được đưa ra với
các đặc điểm sau: thứ nhất, mã vạch phải có tính phổ biến giữa các loài thực vật;
thứ hai cho chất lượng trình tự cao và thứ ba là có khả năng nhận diện cao, cho phép
phân biệt được hầu hết các loài [47]. Vùng cytochrom c oxidase (CO1) ở ti thể, có
kích thước khoảng 650 bp, là một mã vạch chuẩn được sử dụng cho động vật. Tuy
nhiên, vùng này lại có sự đa hình thấp và hiệu quả nhận diện thấp ở thực vật. Cùng
với đó là sự tiến hóa nhanh về cấu trúc ti thể thực vật. Do đó, nó không được sử
dụng để làm mã vạch ở thực vật [47]. Nghiên cứu các mã vạch khác thay thế cho
thấy vùng phiên mã nội ở ADN ribosom nhân (ITS) và vùng trnH – psbA ở lục lạp
có sự sai khác lớn về trình tự ADN và có sự đa dạng giữa các loài. Bên cạnh đó,
vùng mã hóa tiểu đơn vị lớn của gen ribulose-bisphosphat carboxylase (rbcL ) và
gen maturase K (matK) cũng là các mã vạch thích hợp do phổ biến và có khả năng
nhận diện cao [47]. Do đó, rbcL, matK cùng với ITS và trnH – psbA được coi là các
mã vạch chuẩn cho nhận diện thực vật.
40
Cùng với các marker thu được từ phương pháp PCR, các mã vạch thu được
từ phương pháp giải trình tự cũng được sử dụng trong nhận diện thảo dược. Các
dược liệu giả mạo có thể có nguồn gốc từ các loài họ hàng thân thuộc của loài chính
thức được sử dụng làm thuốc hoặc từ một loài thuộc một họ khác. Do đó, dữ liệu
mã vạch ADN bao gồm các trình tự có thể phân biệt tại các cấp độ phân loại khác
nhau là cần thiết. Trong cây thuốc, có bốn mã vạch chuẩn chiếm hơn 50% số trình
tự, trong đó, vùng ITS là vùng được sử dụng thường xuyên nhất với 28%, tiếp đó là
psbA – trnH với 9%, rbcL chiếm 8% và matK chiếm 8% [47].
Ngoài các mã vạch chuẩn, một số vùng gen khác cũng được sử dụng để nhận
diện thảo dược như vùng trnL – trnF ở lục lạp và vùng nối giữa hai gen 5S của
ADN ribosom nhân [47].
2.2.1. Vùng phiên mã nội (ITS)
Vùng phiên mã nội (Internal trancribed spacer - ITS) là một vùng thuộc gen
rADN nhân. Gen rADN được tổ chức dưới dạng các đoạn lặp song song. Mỗi đơn
vị lặp lại chứa một vùng phiên mã gồm bao gồm các gen 18S, 5.8S và 26S cùng với
hai vùng ITS1 và ITS2. Các gen 18S, 5.8S và 26S rADN có độ bảo thủ cao trong
khi đó vùng ITS1 và ITS2 lại cho thấy sự biến đổi lớn, khác biệt giữa các chi, loài,
thậm chí là giữa các quần thể thuộc cùng một loài [73].
Vùng phiên mã nội (ITS) bao gồm vùng ITS1, gen 5.8S rADN và vùng ITS2,
với kích thước thay đổi từ 400 đến hơn 1000 bp [47]. Vùng ITS với tốc độ tiến hóa
nhanh và rất khác nhau giữa các loài. Cùng với đó, phản ứng khuếch đại vùng ITS
dễ dàng được thực hiện do vùng này có kích thước nhỏ và sự sẵn có của các mồi
chung (universal primers) được thiết kế từ các trình tự bảo thủ cao bên cạnh vùng
ITS. Do những đặc điểm trên, vùng ITS trở thành một marker phổ biến nhất trong
nghiên cứu thực vật [9].
41
Hình 17. Đơn vị lặp lại 18S – 26S của ADN ribosom [10]
Vùng ITS là vùng được sử dụng thường xuyên trong tạo mã vạch giúp nhận
diện thảo dược. Ví dụ như vùng ITS đã cung cấp những thông tin quý giá giúp phân
biệt các loài Dendrobium sử dụng làm thuốc và các loài giả mạo. Các thuốc này có
nguồn gốc từ rễ của các loài D. loddigesii, D. firmbriatum, D. chrysanthum, hoặc D.
nobile. Tuy nhiên, trên thị trường lại có đến 27 loài Dendrobium khác cũng được sử
dụng để giả mạo làm thuốc. Vùng ITS đã được khuếch đại, giải trình tự và đánh giá
sự đa dạng ở 18 loài Dendrobium được sử dụng làm thuốc trên thị trường. Kết quả
cho thấy sự đa hình trình tự giữa các loài Dendrobium tại vùng ITS1 là 3,2 – 37,9 %
và tại vùng ITS2 là 5,0 – 26,6 %. Hơn nữa, sự đa hình trình tự giữa các mẫu trong
cùng một loài là rất thấp và thay đổi từ 0 – 3,0% ở ITS1 và 0 – 4,0% ở vùng ITS2.
Kết quả trên cho thấy sự đa hình trình tự ở giữa các loài lớn hơn nhiều so với sự đa
hình trình tự ở bên trong một loài và mỗi loài Dendrobium đều có trình tự đặc trưng
ở vùng ITS1 và ITS2 và các loài trên có thể dễ dàng được phân biệt ở cấp độ ADN
[73].
Bên cạnh nhận diện các loài Dendrobium, vùng ITS còn được khai thác trong
nhận diện rất nhiều thảo dược khác. Vùng ITS đã giúp nhận diện hai loài sâm
Panax ginseng và Panax quinquefolius thông qua giải trình tự vùng ITS nhờ
phương pháp pyrosequencing [46]. Các peak thu được ở hai loài này là khác nhau
cho phép nhận diện hai loài này.
Ngoài ra, vùng ITS còn được áp dụng nhằm phân biệt Ruta graveolens với
loài giả mạo là Euphorbia dracunculoides. Kết quả giải trình tự vùng ITS cho thấy
42
E. dracunculoides không thể hiện bất kì sự tương đồng nào với R. graveolens [7].
Vùng ITS đem lại nhiều thông tin và có khả năng nhận diện cao loài Hedyosti dùng
làm thuốc và các loài khác trong chi Rutaceae ở sáu vị trí được nghiên cứu [34].
Vùng ITS tỏ ra đặc biệt hiệu quả trong việc phân biệt 14 loài thuộc chi Hydyotis bao
gồm cả thảo dược H. diffusa và loài giả mạo H. corymbose. Sự biến dị thấp ở trong
loài (<0,5%) và cao giữa các loài với nhau cho phép nhận diện các loài này [48].
Vùng ITS được áp dụng trong phân biệt H. diffusa với các thuốc giả mạo từ các cây
thuộc họ khác như Sagina japonica, Stellaria alsine và Arenaria serpyllifolia với
tổng cộng 103 vị trí đa hình [47].
Trong vùng ITS, vùng ITS2 có mức độ đa hình cao nên cũng được dùng làm
mã vạch trong nhận diện thảo dược. Ưu điểm của vùng này là có cấp độ đa hình cao
giữa các loài và thấp ở trong một loài nên có thể nhận diện các loài có mối quan hệ
họ hàng. Theo thống kê của Chen S., năm 2009, tỉ lệ thành công trong phân biệt
hơn 4800 loài cây từ 753 chi nhờ giải trình tự vùng ITS2 lên đến 92.7% [14].
Nghiên cứu trình tự ITS2 ở các loài thuộc họ Đậu (Fabaceae) cho thấy sự biến dị
giữa các mẫu cùng loài là 1,7% (từ 0 – 14,4%) và giữa các loài là 8,6% ( từ 0% -
68%). Trong nghiên cứu này, 22 loài ghi trong dược điển Trung Quốc cùng với 66
loài khác bao gồm các loài giả mạo với chúng đã được nhận diện thành công nhờ
các trình tự ITS2 [21].
2.2.2. Vùng trnH – psbA
Vùng trnH – psbA là một vùng không mã hóa nằm ở lục lạp. Vùng này có
kích thước khoảng 340 – 660 bp và nằm giữa gen mã hóa cho protein D1 của hệ
thống quang hóa II (photosystem II) và gen mã hóa cho ARN vận chuyển của
histidin [47]. Vùng trnH – psbA có các tiêu chuẩn cần có của một mã vạch ADN
như có chiều dài ngắn để dễ dàng khuếch đại và giải trình tự, có sự đa dạng cần
thiết để nhận diện và có vùng bảo thủ để phát triển mồi chung [32]. Vùng trnH –
psbA là một trong các trình tự biến đổi nhanh nhất trong lục lạp do tốc độ tiến hóa
nhanh. Hơn nữa, ở hai đầu của vùng này đều có vùng có tính bảo thủ cao nên có thể
43
dễ dàng khuếch đại sử dụng các mồi chung. Và một ưu điểm khác nữa là có trình tự
đủ ngắn để khuếch đại các mẫu ADN có thể đã thoái biến do quá trình xử lý và bảo
quản mẫu. Do các đặc điểm này nên vùng trnH – psbA là một vùng hữu ích trong
nhận diện các cây thuốc từ loài giả mạo với nó. Ví dụ như vùng trnH – psbA đã
được thành công trong nhận diện Illicium verum từ loài Illicium khác giả mạo cho
nó. Nghiên cứu giải trình tự vùng trnH – psbA với loài Illicium verum và loài
Illicium khác cho thấy tỉ lệ khuếch đại thành công tại vùng này là 100% và tỉ lệ
nhận diện thành công là 100% [50]. Hơn nữa, vùng trnH – psbA còn rất hiệu quả
trong phân biệt các loài Dendrobium khác nhau với sự biến dị giữa các loài là 0,3 –
2,3% và tỉ lệ biến dị trong phạm vi loài là 0 – 0,1% [76]. Hiệu quả của trnH – psbA
còn được chứng minh bằng sự nhận diện thành công thảo dược Paris polyphylla
var. chinensis và Paris polyphylla var. yunnanensis được sử dụng trong y học cổ
truyền với các loài giả mạo chế biến từ Valeriana jatamansi [75].
Mặc dù vùng trnH – psbA rất hữu ích trong nhận diện các loài thảo dược,
nhưng nó cũng không thể nhận diện Citrus chachiensis từ Citrus grandis và một vài
loài Citrus khác. Một nhược điểm của vùng trnH – psbA là không tạo ra các trình tự
ngược chiều rõ ràng. Cùng với đó, sự có mặt của cấu trúc polyA/T trong vùng này
làm giảm tỉ lệ giải trình tự thành công. Thêm nữa, sự chèn vào hoặc mất đi một
nucleotid ở vùng này thường xuyên xảy ra, do đó việc so sánh giữa các trình tự trnH
– psbA gặp nhiều khó khăn [47].
2.2.3. Maturase K (matK)
Vùng matK là một vùng mã hóa nằm tại lục lạp. MatK là một trong những
vùng tiến hóa nhanh nhất ở lục lạp cho thấy cấp độ cao trong nhận diện thực vật
[47]. Vùng matK đã được ứng dụng trong nghiên cứu họ Đậu. Từ 1079 loài thuộc
409 chi của họ này, giải trình tự matK giúp nhận diện thành công 80% ở cấp độ loài
và 96% ở cấp độ chi với tần số sai khác ở trong loài trung bình là 1,4% và giữa các
loài trung bình là 9,1%. MatK cho thấy có sự đa hình giữa các loài cao hơn đối với
các mẫu thuộc cùng một loài [20]. Do có cấp độ đa hình cao, matK còn có thể nhận
44
diện được các dược liệu từ các nguồn gốc khác nhau. Vùng matK có thể nhận diện
Fallopia multiflora từ các vùng địa lý khác nhau [47]. Hơn nữa, matK còn có thể
phân biệt được nguồn gốc của vị thuốc “Chuanxiong” ở Trung Quốc (Ligusticum
chuanxiong) và ở Nhật Bản (Cnidium officinale) [47].
Do phản ánh mức độ đa hình cao nên matK được đề nghị làm một mã vạch
chuẩn. Tuy nhiên, sử dụng matK gặp phải một vấn đề là thiếu mồi chung (universal
primer) do đó cần sử dụng nhiều mồi khác nhau để khuếch đại các mẫu từ các bậc
phân loại khác nhau. Kress và Erickson chỉ đạt được độ khuếch đại là 39,3% cho
96 loài thuộc 48 chi mặc dù sử dụng đến 10 cặp mồi [65]. Do đó, matK nên được
kết hợp với một mã vạch chuẩn khác. Sự kết hợp giữa matK và rbcL đã được đề
xuất bởi nhóm nghiên cứu thực vật CBOL nhằm tạo mã vạch trọng tâm trong nhận
diện thảo dược [12].
2.2.4. Tiểu đơn vị lớn của ribulose-biphosphat carboxylase (vùng rbcL)
Vùng rbcL là một vùng gen mã hóa nằm ở lục lạp. Vùng này cho tỉ lệ khuếch
đại thành công và chất lượng trình tự cao [47]. Tuy nhiên, sự đa dạng ở vùng này lại
thấp. Trường hợp nghiên cứu trên các loài Epimedium là một ví dụ. Trên tổng số 10
loài Epimedium được nghiên cứu thì kết quả cho thấy các đặc điểm sai khác đặc
trưng tại vùng rbcL chỉ là 4/706. Trong khi đó, các đặc điểm sai khác được xác định
ở vùng ITS là 18/678 và vùng trnH – psbA là 35/533 [32]. Bên cạnh đó, trong
nghiên cứu của Kress WJ, rbcL cũng cho thấy sự đa dạng thấp nhất (0,83%) giữa 11
mã vạch khác cùng được nghiên cứu để phân biệt hai loài khác nhau trong họ Cà
(Solanaceae) là Atropa belladonna và Nicotiana tabacum [43]. Sự đa hình thấp của
vùng rbcL là một trở ngại lớn trong nhận diện các mẫu thu được từ các loài có quan
hệ gần gũi với nhau. Tuy nhiên, khi sử dụng vùng này kết hợp với các vùng khác sẽ
cho kết quả nhận diện cao hơn. Trong nghiên cứu ở các loài Dioscorea cho thấy,
nếu chỉ sử dụng một vùng riêng lẻ thì tỉ lệ nhận diện thành công của matK là
23,26%, của rbcL là 9,30%, của trnH – psbA là 11,63% nhưng khi có sự kết hợp
của hai vùng thì hiệu quả nhận diện tăng lên rõ rệt. Nếu kết hợp matK+rbcL thì tỉ lệ
45
nhận diện thành công tăng lên 46,51% còn nếu kết hợp rbcL+trnH- psbA thì tỉ lệ đạt
được là 37,21% [65]. Như vậy việc kết hợp giữa vùng rbcL với vùng trnH – psbA
hay matK sẽ cho hiệu quả nhận diện cao nhất giữa các loài và đem lại một công cụ
quan trọng để nhận diện thảo dược.
2.2.5. Các trình tự ADN khác dùng trong nhận diện thảo dược
Bên cạnh các mã vạch chuẩn, có nhiều trình tự ADN khác cũng có thể được
sử dụng trong nhận diện thảo dược.
Các vùng atpF – atpH và psbK – psbI là hai vùng không mã hóa nằm ở lục
lạp, đã được đề xuất là các mã vạch để nhận diện thực vật. Hai marker này không
được sử dụng rộng rãi trong nghiên cứu hệ thống và nguồn gốc phát sinh loài nên có
rất ít dữ liệu về chúng. Trong nghiên cứu của nhóm CBOL, psbK – psbI cho hiệu
quả nhận diện cao nhưng có nhược điểm là không phổ biến và chất lượng trình tự
đạt được thấp. Trái lại, vùng atpF – atpH cho hiệu quả nhận diện tương tự nhưng
phổ biến hơn và chất lượng trình tự đạt được ở mức trung bình. Một vài nghiên cứu
đã được thực hiện với hai vùng này và cho thấy khả năng áp dụng trong nghiên cứu
hệ thực vật ở Hàn Quốc [27].
Vùng intron trnL và vùng trnL – trnF đã được sử dụng rất lâu để nghiên cứu
nguồn gốc phát sinh loài ở thực vật. Việc giải trình tự cả hai vùng này đều được
thực hiện dễ dàng. Một trong các ưu điểm khi sử dụng intron trnL là vùng ở giữa
intron có thể được sử dụng làm vị trí gắn mồi và vị trí này tiếp giáp ngay với một vị
trí có sự đa dạng cao [27]. Sử dụng intron trong nhận diện 40 mẫu bao gồm tám loài
Lonicera và một thứ (var) cho thấy tỉ lệ nhận diện thành công là 50% [66]. Vùng
trnL – trnF có chiều dài hợp lý, tỉ lệ khuếch đại thành công cao, tuy nhiên sự đa
dạng trong trình tự lại kém vùng trnH – psbA tới 3 lần [12]. Trong các nghiên cứu
trên cây thuốc, vùng trnL – trnF đã thành công trong nhận diện Cardiocrinum
giganteum với loài họ hàng thân thuộc là C. cordatum. Mức độ nhận diện của vùng
này chỉ ở mức vừa phải trong một số trường hợp. Trường hợp nhận diện vị thuốc
“Cangzu” có nguồn gốc từ Atractylodes chinensis và A. lancea với các loài
46
Atractylodes là một ví dụ. Nó có thể phân biệt A. chinensis với A. koreana và A.
macrocephala nhưng không thể phân biệt A. lanceae từ A. japonica [47].
Ngoài các vùng trên, vùng nối giữa hai gen 5S ở ADN ribosom nhân cũng là
một trong những vùng được sử dụng trong nhận diện thảo dược. Đây là một trong
những vùng thường xuyên được sử dụng (chiếm 5%) do có sự biến đổi lớn, đồng
thời hiệu quả nhận diện cao [47]. Vùng này đã được sử dụng trong nghiên cứu
Swertia mussotii và các loài Swertia giả mạo, cho thấy sự đa dạng giữa các loài thay
đổi từ 31% đến 65% [47]. Vùng nối giữa hai gen 5S cũng đã được sử dụng nhận
diện loài Epimedium có tác dụng chữa bệnh [47]. Mặc dù có sự đa dạng lớn và hiệu
quả nhận diện cao, nhưng sử dụng vùng này trong nhận diện thảo dược sẽ phải đối
mặt với một số vấn đề như có quá nhiều bản sao cùng với đó là sự biến đổi nhiều về
trình tự giữa các loài và trong một loài sẽ làm cho việc so sánh trở nên khó khăn.
Do đó, vùng nối giữa hai gen 5S không được sử dụng như là một mã vạch chuẩn
[47].
Tóm lại, bên cạnh các marker thu được bằng khuếch đại PCR, các marker
dựa trên phương pháp giải trình tự ADN cũng được sử dụng để nhận diện thảo
dược. Đây là một công cụ có độ chính xác cao, tin cậy và hiệu quả. Với một thảo
dược, có rất nhiều phương pháp được nghiên cứu với mục đích nhận diện. Ví dụ
như loài Ruta graveolens với loài giả mạo là Euphorbia dracunculoides trước đây
đã được phân biệt bằng RAPD thì nay cũng có thể phân biệt nhờ so sánh trình tự
vùng ITS. Các loài Panax đã được nhận diện bằng marker RAPD, AFLP, SCAR,
MARMS… thì nay lại có thể nhận biết nhờ giải trình tự vùng ITS. Các loài
Dendrobium, bên cạnh nhận diện bằng ARMS còn có thể nhận diện nhờ trnH –
psbA… Nhìn chung so với phương pháp marker dựa trên phản ứng khuếch đại PCR,
phương pháp dựa vào giải trình tự có ưu điểm hơn là cho phép nghiên cứu trên số
lượng lớn các mẫu, đồng thời lượng thông tin thu được cũng nhiều hơn. So với một
số phương pháp như RAPD, ISSR hay DALP thì kết quả thu được của phương pháp
dựa trên giải trình tự ADN là chính xác hơn. Tuy nhiên, sử dụng các marker dựa
47
trên giải trình cũng tồn tại nhược điểm là quá trình nghiên cứu khá phức tạp và đòi
hỏi những kiến thức trước về trình tự cần nghiên cứu để thiết kế mồi cho trình tự
này.
2.3. Phương pháp ADN micrroarray
Microarray là một phương pháp dựa trên sự lai phân tử [2]. Nguyên tắc của
lai phân tử là một quá trình trong đó hai sợi ADN ở dạng sợi đơn có trình tự
nucleotid bổ sung cho nhau sẽ bắt cặp với nhau tạo thành ADN mạch kép thông qua
cầu nối là các liên kết hydro [78]. Trong microarray, các mẫu dò được cố định trên
giá thể rắn còn các trình tự mục tiêu được đánh dấu phục vụ cho quá trình lai [2].
Trong phương pháp ADN microarray, hai kĩ thuật thường được sử dụng trong
nhận diện thảo dược là kĩ thuật microarray sử dụng mẫu dò là các oligonucleotid và
kĩ thuật microarray sử dụng mẫu dò là gen. Hai kĩ thuật này đều phụ thuộc vào
thông tin có sẵn về trình tự của loài nghiên cứu. Các trình tự trong bộ gen của các
loài được đem ra so sánh để từ đó xác định các trình tự đặc trưng cho một loài cụ
thể. Hàng trăm hoặc hàng nghìn trình tự đặc trưng được gắn lên một microarray duy
nhất để nhận diện thảo dược trong một hỗn hợp phức tạp nhiều thành phần [53].
2.3.1. Kĩ thuật microarray sử dụng mẫu dò là các oligonucleotid
Trong kĩ thuật microarray sử dụng mẫu dò oligonucleotid, các mẫu dò đặc
trưng cho loài có chiều dài từ 25 – 60 nucleotid được gắn lên một giá thể rắn. Mẫu
dò có thể có nguồn gốc từ vùng mã hóa hoặc vùng không mã hóa. Mỗi microarray
được gắn mẫu dò từ hàng trăm loài khác nhau. Các mẫu ADN được chiết tách từ
loài mục tiêu, với trình tự tương ứng với mẫu dò được khuếch đại, được đánh dấu
huỳnh quang và lai trên array oligonucleotid dưới điều kiện thực hiện chính xác,
nghiêm ngặt [53].
48
Hình 18. Nguyên tắc của kĩ thuật microarray với mẫu dò là oligonucleotid hoặc
gen để nhận diện thảo dược [53]
Kĩ thuật microarray sử dụng mẫu dò là các oligonucleotid đã thành công
trong nhận diện tám loài Panax khác nhau dựa vào gen 18S rADN. Quá trình
nghiên cứu đã thu được các tín hiệu đặc trưng tại mỗi điểm từ đó giúp xác định
được tám loài này. Trong quá trình nghiên cứu có một vài điểm chú ý là quá trình
lai được thử nghiệm ở 4 mức nhiệt độ là 55, 60, 65 và 680C với các đoạn ADN đặc
trưng của tám loài sâm này. Kết quả cho thấy mức độ nghiêm ngặt càng cao thì
phản ứng lai càng đặc hiệu. Nhiệt độ 680C được lựa chọn vì cho phép quan sát mô
hình các điểm huỳnh quang đặc trưng cho mỗi loài. Trong kĩ thuật microarray thì
việc phải có các mẫu dò chứng âm và chứng dương là cần thiết. Trong nghiên cứu
trên, các mẫu dò chứng âm và chứng dương đều được sử dụng nhằm kiểm soát sai
49
số, đảm bảo độ tin cậy của kết quả. Mẫu dò chứng dương được sử dụng trong
nghiên cứu trên là mẫu dò có chiều dài 27 bp bổ sung với vị trí từ 227 – 253 theo
đầu từ 5’ – 3’ với trình tự gen 18 rADN, là vùng có sự khác biệt lớn giữa các loài và
có sự tương đồng cao ở trong một loài sâm. Các mẫu dò chứng dương được sắp xếp
theo sơ đồ nhất định trên mỗi array. Các mẫu dò chứng âm dài 25 bp với trình tự
nucleotid được lựa chọn ngẫu nhiên mà đã được xác nhận là không tương đồng với
trình tự mục tiêu [83].
Ngoài sử dụng để nhận diện các loài sâm, kĩ thuật này cho thấy hiệu quả
trong nhận diện nhiều loài thảo dược có độc tính cao như Aconitum carmichaeli, A.
kusnezoffi, Alocasia macrorrhiza, Croton tiglium, Datura inoxia, Datura metel,
Datura tatula, Dysosma pleiantha, Dysosma versipellis, Euphorbia kansui,
Hyoscyamus niger, Pinellia cordata, Pinellia pedatisecta, Pinellia ternata,
Rhododendron molle, Strychnox nux-vomica, Typhonium divaricatum, Typhonium
giganteum bằng sử dụng các mẫu dò là các oligonucleotid dựa vào trình tự của gen
5S rADN [11]. Cùng với đó, kĩ thuật này đã được áp dụng để phân biệt loài
Dendrobium officinale với 7 loài Dendrobium khác dựa vào trình tự tại vùng nối
giữa hai gen 5S [67].
2.3.2. Kĩ thuật microarray sử dụng mẫu dò là gen
Kĩ thuật microarray sử dụng mẫu dò là gen về cơ bản là giống với kĩ thuật
microarray oligonucleotid ngoại trừ việc sử dụng các mẫu dò là các trình tự đặc
trưng từ các vùng mã hóa. Mẫu dò có kích thước mở rộng toàn bộ gen, nằm trong
khoảng 0.5 – 1.5 kb. Các bước chiết tách ADN, quá trình lai và thăm dò tương tự
như kĩ thuật trên. Tuy nhiên, so với kĩ thuật microarray, các đoạn gen đặc trưng
được sử dụng làm mẫu dò thay vì vài oligonucleotid từ một trình tự gen [53]. Một
nghiên cứu sử dụng kĩ thuật này đã được thực hiện với 5 loài Dendrobium là
Dendrobium oficinale, D. loddigesii, D. fimbriatum, D. chrysanthum, D. nobile.
Mẫu dò để nhận các loài Dendrobium được xây dựng dựa trên trình tự ITS. Trình tự
ITS được gắn lên giá thể, trong đó các trình tự ITS2 được đánh dấu huỳnh quang
50
cho các tín hiệu đặc trưng của mỗi loài. Từ kết quả thu được cho thấy phương pháp
đủ nhạy để thăm dò sự có mặt của Dendrobium nobile trong một hỗn hợp thảo dược
chứa chín thành phần khác nhau [79]. So với kĩ thuật microarray sử dụng mẫu dò
oligonucleotid, kĩ thuật này đặc hiệu hơn do sử dụng trình tự mẫu dò dài hơn. Tuy
nhiên, nhược điểm chung của cả hai phương pháp này là không thích hợp trong
nghiên cứu các loài khi chưa có đủ thông tin về bộ gen do những thông tin về bộ
gen là cần thiết để thiết kế mẫu dò oligonucleotid hoặc thiết kế mồi.
Như vậy, bên cạnh các phương pháp marker dựa vào PCR và marker dựa vào giải
trình tự, các marker thu được dựa vào phương pháp microarray cũng được sử dụng
với mục đích nhận diện thảo dược. Phương pháp microarray đem lại một công cụ
hiệu quả trong nhận diện thảo dược. Nếu như phương pháp marker dựa vào khuếch
đại PCR có nhược điểm là việc thăm dò đa dạng được thực hiện trên gel do đó rất
tốn thời gian công sức và làm giới hạn số mẫu được thăm dò thì phương pháp
microarray lại tỏ ra có ưu điểm vượt trội vì cho phép một số lượng lớn các mẫu dò
ADN lai với các đoạn ADN mục tiêu, do đó chúng rất chính xác và giúp tiết kiệm
được công sức. Kĩ thuật microarray cho phép thăm dò nhiều loài khác nhau. Việc
thăm dò sự có mặt của một thành phần trong một hỗn hợp các thành phần hay các
sản phẩm đã qua chế biến, xử lý bằng nhiệt cũng đã được thực hiện. Tuy nhiên
phương pháp này cũng có nhược điểm là cần một số lượng mẫu lớn và quá trình
thực hiện tốn thời gian do quá trình lai kéo dài thường đòi hỏi là ủ qua đêm. Trong
khi đó, các phương pháp khác lại tỏ ra là tiết kiệm thời gian hơn ví dụ như trong
trường hợp nhận diện Panax giseng và Panax quinquefolius là một ví dụ. Phân biệt
Panax ginseng và Panax quinquefolius dựa vào giải trình tự vùng ITS sử dụng
phương pháp pyrosequencing cho phép việc nghiên cứu đồng thời các mẫu chỉ
trong vòng 15 phút [46]. Một nhược điểm nữa của các phương pháp microarray là
nếu điều kiện không được thực hiện nghiêm ngặt thì sự lai chéo giữa các trình tự
tương tự nhau sẽ xảy ra dẫn đến những dương tính giả.
51
Chương 3. Bàn luận
3.1. Đánh giá về các phương pháp nhận diện thảo dược sử dụng công cụ sinh
học phân tử
Nhận diện thảo dược đóng vai trò rất quan trọng trong việc đảm bảo hiệu quả
điều trị, an toàn cho người sử dụng, giảm sự thiếu công bằng trong thương mại và
đem lại lòng tin cho người tiêu dùng. Đồng thời, nhận diện chính xác thảo dược
cũng góp phần trong việc chuẩn hóa và công nghiệp hóa các thuốc có nguồn gốc
thảo dược. Cùng với sự phát triển không ngừng của khoa học hiện đại, các kĩ thuật
sinh học phân tử ngày càng được ứng dụng rộng rãi trong nhiều lĩnh vực. Các kĩ
thuật này bước đầu đã được ứng dụng có hiệu quả để nhận diện thảo dược. Sử dụng
sinh học phân tử trong nhận diện thảo dược có thể khắc phục được một số các
nhược điểm của các phương pháp nhận diện hiện có như phương pháp nhận diện
dựa vào hình thái, phương pháp vi học và phương pháp phân tích thành phần hóa
học. Nhận diện thảo dược sử dụng công cụ sinh học phân tử có thể thực hiện với
nhiều dạng khác nhau của của thảo dược từ mẫu tươi, mẫu khô đến mẫu đã sơ chế
và kết quả không chịu ảnh hưởng bởi giai đoạn phát triển của thực vật, điều kiện
môi trường, điều kiện thu hái... Do đó, phương pháp nhận diện dựa trên chỉ thị
ADN là một công cụ tiên tiến, hiệu quả cho mục đích nhận diện thảo dược.
Tuy nhiên không có một phương pháp nào là hoàn hảo tuyệt đối. Bên cạnh
những ưu điểm vượt trội, việc sử dụng phương pháp nhận diện thảo dược dựa trên
ADN cũng phải đối mặt với một số khó khăn, thách thức.
Vấn đề đầu tiên là sự thoái biến của ADN. Ở thảo dược, sự thoái biến của
ADN thường xuyên xảy do chúng thường được xử lý bằng nhiệt (phơi hoặc sấy
khô), xay, nghiền hoặc được xử lý với nhiều chất hóa học khác nhau [78]. Vấn đề
này có thể được giải quyết nhờ việc lựa chọn các kĩ thuật có thể áp dụng các ADN
thoái biến. Một số kĩ thuật trong đó sử dụng các gen có nhiều bản sao (như gen
ribosom), từ đó, cơ hội để thu được trình tự của toàn bộ gen là cao hơn. Một giải
52
pháp khác là sử dụng các kĩ thuật trong đó việc khuếch đại được thực hiện tại các
vùng ADN có kích thước nhỏ, ví dụ như kĩ thuật nghiên cứu SSR với các trình tự
mục tiêu thường có chiều dài khoảng vài chục bp do đó nguy cơ xảy ra đứt gãy ở
bên trong đoạn trình tự mục tiêu này sẽ thấp hơn. Sử dụng kĩ thuật lai ADN
microarray cũng rất hữu ích trong việc nhận diện các ADN đã bị thoái biến [78]. Ví
dụ như kĩ thuật ADN microarray đã được áp dụng với hai loài Panax ginseng và
Panax quinquefolius ở dạng rễ đã chế biến và đã thành công trong việc nhận diện
hai loài này [54].
Sự có mặt của các chất ức chế chuỗi phản ứng PCR cũng là một vấn đề cần
quan tâm [78]. Thảo dược thường chứa các hợp chất phenolic, các polysaccharid và
các sắc tố. Các chất này có thể đóng vai trò là những yếu tố ức chế phản ứng PCR.
Lựa chọn một phương pháp chiết tách thích hợp có thể loại trừ được các yếu tố ảnh
hưởng đến nói trên. Một giải pháp nữa là pha loãng ADN mẫu và thêm vào đó chất
làm tăng cường phản ứng PCR [78]. Ví dụ như trong quá trình nghiên cứu ba loài
Tribulus terrestris, Tribulus lanuginosus và Tribulus subramanyamii, sau khi thử
nhiều quy trình hướng dẫn chiết tách ADN khác nhau, phương pháp chiết tách ADN
được mô tả bởi Milligan với một số cải tiến đã được lựa chọn. Dung dịch chiết tách
được bổ sung LiCl có tách dụng loại bỏ các hợp chất polyphenol và polysaccharid.
Hỗn hợp chloroform và isoamyl alcol được sử dụng để loại tạp, chủ yếu là protein
do protein biến tính chuyển vào trong pha dầu còn ADN nằm ở pha nước. RNase
cũng được sử dụng để loại bỏ ARN lẫn với ADN. Sử dụng phương pháp này thu
được ADN có chất lượng tốt, tỉ lệ A260/A280 đạt 1,6 – 1,8 [9].
Vấn đề ngoại nhiễm bởi các ADN không thuộc loài mục tiêu cũng cần được
xem xét [78]. Các ADN này có thể bắt nguồn từ nấm, vi khuẩn hoặc các côn trùng
nhiễm vào trong thảo dược do quá trình bảo quản không đúng hoặc do các ADN từ
các thực vật khác bị lẫn trong công thức phối hợp. Các ADN này sẽ được khuếch
đại cùng với các ADN mục tiêu gây ảnh hưởng đến kết quả thu được. Vấn đề này có
thể được giải quyết bằng một quy trình xử lý mẫu, dụng cụ thao tác nghiêm ngặt
53
hoặc sử dụng các kĩ thuật đặc trưng cho các ADN mục tiêu như kĩ thuật ARMS
hoặc SCAR [78]. Ví dụ như trong nghiên cứu ở ba loài Phyllanthus amarus,
Phyllanthus urinaria và Phyllanthus debilis sử dụng kĩ thuật SCAR. Trong một hỗn
hợp đồng lượng của ba loài trên, mồi SCAR đặc hiệu được thiết kế cho loài
Phyllanthus amarus chỉ khuếch đại các băng đặc trưng cho loài này mà không tạo ra
băng ADN với các ADN nhiễu từ hai loài còn lại. Trường hợp tương tự khi sử dụng
mồi đặc hiệu cho loài P. urinaria hoặc P. debilis. Mồi này chỉ khuếch đại ADN từ
loài mục tiêu và không khuếch đại đoạn ADN ngoại nhiễm [68]. Bên cạnh sử dụng
hai kĩ thuật SCAR và ARMS, nếu vùng nghiên cứu đặc trưng cho loài và quy trình
xử lý và bảo quản mẫu nghiêm ngặt thì có thể sử dụng nghiên cứu microarray để
nghiên cứu hỗn hợp ADN [78].
Mặc dù còn tồn tại những điểm hạn chế, các công cụ sinh học phân tử vẫn là
một phương pháp hiệu quả trong nhận diện thảo dược và những điểm hạn chế còn
tồn tại hoàn toàn có thể khắc phục được. Hiện nay đã có nhiều loại vân tay hoặc mã
vạch đã được áp dụng rộng rãi trên toàn thế giới như dấu vân tay SCAR, ISSR hay
mã vạch ITS.
Trong sinh học phân tử, có rất nhiều kĩ thuật có thể được sử dụng để nhận
diện thảo dược. Căn cứ để nhận diện thảo dược là các marker ADN có thể thu được
nhờ các phương pháp khuếch đại PCR với nhiều loại mồi khác nhau, phương pháp
giải trình tự ADN và phương pháp ADN microarray. Trong mỗi phương pháp này
lại có rất nhiều kĩ thuật khác nhau. Một khó khăn cho những nhà nghiên cứu là việc
phải lựa chọn một hoặc một số marker phù hợp cho các nghiên cứu của mình. Một
marker phù hợp là một marker có sự đa hình cao, xuất hiện trong bộ gen với tần
suất lớn, quy trình thực nghiệm đơn giản, nhanh, chi phí thấp, hiệu suất cao, độ tin
cậy cao và có khả năng trao đổi dữ liệu giữa các phòng thí nghiệm. Tuy nhiên,
không một kĩ thuật nào có thể đạt được tất cả các tiêu chuẩn này. Do đó, việc lựa
chọn marker cho một nghiên cứu phải xem xét đến các yếu tố sau:
- Sự sẵn có của hệ thống marker.
54
- Mức độ đơn giản của kĩ thuật và thời gian cần để thực hiện.
- Khả năng phản ánh mức độ đa hình của marker.
- Chất lượng và số lượng mẫu ADN hiện có.
- Khả năng trao đổi dữ liệu giữa các phòng thí nghiệm.
- Kích thước, số lượng mẫu nghiên cứu.
- Thiết bị và các kĩ năng cần thiết.
- Chi phí thực hiện.
Bảng sau đây sẽ cho thấy một vài so sánh giữa các kĩ thuật làm căn cứ để lựa chọn.
55
Bảng 2. So sánh một số kĩ thuật khác nhau sử dụng công cụ sinh học phân tử để nhận diện thảo dược [78]
Các đặc điểm SCAR ARMS SSR CAPS RP-PCR ISSR AFLP Giải
trình Lai
Chi phí phát triển Trung
bình
Trung
bình Cao
Trung
bình Thấp Thấp Thấp
Trung
bình
Trung
bình
Chi phí vận hành Thấp Thấp Trung bình Trung
bình Thấp Thấp
Trung
bình
Trung
bình
Trung
bình
Số vị trí khuếch đại Một vị trí Một vị trí Một vị trí Một vị trí Nhiều vị
trí
Nhiều vị
trí
Nhiều vị
trí Một vị trí Một vị trí
Yêu cầu về tính nguyên vẹn của
ADN mẫu
Trung
bình
Trung
bình Thấp
Trung
bình Cao Cao Cao
Trung
bình
Trung
bình
Yêu cầu về độ tinh sạch của
ADN mẫu Cao Cao Trung bình Cao Cao Cao Cao Cao Cao
Kiến thức cần biết trước về bộ
gen Có Có Có Không Không Không Không Có Có
Hiệu suất Thấp Thấp Cao Thấp Cao Cao Cao Thấp Cao
Kĩ năng yêu cầu Thấp Thấp Trung bình-
thấp Thấp Thấp Thấp
Trung
bình
Trung
bình
Trung
bình
Khả năng tự động hóa Có Có Có Khó Có Có Có Có Khó
Độ tin cậy Cao Cao Cao Cao Thấp Trung
bình Cao Cao
Trung
bình
56
Mỗi phương pháp có ưu điểm và nhược điểm riêng nên tùy vào mục đích và
điều kiện sẵn có để lựa chọn một phương pháp thích hợp nhất. Từ góc độ mục đích
của nghiên cứu, nếu muốn thực hiện nghiên cứu trên số lượng mẫu lớn thì nên sử
dụng các phương pháp cho phép nghiên cứu với số lượng mẫu lớn như phương
pháp giải trình tự ADN và phương pháp ADN microarray. Phương pháp ADN
microarray thích hợp cho nhận diện loài trong hỗn hợp các loài nghi ngờ. Phương
pháp giải trình tự ADN thích hợp cho việc xác định các mẫu chưa biết rõ loài. Với
số lượng mẫu nhỏ có thể sử dụng các marker thu được dựa vào phản ứng khuếch đại
PCR. Với các marker này, căn cứ vào độ tin cậy mong muốn đạt được có thể lựa
chọn phương pháp. Kĩ thuật nhận diện chính xác được đề xuất là kĩ thuật SCAR
hoặc ARMS. Kĩ thuật có độ lặp lại giữa các lần thí nghiệm thấp, độ tin cậy thấp như
kĩ thuật sự đa hình các đoạn ADN được khuếch đại ngẫu nhiên (RAPD) chỉ thích
hợp trong việc phân nhóm các thảo dược hoặc để phân biệt các mẫu với nhau vì với
cùng một mẫu mỗi lần thử nghiệm chạy PCR sẽ có thể cho một mô hình băng ADN
khác nhau.
3.2. Đánh giá thực tế việc nhận diện thảo dược ở Việt Nam
Theo nghiên cứu về thực trạng sử dụng thảo dược ở Việt Nam cho thấy thảo
dược hoang dại hoặc sản xuất trong nước cũng như các thảo dược nhập khẩu từ
nước ngoài đang lưu hành trong nước không được kiểm soát về chất lượng và độ
an toàn [1]. Thảo dược trong nước chủ yếu được thu hái từ nguồn cây mọc hoang,
lấy số lượng làm mục tiêu chính. Tình trạng thu hái không đúng mùa vụ, sơ chế,
bảo quản không theo quy trình nghiêm ngặt dẫn đến những sự nhầm lẫn thường
xuyên xảy ra. Những nguyên nhân chính dẫn đến nhầm lẫn là:
- Do hình dạng của các thảo dược rất giống nhau.
- Do chế biến làm thay đổi hình dạng thảo dược.
- Do sự thay thế tùy tiện các thảo dược.
- Do trùng tên gọi.
- Do chưa xác định được tên khoa học của thảo dược.
57
- Do cố ý giả mạo.
Trong các lý do trên, việc nhầm lẫn do sự giống nhau của các thảo dược hoặc
do trùng tên gọi là nguyên nhân quan trọng có thể gây nguy hiểm đến tính mạng của
người bệnh và đã có trường hợp tử vong [1]. Cùng với đó, sự cố ý giả mạo có xu
hướng ngày càng gia tăng bởi sự giao lưu buôn bán chưa được kiểm soát chặt chẽ.
Trên thị trường, thảo dược được mua bán theo cảm quan, nhu cầu và chưa được sự
quản lý chặt chẽ từ phía các cơ quan nhà nước. Theo thống kê từ năm 1980 đã phát
hiện 70 cây thuốc và vị thuốc có cùng tên gọi với các cây thuốc và vị thuốc khác; có
khoảng 50 dược liệu dễ bị nhầm lẫn và nhiều dược liệu bị giả mạo do người sản
xuất, buôn bán cố ý. Trên thị trường Việt Nam đã phát hiện có sự giả mạo tam thất
bằng nga truật, hoài sơn bằng củ cọc, địa cốt bì bằng hương gia bì [1]. Những bất
cập này cho thấy việc nhận diện thảo dược tại Việt Nam đang là một nhu cầu cấp
thiết để đảm bảo hiệu quả điều trị và nhằm ngăn chặn những hậu quả đáng tiếc cho
người sử dụng.
Cho đến nay, tại Việt Nam đã có các phương pháp để nhận diện thảo dược
chủ yếu còn ở mức độ đơn giản. Các tiêu chuẩn để nhận diện một thảo dược
thường là dựa vào phương pháp hình thái, phương pháp vi học và phương pháp
phân tích hóa học được lựa chọn là sắc kí lớp mỏng. Những phương pháp này cho
thấy độ chính xác không cao, tuy nhiên do đơn giản, dễ thực hiện nên được sử
dụng khá phổ biến. Trái lại, việc áp dụng các kĩ thuật tiên tiến và có độ chính xác
cao hơn như các kĩ thuật sinh học phân tử trong nhận diện thảo dược còn khá mới
mẻ. Ở Việt Nam, có rất ít nghiên cứu trên thảo dược áp dụng các phương pháp này.
Qua khảo sát thực tế tại Viện Dược liệu, các nhà khoa học mới áp dụng kĩ thuật
RAPD để nghiên cứu phân biệt sâm Việt Nam (Panax vietnamensis) với sâm vũ
diệp (Panax bipinnatifidus) và tam thất hoang (Panax stipuleanatus) [3], nghiên
cứu phân biệt ngũ gia bì hương (Acanthopanax gracilistylus) với ngũ gia bì gai
(Acanthopanax trifoliatus) [4]. Kết quả thu được từ các nghiên cứu cho thấy sử
dụng RAPD có thể phân biệt được các loài này. Tuy nhiên RAPD không phải là
58
một kĩ thuật được đề xuất cho việc nhận diện thảo dược do có độ tin cậy thấp. Bộ
môn Thực vật – trường Đại học Dược Hà Nội mới bắt đầu quá trình triển khai áp
dụng các kĩ thuật sinh học phân tử trong nghiên cứu thảo dược. Một báo cáo hiếm
hoi sử dụng kĩ thuật sinh học phân tử trong nhận diện thảo dược là của Nguyễn
Thanh Thuận và cộng sự tại Đại học Y Dược Tp.HCM trong đó kĩ thuật RFLP-
PCR sử dụng mồi là trình tự vùng ITS và 18S được áp dụng để nhận diện các loài
sâm khác nhau [5]. Trong nông nghiệp, việc áp dụng công cụ sinh học phân tử
được chú nhiều ý hơn. Tuy nhiên, mặc dù các công cụ sinh học phân tử, di truyền
học đã được áp dụng rộng rãi trong một thời gian dài trong lĩnh vực nông nghiệp
nhưng chủ yếu chỉ giới hạn trong nghiên cứu các loại cây lương thực trọng điểm.
Như vậy, việc sử dụng các kĩ thuật sinh học phân tử trong nghiên cứu cây thuốc và
vị thuốc nói chung và trong việc nhận diện thảo dược nói riêng vẫn đang là một
hướng đi khá mới mẻ tại Việt Nam. Cơ sở vật chất và nguồn nhân lực ở nước ta có
thể đáp ứng một phần đáng kể cho việc triển khai các nghiên cứu và ứng dụng
công cụ sinh học phân tử trong nhận diện thảo dược. Tuy nhiên, điều quan trọng là
các nhà quản lý, các nhà khoa học và nhà sản xuất cần có nhận thức đầy đủ về ý
nghĩa của việc nhận diện thảo dược và những lợi thế của công cụ sinh học phân tử
để quan tâm đẩy mạnh hơn nữa sự phát triển của lĩnh vực này. Trước mắt, để phù
hợp với điều kiện thực tế của Việt Nam, có thể lựa chọn triển khai một số kĩ thuật
đơn giản, độ tin cậy tương đối cao như kĩ thuật giải trình tự ADN một số vùng
chọn lọc, kĩ thuật ISSR hoặc SSR…
59
KẾT LUẬN
Đề tài hoàn thành đã đạt được các mục tiêu sau:
- Đã tìm hiểu những nguyên tắc cơ bản của các kĩ thuật sinh học phân tử được
ứng dụng trong nhận diện thảo dược. Có ba phương pháp được sử dụng là
phương pháp marker dựa trên phản ứng khuếch đại PCR, phương pháp giải trình
tự ADN và phương pháp ADN microarray. Từ mỗi phương pháp, có nhiều kĩ
thuật khác nhau được xây dựng và triển khai.
- Đã đưa ra những đánh giá bước đầu về ưu nhược điểm và khả năng áp dụng của
mỗi kĩ thuật. Mỗi kĩ thuật đều có ưu nhược điểm riêng nên cần xem xét đầy đủ
các yếu tố liên quan để chọn được kĩ thuật phù hợp nhất.
ĐỀ XUẤT
Đẩy mạnh triển khai các nghiên cứu áp dụng công cụ sinh học phân tử trong
nhận diện thảo dược như một biện pháp hướng đến tiêu chuẩn hóa dược liệu tại Việt
Nam nhằm đạt mục tiêu sử dụng thuốc an toàn, hợp lý và hiệu quả.
TÀI LIỆU THAM KHẢO
Tiếng Việt
1. Bùi Thị Bằng (2003), “Thực trạng chất lượng và an toàn dược liệu lưu hành trên
thị trường”, Tài liệu hội nghị Dược liệu toàn quốc lần thứ nhất “Phát triển dược
liệu bền vững trong thế kỉ mới”, tr.174-175.
2. Hồ Huỳnh Thùy Dương (2008), Sinh học phân tử, NXB Giáo dục, Hồ Chí Minh.
3. Phạm Thanh Huyền, Nguyễn Tập, Lê Thanh Sơn, Ngô Đức Phương, Đinh Đoàn
Long (2009), “Sử dụng chỉ thị RAPD-PCR trong nghiên cứu đa hình di truyền
góp phần phân biệt và bảo tồn ba loài cây thuốc sâm Việt Nam (Panax
vietnamensis Ha et Grushv.), sâm vũ diệp (P. bipinnatifidus) và tam thất hoang
(P. stipuleanatus Tsai et Feng) ở Việt Nam”, Tạp chí Dược liệu, 14(2), tr. 74-81.
4. Đinh Đoàn Long, Nguyễn Tập, Phạm Thanh Huyền, Lê Thanh Sơn, Ngô Đức
Phương (2009), “Sử dụng chỉ thị RAPD-PCR trong nghiên cứu đa hình di truyền
nhằm góp phần giá trị bảo tồn hai loài cây thuốc ngũ gia bì hương
(Acanthopanax gracilistylus W.W.Smith) và ngũ gia bì gai (Acanthopanax
trifoliatus (L.) Merr.)”, Tạp chí Dược liệu, 14(1), tr. 10-16.
5. Nguyễn Thanh Thuận, Vũ Thanh Thảo, Nguyễn Văn Thanh, Trần Cát Đông
(2010), “Ứng dụng kỹ thuật sinh học phân tử để xác định một số loài sâm thuộc
chi Panax”, Y Học TP. Hồ Chí Minh, 14(1), tr. 129-133.
Tiếng Anh
6. Agarwal M., Shrivastava N., Padh H. (2008), “Advances in molecular marker
techniques and their applications in plant sciences”, Plant Cell Rep, 27:617–631.
7. Al-Qurainy F., Khan S., Ali M.A., Al-Hemaid F.M., Tarroum M., Ashraf M.
(2011), “ Authentication of Ruta graveolens and its adulterant using internal
transcribed spacer (ITS) sequences of nuclear ribosomal DNA”, Pak. J. Bot.,
43(3): 1613-1620.
8. Arif I.A., Bakir M.A., Khan H.A., Al Farhan A.H., Al Homaidan A.A.,
Bahkali A.H., Al Sadoon M., Shobrak M. A. (2010), “Brief review of
molecular techniques to assess plant diversity”, .Int. J. Mol. Sci., 11, pp. 2079-
2096.
9. Balasubramani S.P., Murugan R., Ravikumar K., Venkatasubramanian P.
(2010), “Development of ITS sequence based molecular marker to distinguish,
Tribulus terrestris L. (Zygophyllaceae) from its adulterants”, Fitoterapia 81, pp.
503–508.
10. Baldwin B.G. (1992), “Phylogenetic utility of the internal transcribed spacer of
nuclear ribosomal DNA in plans: An example from Compositae”, Mol
Phylogenet Evol., 1(1): 3-16.
11. Carles M., Cheung M.K.L., Moganti S., Dong T.T.X., Tsim K.W., Ip N.Y.,
Sucher N.J. (2005), “A DNA microarray for the authentication of toxic
traditional Chinese medicinal plants”, Planta Med, 71(6): 580-584.
12. CBOL Plant Working Group (2009), “A DNA barcode for land plants”, PNAS,
106(31), pp. 12794 –12797.
13. Chen R., Dong J., Cui X., Wang W., Yasmeen A., Deng Y., Zeng X., Tang Z.
(2012), “DNA based identification of medicinal materials in Chinese patent
medicines”, Sci. Rep., 2:958.
14. Chen S., Yao H., Han J., Liu C., Song J., Shi L., Zhu Y., Ma X., Gao T., Pang
X., Luo K., Li Y., Li X., Jia X., Lin Y., Leon C. (2010), “Validation of the ITS2
region as a novel DNA barcode for identifying medicinal plant species”, PLoS
ONE 5(1): e8613.
15. Cheng KT., Su B., Chen CT., Lin CC. (2000), “RAPD analysis oi Astragalus
medicines marketed in Taiwan”, Am J Chin Med., 28(2):273-8.
16. Choudhary N., Sekhon B.S. (2011), “An overview of advances in the
standardization of herbal drugs”, J Pharm Educ Res, 2(2), pp. 55-70.
17. Dhanya K., Syamkumar S., Siju S., Sasikumar B. (2011), “Sequence
characterized amplified region markers: A reliable for adulterant detection in
turmeric powder”, Food Research International, 44(9), pp. 2889–2895.
18. Franca L.T., Carrilho E., Kist T.B. (2002), “A review of DNA sequencing
techniques”, Quarterly Reviews of Biophysics, 35 (2), pp. 169-200.
19. Ganie S.H., Srivastava P.S., Narula A., Ali Z., Sharma M.P. (2012),
“Authentication of shankhpushpi by RAPD markers”, Eurasia J Biosci 6, pp.
39-46.
20. Gao T., Sun Z., Yao H., Song J., Zhu Y., Ma X., Chen S. (2011), “Identification
of Fabaceae plants using the DNA barcode matK”, Planta Med., 77(1):92-94.
21. Gao T., Yao H., Song J., Liu C., Zhu Y., Ma X., Pang X., Xu H., Chen S.
(2010), “Identification of medicinal plants in the family Fabaceae using a
potential DNA barcode ITS2”, J Ethnopharmacol., 130(1):116-121.
22. Ghosh S., Majumder P.B., Sen Mandi S.S. (2011), “Species-specific AFLP
markers for identification of Zingiber officinale, Z. montanum and Z. zerumbet
(Zingiberaceae)”, Genetics and Molecular Research, 10(1): 218-229.
23. Guo JL., Ren Y., Chen L., Pei J., Wan DG. (2010), “Authentication of Caulis
clematidis armandii (Chuanmutong) and differentiation of its common
adulterants using RAPD and SCAR markers”, Journal of Medicinal Plants
Research, 4(8), pp. 697-701.
24. Ha W.Y., Shaw P.C., Liu J., Yau C.F., Wang J. (2002), “Authentication of
Panax ginseng and Panax quinquefolius using amplified fragment length
polymorphism (AFLP) and directed amplification of minisattlite region DNA
(DAMD)”, J. Agric. Food Chem., 50, pp. 1871 −1875.
25. Ha WY., Yau F.C., But P.P., Wang J, Shaw PC. (2001), “Direct amplification of
length polymorphism analysis differentiates Panax ginseng from P.
quinquefolius”, Planta Med 67, pp. 587-589.
26. Heubl G. (2010), “New aspects of DNA-based authentication of Chinese
medicinal plants by molecular biological techniques”, Planta Med, 76: 1963-
1974.
27. Hollingsworth P.M., Graham S.W., Little D.P. (2011), “Choosing and using a
plant DNA barcode”, PLoS ONE 6(5): e19254.
28. Hon CC, Chow YC, Zeng FY, Leung FC. (2003), “Genetic authentication of
ginseng and other traditional Chinese medicine”, Acta Pharmacol Sin., 24(9):
841-6.
29. Hussain M.A., Bedi Y.S. (2012), “Authentication of Picrorhiza kurrooa Royle
ex Benth. using DNA fingerprint”, International Journal of AgriScience, 2(6):
511-521.
30. Ince A. G., Karaca M. (2011), “Species-specific touch-down DAMD-PCR
markers for Salvia species”, Journal of Medicinal Plants Research, 6(9), pp.
1590-1595.
31. Jiang Y., David B., Tua P., Barbin Y. (2010), “Recent analytical approaches in
quality control of traditional Chinese medicines—A review”, Analytica Chimica
Acta 657, pp. 9–18.
32. Jiang Y., Ding C., Zhang L., Yang R., Zhou Y., Tang L. (2011), “Identification
of the genus Epimedium with DNA barcodes”, Journal of Medicinal Plants
Research, 5(28), pp. 6413-6417.
33. Joshi M., Deshpande J.D. (2010), “Polymerase chain reaction: methods,
principles and application”, International Journal of Biomedical Research 1, pp.
81-97.
34. Kårehed J., Groeninckx I., Dessein S., Motley T.J., Bremer B. (2008), “The
phylogenetic utility of chloroplast and nuclear DNA markers and the phylogeny
of the Rubiaceae tribe Spermacoceae”, Mol Phylogenet Evol., 49(3):843-866.
35. Khan S., Mirza K.J., Abdin M.Z. (2010), “Development of RAPD markers for
authentication of medicinal plant Cuscuta reflexa”, EurAsia J BioSci 4, pp. 1-7.
36. Khan S., Mirza K.J., Abdin M.Z. (2010), “DNA fingerprinting for the
authentication of Ruta graveolens”, African Journal of Biotechnology, 10(44),
pp. 8709-8715.
37. Khan S., Mirza K.J., Al-Qurainy F., Abdin M.Z. (2011), “Authentication of the
medicinal plant Senna angustifolia by RAPD profiling”, Saudi Journal of
Biological Sciences 18, pp. 287–292.
38. Khan S., Mirza K.J., Md Tayaab Md, Abdin M.Z. (2009), “RAPD profile for
authentication of medicinal plant Glycyrrhiza glabra Linn.”, Internet Journal of
Food Safety, 11, pp. 24-28.
39. Khan S., Qureshi M.I., Kamaluddin, Alam T., Abdin M. Z. (2006), “Protocol for
isolation of genomic DNA from dry and fresh roots of medicinal plants suitable
for RAPD and restriction digestion”, African Journal of Biotechnology, 6(3), pp.
175-178.
40. Kim J, Jo BH, Lee KL, Yoon ES, Ryu GH, Chung KW. (2007), “Identification
of new microsatellite markers in Panax ginseng”, Mol Cells., 24(1): 60-8.
41. Ko R.J. (2004), “A U.S. perspective on the adverse reactions from traditional
Chinese medicines”, J Chin Med Assoc, 67:109-116.
42. Kreader C.A. (1996), “Relief of amplification inhibition in PCR with Bovine
Serum Albumin or T4 Gene 32 Protein”, Applied and environmental
microbilogy, pp. 1102–1106.
43. Kress WJ, Wurdack KJ, Zimmer EA, Weigt LA, Janzen DH (2005), “Use of
DNA barcodes to identify flowering plants”, PNAS, 102(23), pp. 8369 – 8374.
44. Kunle, Folashade O., Egharevba, Omoregie H., Ahmadu, Ochogu P. (2012),
“Standardization of herbal medicines - A review”, International Journal of
Biodiversity and Conservation , 4(3), pp. 101-112
45. Kwon HK., Ahn Ch., Choi YE. (2009), “Molecular authentication of Panax
notoginseng by specific AFLP-derived SCAR marker”, Journal of Medicinal
Plants Research, 3(11), pp. 957-966.
46. Leem K., Kim S.C., Yang C.H., Seo J. (2005), “Genetic identification of Panax
ginseng and Panax quinquefolius by pyrosequencing methods”, Biosci
Biotechnol Biochem., 69(9):1771-1773.
47. Li M., Cao H., But P.P., Shaw PC. (2011), “Identification of herbal medicinal
materials using DNA barcodes”, Journal of Systematics and Evolution, 49(3):
271–283.
48. Li M., Jiang RW., Hon PM., Cheng L., Li LL., Zhou JR., Shaw PC., But P.P.
(2010), “Authentication of the anti-tumor herb Baihuasheshecao with bioactive
marker compounds and molecular sequences”, Food Chemistry, 119(3), pp.
1239–1245.
49. Liu T., Ji Y. (2011), “Molecular authentication of the medicinal plant Paris
polyphylla Smith var. yunnanensis (Melanthiaceae) and its related species by
polymerase chain reaction–restriction fragment length polymorphism (PCR-
RFLP)”, Journal of Medicinal Plants Research, 6(7), pp. 1181-1186.
50. Meizi L., Hui Y., Kun L., Pei M., Wenbin Z., Ping L. (2012), “Authentication of
Illicium verum using a DNA barcode psbA-trnH”, Journal of Medicinal Plants
Research, 6(16), pp. 3156-3161.
51. Misra A., Shasany A.K., Shukla A.K., Darokar M.P., Singh S.C., Sundaresan V.,
Singh J., Bagchi G.D., Jain S.P., Saikia D., Khanuja S.P.S. (2010), “AFLP
markers for identification of Swertia species (Gentianaceae)”, Genetics and
Molecular Research, 9 (3): 1535-1544.
52. Nikam P. H., Kareparamban J., Jadhav A., Kadam V. (2012), “Future trends in
standardization of herbal drugs”, Journal of Applied Pharmaceutical Science 02
(06); pp. 38-44.
53. Niu L., Mantri N., Li C.G., Xue C., Pang E. (2011), “Array-based techniques for
fingerprinting medicinal herbs”, Chinese Medicine, 6:18
54. Niu L., Mantri N., Li C.G., Xue C., Wohlmuth H., Pang E.CK (2011),
“Detection of Panax quinquefolius in Panax ginseng using ‘subtracted diversity
array’”, J Sci Food Agric, 91: 1310 – 1315.
55. Saini A., Reddy S.K, Jawali N. (2004), “Evaluation of long primers for AP-PCR
analysis of mungbean [Vigna radiata (L.) Wilczek]: Genetic relationships and
fingerprinting of some genotypes”, Indian journal of Biotechnology 3, pp 511-
518.
56. Schlötterer C. (2000), “Evolutionary dynamics of microsatellite DNA”,
Chromosoma, 109(6): 365-71.
57. Scott M.C., Caetano-Anollés G., Trigiano R.N. (1996), “DNA amplification
fingerprinting identifies closely related Chrysanthemum Cultivars”, J. A MER.
SOC. H ORT. SCI., 121(6):1043–1048.
58. Sehgal D., Bhat V., Raina S.N. (2008), “Advent of diverse DNA markers to
decipher genome sequence polymorphism”, Handbook of new technologies
genetic improvement of legumes, CRC Press Taylor and Francis Group, Boca
Raton.
59. Selkoe K.A., Toonen R.J. (2006), “Microsatellites for ecologists: a practical
guide to using and evaluating microsatellite markers”, Ecol Lett., 9(5): 615-29.
60. Semagn K., Bjørnstad Å., Ndjiondjop M. N. (2006), “An overview of molecular
marker methods for plants”, African Journal of Biotechnology, 5(25), pp. 2540-
2568.
61. Shaw PC., Wong KL., Chan A.W., Wong WC., But P.P. (2009), “Patent
applications for using DNA technologies to authenticate medicinal herbal
material”, Chin Med., 4: 21.
62. Shi H.M., Wang J., Wang M.Y., Tu P.F., Li X.B. (2009), “Identification of
Cistanche Species by chemical and inter-simple sequence repeat fingerprinting”,
Biol. Pharm. Bull., 32(1), pp. 142-146.
63. Smillie TJ and Khan IA (2010), “A comprehensive approach to identifying and
authenticating botanical products”, Clinical pharmacology and theurepeutics,
87(2), pp. 175-186.
64. Sun X., Guo J., Ge Y., Xia B., Hang Y. (2012), “Study of specific random
amplification of polymorphic DNA- sequence characterized amplified region
(RAPD-SCAR) marker for the endangered Chinese endemic herb Atractylodes
lancea”, Journal of Medicinal Plants Research, 6(21), pp. 3774-3780.
65. Sun XQ., Zhu YJ., Guo JL., Peng B., Bai MM., Hang YY. (2012), “DNA
barcoding the Dioscorea in China, a vital group in the evolution of
monocotyledon: Use of matK gene for species discrimination”, PLoS ONE 7(2):
e32057.
66. Sun Z., Gao T., Yao H., Shi L., Zhu Y., Chen S. (2011), “Identification of
Lonicera japonica and its related species using the DNA barcoding method”,
Planta Med, 77: 301 – 306.
67. Sze S.C., Zhang K.Y., Shaw PC., But P.P., Ng TB., Tong Y. (2005), “A DNA
microarray for differentiation of the Chinese medicinal herb Dendrobium
officinale (Fengdou Shihu) by its 5 S ribosomal DNA intergenic spacer region”,
Biotechnol Appl Biochem., 49(2):149-154.
68. Theerakulpisut P., Kanawapee N., Maensiri D., Bunnag S., Chantaranothai P.
(2008), “ Development of species- specific SCAR markers for identification of
three medicinal species of Phyllanthus”, Journal of Systematics and Evolution,
46 (4): 614-621.
69. Wagner H. Bauer R., Melchart D., Xiao P., Staudinger A. (2011),
“Chromatography fingerprint Analysis of Herbal Medicines”, Springer, New
York.
70. Wang H., Kim MK., Kim YJ., Lee HN., Jin H., Chen J., Yang DC. (2012),
“Molecular authentication of the Oriental medicines Pericarpium Citri
Reticulatae and Citri Unshius Pericarpium using SNP markers”, Gene., 494(1),
pp. 92-95.
71. Wang J., Tanret I., Mangelings D., Fan G., Wu Y., Heyden Y.V. (2010),
“Fingerprint development for Ginkgo biloba extracts by pressurized capillary
electrochromatography: Comparison of column types”, Journal of
Chromatographic Science, 48, pp. 428-435.
72. Wang X. (2011), “Inter-simple sequence repeats (ISSR) molecular
fingerprinting markers for authenticating the genuine species of rhubarb”,
Journal of Medicinal Plants Research, 5(5), pp. 758-764.
73. Xu H, Wang Z, Ding X, Zhou K, Xu L (2005), “Differentiation of Dendrobium
species used as "Huangcao Shihu" by rDNA ITS sequence analysis, Planta
Med., 71: 1-3.
74. Yadav A., Ahmad J., Chaudhary A.A., Ahmad A. (2012), “Development of
sequence characterized amplified region (SCAR) Marker for the authentication
of Bacopa monnieri (L.) Wettst)”, European Journal of Medicinal Plants, 2(3):
186-198.
75. Yang Y., Zhai Y., Liu T., Zhang F., Ji Y. (2011), “Detection of Valeriana
jatamansi as an adulterant of medicinal Paris by length variation of chloroplast
psbA-trnH region”, Planta Med., 77(1):87-91.
76. Yao H., Song JY., Ma XY., Liu C., Li Y., Xu HX., Han JP., Duan LS., Chen SL.
(2009), “Identification of Dendrobium species by a candidate DNA barcode
sequence: The chloroplast psbA-trnH intergenic region”, Planta Med.,
75(6):667-669.
77. Ye Q, Qiu YX, Quo YQ, Chen JX, Yang SZ, Zhao MS, Fu CX. (2006),
“Species-specific SCAR markers for authentication of Sinocalycanthus
chinensis”, J Zhejiang Univ Sci B., 7(11):868-872.
78. Yip P.Y., Chau C.F., Mak C.Y., Kwan H.S. (2007), “DNA methods for
identification of Chinese medicinal materials”, Chinese Medicine, 2:9.
79. Zhang YB., Wang J., Wang ZT., But P.P., Shaw PC. (2003), “DNA Microarray
for identification of the herb of Dendrobium species from Chinese medicinal
formulations”, Planta Med., 69(12):1172-1174.
80. Zhao YP., Qiu YX., Gong W., Li JH., Fu CX. (2007), “Authentication of
Actinidia macrosperma using PCR-RFLP based on trnK sequences”, Botanical
Studies, 48: 239-242.
81. Zhao Z., Hu Y., Liang Z., Yuen J.P., Jiang Z., Leung K.S. (2006),
“Authetication is fundamental for standardization of Chinese medicines”, Planta
Med, 72: 865-874.
82. Zhu S., Fushimi H., Cai S., Komatsu K. (2003), “Species identification from
Ginseng drugs by multiplex amplification refractory mutation system
(MARMS)”, Planta Med, 70: 189-192.
83. Zhu S., Fushimi H., Komatsu K. (2008), “Development of a DNA microarray
for authentication of Ginseng drugs based on 18S rRNA gene sequence”, J.
Agric. Food Chem., 56, pp. 3953–3959.
Recommended