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UNIVERSIDADE ESTADUAL DE MARINGÁ
CENTRO DE CIÊNCIAS EXATAS DEPARTAMENTO DE QUÍMICA
PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM QUÍMICA
ESTUDO QUÍMICO E AVALIAÇÃO DE ATIVIDADE ANTIFÚNGICA E ANTIPROLIFERATIVA DA ESPÉCIE
Luehea candicans MART et ZUCC. (TILIACEAE)
Dissertação apresentada por Dioni
Antunes da Silva ao Programa de Pós-
Graduação em Química do Departamento
de Química do Centro de Ciências Exatas
da Universidade Estadual de Maringá, como
parte dos requisitos para obtenção do título
de Mestre em Química.
MARINGÁ, DEZEMBRO DE 2004
“Quanto a você, porém, permaneça nas coisas que aprendeu e das quais tem
convicção, pois você sabe de quem aprendeu. Porque desde criança você
conhece as Sagradas letras, que são capazes de torná-lo sábio para salvação
mediante a fé em Cristo Jesus. ” 2 Timóteo 3: 14,15 (NVI)
Agradecimentos
- À Professora Doutora Cleuza Conceição da Silva pela
orientação, paciência e dedicação.
- À Professora Doutora Maria Conceição de Souza, Departamento
de Biologia, pela coleta e identificação da planta.
- Aos Professores Doutores Celso Vataru Nakamura e Benedito
Prado Dias Filho, Departamento de Análises Clínicas, pela realização
dos ensaios de atividade antibacteriano e antifúngico.
- Ao Doutor João Ernesto de Carvalho, Instituto CPQBA
(UNICAMP), pela realização dos ensaios de atividade
antiproliferativa.
- Aos professores do curso de mestrado em Química Aplicada
pela formação.
- À professora Doutora Silvana Maria de Oliveira Santin pela
orientação na realização do estágio docência.
- Aos colegas da Universidade Estadual de Maringá, pelos
inúmeros serviços prestados, em particular ao Cláudio, Ana e
Claudemir.
- À Ivânia pela valiosa contribuição e também pela obtenção dos
espectros.
- Aos acadêmicos e amigos Vanessa, Anelise, Júlio, Anderson,
Conceição, Fábio, Isis e Lílian.
- A todos os professores, funcionários e amigos pela convivência
durante este período.
- Ao CNPq, pelo suporte financeiro e à CAPES pela bolsa
concedida para realização deste trabalho.
- Finalmente, ao Sivaldo pela compreensão, paciência e presença
nos momentos difíceis.
SUMÁRIO
1 – Introdução e objetivo 1
1.1 – Introdução 1
1.2 – Objetivos 4
2 – Revisão Bibliográfica 5
1.3 – Família Tiliaceae 5
1.4 – Gênero Luehea 11
3 – Parte Experimental 13
3.1 – Matérias e métodos 13
3.2 – Estudo químico de Luehea candicans 14
3.2.1 – Coleta e secagem do material botânico 14
3.2.2 - Isolamento dos principais constituintes químicos dos galhos de
Luehea candicans 14
3.2.2.1 – Preparação e fracionamento do extrato bruto dos galhos 14
3.2.2.2 – Tratamento da fração LCG-4 (fração clorofórmica) 15
3.2.2.3 - Tratamento da fração LCG-5 (fração CHCl3/MeOH 25%) 17
3.2.2.4 – Tratamento da fração LCG-6 (fração CHCl3/MeOH 50%) 18
3.2.2.5 – Tratamento da fração LCG-7 (fração CHCl3/MeOH 75%) 19
3.2.3 - Isolamento dos principais constituintes químicos das folhas de
Luehea candicans 20
3.2.3.1 - Preparação e fracionamento do extrato bruto das folhas 20
3.2.3.2 - Tratamento da fração LCF-2 (fração clorofórmica) 21
3.2.3.3 - Tratamento da fração LCF-3 (fração acetato de etila) 23
3.2.3.4 - Tratamento da fração LCF-4 (fração metanólica) 24
4 – Resultados e Discussão 29
4.1 – Método de extração e isolamento dos constituintes
químicos de L. candicans 29
4.2 – Determinação estrutural dos compostos isolados 31
4.2.1 – Substância LC-1 31
4.2.2 – Substância LC-2 41
4.2.3 – Substância LC-3 49
4.2.4 – Substância LC-4 58
4.2.5 – Substância LC-5 63
4.2.6 – Substância LC-6 69
4.2.7 – Substância LC-7 80
4.3 – Dados espectroscópicos das substâncias isoladas 86
4.3.1 - Substância LC-1: lup-20(29)-en-3β-ol 86
4.3.2 - Substância LC-2 : Mistura dos compostos:
LC-2(I) 24ξ- etil- colest- 5 enol, LC-2(II)24ξ- etil- colesta-
5, 22- dienol, LC-2(III) 24ξ- metil- colest- 5 enol 87
4.3.3 – Substância LC-3: 3β,28-diidróxilup-20(29)-ene 88
4.3.4 – Substância LC-4: 3β-O-glicopiranosídeo-24ξ-etil-colest-5enol 89
4.3.5 – Substância LC-5: 2-(3,4-diidroxifenil)-3,4-diidro-1-2H-
benzopiran-3,5,7-triol 90
4.3.6 – Substância LC-6: (siringaresinol-(2,6-Bis(4’,4’-O-
bis-β-D-glicosídeo-3’,5’-dimetoxi-fenil)-3,7-dioxabiciclo) 91
4.3.7 – Substância LC-7: 8-β-D-Glicopiranosil-5,7-dihidroxi-
2-(4-hidroxifenil)-4-H-benzopiran-4-ona 91
5 – Estudo da atividade biológica 94
5.1 – Avaliação da atividade antibacteriana do extrato bruto
dos galhos e do extrato bruto das folhas 94
5.2 – Avaliação da atividade antifúngica dos extratos brutos
das folhas e dos galhos e substâncias isoladas 94
5.3 – Avaliação da atividade antiproliferativa 95
5.3.1 – Avaliação da atividade antiproliferativa do extrato bruto
das folhas e frações Hexano, CHCl3, AcOEt e MeOH 96
5.3.2 – Avaliação da atividade antiproliferativa do extrato bruto
dos galhos e frações Hexano, CHCl3, CHCl3/ MeOH (50%)
e MeOH 99
6 – Conclusões 103
7 – Referências Bibliográficas 105
INDICE DE ESQUEMAS ESQUEMA 1: Procedimento usado para a separação preliminar em coluna
cromatográfica do extrato bruto dos galhos e para o
isolamento de seus principais constituintes químicos
15
ESQUEMA 2: Procedimento usado para a separação preliminar em coluna
cromatográfica do extrato bruto das folhas e para o
isolamento de seus principais constituintes químicos
21
ESQUEMA 3: Provável fragmentação de LC-1 33
INDICE DE FIGURAS FIGURA 1: Luehea candicans – árvore 3 FIGURA 2: Luehea candicans – flores 3 FIGURA 3: Espectro no IV de LC-1 31 FIGURA 4: Espectro de massas (70 eV) de LC-1 32 FIGURA 5: Espectro de RMN 1H (300 MHz, CDCl3) de LC-1 35 FIGURA 6: Mapa de contornos 1Hx1H COSY (300 MHz, CDCl3) de LC-1 37 FIGURA 7: Espectro de RMN 13C e DEPT 90o e135o (75 MHz, CDCl3) de
LC-1
39
FIGURA 8: Mapa de contornos HETCOR (13C x 1H, CDCl3) de LC-1 40 FIGURA 9: Cromatograma da mistura LC-2 42 FIGURA 10: Espectro de massas (70 eV) de LC-2(I) 42 FIGURA 11: Espectro de massas (70 eV) de LC-2(II) 43 FIGURA 12: Espectro de massas (70 eV) de LC-2(III) 43 FIGURA 13: Espectro de RMN 1H (300 MHz, CDCl3) de LC-2 44 FIGURA 14: Espectro de RMN 13C e DEPT 90o e135o (75 MHz, CDCl3) de
LC-2
45
FIGURA 15: Espectro no IV de LC-3 49 FIGURA 16: Espectro de massas (70 eV) de LC-3 50 FIGURA 17: Espectro de RMN 1H (300 MHz, CDCl3) de LC-3 52 FIGURA 18: Mapa de contornos 1Hx1H COSY (300 MHz, CDCl3) de LC-3 53 FIGURA 19: Espectro de RMN 13C e DEPT 90o e135o (75 MHz, CDCl3) de
LC-3
56
FIGURA 20: Mapa de contornos HETCOR (13C x 1H, CDCl3) de LC-3 57 FIGURA 21: Espectro de RMN 1H (300 MHz, CDCl3) de LC-4 59 FIGURA 22: Espectro de RMN 13C e DEPT 90o e135o (75 MHz, CDCl3) de
LC-4
61
FIGURA 23: Espectro no IV de LC-5 63 FIGURA 24: Espectro de massas (70 eV) de LC-5 64 FIGURA 25: Espectro de RMN 1H (300 MHz, CD3OD) de LC-5 67
FIGURA 26: Espectro de RMN 13C e DEPT 90o e135o (75 MHz, CD3OD) de
LC-5
68
FIGURA 27: Espectro de massas (70 eV) de LC-6 69 FIGURA 28: Espectro de RMN 1H (300 MHz, D2O) de LC-6 71 FIGURA 29: Espectro de RMN 13C e DEPT 90o e135o (75 MHz, D2O) de
LC-6
72
FIGURA 30: Mapa de contornos HMQC (75 MHz, D2O) de LC-6 73 FIGURA 31: Mapa de contornos 1Hx1H COSY (300 MHz, D2O) de LC-6 74 FIGURA 32a: Mapa de contornos NOESY (300 MHz, D2O) de LC-6 75 FIGURA 32b: Mapa de contornos NOESY de LC-6 (expansão) 76 FIGURA 33: Mapa de contornos HMBC (300 MHz, D2O) de LC-6 77 FIGURA 34: Correlações de HMBC de LC-6 78 FIGURA 35: Espectro no IV de LC-7 81 FIGURA 36: Espectro de massas (70 eV) de LC-7 82 FIGURA 37: Espectro de RMN 1H (300 MHz, DMSO) de LC-7 84 FIGURA 38: Espectro de RMN 13C e DEPT 90o e135o (75 MHz, DMSO) de
LC-7
85
FIGURA 39: Doxorrubicina – Controle positivo do teste antiproliferativo 97 FIGURA 40: Teste antiproliferativo do extrato bruto das folhas de L.
candicans
97
FIGURA 41: Teste antiproliferativo da fração hexano (folhas) 98 FIGURA 42: Teste antiproliferativo da fração CHCl3 (folhas) 98 FIGURA 43: Teste antiproliferativo da fração MeOH (folhas) 98 FIGURA 44: Teste antiproliferativo da fração AcOEt (folhas) 99 FIGURA 45: Teste antiproliferativo do extrato bruto dos galhos de L.
candicans
100
FIGURA 46: Teste antiproliferativo da fração hexano (galhos) 101FIGURA 47: Teste antiproliferativo da fração CHCl3/MeOH (50%) (galhos) 101FIGURA 48: Teste antiproliferativo da fração CHCl3 (galhos) 102FIGURA 49: Teste antiproliferativo da fração MeOH (galhos) 102
INDICE DE TABELAS
TABELA 1: Fracionamento preliminar do extrato bruto dos galhos 15TABELA 2: Dados da cromatografia em coluna da fração LCG-4 16TABELA 3: Dados da cromatografia em coluna da fração LCG-5 17TABELA 4: Dados da cromatografia em coluna da fração LCG-6 18TABELA 5: Dados da cromatografia em coluna da fração LCG-7 19TABELA 6: Dados da cromatografia em coluna da fração LCG-7.9 20TABELA 7: Dados do fracionamento do extrato bruto das folhas 21TABELA 8: Dados da cromatografia em coluna da fração LCF-2 22TABELA 9: Dados da cromatografia em coluna da fração LCF-2.6 22TABELA 10: Dados da cromatografia em coluna da fração LCF-2.6.3 23TABELA 11: Dados da cromatografia em coluna da fração LCF-4 24TABELA 12: Linhagens de células tumorais utilizadas no teste de atividade
antiproliferativa
28
TABELA 13: Dados de RMN 1H de LC-1 e do lupeol 34TABELA 14: Correlações observadas nos espectros HETCOR (13C x 1H) e
COSY (1H x 1H) de LC-1
36
TABELA 15: Dados de RMN 13C/DEPT de LC-1 e do lupeol 38TABELA 16: Dados de RMN 13C/DEPT da mistura LC-2 e da mistura 24α –
etil- colest- 5 enol (sitosterol), 24α – etil- colesta- 5, 22- dienol
(estigmasterol) e 24ξ – metil- colest- 5 enol
46
TABELA 17: Dados de RMN 1H para os metilas de LC-2(I) e do 24α –
metil- colest- 5 enol(campesterol) e 24β – metil- colest- 5
enol(22,23 diidrobrassicasterol)
47
TABELA 18: Dados de RMN 1H para os metilas de LC-2(II) e do 24α – etil-
colest- 5,22- dienol(estigmasterol) e 24β – etil- colest- 5,22 -
dienol(poriferasterol)
47
TABELA 19: Dados de RMN 1H para os metilas de LC-2(III) e do 24α – etil-
colest- 5 enol(sitosterol) e 24β – etil- colest- 5
enol(clionasterol)
48
TABELA 20: Dados de RMN 1H de LC-3 e da betulina 51TABELA 21: Correlações observadas nos espectros HETCOR (13C x 1H) e
COSY (1H x 1H) de LC-3
54
TABELA 22: Dados de RMN 13C/DEPT de LC-3 e da betulina 55TABELA 23: Dados de RMN 1H de LC-4 e do glicopiranositosterol 60TABELA 24: Dados de RMN 13C/DEPT de LC-4 e do glicopiranositosterol 62TABELA 25: Dados de RMN 1H de LC-5 e da (−)-epicatequina 65
TABELA 26: Dados de RMN 13C / DEPT de LC-5 e da (−)-epicatequina 66
TABELA 27: Correlações observadas nos mapas de contornos (13C x 1H)
HMQC, (1H x 1H) COSY e NOESY da substância LC-6
78
TABELA 28 Correlações observadas no mapa de contornos HMBC da
substância LC-6
79
TABELA 29: Dados de RMN 1H de LC-6 e da liriodendrina 79TABELA 30: Dados de RMN 13C/DEPT de LC-6 e da liriodendrina 80TABELA 31: Dados de RMN 1H de LC-7 e da vitexina 83TABELA 32: Dados de RMN 13C/DEPT de LC-7 e da vitexina 86TABELA 33: Atividade antibactriana do extrato bruto das folhas e galhos de
L. candicans
94
TABELA 34: Atividade antifúngica dos extratos brutos das folhas e dos
galhos de L. candicans
95
TABELA 35: Atividade antiproliferativa ( efeito citostático) dos extratos
brutos das folhas e das frações Hexano, CHCl3, AcOEt e
MeOH de L. candicans
96
TABELA 36: Atividade antiproliferativa ( efeito citostático) dos extratos
brutos dos galhos e frações Hexano, CHCl3, CHCl3/ MeOH
(50%) e MeOH de L. candicans
99
ABREVIATURAS E SÍMBOLOS
ATCC American Type Culture Collection
CC Cromatografia em coluna
CCD Cromatografia em camada delgada
COSY 1H-1H Correlation Spectroscopy
D Dubleto
Dd Duplo Dubleto
Dl Dubleto Largo
DEPT Distortionless Enhancement By Polarization Transfer
DMSO Dimetilssulfóxido
EM Espectro de massas
EV Elétron Volt
HETCOR Heteronuclear Correlation Spectroscopy
HMBC Heteronuclear Multiple Bond Correlation
HMQC Heteronuclear Multiple Quantun Coherence
IV Infravermelho
J Constante de acoplamento, em Hertz
M Multipleto
M.+ Íon molecular
m/e Relação massa/carga
NOESY Nuclear Overhauser Enhancement Spectroscopy
Ppm Partes por milhão
Q Quarteto
S Singleto
Sl Singleto largo
T Tripleto
TMS Tetrametilsilano
UFC Unidade Formadora de Colônia
UV Ultravioleta
δ Deslocamento químico (em ppm)
RESUMO
A espécie Luehea candicans Mart. et Zucc., (Tiliaceae), conhecida
popularmente como ‘’mutamba-preta” e “açoita cavalo”, está distribuida
nos Estados de Minas Gerais, Mato Grosso do Sul e floresta latifoliada
semidecídua da bacia do Paraná. Pouco se conhece a respeito dos
constituintes químicos presentes no gênero Luehea, e o único estudo
químico descrito na literatura para espécie do gênero, o qual foi realizado
anteriormente em nosso laboratório de pesquisa, relata o isolamento de
um triterpeno, da classe dos ursenos e outro dos oleanenos, da espécie
Luehea divaricata, da qual também foram obtidos uma flavona e um
flavonol.
O presente estudo envolveu a extração, isolamento, identificação
dos constituintes químicos dos galhos e folhas de L. candicans, e ainda
ensaios biológicos para avaliação da atividade antibacteriana, antifúngica
e antiproliferativa dos extratos brutos, frações e substâncias isoladas.
Do extrato bruto metanólico dos galhos foram isolados dois
triterpenos pertencentes à classe dos lupanos, o lup-20(29)-en-3β-ol
(lupeol) e o 3β,28-diidróxilup-20(29)-eno (betulina), a mistura dos
esteróides 24ξ- etil- colest- 5 enol (sitosterol), 24ξ- etil- colesta- 5, 22-
dienol (estigmasterol) e 24ξ- metil- colest- 5 enol, o esteróide glicosilado
3-β-O-glicopiranosídeo-24ξ-etil-colest-5-enol (3-O-β-D-
glicopiranosilsitosterol), o flavan-3-ol, 2-(3,4-diidroxifenil)-3,4-diidro-1-2H-
benzopiran-3,5,7-triol [(-)-epicatequina] e a lignana (+)-siringaresinol di-
O-β-D-glicopiranosídeo (liriodendrina).
Do extrato bruto metanólico das folhas foi isolada a flavona C-
glicosilada 8-β-D-Glicopiranosil-5,7-dihidroxi-2-(4-hidroxifenil)-4-H-
benzopiran-4-ona (vitexina).
Os extratos brutos dos galhos e folhas tiveram suas atividades
antibacteriana, antifúngica e antiproliferativa testadas. Nenhum dos
extratos apresentou atividade antibacteriana através da metodologia
empregada. O extrato bruto das folhas apresentou atividade antifúngica
contra a cepa Candida krusei. O extrato bruto das folhas de L. candicans
apresentou atividade antiproliferativa, com efeito citostático de 85%
(25μg/mL) e efeito citocida em 25%, na maior concentração utilizada,
para células de câncer de rim. As frações hexano, CHCl3 e MeOH
apresentaram efeito citastático em 100%, na maior concentração
utilizada, também para células de câncer de rim. O extrato bruto dos
galhos apresentou atividade antiproliferativa concentração dependente
com efeito citostático e pequena seletividade entre as linhagens
estudadas.
A atividade antifúngica dos triterpenos, esteróides e flavonóides
isolados foi testada, e nenhuma das substâncias foi ativa através da
metodologia empregada.
Palavras-chave: Luehea candicans; triterpenos; flavonóides; lignana;
atividade biológica
ABSTRACT
The species Luehea candicans Mart. et Zucc., ( Tiliaceae),
popularly known as “mutamba- preta” and “açoita cavalo”, it is found in
the states of Minas Gerais, Mato Grosso do Sul and forests of Paraná’s
basin. Little is known about the chemical components presented in the
genus Luehea, and the only chemical research described in the literature
for the species of the genus, which was made in our laboratory of
research previously, reports the isolation of a triterpene, of the class of
the ursenes and another of the oleanenes, of the species Luehea
divaricata, from which was obtained also a flavone and a flavonol.
The following study involved the extraction, isolation, identification
of the chemical components of the branches and leaves of the L.
candicans, besides biological essays to evaluate the antibacterial,
antifungal and antiproliferative activity of the crude extracts, fractions and
isolated substances.
From the crude methanolic extract of the branches were isolated
two triterpenes belonging to the class of the lupanes , the lup- 20 (29)-
en- 3ß -ol (lupeol) and the 3ß, 28- dihydroxylup-20 (29)-ene (betulin), the
mixture of the steroid 24ξ-ethylcholest-5-enol ( sitosterol), 24ξ-
ethylcholesta-5,22-dienol (stigmasterol) and 24ξ-methylcholest-5-enol,
the glucosiled steroid 3-ß-O-glucopyranosyl-24ξ-ethylcholest-5-enol (3-O-
ß-D-glucopyranosylsitosterol), the flavan-3-ol, 2-(3,4-dihydroxyphenil)-
3,4-dihydro-1-2H-benzopyran-3,5,7- triol [(-)-epicatechin] and the lignan
(+)- syringaresinol di-O-ß-D-glucopyranoside (liriodendrin) .
From the crude methanolic extract of the leaves it was isolated the
(-glucoside 8- ß-D-Glucopyranosyl-5, flavone 7- dihydroxy-2-(4-
hydroxyphenil)-4-H-benzopyran-4-one (vitexin).
The crude extracts of the branches and leaves had their
antibacterial, antifungal and antiproliferative activities tested. None of the
extracts presented antibacterial activity through the methodology
employed. The crude extract of the leaves presented antifungal activity
against Candida Krusei. The crude extract of the leaves of L. candicans
presented antiproliferative activity with inhibition of growth of 85%
(25μg/mL) and cellular death in 25%, in the major concentration utilized,
to cells of cancer of kidney. The fractions hexane, CHCl3 and MeOH
presented inhibition of growth in 100%, in the major concentration
utilized, also, to the cells of kidney’s cancer.
The crude extract of the branches presented anticancer activity,
dependent concentrations with inhibition of growth and small selectivity
between the lineages studied.
The antifungal activity of the triterpenes, steroids and isolated
flavonoids it was tested, and none of the substances tested presented
any activity.
Key words: Luehea candicans; triterpenes; flavonoids; lignan;
biological activity
1 – INTRODUÇÃO E OBJETIVOS
1.1 – INTRODUÇÃO
Há cerca de 15 anos o grupo de pesquisa do Nupélia/UEM iniciou o
levantamento florístico direcionado às espécies nativas presentes na planície de
inundação do alto rio Paraná, região considerada como área de preservação
ecológica do Estado. Esta região abriga uma grande diversidade de ambientes,
incluindo florestas do tipo estacional semidecídua, submontana e mata ciliar.
Existem ainda, várzeas paludícula e aquática em áreas alagadas das lagoas
temporárias ou permanentes.
Um dos objetivos deste levantamento é apresentar uma listagem das
espécies presentes nesta área e correlacioná-las com sua distribuição na América
do Sul, acompanhando principalmente a vegetação que segue o leito do rio
Paraná, através de outros estados brasileiros e outros países como Argentina e
Paraguai.
Muitas espécies mapeadas nesta região não possuem estudo químico e/ou
de atividade biológica descritos na literatura e algumas já estão incluídas entre as
ameaçadas de extinção no Estado do Paraná, sendo que dentre estas encontra -
se a espécie Luehea candicans (Vazzoler e col.1997).
Este levantamento tem ainda o objetivo de contribuir para a ampliação do
conhecimento do potencial químico e farmacológico de tais espécies, bem como
dar suporte à classificação botânica das mesmas, com base em estudos
qimiotaxonômicos.
Desta forma, considerando que alguns estudos químicos de plantas
bioativas presentes na planície de inundação do alto rio Paraná, estão sendo
desenvolvidos de forma interdisciplinar entre pesquisadores do NUPÉLIA,
Biologia, do grupo de Produtos Naturais (DQI) e Análises Clínicas, optou-se pelo
estudo químico de Luehea candicans, o qual se somará ao estudo da espécie L.
divaricata, realizado em nosso laboratório de pesquisa, sendo este o primeiro no
gênero.
Pertencente à família Tiliaceae, a qual compreende aproximadamente cerca
de 35 gêneros e 370 espécies e tem o sul da África e o Brasil como os dois
principais centros de dispersão, sendo que no Brasil encontra-se cerca de 13
gêneros e de 55 a 60 espécies (Barroso e col., 1978), a espécie L. candicans
(Figuras 1 e 2) conhecida popularmente como ‘’mutamba-preta” e “açoita-cavalo”,
ocorre também nos Estados de Minas Gerais e Mato Grosso do Sul
(Lorenzi,1998).
Na classificação botânica segundo Cronquist (1988), a espécie Luehea
candicans pertence à seguinte posição sistemática:
Divisão: Magnoliophyta
Classe: Magnoliopsida
Sublcasse: Dilleniidae
Ordem: Malvales
Família: Tiliaceae
Tribo: Tilieae (segundo Angely – 1965)
Gênero: Luehea
Espécie: Luehea candicans
E segundo Lorenzi (1992) seus dados botânicos são:
Nome científico: Luehea candicans Mart. et Zucc.
Nomes populares: mutamba-preta, açoita-cavalo.
Características morfológicas: árvore com altura de 8-12 m, com tronco de 30-50
cm de diâmetro. Folhas simples, de coloração prateada.
Ocorrência: São Paulo, Minas Gerais e Mato Grosso do Sul, floresta latifoliada
semidecídua da bacia do Paraná.
Utilidade: a madeira é empregada na confecção de cadeiras, cangas de boi,
saltos de calçados, ripas, caibros, etc.
Informações ecológicas: planta decídua, heliófita, seletiva higrófita, exclusiva da
floresta semidecídua do rio Paraná. Planta rara e de dispersão descontínua.
Fenologia: floresce durante os meses de novembro-dezembro. A maturação dos
frutos ocorre durante os meses de julho-agosto.
FIGURA 1 – Luehea candicans : Árvore
FIGURA 2 – Luehea candicans : Flores
1.2 – OBJETIVOS
O estudo de L. candicans visa ampliar o conhecimento químico e biológico
do gênero Luehea que iniciou-se com o estudo da espécie L. divaricata. E ainda, o
estudo químico e a avaliação da atividade biológica sevirão de auxílio,
contribuição e suporte para a confirmação da classificação botânica desta espécie.
Desta forma, considerando que tais informações também poderão contribuir para
ampliar o conhecimento do potencial químico e farmacológico das espécies
nativas presentes na planície de inundação do alto rio Paraná e com isto,
assegurar a preservação de espécies com potencial biológico ainda
desconhecidos, este trabalho tem por objetivo:
♦ Estudar fitoquimicamente a espécie L. candicans visando isolar e
identificar os principais metabólitos secundários presentes nos galhos e
folhas.
♦ Avaliar a atividade biológica (antibacteriana, antifúngica e
antiproliferativa) dos extratos brutos, frações e substâncias isoladas.
2 – REVISÃO BIBLIOGRÁFICA
2.1 – Família Tiliaceae Na família Tiliaceae poucas espécies, pertencentes a apenas três dos 35
gêneros, foram estudadas quimicamente, sendo que a maioria dos estudos são
com espécies do gênero Corchorus, relatando principalmente o isolamento de
cardenolídeos glicosilados. Da espécie C. olitorius foram isolados os
cardenolídeos glicosilados (1,2,3,4,5,6,7,8)(Nakamura e col., 1998).
a
OHO
HO
HOO H
O O
O H
C H 3
C H 3O
O H
OHO
HO
HOO H
O
b
C H 3O
O H
c HO
dO
O H
HOC H 3
C H 3O
O H
OHO
HO
HOO H
O
e
OHO
HOO H
O
O
O
R2
CH3
OH
R3
(1) R1=a, R2=CHO, R3=OH(2) R1=c, R2=CHO, R3=OH(3) R1=d, R2=CHO, R3=OH(4) R1=b, R2=CH2OH, R3=H(5) R1=e, R2=CH3, R3=H(6) R1=b, R2=CH3, R3=H(7) R1=a, R2=CH3, R3=H(8) R1=c, R2=CH3, R3=H
R1O
Venkata (1975) isolou quatro cardenolídeos glicosilados (9), (10), (11), (12),
da espécie C. trilocularis.
(9) R=β-D-boivonosil
(10) R=H
(11) R=OMe
(12) R=α-L-raminosil
Ahmad e colaboradores (1998) isolaram os triterpenos cicloartanos
glicosilados (13) e (14), enquanto que Khan e colaboradores (1991) obtiveram os
derivados da α-amirina (15), (16) e (17) da espécie C. depressus.
ROOH
O O
O
OH
O
OH
(13)Glc
(15)
(16)
OH
CO2H
HO2CHO
HO
OH
CO2H
GlcO2CHO
HO
O
OAc
O
OH
(14)Glc
(17)
Os triterpenos glicosilados (18) e (19), juntamente com os triterpenos (20),
(21) e (22) foram isolados da espécie C. acutangulus por Mahato e col. (1988).
C O 2H
H O 2 C H O
H O
Das folhas da espécie C. capsularis foram obtidos os triterpenos (23), (24),
(25) e (26) por C. M. Hasan e col. (1984) .
CH2OR3
R1O
OR2
R2=R3=Me
R2=R3=HO
OHHO
HOOH
O
OMeMeO
MeOOMe
(18) R1=
(20) R1=R2=R3=H(21) R1=H, R2=R3=Me(22) R1=Ac, R2=R3=Me
(19) R1=
(23) R1=R2=R3=H
(24) R1=R2=Ac, R3=H
(25) R1=R2=R3=Ac
(26) R1= Glc, R2=R3=H
Do gênero Microcos foram isolados alcalóides piperidínicos, sendo a
micropina (27) isolada da espécie M. philippinensis por Aguinaldo (1990) e a
piperidina (28) isolada da espécie M. paniculata por Bandara e col. (2000).
N
OH
CH2OH
Me(27)
R1O
OR3
CH2OR2
H
O
OH
H
No gênero Grewia, Rosler e colaboradores (1978) isolaram o alcalóide 6-
hidróxi-1-metil-β-carbolina (29) das raízes de Grewia mollis e Lakshmi e
colaboradores (1976) obtiveram uma δ-lactona (30) das flores de Grewia asiatica.
(29)
(30)
N
OMe
Me
Me(28)
O
O
OH
NH
N
HO
CH3
2.2 – Gênero Luehea
No gênero Luehea, algumas espécies são usadas na medicina popular
como diuréticas e antinflamatórias (Alice e col.,1985). Braga (1976), assinalou
como adstringentes as cascas de L. speciosa Willd. (sinônimo botânico de L.
divaricata), e registrou também a presença das espécies L. candicans Mart. et
Zucc. (Luehea uniflora St. Hil.) e L. paniculata Mart., assinalando-as como tendo o
mesmo uso da primeira. A atividade antifúngica de L. divaricata foi avaliada por
Zacchino e colaboradores (1998), obtendo como resultado a ação moderada do
extrato diclorometânico na inibição do crescimento de hifas de fungos
dermatófitos.
Sáens e Nassar (1968) constataram a presença, em pequena quantidade,
de alcalóides na espécie L. candida (DC) Mart. Flavonóides, taninos, saponinas e
triterpenos/esteróides foram detectados em triagem fitoquímica dos extratos
etanólicos das folhas e caules de L. divaricata (Alice e col.,1985), cujo estudo
químico foi realizado em nosso laboratório de pesquisa. No trabalho citado, foram
isolados de L. divaricata o triterpeno inédito ácido 3β-p-hidroxibenzoil tormêntico
(ácido 3β-p-hidroxibenzoil, 2α,19α-di-hidroxiurs-12-en-28-óico) (31); uma mistura
de triterpenos cujo constituinte majoritário é o ácido 2α, 3β-dihidroxiolean-12-en-
28-óico (ácido maslínico), um derivado 2,3 diidroxilado de β-amirina (32) (Tanaka
e col., 2003). Além dos triterpenos, foi isolado uma flavona, a vitexina (33) e a (-)-
epicatequina (34), um flavonóide pertencente à classe dos flavan-3-ol (Tanaka,
2002). Este foi o primeiro relato de estudo fitoquímico no genêro Luehea.
(31)
COOH
OH
HO
H
HO
O
HO
(32)
(33)
(34)
H
H
HO
HO
COOH
O
OOH
HO HO
OH
OHO
HO
OH
O
OH
HO
OH
OH
OH
3 – PARTE EXPERIMENTAL
3.1 – Materiais e métodos
Os espectros de massas de baixa resolução foram obtidos em um
equipamento GC/MS SHIMADZU a 70 eV, modelo QP 2000A, com sonda para
sólidos.
Os espectros de absorção na região do IV foram registrados em um
espectrofotômetro FTIR-BOMEM MB-100, na região de 400 a 4000 cm-1. Utilizou-
se a absorção em 1601 cm-1 de um filme de poliestireno como referência.
Os espectros de RMN de 1H e de 13C foram obtidos em espectrômetro
VARIAN, modelo Gemini 2000 BB e Mercury Plus BB (300,6 MHz para 1H e 75,45
MHz para 13C). Os deslocamentos químicos foram obtidos em ppm, tendo como
referência interna o TMS (δ = 0,0 ppm). Os solventes deuterados utilizados foram
DMSO-d6, CDCl3, CD3OD, Aldrich ou Isotec.
As técnicas unidimensionais de RMN utilizadas na obtenção dos dados
experimentais visando a elucidação estrutural das substâncias obtidas foram RMN
de 1H, RMN de 13C, DEPT 90o e 135o. Foram também utilizadas em alguns casos,
as técnicas bidimensionais COSY 45o, HETCOR, NOESY, HMQC e HMBC.
As cromatografias em coluna foram feitas utilizando sílica gel 60 [(0,063 –
0,200 mm) (70-230 mesh ASTM)] ou [(0,2 - 0,5 mm) (35-70 mesh ASTM)] da
Merck ou Fluka e o monitoramento das frações foi realizado através de
cromatografia em camada delgada analítica (CCDA).
A espessura da camada de sílica gel (silica gel GF254 - Merck) usada na
confecção das placas de vidro para cromatografia em camada delgada analítica
(CCDA) e cromatografia em camada delgada preparativa (CCDP) foram de 0,25
mm (20x5 cm) e 1,00 mm (20x20 cm).
Os solventes utilizados nas CC, CCDP, CCDA e recristalizações
apresentavam grau de pureza P.A. ou foram tratados e destilados quando
necessário.
As substâncias foram visualizadas nas placas de CCDA utilizando
reveladores como H2SO4/MeOH (1:1), iodo e anisaldeído para terpenos (4-metóxi-
benzaldeído, ácido acético, ácido sulfúrico, / 1,0 : 48,5 : 0,5). As substâncias
fluorescentes foram visualizadas sob luz UV nos comprimentos de onda de 254 e
366 nm.
3.2 – Estudo químico de Luehea candicans
3.2.1 – Coleta e secagem do material botânico A planta foi coletada no entardecer do dia 12 de outubro de 2000, na região
de Porto Rico, Estado do Paraná, reserva ecológica do NUPÉLIA (UEM). A coleta
e identificação do material botânico foi feito pela Profa Dra Maria Conceição de
Souza. Uma excicata da planta em estudo foi depositada no Herbário do
Departamento de Biologia da Universidade Estadual de Maringá, sob número
9326. O material foi seco ao ar e pulverizado em moinho, obtendo-se 345,0g das
folhas e 432,5g dos galhos.
3.2.2 – Isolamento dos principais constituintes químicos dos galhos de
Luehea candicans
3.2.2.1 – Preparação e fracionamento do extrato bruto dos galhos O material botânico dos galhos foi submetido ao processo de remaceração
exaustiva com metanol (20x 500mL), a temperatura ambiente e concentrado a
pressão reduzida em evaporador rotativo (40o) obtendo-se 49,0g de extrato bruto.
Parte do extrato bruto, 20,0 g, foi adsorvido em sílica gel (31,0g) e
submetido a uma separação preliminar em coluna cromatográfica utilizando o
sistema de eluentes conforme Tabela 1. O procedimento geral do fracionamento
dos galhos está representado no Esquema 1.
Tabela 1: Fracionamento preliminar do extrato bruto dos galhos
Fração(%) Volume(mL) Massa(g) Código
Hexano 1500 0,0151 LCG-1
Hex./Clorofórmio 50 700 0,0415 LCG-2
Hex./Clorofórmio 75 700 0,0730 LCG-3
Clorofórmio 1400 0,7020 LCG-4
CHCl3/Metanol 25 700 0,8979 LCG-5
CHCl3/Metanol 50 700 2,7527 LCG-6
CHCl3/Metanol 75 700 7,9094 LCG-7
Metanol 1300 7,1133 LCG-8
Esquema 1: Procedimento usado para a separação preliminar em coluna
cromatográfica do extrato bruto dos galhos e para o isolamento de seus principais
constituintes químicos
EXTRATO BRUTO20,0g
LCG-1
LC-64,3mg
LC-7.9
LCG-2 LCG-4 LCG-6 LCG-7 LCG-8
LC-59mg
LC-312mg
LC-212mg
LC-116mg
LCG-5
LC-418mg
CC sílica gel
CC sílica gelCC sílica gel
CC sílica gel
CC sílica gel
PRÉ-FRACIONAMENTOCC SILICA GEL
HEXANO HEX./CHCl350%
CHCl3CHCl3/MeOH
25%CHCl3/MeOH
50%CHCl3/MeOH
75%MeOH
GALHOS (430,0g)↓
EXTRATO BRUTO ( 49,0g)↓
3.2.2.2 – Tratamento da fração LCG-4 (Fração clorofórmica) Parte da fração LCG-4 (620,0 mg) foi submetida à cromatografia em coluna
de sílica gel 60(∅= 1,0 cm e msi = 8,6g) empacotada com hexano e eluída com
hexano/ acetato de etila em polaridade crescente. Foram coletadas 125 frações de
10,0mL cada, reunidas em 14 novas frações de acordo com as semelhanças
observadas por CCDA, conforme Tabela 2.
Tabela 2: Dados da cromatografia em coluna da fração LCG-4
Frações
reunidas
Eluente(%)
Massa(mg) Denominação Substância
Isolada
1-5 Hexano/AcOEt 2,5 0,1 LCG-4.1
6 Hexano/ AcOEt 2,5 19,0 LCG-4.2
7 Hexano/ AcOEt 2,5 0,1 LCG-4.3
8-12 Hexano/ AcOEt 5,0 18,1 LCG-4.4 LC-1 (16,0mg)
13-14 Hexano/ AcOEt 5,0 1,0 LCG-4.5
15-16 Hexano/ AcOEt 5,0 29,3 LCG-4.6 LC-2 (12,0mg)
17-20 Hexano/ AcOEt 5,0 2,0 LCG-4.7
21-23 Hexano/ AcOEt 7,0 19,7 LCG-4.8
24-37 Hexano/ AcOEt 10,0 31,0 LCG-4.9
38-40 Hexano/ AcOEt 10,0 10,0 LCG-4.10
41-54 Hexano/ AcOEt 15,0 70,4 LCG-4.11 LC-3 (12,0mg)
55-65 Hexano/ AcOEt 20,0 32,0 LCG-4.12
66-93 Hexano/ AcOEt 50,0 28,0 LCG-4.13
925 Hexano/ AcOEt 75,0 13,0 LCG-4.14
Na fração LCG-4.4 formou-se um sólido branco, o qual foi lavado com
hexano para remoção de impurezas. A análise por CCDA apresentou uma única
mancha. Os dados de RMN de 1H e de 13C demonstraram tratar-se de um
triterpeno, o qual foi denominado de LC-1.
A fração LCG-4.6 também apresentou uma única mancha em CCDA e seus
dados de RMN de 1H e de 13C demonstraram tratar-se de mistura de esteróides,
denominada de LC-2. Esta fração também foi purificada com hexano.
Da fração LCG-11 as impurezas foram retiradas utilizando-se acetona,
isolando-se também um sólido branco solúvel em clorofórmio. Os dados de RMN
de 1H e de 13C demonstraram que esta substância também tratava-se de um
triterpeno, a qual foi denominada de LC-3. As demais frações não foram
estudadas por apresentarem-se como misturas complexas ou por conterem pouca
massa.
3.2.2.3 – Tratamento da fração LCG-5 (Fração CHCl3/MeOH 25%) Parte da fração LCG-5 (700,0mg) foi submetida à cromatografia em coluna
de sílica gel 60 (∅= 1,5cm e msi = 12,0g) empacotada com clorofórmio e eluída
com clorofórmio/acetato de etila/metanol em polaridade crescente. Desta coluna
foram coletadas 103 frações de 10,0mL cada, reunidas em 15 novas frações de
acordo com as semelhanças observadas por CCDA, conforme Tabela 3. Tabela 3: Dados da cromatografia em coluna da fração LCG-5
Frações Reunidas
Eluente(%)
Massa(mg) Denominação Substância Isolada
1-2 CHCl3/AcOEt 2,5 0,1 LCG-5.1 3-4 CHCl3/ AcOEt 2,5 19,9 LCG-5.2 5-9 CHCl3/ AcOEt 2,5 61,7 LCG-5.3
10-12 CHCl3/ AcOEt 5,0 23,9 LCG-5.4 13-18 CHCl3/ AcOEt 10,0 96,1 LCG-5.5 19-30 CHCl3/ AcOEt 10,0 37,8 LCG-5.6 31-37 CHCl3/ AcOEt 25,0 12,0 LCG-5.7 38-42 CHCl3/ AcOEt 25,0 85,4 LCG-5.8 LC-4 (10,0mg)43-54 CHCl3/ AcOEt 50,0 68,7 LCG-5.9 LC-4 (8,0mg) 55-60 CHCl3/ AcOEt 75,0 19,1 LCG-5.10 61-72 AcOEt 89,6 LCG-5.11 73-78 AcOEt 25,5 LCG-5.12 79-91 AcOEt/MeOH 20,0 10,6 LCG-5.13 92-96 MeOH 10,6 LCC-5.14 97-103 MeOH 92,6 LCG-5.15
Nas frações LCG-5.8 e LCG-5.9 formou-se um precipitado branco, cuja a
análise por CCDA apresentou uma única mancha. Os dados obtidos nos
espectros de RMN de de 1H e de 13C demonstraram tratar-se de um esteróide (LC-4). As frações LCG-5.5 e LCG-5.15 foram estudadas não tendo sido obtido
resultado satisfatório. As demais frações não foram estudadas por apresentarem-
se como misturas complexas ou por apresentarem pouca massa.
3.2.2.4 – Tratamento da fração LCG-6 (Fração CHCl3/MeOH 50%) Parte da fração LCG-6 (2,0g) foi submetida à cromatografia em coluna de
sílica gel 60 (∅= 2,5cm e msi = 38,0g) empacotada com clorofórmio e eluída com
clorofórmio/acetato de etila/metanol em polaridade crescente. Foram coletadas
123 frações de 10,0mL cada, reunidas em 11 novas frações de acordo com as
semelhanças observadas por CCDA, conforme Tabela 4.
Tabela4: Dados da cromatografia em coluna da fração LCG-6
Frações reunidas
Eluente(%) Massa(mg) Denominação Substância Isolada
1-61 CHCl3/AcOEt 5,0-50,0 25,6 LCG-6.1 62-64 AcOEt 28,9 LCG-6.2 LC-5 (9,0mg) 65-70 AcOEt 42,8 LCG-6.3 71-84 AcOEt /MeOH 10,0 616,3 LCG-6.4 85-87 AcOEt /MeOH 25,0 103,4 LCG-6.5 88-90 AcOEt /MeOH 25,0 249,1 LCG-6.6 91-96 AcOEt /MeOH 25,0 399,5 LCG-6.7 97-100 AcOEt /MeOH 50,0 197,2 LCG-6.8
101-107 AcOEt /MeOH 50,0 116,3 LCG-6.9 108-112 MeOH 193,8 LCG-6.10 113-123 MeOH 42,0 LCG-6.11
Na fração LCG-6.2, formou-se um sólido levemente marrom, solúvel em
metanol, o qual foi purificado utilizando-se clorofórmio. A análise por CCDA
apresentou uma única mancha. Os dados de RMN de 1H e de 13C demonstraram
que a substância isolada pertencia à classe dos flavonóides, a qual foi
denominada de LC-5. A fração LCC-6.4 foi estudada, não tendo sido obtido
resultado satisfatório. As demais frações não foram estudadas por apresentarem-
se como misturas complexas ou por apresentarem pouca massa.
3.2.2.5 – Tratamento da fração LCG-7 (Fração CHCl3/MeOH 75%) Parte da fração LCG-7 (5,0g) foi submetida à cromatografia em coluna de
sílica gel 60 (∅= 2,5cm e msi = 60,0g) empacotada com acetato de etila e eluída
com acetato de etila/metanol em polaridade crescente. Foram coletadas 95
frações de 10,0mL cada, reunidas em 11 novas frações de acordo com as
semelhanças observadas por CCDA, conforme Tabela 5.
Tabela 5: Cromatografia em coluna da fração LCG-7
Frações reunidas
Eluente(%) Massa(g) Denominação Substância isolada
1-6 AcOEt 0,074 LCG-7.1 LC-5 7 AcOEt 0,455 LCG-7.2
8-10 AcOEt 0,227 LCG-7.3 11-27 AcOEt/MeOH 10,0 0,130 LCG-7.4 28-32 AcOEt /MeOH 20,0 0,180 LCG-7.5 LC-5 33-41 AcOEt/MeOH 20,0 0,712 LCG-7.6 42-51 AcOEt/MeOH 20,0-30,0 0,953 LCG-7.7 52-59 AcOEt/MeOH 30,0 0,334 LCG-7.8 60-67 AcOEt/MeOH 30,0-40,0 1,000 LCG-7.9 68-75 AcOEt/MeOH 50,0 0,515 LCG-7.10 76-95 AcOEt/MeOH 75,0 0,199 LCG-7.11
Nas frações LCG-7.1 a LCG-7.5 foi detectado a presença de LC-5. As
frações LCG-7.6 a LCG-7.8 foram reunidas por apresentarem flurescência
semelhante sob luz ultravioleta, no comprimento de onda λ = 366 nm, e
submetidas a uma coluna cromatográfica em silica gel onde nenhum resultado
satisfatório foi obtido.
A fração LCG-7.9 (1,0g), por apresentar perfil cromatográfico menos
complexo, foi submetida a uma coluna cromatográfica em silica gel 60 (∅= 1,0cm
e msi = 12,0g) empacotada com clorofórmio e eluída com clorofórmio/metanol em
polaridade crescente. Foram coletadas 40 frações de 15,0mL cada, reunidas em 6
novas frações de acordo com as semelhanças observadas por CCDA, conforme
Tabela 6.
Tabela 6: Dados da cromatografia em coluna da fração LCG-7.9
Frações reunidas
Eluente(%) Massa(mg) Denominação Substância Isolada
1-6 CHCl3/MeOH 5,0 18,3 LCG-7.9.1 7-14 CHCl3/MeOH 7,0-10,0 1,7 LCG-7.9.2 15-18 CHCl3/MeOH 15,0 4,3 LCG-7.9.3 LC-6 (4,3mg)19-20 CHCl3/MeOH 20,0 2,9 LCG-7.9.4 21-30 CHCl3/MeOH 25,0-50,0 177,0 LCG-7.9.5 31-40 CHCl3/MeOH 75,0 728,0 LCG-7.9.6
Na fração LCG-7.9.3 precipitou um sólido branco(4,0mg) solúvel em H2O,
denominado LC-6. As demais frações não foram estudadas por apresentarem-se
como misturas complexas ou por apresentarem pouca massa.
As frações LCG-1, LCG-2 e LCG-3 não foram estudadas por apresentarem
perfil muito complexo e massa insuficiente para dar continuidade aos trabalhos.
A fração LCG-8 não foi estudada por apresentar muita quantidade de
taninos, visualizados através de cromatografia em camada delgada (MeOH/ H2O –
50%) que dificultaram o trabalho.
3.2.3 – Isolamento dos principais constituintes químicos das folhas de
Luehea candicans
3.2.3.1 – Preparação e fracionamento do extrato bruto das folhas As folhas foram submetidas ao processo de remaceração exaustiva com
metanol (26x500mL) à temperatura ambiente, concentrado à pressão reduzida em
evaporador rotativo (40o) obtendo-se 61,0g de extrato bruto.
Parte do extrato bruto obtido, 40,0 g, foi adsorvido em silica gel (40,0g) e
submetido a uma separação preliminar em coluna cromatográfica utilizando o
sistema de eluentes conforme Tabela 7. O procedimento geral do fracionamento
das folhas está representado no Esquema 2.
Tabela 7: Dados do fracionamento do extrato bruto das folhas
Fração Volume(L) Massa(g) Código Hexânica 2,2 0,286 LCF-1
Clorofórmica 2,0 2,789 LCF-2 Acetato de etila 2,0 1,597 LCF-3
Metanólica 2,5 23,855 LCF-4
Esquema 2: Procedimento usado para a separação preliminar em coluna
cromatográfica do extrato bruto das folhas e para o isolamento de seus principais
constituintes químicos
EXTRATO BRUTO40,0g
LCF-1
LC-1 LC-78,0 mg
LCF-3pCC sílica gel
CC sílica gel
PRÉ-FRACIONAMENTOCC SILICA GEL
HEXANO CHCl3 MeOH
FOLHAS (345,0g)↓
EXTRATO BRUTO ( 60,0g)↓
LCF-2 LCF-3 LCF-4
AcOEt
LC-74,0 mg
LC-411,0 mg
Ppt
CHCl3 / H2O (sucessivas lavagens)
3.2.3.2 – Tratamento da fração LCF-2 (Fração clorofórmica) Parte da fração LCF-2 (2,0g) foi submetida à cromatografia em coluna de
sílica gel 60 (∅= 2,0cm e msi = 20,0g) empacotada com hexano e eluída com
hexano/acetato de etila em polaridade crescente. Foram coletadas 64 frações de
15,0mL cada, reunidas em 8 novas frações de acordo com as semelhanças
observadas por CCDA, conforme Tabela 8.
Tabela 8: Dados da cromatografia em coluna da fração LCF-2
Frações
reunidas
Eluente(%) Massa(mg) Denominação Substância
isolada
1-14 Hexano/AcOEt 2,5-7,0 173,6 LCF-2.1
15-22 Hexano AcOEt 10,0 114,8 LCF-2.2 LC-1 23-27 Hexano/ AcOEt 10,0 160,0 LCF-2.3 28-34 Hexano/ AcOEt 15,0 106,3 LCF-2.4 LC-2 35-44 Hexano/ AcOEt 20,0-25,0 220,8 LCF-2.5
45-53 Hexano/ AcOEt 50,0-75,0 215,4 LCF-2.6
54-55 AcOEt 49,1 LCF-2.7
56-64 AcOEt 42,7 LCF-2.8
Na fração LCF-2.2 foi detectada a presença de LC-1 e na fração LCF-2.4
LC-2. As frações LCF-2.6 e LCF-2.7 foram reunidas por apresentarem
semelhanças. Esta fração foi denominada LCF-2.6 (264,0mg), e foi submetida a
uma coluna cromatográfica em silica gel 60 (∅= 1,0cm e msi = 10,0g) empacotada
com clorofórmio e eluída com clorofórmio/metanol em polaridade crescente.
Foram coletadas 55 frações de 15,0mL cada, reunidas em 5 novas frações de
acordo com as semelhanças observadas por CCDA, conforme Tabela 9.
Tabela 9: Dados da cromatografia em coluna da fração LCF-2.6
Frações reunidas Eluente(%) Massa(mg) Denominação
1-8 CHCl3 88,0 LCF-2.6.1
9-17 CHCl3/MeOH 2,5 160,0 LCF-2.6.2
18-24 CHCl3/MeOH 2,5-5,0 4,0 LCF-2.6.3
25-48 CHCl3/MeOH 7,0-40,0 2,3 LCF-2.6.4
49-55 CHCl3/MeOH 40,0-80,0 1,0 LCF-2.6.5
A fração LCF-2.6.2 (160,0mg), por apresentar fluorescência sob luz
ultravioleta no comprimento de onda λ = 254 nm, foi submetida a uma coluna
cromatográfica em silica gel 60 (∅= 1,0cm e msi = 8,0g) empacotada com
clorofórmio e eluída com clorofórmio/metanol em polaridade crescente. Foram
coletadas 43 frações de 15,0mL cada, reunidas em 4 novas frações de acordo
com as semelhanças observadas por CCDA, conforme Tabela 10.
Tabela 10: Dados da cromatografia em coluna da fração LCF-2.6.3
Frações reunidas Eluente(%) Massa(mg) Denominação
1-11 CHCl3 14,0 LCF-2.6.3 a
12-18 CHCl3/MeOH 1,0 76,0 LCF-2.6.3 b
19-38 CHCl3/MeOH 1,5-2,5 52,6 LCF-2.6.3 c
38-43 CHCl3/MeOH 5,0 3,0 LCF-2.6.3 d
A fração LCF-2.6.3b (76,0mg), por apresentar perfil cromatográfico menos
complexo foi submetida a uma cromatografia em camada delgada
preparativa(CCDP). Foram retiradas quatro faixas sendo que apenas uma
apresentou quantidade de massa suficiente para análises espectroscópicas,
sendo denominada LCF-2.6b (4,0mg).
3.2.3.3 – Tratamento da fração LCF-3 (Fração acetato de etila) A fração LCF-3 foi evaporada à secura e ao ser solubilizada em metanol
,para removê-la do balão, houve a formação de um precipitado de coloração
amarela. A análise por CCDA apresentou duas manchas com rfs diferentes, uma
de cor amarela e outra de cor violeta sob luz visível. As substâncias foram
separadas utilizando-se clorofórmio e água. Os dados de RMN de 1H e de 13C
demonstraram que uma substância isolada pertencia à classe dos flavonóides, a
qual foi denominada de LC-7 (8,0 mg) e a outra substância era o esteróide já
isolado (LC-4) (11,0 mg). Optou-se por não fazer coluna cromatográfica da fração
LCF-3 por apresentar perfil intermediário entre a fração clorofórmica(LCF-2) e a
fração metanólica(LCF-4).
3.2.3.4 – Tratamento da fração LCF-4 (Fração metanólica) Parte da fração LCF-4 (4,0g) foi submetida à cromatografia em coluna de
silica gel 60 (∅= 2,5cm e msi = 50,0g) empacotada com clorofórmio e eluída com
clorofórmio/acetato de etila/ metanol em polaridade crescente. Foram coletadas 72
frações de 15,0mL cada, reunidas em 7 novas frações de acordo com as
semelhanças observadas por CCDA, conforme Tabela 11.
Tabela 11: Dados da cromatografia em coluna da fração LCF-4
Frações
reunidas
Eluente(%) Massa(mg) Denominação Substância
isolada
1-33 CHCl3/ AcOEt 10,0-50,0 42,5 LCF-4.1
34-40 AcOEt /MeOH 5,0-10,0 104,8 LCF-4.2
41-50 AcOEt /MeOH 20,0 84,6 LCF-4.3 LC-7
51-52 AcOEt /MeOH 30,0 45,0 LCF-4.4
53-57 AcOEt /MeOH 50,0 87,2 LCF-4.5
58-64 AcOEt /MeOH 50,0-75,0 104,8 LCF-4.6
65-72 MeOH 178,0 LCF-4.7
Na fração LCF-4.2 foi detectado através de CCDA, uma mancha de
coloração amarela sob luz visível. Esta fração foi purificada com acetato de etila
não tendo sido obtido quantidade de massa suficiente para as análises
espectroscópicas. Na fração LCF-4.3 foi isolada mais quantidade da substância
LC-7 (4,0 mg). As demais frações não foram estudadas por apresentarem um
perfil cromatográfico muito complexo.
A fração LCF-1 não foi estudada por apresentar pouca massa e perfil
cromatográfico muito complexo.
3.3 – Estudo de atividade biológica Os testes de atividade antifúngica e antibacteriana foram realizados no
Departamento de Análises Clínicas da Universidade Estadual de Maringá, sob
coordenação do professor Dr. Benedito Dias Prado Filho e professor Dr. Celso
Nakamura. O método usado nos testes foi o da microdiluição descrito por Woods
(1995).
A avaliação da atividade antiproliferativa foi realizada no CPQBA
(UNICAMP), sob responsabilidade do professor Dr. João Ernesto de Carvalho. Os
testes de atividade foram realizados segundo método descrito por Skehan e col.
(1990) e Monks e col. (1991).
3.3.1 – Avaliação da atividade antibacteriana do extrato bruto dos galhos e das folhas A avaliação da atividade antibacteriana foi feita através do teste de
susceptibilidade antibacteriana pelo método de microdiluição. Este método utiliza
placas contendo 96 compartimentos, sendo cada compartimento denominado well
(poço). Foram utilizadas três placas para verificar a atividade antibacteriana, uma
para cada espécie de bactéria, juntamente com os respectivos antibacterianos
padrões descritos pela literatura. Cada poço continha aproximadamente 10 μL de
caldo de cultura Müller-Hinton para crescimento bacteriano. As drogas utilizadas
(padrões e testes) foram diluídas em dimetilssulfóxido (DMSO), na concentração
de 20 mg/mL. Após sucessivas diluições do extrato e das frações em meio de
cultura (caldo Müller-Hinton) estéril obteve-se concentração de 2000 μg/mL. A
partir dessa concentração foi retirada uma alíquota de 100 μL e iniciou-se a
inoculação da droga em sucessivos compartimentos com meio de cultura. As
diluições ocorreram no sentido das colunas, uma para cada droga. Ao ser
adicionada em um compartimento este era homogeneizado com a mesma pipeta,
sendo transferida uma quantidade igual a 100 μL para o poço seguinte. Dessa
forma, cada compartimento anterior tinha o dobro da concentração do posterior. O
primeiro poço da primeira coluna, portanto, ficou com a primeira droga teste numa
concentração de 1000 μg/mL, o segundo com 500 μg/mL, o terceiro com 250
μg/mL, o quarto com 125 μg/mL, o quinto com 62,5 μg/mL, o sexto com 31,75
μg/mL e o último com aproximadamente 15,85 μg/mL. As placas de microdiluição
foram incubadas em estufa Bacteriológica a 37º C por 24 horas. A leitura foi feita,
considerando o CMI a menor concentração capaz de inibir o crescimento
bacteriano.
A concentração mínima bactericida foi determinada retirando uma alíquota
de 10 μL (alça de semeadura calibrada) do conteúdo de cada poço com a droga,
mas isento de crescimento e dos controles para placas de petri com meio de
cultura ágar Mueller Hinton, devidamente identificadas. A Concentração Mínima
Bactericida (CMB) foi lida, considerando-a como a menor concentração da droga
que impediu o crescimento visível do subcultivo.
Os extratos brutos das folhas e dos galhos foram avaliados frente as
bactérias Staphylococcus aureus ATCC 25923, Bacillus subtilis ATCC 6623 e
Escherichia coli ATCC 25922, utilizando-se como padrões os antibacterianos
penicilina, vancomicina e tetraciclina, respectivamente.
3.3.2 – Avaliação da atividade antifúngica dos extratos brutos das folhas e dos galhos
A avaliação utilizou o teste de susceptibilidade antifúngica pelo método de
microdiluição. Este método utiliza placas contendo 96 compartimentos, sendo
cada compartimento denominado well (poço). Foram utilizadas quatro placas para
verificar a atividade antifúngica, uma para cada espécie de fungo, juntamente com
o antifúngico padrão descrito pela literatura. Cada poço continha
aproximadamente 10 μL de caldo de cultura RPMI-1640 da Sigma® para
crescimento fúngico. As drogas utilizadas (padrão e testes) foram diluídas em
dimetilssulfóxido (DMSO), na concentração de 20 mg/mL. Após sucessivas
diluições do extrato em meio de cultura (caldo Müller-Hinton) estéril obteve-se
concentração de 2000 μg/mL. A partir dessa concentração foi retirada uma
alíquota de 100 μL e iniciou-se a inoculação da droga em sucessivos
compartimentos com meio de cultura. As diluições ocorreram no sentido das
colunas, uma para cada droga. Ao ser adicionada em um compartimento este era
homogeneizado com a mesma pipeta, sendo transferida uma quantidade igual a
100 μL para o poço seguinte. Dessa forma, cada compartimento anterior tinha o
dobro da concentração do posterior. O primeiro poço da primeira coluna, portanto,
ficou com a primeira droga teste numa concentração de 1000 μg/mL, o segundo
com 500 μg/mL, o terceiro com 250 μg/mL, o quarto com 125 μg/mL, o quinto com
62,5 μg/mL, o sexto com 31,75 μg/mL e o último com aproximadamente 15,85
μg/mL. As placas de microdiluição foram incubadas em estufa Bacteriológica a 37º
C por 24 horas. A leitura foi feita, considerando o CMI a menor concentração
capaz de inibir o crescimento fúngico.
A concentração mínima fungicida (CMF) foi determinada retirando uma
alíquota de 10 μL (alça de semeadura calibrada) do conteúdo de cada poço com a
droga, mas isento de crescimento e dos controles para placas de petri com meio
de cultura ágar Sabourand, devidamente identificadas. A concentração mínima
fungicida (CMF) foi lida, considerando-a como a menor concentração da droga
que impediu o crescimento visível do subcultivo.
A droga padrão foi a micostatina e a incubação foi realizada em estufa
bacteriológica a 37º C por 24 horas. A leitura foi realizada considerando a CMI a
menor concentração capaz de inibir o crescimento fúngico.
Os extratos brutos das folhas e dos galhos foram avaliados frente aos fungos
Candida albicans, C. parapsilosis, C. krusei e C. tropicalis utilizando-se como
antifúngico padrão a micostatina.
3.3.3 – Avaliação da atividade antiproliferativa dos extratos brutos das folhas e suas frações, do extrato bruto dos galhos e suas frações As linhagens celulares cedidas pelo National Cancer Institute (NCI) dos
Estados Unidos da América, e utilizadas na triagem da atividade antiproliferativa
foram diluídas em dimetilsulfóxido de sódio (DMSO) na concentração de 1g/mL
resultando em soluções estoques.
Para o teste de atividade, foram plaqueados 100 μl de células em meio
RPMI/SFB/ gentamicina, nas suas respectivas densidades de inoculação, em
placas de 96 compartimentos. As placas foram incubadas por 24 horas a 37ºC em
atmosfera de 5% de CO2 e ambiente úmido, para readaptação ao ambiente. Após
esse período uma placa controle foi fixada através da adição de ácido
tricloroacético para determinação da quantidade de células no momento da adição
das drogas. Nas demais placas foram adicionadas as drogas nas concentrações
de 0,25; 2,5; 25 e 250 ug/mL e incubadas por 48 horas, centrifugadas por 3
minutos a 2000 rpm, e fixadas com 50 μl de ácido tricloroacético a 50% (TCA)
para as células aderidas e 80% para as células em suspensão (leucemia). Para
completar a fixação celular, as placas foram incubadas por 1 hora a 4ºC,
submetidas a quatro lavagens com água destilada para a remoção dos resíduos
de TCA, meio, SFB e metabólitos secundários e mantidas em temperatura
ambiente até a secagem completa. As placas foram coradas pela adição de 50μl
do corante proteico sulforrodamina B (SRB) a 0,4 % (peso/volume), dissolvido em
ácido acético a 1 %, e incubadas a 4 ºC, durante 30 minutos e lavadas por 4 vezes
com uma solução de ácido acético 1%. O resíduo da solução de lavagem foi
removido das placas, as quais foram secas à temperatura ambiente. O corante
ligado às proteínas celulares foi solubilizado com uma solução de Trizma Base na
concentração de 10μM e pH 10,5 por 5 minutos em ultra-som. A leitura
espectrofotométrica da absorbância foi realizada em 560 nm em um leitor de
microplacas. Para análise dos resultados, foram calculadas as médias das
absorbâncias descontadas de seus respectivos brancos, e calculada a
porcentagem de inibição de crescimento. Com os dados obtidos, foram
construídos gráficos relacionando a porcentagem de inibição de crescimento com
a concentração da substância teste. Como controle positivo foi padronizado o
quimioterápico doxorrubicina Os testes foram realizados com os extratos
brutos das folhas e galhos e frações, avaliados frente a um painel de células
tumorais humanas composto pelas linhagens apresentadas na Tabela 12. O
quimioterápico utilizado como controle foi a doxorrubicina.
Tabela 12: Linhagens de células tumorais utilizadas no teste de atividade
antiproliferativa
Código Tipo de célula tumoral K-562 Leucemia linfóide
UACC-62 Melanoma NCI-460 Pulmão tipo não pequenas células MCF-7 Mama
NCI-ADR Mama que expressa o fenótipo de resistência MDR
HT-29 Cólon OVCAR-3 Ovário
786-0 Rim PCO-3 Próstata
3.4 – Dados espectroscópicos das substâncias isoladas
3.4.1 – Substância LC-1: lup-20(29)-en-3β-ol
Fórmula molecular: C30H50O
IV ν KBr cm-1, (FIGURA 3)
max
3324 (O-H), 2917 – 2849 (C-H), 1472 – 1462 (CH2).
EM (70 eV), [m/e (%)], (FIGURA 4) [M.+ ] 426 (14,4); 411 (8,3); 281 (9,9); 219 (11,5); 218 (24,4); 208 (18,1); 207
(52,5); 203 (21,6); 191 (21,8); 190 (20,6); 189 (43,2); 176 (7,8); 175 (18,0); 173
(10,9); 163 (16,1); 162 (10,0); 161 (19,4); 149 (21,3); 148 (16,9); 147 (27,3); 145
(9,6); 137 (13,2); 136 (21,9); 135 (45,4); 134 (16,7); 133 (24,6); 123 (33,4); 122 (
21,8); 121 (47,5); 119 (32,3); 109 ( 58,9); 108 (36,0); 107 ( 55,0); 105 (31,3); 97
(16,4); 96 (18,5); 95 (78,1); 93 (62,0); 91 (29,8); 83 (23,8); 81 (79,4); 79 (44,6); 71
(24,4); 69 (73,7); 68 ( 29,7); 67 (55,1); 57 ( 32,4); 55 (87,6); 53 (16,6); 43 ( 100,0);
41 (81,5); 40 (47,2); 39 (11,0).
RMN 1H (CDCl3, 300 MHz), δ (H, mult., J em Hz, int.), (FIGURA 5)
4,69 (H-29; d;zsHz
2,4; 1H); 4,56 (H-29; m; 1H); 3,19 (H-3; dd;zsHz
10,8 e 5,4; 1H); 2,39 (H-19; spt; 1H); 1,91 (H-21; m; 1H); 1,88 (H-15; t;2,4; 1H);
1,68 (H-30; s; 3H); 1,66 (H-13; t; 3,0; 1H); 1,65 (H-1; 1H); 1,62 (H-12; 1H); 1,54 (H-
2; 2H); 1,49 (H-16; 2H); 1,41 (H-7; 2H); 1,41 (H-22; 1H); 1,38 (H-11; d; 1,5; 1H);
1,36 (H-18; 1H); 1,35 (H-21; m; 1H); 1,28 (H-9; 1H); 1,20 (H-11; 1H); 1,20 (H-22;
m; 1H); 1,07 (H-12; 1H); 1,03 (H-26;s; 3H); 0,99 (H-15; d; 2,1; 1H);0,97 (H-23; s;
3H); 0,94 (H-27; s; 3H); 0,88 (H-1; 1H); 0,83 (H-25; s; 3H); 0,79 (H-28; s; 3H); 0,76
(H-24; s; 3H); 0,70 (H-5; 1H).
RMN 13C (CDCl3, 75,5 MHz), δ (C, DEPT), (FIGURA 7)
38,6 (C-1, CH2); 27,3 (C-2, CH2); 79,0 (C-3, CH); 38,7 (C-4, C); 55,2 (C-5, CH);
18,2 (C-6, CH2); 34,1 (C-7, CH2); 40,7 (C-8, C); 50,3 (C-9, CH); 37,0 (C-10, C);
20,8 (C-11, CH2); 25,0 (C-12, CH2); 37,9 (C-13, CH); 42,7 (C-14, C); 27,3 (C-15,
CH2); 35,5 (C-16, CH2); 42,9 (C-17, C); 48,2 (C-18, CH); 47,9 (C-19, CH); 151,1
(C-20, C); 29,7 (C-21, CH2); 39,9 (C-22, CH2); 27,8 (C-23, CH3); 15,2 (C-24, CH3);
16,0 (C-25, CH3); 15,8 (C-26, CH3); 14,4 (C-27, CH3); 17,8 (C-28, CH3); 109,3 (C-
29, CH2); 19,2 (C-30 CH3).
3.4.2 – Substância LC-2: Mistura dos compostos:
LC-2(I) 24ξ- etil- colest- 5 enol
LC-2(II)24ξ- etil- colesta- 5, 22- dienol
LC-2(III) 24ξ- metil- colest- 5 enol
EM (70 eV), [m/e (%)], LC-2(I) (FIGURA 10) [M.+ ] 400 (28,2); 367 (19,0); 207 (41,6); 145 (42,2); 133 (22,0); 119 (20,3); 107
(29,7); 105 (26,2); 95 (28,5); 93 (25,9); 91 (28,6); 81 (35,4); 79 (25,8); 73 (23,3); 71
(29,1); 69 (31,9); 67 (28,6); 57 (44,6); 55 (60,7); 43 (100,0); 41 (56,9); 40 (45,0).
EM (70 eV), [m/e (%)], LC-2(II) (FIGURA 11) [M.+ ] 412 (23,7); 281 (27,0); 255 (23,0); 207 (50,0); 159 (21,7); 145 (21,8); 133
(30,1); 119 (19,8); 109 (21,8); 107 (25,2); 105 (25,7); 97 (29,4); 95 (28,8); 93
(27,5); 91 (28,1); 83 (52,1); 81 (47,9); 79 (30,5); 73 (23,9); 71 (20,6); 69 (57,5); 67
(32,7); 57 (28,8); 55 (100,0); 43 (69,0); 41 (63,8).
EM (70 eV), [m/e (%)], LC-2(III) (FIGURA 12) [M.+ ] 414 (23,6); 213 (16,7); 145 (21,0); 133 (15,7); 119 (18,0); 107 (28,9); 105
(25,6); 95 (30,1); 93 (24,3); 91 (24,8); 85 (16,1); 81 (33,7); 79 (24,7); 71 (22,8); 69
(31,8); 67 (25,7); 57 (52,2); 55 (58,7); 43 (100,0); 41 (48,9).
RMN 1H (CDCl3, 300 MHz), δ (H, mult., J em Hz, int.), Mistura LC-2 (FIGURA
13) 0,68 (H-18, 3H, LC-2 (I) e (III)); 0,69 (H-18, 3H, LC-2 (II)); 1,01 (H-19, 3H, LC-2 (I)
e (III)); 1,03 (H-19, 3H, LC-2 (II)); 0,91 (H-21, 3H, d, 6,3, LC-2 (I) e (III)); 1,03 (H-
21, 3H, LC-2 (II)); 0,85 (H-26, 3H, LC-2 (I) e (II)); 0,83 (H-26, 3H, LC-2 (III)); 0,80
(H-27, 3H, d, 6,6, LC-2 (I)); 0,79 (H-27, 3H, d, 6,6, LC-2 (II)); 0,83 (H-27, 3H, d,
6,3, LC-2 (III)); 0,77 (H-28, 3H, d, 6,6, LC-2 (I)); 0,80 (H-29, 3H, d, 6,6, LC-2 (II));
0,85 (H-29, 3H, d, 6,6, LC-2 (III)).
RMN 13C (CDCl3, 75,5 MHz), δ (C, DEPT), Mistura LC-2 (FIGURA 14)
37,18(C-1, CH2); 31,58(C-2, CH2); 71,79(C-3, CH); 42,25(C-4, CH2); 140,88(C-5,
C); 121,80(C-6, CH); 31,82(C-7, CH2); 31,82(C-8, CH); 50,08(C-9, CH); 36,43(C-
10, C); 20,97(C-11, CH2); 39,70(C-12, CH2); 42,25(C-13, C); 56,72(C-14, CH);
24,20(C-15, CH2); 28,15(C-16, CH2); 56,01(C-17, CH); 11,84(C-18, CH3); 19,28(C-
19, CH3); 40,20(C-20, CH); 18,92(C-21, CH3, LC-2(I) e(III)); 21,11(C-21, CH3, LC-
2(II)); 33,85(C-22, CH2, LC-2(I) e (III)); 138,42(C-22, CH, LC-2(II)); 39,70(C-23,
CH2, LC-2(I)); 129,36(C-23, CH, LC-2(II)); 28,81(C-23, CH2, LC-2(III)); 45,77(C-24,
CH, LC-2(I)); 51,19(C-24, CH, LC-2(II)); 56,01(C-24, CH, LC-2(III)); 26,00(C-25,
CH, LC-2(I)); 31,82(C-25, CH, LC-2(II)); 29,06(C-25, CH, LC-2(III)); 18,66(C-26,
CH3, LC-2(I) e (III)); 19,22(C-26, CH3, LC-2(II)); 19,70(C-27, CH3, LC-2(I) e (III));
19,22(C-27, CH3, LC-2(II)); 22,95(C-28, CH3, LC-2(I)); 25,30(C-28, CH2, LC-2(II));
18,66(C-28, CH2, LC-2(III)); 11,72(C-29, CH3, LC-2(I)); 12,12(C-29, CH3, LC-2(II)).
3.4.3 – Substância LC-3: 3β,28-diidróxilup-20(29)-ene
Fórmula molecular: C30H50O2
IV ν KBr cm-1, (FIGURA 15)
max
3407 e 3076 (O-H), 2942 – 2869 (C-H), 1455 (CH2), 1375 (CH3), 1106 – 1033 (=C-
H).
EM (70 eV), [m/e (%)], (FIGURA 16) [M.+ ] 456 (7,2); 411 (12,5); 248 (31,0); 234 (19,6); 220 (18,3); 207 (100,0); 203
(24,1); 190 (9,6); 189 (42,8); 175 (18,1); 147 (17,3); 137 (13,2); 135 (47,4); 123
(35,4); 122 ( 24,8); 119 (33,3); 109 ( 58,9); 107 ( 54,0); 95 (78,6); 83 (23,2); 81
(80,2); 79 (43,5); 69 (72,8); 68 ( 31,1); 57 ( 31,8); 55 (89,3); 53 (17,3); 40 (56,2); 39
(7,0).
RMN 1H (CDCl3, 300 MHz), δ (H, mult., J em Hz, int.), (FIGURA 17)
4,68 (H-29;zsHz
1H); 4,58 (H-29; 1H); 3,78 (H-28; dd; 10,2; 1H); 3,31 (H-28; dd; 10,8; 1H); 3,18 (H-
3; dd;zsHz
10,8 e 5,1; 1H); 2,38 (H-19; m; 1H); 1,95 (H-21; m; 1H); 1,92 (H-16; 1H); 1,84 (H-
22; 1H); 1,68 (H-30; s; 3H); 1,68 (H-15; 1H); 1,64 (H-1; 1H); 1,63 (H-12; 1H); 1,62
(H-13; 1H); 1,58 (H-2; 2H); 1,57 (H-18; 1H); 1,42 (H-11; m; 1H); 1,39 (H-7; 2H);
1,26 (H-9; 1H); 1,20 (H-16; d; 2,4; 1H); 1,18 (H-11; d; 4,2; 1H); 1,05 (H-12; 1H);
1,04 (H-15; d; 2,7; 1H); 1,02 (H-22; 1H); 1,02 (H-26; s; 3H); 0,98 (H-27; s; 3H);
0,97 (H-23; s; 3H); 0,89 (H-1; 1H); 0,82 (H-25; s; 3H); 0,76 (H-24; s; 3H); 0,67 (H-
5; 1H).
RMN 13C (CDCl3, 75,5 MHz), δ (C, DEPT), (FIGURA 19)
38,6 (C-1, CH2); 27,2 (C-2, CH2); 78,9 (C-3, CH); 38,7 (C-4, C); 55,2 (C-5, CH);
18,1 (C-6, CH2); 34,1 (C-7, CH2); 40,8 (C-8, C); 50,3 (C-9, CH); 37,0 (C-10, C);
20,7 (C-11, CH2); 25,0 (C-12, CH2); 37,2 (C-13, CH); 42,6 (C-14, C); 26,9 (C-15,
CH2); 26,9 (C-16, CH2); 47,7 (C-17, C); 48,6 (C-18, CH); 47,7 (C-19, CH); 150,6
(C-20, C); 29,6 (C-21, CH2); 39,8 (C-22, CH2); 27,8 (C-23, CH3); 15,2 (C-24, CH3);
15,9 (C-25, CH3); 15,8 (C-26, CH3); 14,6 (C-27, CH3); 60,5 (C-28, CH2); 109,7 (C-
29, CH2); 18,9 (C-30 CH3).
3.4.4 – Substância LC-4: 3β-O-glicopiranosídeo-24ξ-etil-colest-5enol
Fórmula molecular: C35H60O6
RMN 1H (CDCl3, 300 MHz), δ (H, mult., J em Hz, int.), (FIGURA 21)
5,35 (H-6; d;zsHz
1H); 5,07 (H-1’; d ; 7,8; 1H); 4,56 (H-3’; dl; 9,3; 1H); 4,45 - 4,25 (H-6’b, H-4’, H-2’;
m; 3H); 4,09 - 3,91 (H-6’a, H-5’, H-3α; m; 3H); 0,92 (H-19; s; 3H); 0,64 (H-18; s;
3H).
RMN 13C (CDCl3, 75,5 MHz), δ (C, DEPT), (FIGURA 22 )
37,3 (C-1, CH2); 30,0 (C-2, CH2); 78,4 (C-3, CH); 39,1 (C-4, CH2); 140,9 (C-5, C);
121,8 (C-6, CH); 31,9 (C-7, CH2); 31,8 (C-8, CH); 50,1 (C-9, CH); 36,7 (C-10, C);
21,0 (C-11, CH2); 39,7 (C-12, CH2); 42,3 (C-13, C); 56,6 (C-14, CH); 24,3 (C-15,
CH2); 28,3 (C-16, CH2); 56,0 (C-17, CH); 11,7 (C-18, CH3); 19,2 (C-19, CH3); 36,2
(C-20, CH); 18,9 (C-21, CH3); 34,0 (C-22, CH2); 26,1 (C-23, CH2); 45,8 (C-24, CH);
29,2 (C-25, CH); 18,7 (C-26, CH3); 19,7 (C-27, CH3); 23,1 (C-28, CH2); 11,9 (C-29,
CH3); 102,5 (C-1' CH); 75,2 (C-2’, CH); 77,9 (C-3’, CH); 71,5 (C-4’, CH); 78,3 (C-5’,
CH); 62,6 (C-6’, CH2).
3.4.5 – Substância LC-5: 2-(3,4-diidroxifenil)-3,4-diidro-1-2H-benzopiran-
3,5,7-triol. Fórmula molecular: C15H14O6
IV ν KBr cm-1, (FIGURA 23)
max
3324 (O-H), 1628 (C = C), 1148 (C-O)
EM (70 eV), [m/e (%)], (FIGURA 24) [M.+ ] 290 (14,0); 272 (44,2); 258 ( 17,0); 164 ( 45,3); 152 (36,4); 139 (100,0); 123
(45,4); 110 (6,6); 64 (13,6); 44 (17,6);39 (6,7).
RMN 1H (CD3OD, 300 MHz), δ (H, mult., J em Hz, int.), (FIGURA 25)
6,96 (H-2’; d;zsHz
1,8; 1H); 6,80 (H-6’; dd; 1,8; 1H); 6,76 (H-5’; d; 1H); 5,91 (H-6; d; 2,1; 1H); 5,93
(H-8; d; 2,4; 1H); 4,80 (H-2; m;zsHz
1H); 4,17 (H-3; m; 1H); 2,69 (H-4b; dd; 16,8 e 3,0; 1H); 2,87 (H-4a; dd; 16,8 e 4,5;
1H).
RMN 13C (CD3OD, 75,5 MHz), δ (C, DEPT), (FIGURAS 26)
79,9 (C-2, CH); 67,5 (C-3, CH); 29,2 (C-4a e C-4b, CH2); 157,8 (C-5, C); 96,4 (C-6,
CH); 158,2 (C-7, C); 95,9 (C-8, CH); 157,5 (C-9, C); 100,1 (C-10, C); 132,2 (C-1’,
C); 115,4 (C-2’, CH); 145,9 (C-3’, C); 146,1 (C-4’, C); 116,0 (C-5’, CH); 119,5 (C-6’,
CH).
3.4.6 – Substância LC-6: (siringaresinol-(2,6-Bis(4’,4’-O-bis-β-D-glicosídeo-3’,5’-
dimetoxi-fenil)-3,7-dioxabiciclo).
Fórmula molecular:
EM (70 eV), [m/e (%)], (FIGURA 27) 135 (36,5); 76 (19,2); 75 (100,0); 73 (82,7); 69 (12,2); 60 (84m0); 57 (36,1); 45
(48,2); 44 (47,2); 43 (55,5); 42 (18,0); 41 (11,4).
RMN 1H (D2O, 300 MHz), δ (H, mult., J em Hz, int.), (FIGURA 28)
6,82 (H-2 e H-6; s;zsHz
2H); 4,90 (H-7; d; 5,1; 1H); 3,32 (H-8, m; 1H); 4,34 (H-9; m; 1Hb); 3,99 (H-9; dd;
7,2; 1Ha); 3,51 (H-10; 1H); 3,88 (OCH3; s; 6H); 5,03 (H-1’; d; 7,2; 1H); 3,84 (H-5’;
dd; 12,0 e 6,0; 1Hb); 3,73 (H-5’; dd; 12,6 e 5,4; 1Ha); 3,57 (H-2’; d; 1,8; 1H); 3,54
(H-4’; 1H); 3,36 (H-3’; d; 1H).
RMN 13C (D2O, 75,5 MHz), δ (C, DEPT), (FIGURA 29)
141,1 (C-1; C); 106,9 (C-2 e C-6; CH); 155,9 (C-3 e C-5; C); 136,0 (C-4; C); 88,7
(C-7; CH); 56,2 (C-8; CH); 74,7 (C-9; CH2); 72,3 (C-10; CH); 103,1 (C-11; C); 59,2
(2x OCH3); 105,9 ( C-1’; CH); 79,3 (C-4’; CH); 78,7 (C-3’; CH); 76,4 (C-2’; CH);
63,5 (C-5’; CH2).
3.4.7 – Substância LC-7: 8-β-D-Glicopiranosil-5,7-dihidroxi-2-(4-
hidroxifenil)-4-H-benzopiran-4-ona Fórmula molecular: C21H20O10
IV ν KBr cm-1, (FIGURA 35)
max
3381 e 3237 (O-H), 1652 (C=O), 1614 (C = C), 1189 (C -O)
EM (70 eV), [m/e (%)], (FIGURA 36) [M.+ ] 432 (0,6); 414 (12,1); 378 (6,7); 342 ( 6,0); 324 (5,9); 323 (5,7); 312 (6,3);
310 (6,6); 294 ( 8,3); 284 ( 19,7); 283 (100,0); 270 (18,0); 254 (7,7); 165 (37,6);
123 (7,6); 121 (13,4); 119 (7,1); 118 (12,6); 93 (7,7); 89 (7,8); 69 (24,9); 65 (8,9);
63 (8,6); 61 (12,3); 60 (11,8); 55 (17,3); 53 (10,4); 51 (8,5); 44 (14,7); 43 (33,2); 42
(12,1); 39 (13,9).
RMN 1H (DMSO, 300 MHz), δ (H, mult., J em Hz, int.), (FIGURA 37)
8,02 (H-2’e H-6’; d;zsHz
8,4; 2H); 6,89 (H-3’ e H-5’; d; 8,4; 2H); 6,77 (H-3, s; 1H); 6,26 (H-6; s; 1H); 4,69
(H-1”; d; 9,9; 1H); 3,78 (H-2”; nd; 1H).
RMN 13C (DMSO, 75,5 MHz), δ (C, DEPT), (FIGURA 38)
164,5 (C-2, C); 102,8 (C-3, CH); 182,6 (C-4, C); 160,9 (C-5, C); 98,5 (C-6, CH);
163,0 (C-7, C); 104,4 (C-8, C); 156,5 (C-9, C); 105,0 (C-10, C); 122,0 (C-1’, C);
129,4 (C-2’, CH) 116,3 (C-3’, CH); 161,6 (C-4’, C); 116,3 (C-5’, CH); 129,4 (C-6’,
CH); 73,7 (C-1”, CH); 71,2 (C-2”, CH); 78,9 (C-3”, CH); 70,8 (C-4”, CH); 82,1 (C-5”,
CH); 61,6 (C-6”, CH2).
4 – RESULTADOS E DISCUSSÃO
4.1 – Método de extração e isolamento dos constituintes químicos de L.
candicans
O estudo químico de L. candicans iniciou-se com a preparação do extrato
bruto metanólico dos galhos e folhas (em separado) por remaceração à
temperatura ambiente. Pelo fato dessa espécie ser muito rica em taninos, optou-
se por submeter o extrato bruto dos galhos a um pré – fracionamento em coluna
de silica gel obtendo-se oito frações, denominadas de LCG-1, LCG-2, LCG-3,
LCG-4, LCG-5, LCG-6, LCG-7 e LCG-8 (frações Hexano, Hex./CHCl3 50% ,
Hex./CHCl3 75%, CHCl3, CHCl3/MeOH 25%, CHCl3/MeOH 50%, CHCl3/MeOH
75%, MeOH, respectivamente).
A fração LCG-4 foi submetida a uma CC em sílica gel, obtendo-se 15
frações, sendo que dessas frações foram isolados três substâncias denominadas
LC-1, LC-2 e LC-3.
A fração LCG-5 também foi submetida a uma CC em sílica gel, obtendo-se
15 frações, tendo sido isolada a substância denominada LC-4.
Da fração LCG-6 foi isolada a substância LC-5, através de CC em sílica gel
e da fração LCG-7 após CC em sílica gel foi isolada a substância LC-6.
O extrato bruto das folhas também foi submetido a um pré – fracionamento
em coluna de sílica gel obtendo-se quatro frações denominadas de LCF-1, LCF-2,
LCF-3 e LCF-4 (frações Hexano, AcOEt, CHCl3 e MeOH, respectivamente).
A fração LCF-2 foi submetida a uma CC em sílica gel, obtendo-se 8
frações(LCF-1 a LCF-8), sendo que dessas frações foram isolados mais
quantidade das substâncias LC-1 e LC-2 e detectado a presença de LC-3. As
frações LCF2-6 e LCF-2.7 por serem semelhantes foram reunidas e submetidas a
uma CC em sílica gel, obtendo-se 5 novas frações. Esta fração foi denominada
LCF-2.6. A fração LCF-2.6.3, por apresentar fluorescência sob luz ultravioleta no
comprimento de onda λ = 254 nm, foi submetida a uma CC em silica gel, obtendo-
se 4 frações (LCF-2.6.a a LCF-2.6.d). A fração LCF-2.6.3b, por apresentar perfil
cromatográfico menos complexo foi submetida a uma cromatografia em camada
delgada preparativa (CCDP). Foram retirados quatro faixas sendo que apenas
uma apresentou quantidade suficiente para análises espectroscópicas, a qual foi
denominada LCF-2.6b (4,0mg). Os dados de RMN de 1H e de 13C de LCF-2.6b
demonstraram que a substância estava impura, sendo que no processo de
purificação não houve quantidade de massa suficiente para continuação dos
estudos.
A fração LCF-3 foi evaporada à secura e ao ser solubilizada em metanol
houve a formação de um precipitado de coloração amarela, o qual foi denominado
de LC-7.
As demais frações não foram estudas ou por apresentarem pouca massa
ou devido à presença de taninos que dificultam muito o trabalho.
4.2 – Determinação estrutural dos compostos isolados
4.2.1 – Substância LC-1
A substância LC-1(35) (16,0mg) foi isolada da fração clorofórmica através
de coluna cromatográfica, como um sólido branco solúvel em clorofórmio.
(35)
O espectro no IV (Figura 3) apresentou banda de absorção em 3330 cm –1 referente a estiramento de ligação OH, em 2917 a 2849 cm –1 referente a
deformação axial de ligação C-H, e deformação angular de grupos metilenos em
1472 a 1462 cm –1.
29
24 23HO
26
27
28
25
3
11
5 7
15
13
3021
2218
17
1 9
2019
FIGURA 3 – Espectro no IV de LC-1
O espectro de massas de baixa resolução, obtido por inserção direta via
sólido (Figura 4), apresentou o pico base em m/e 43, relativo a uma clivagem da
cadeia lateral α ao anel com rearranjo e ganho de um hidrogênio (Silverstein e
col.,1994), e o pico do íon molecular em m/e 426 [M.+]. Verifica-se ainda os picos
em m/e 218[M.+] - [C14H23O]+, correspondendo a uma possível clivagem nos
carbonos C-8/C-14 e C-9/C-11(Esquema 3), e ainda um pico em m/e 191[207 –
OH/ + H]+ com transferência de um hidrogênio através de rearranjo (Branco &
Pizzoletti, 2002).
FIGURA 4 – Espectro de massas (70 eV) de LC-1
m/e 207 m/e 218
HO
m/e 426
HO
H
H
H HO
HO
Esquema 3- Provável fragmentação de LC-1
O espectro de RMN de 1H (Figura 5) de LC-1 apresentou sinais de
hidrogênios vinílicos em δ 4,56(dd) e δ 4,69 (d; J=2,4Hz), referentes aos
hidrogênios H-29 da ligação dupla terminal. O duplo dubleto em δ 3,18
(J =5,4 e 10,8Hz) é relativo ao hidrogênio carbinólico H-3, estes acoplamentos
indicaram a presença de β-configuração, e os sinais em δ 0,76 a δ 1,68 são
referentes aos metilas. Os dados de RMN de 1H de LC-1 (Tabela 13) foram
comparados com os dados da literatura para o lupeol, isolado da espécie
Clathrotropis branchypetala por Reynolds e col. (1986).
Tabela 13: Dados de RMN 1H de LC-1 e do lupeol (Reynolds e col.,1986).
Hidrogênio LC-1a δ 1H, mult. (no H, J)
Lupeolb δ 1H, multiplicidade
H-1 0,88, m (1H), 1,65, m (1H) 0,91, 1,68 H-2 1,54, m (2H) 1,54, q, 1,61, d H-3 3,18, dd (1H, 5,4 e 10,8) 3,18, dd H-5 0,70, m (1H) 0,69, d H-6 * 1,39, q, 1,54, d H-7 1,41, m (2H) 1,41, m H-9 1,28, m (1H) 1,28, d H-11 1,20, m (1H), 1,38, d (1H, 1,5) 1,25, q, 1,42, d H-12 1,07, m (1H), 1,62, m (1H) 1,07, q, 1,68, d H-13 1,66, t (1H, 3,0) 1,67, t H-15 0,99, d (1H, 2,1), 1,88, t (1H ,2,4) 1,01, d, 1,71, t H-16 1,49, m (2H) 1,38, t, 1,49, d H-18 1,36, m (1H) 1,37, t H-19 2,37, m (1H) 2,39, m H-21 1,35, m (1H), 1,91, m (1H) 1,33, m, 1,93, m H-22 1,20, m (1H), 1,41, m (1H) 1,20, m, 1,42, m
H-23 0,97, s (3H) 0,98, s H-24 0,76, s (3H) 0,77, s H-25 0,83, s (3H) 0,84, s H-26 1,03, s (3H) 1,04, s H-27 0,94, s (3H) 0.97, s H-28 0,79, s (3H) 0,79, s H-29 4,69, d (1H ,2,4), 4,50, m (1H) 4,69, m, 4,56, m H-30 1,68, s (3H) 1,69, s
a- RMN de 1H (CDCl3, 300MHz); b- RMN de 1H (CDCl3, 400MHz); As constantes
de acoplamento J entre parêntesis estão em Hertz. * Sinal encoberto.
As correlações entre os hidrogênios vinílicos foram confirmadas
através do mapa de contornos COSY (Figura 6) (Tabela 14). Este experimento
mostra também a correlação entre o duplo dubleto em δ 4,56 (H-29) e o metila em
δ 1,68(H-30). O septeto em δ 2,37 (H-19) está correlacionado com o sinal em δ
1,35 (Ha-21), que correlaciona - se com o sinal em δ 1,91 (Hb-21).
FIGURA 5 – Espectro de RMN de 1H (300 MHz, CDCl3) de LC-1
Tabela 14: Correlações observadas nos mapas de contornos HETCOR (13C x 1H )
e COSY (1H x 1H) da substância LC-1.
Carbono δ 13C / DEPT HETCOR (13C x1H)δ 1H
COSY (1H x1H) δ 1H
C-1 38,6(CH2) 0,88; 1,65
C-2 27,3(CH2) 1,54 3,18
C-3 79,0 (CH) 3,18 1,54
C-5 55,2(CH) 0,70
C-7 34,1(CH2) 1,41
C-9 50,3(CH) 1,28
C-11 20,8 (CH2) 1,20; 1,38
C-12 25,0 (CH2) 1,07; 1,62
C-13 37,9(CH) 1,66
C-15 27,3(CH2) 0,99
C-18 48,2(CH) 1,36
C-19 47,9 (CH) 2,37 1,35
C-21 29,7(CH2) 1,35; 1,91 1,91; 1,35
C-22 39,9 (CH2) 1,41
C-23 27,8(CH3) 0,97
C-24 15,2(CH3) 0,76
C-25 16,0(CH3) 0,83
C-26 15,8(CH3) 1,03
C-27 14,4(CH3) 0,94
C-28 17,8(CH3) 0,79
C-29 109,3 (CH2) 4,69; 4,56 4,56; 4,69
C-30 19,2 (CH3) 1,68 4,56
FIGURA 6 – Mapa de contornos 1Hx1H COSY (300 MHz, CDCl3) de LC-1
No espectro de RMN de 13C e DEPT (Figura 7) observa-se os sinais em δ
109,3 (C-29) e δ 151,1 (C-20), referentes a dupla terminal. O sinal em δ 79,0
corresponde ao metino carbinólico C-3, e os sinais da região de δ 14,4 a 27,8,
são atribuídos aos metilas C-23 a C28 e C-30. Os dados de RMN de 13C de LC-1
foram comparados com os dados da literatura para o lupeol, segundo Reynolds e
col.(1986), conforme Tabela 15.
Tabela 15: Dados de RMN 13C / DEPT de LC-1 e do lupeol (Reynolds e
col.,1986).
nº carbono (DEPT) LC-1a
δ13C Lupeolb
δ13C 1(CH2) 38,6 38,7 2(CH2) 27,3 27,4 3(CH) 79,0 78,9 4(C) 38,7 38,8
5(CH) 55,2 55,3 6(CH2) 18,2 18,3 7(CH2) 34,1 34,2 8(C) 40,7 40,8
9(CH) 50,3 50,4 10(C) 37,0 37,1
11(CH2) 20,8 20,9 12(CH2) 25,0 25,1 13(CH) 37,9 38,0 14(C) 42,7 42,8
15(CH2) 27,3 27,4 16(CH2) 35,5 35,5 17(C) 42,9 43,0
18(CH) 48,2 48,2 19(CH) 47,9 47,9 20(C) 151,1 150,9
21(CH2) 29,7 29,8 22(CH2) 39,9 40,0 23(CH3) 27,8 28,0 24(CH3) 15,2 15,4 25(CH3) 16,0 16,1 26(CH3) 15,8 15,9 27(CH3) 14,4 14,5 28(CH3) 17,8 18,0 29(CH2) 109,3 109,3 30(CH3) 19,2 19,3
a- RMN de 13C (CDCl3, 75MHz); b- RMN de 13C (CDCl3, 14,5MHz)
FIGURA 7 – Espectro de RMN de 13C e DEPT 90o e 135o (75 MHz, CDCl3)
de LC-1
O mapa de contornos HETCOR (13Cx1H) (Figura 8) mostra a correlação
dos sinais dos hidrogênios em δ 4,56 e δ 4,69 com o sinal de carbono em δ
109,3. O sinal de carbono em δ 38,6 está correlacionado com os sinais em δ
0,88 e 1,65 e o duplo dubleto em δ 3,18 correlaciona-se com o sinal em δ
79,0. Os sinais em δ 27,8, 15,2, 16,0 ,15,8, 14,4, 17,8 e 19,2 estão
correlacionados com os singletos em δ 0,97, 0,76, 0,83, 1,03, 0,94, 0,79 e 1,68,
respectivamente. Os dados obtidos nos mapas de contorno COSY (1Hx1H) e
HETCOR (13Cx 1H), confirmam as principais atribuições de LC-1.
FIGURA 8 – Mapa de contornos 1Hx13C HETCOR (75 MHz, CDCl3) de LC-1
Após análise dos dados espectrais e da comparação com os dados da
literatura, conclui-se que a substância LC-1 trata-se de um triterpeno da série dos
lupanos, o lupeol (lup-20(29)-en-3β-ol).
4.2.2 – Substância LC-2
A mistura LC-2 (36) foi isolada da fração clorofórmica do extrato bruto dos
galhos como cristais brancos (16mg) solúveis em clorofórmio.
(36)
No cromatograma obtido na análise por CG/EM de LC-2 observa-se a
existência de três substâncias (Figura 9), com tempos de retenção de 35,81 min.,
36,98 min. e 39,60 min. O espectro de massas para a substância com o tempo de
retenção 35,81 min. (Figura 10), apresenta o pico do íon molecular em m/e 400
[M.+], e o pico base em m/e 43. Para a substância com tempo de retenção 36,98
min. (Figura 11), o pico do íon molecular ocorre em m/e 412[M.+] e o pico base em
m/e 55, enquanto que para a substância com tempo de retenção 39,60 min.
(Figura 12), os mesmos ocorrem em m/e 414[M.+] e em m/e 43.
(I) R=
(II) R=
(III) R=
HO
R
1
2
3
45
6
7
89
10
11
12
13
14 15
17 1618
19
20
2122
2324
25
26
27
28
21
21
20
20
22
22
23
2324
24 25
25
26
26
27
27
28
28 29
29
FIGURA 9 – Cromatograma da mistura LC-2
FIGURA 10 – Espectro de massas (70 eV) de LC-2 (I)
FIGURA 11 – Espectro de massas (70 eV) de LC-2 (II)
FIGURA 12 – Espectro de massas (70 eV) de LC-2 (III)
O espectro de RMN de 1H (Figura 13) de LC-2 apresenta dois multipletos
na região de hidrogênios olefínicos, sendo o sinal entre δ 5,35 a 5,37 atribudo ao
hidrogênio H-6 e o sinal na região de δ 4,97 a 5,19 correspondente aos
hidrogênios H-22 e H-23. O multipleto em δ 3,47 a 3,58 é atribuido ao hidrogênio
carbinólico H-3, e os sinais entre δ 0,68 a 1,03 são referentes aos metilas.
FIGURA 13 – Espectro de RMN de 1H (300 MHz, CDCl3) de LC-2
Os deslocamentos químicos observados nos espectros de RMN de 13C e
DEPT (Figura 14), para a mistura LC-2 foram comparados com os dados
existentes na literatura (Goulart e col., 1993) para a mistura de esteróides
pertencentes a classe Δ5, 24α- etil- colest- 5 enol(sitosterol) (a), 24α- etil- colesta-
5, 22- dienol(estigmasterol) (b) e 24ξ- metil- colest- 5 enol (c), conforme Tabela
16, devido ao deslocamento químico do C-19 (δ 19,39) dos mesmos ocorrer na
mesma região que os da mistura LC-2 (C-19=δ 19,28). O deslocamento químico
do C-19 dos esteróides da classe Δ7 ocorre em δ 13,2.
FIGURA 14 – Espectro de RMN de 13C e DEPT 90o e 135o (75 MHz, CDCl3)
de LC-2
Tabela 16: Dados de RMN de 13C / DEPT da mistura LC-2 (isolada) e da mistura
24α- etil- colest- 5 enol(sitosterol) (a), 24α- etil- colesta- 5, 22-
dienol(estigmasterol) (b) e 24ξ- metil- colest- 5 enol (c) (Goulart e col., 1993).
Nº carbono
Misturaa
δ13C (DEPT) LC-2(I) LC-2(II) LC-2(III)
Misturab
δ13C (a) (b) (c)c
1 37,18(CH2) 37,18(CH2) 37,18(CH2) 37,25 37,25 37,24 2 31,58(CH2) 31,58(CH2) 31,58(CH2) 31,64 31,64 31,64 3 71,79(CH) 71,79(CH) 71,79(CH) 71,89 71,89 71,80 4 42,25(CH2) 42,25(CH2) 42,25(CH2) 42,29 42,29 42,27 5 140,88(C) 140,88(C) 140,88(C) 140,73 140,73 140,74 6 121,80(CH) 121,80(CH) 121,80(CH) 121,72 121,72 121,71 7 31,82(CH2) 31,82(CH2) 32,82(CH2) 31,89 31,89 31,90 8 31,82(CH) 31,82(CH) 31,82(CH) 31,89 31,89 31,88 9 50,08(CH) 50,08(CH) 50,08(CH) 50,12 50,12 50,12 10 36,43(C) 36,43(C) 36,43(C) 36,40 36,40 36,50 11 20,97(CH2) 20,97(CH2) 20,97(CH2) 21,08 21,08 21,08 12 39,70(CH2) 39,70(CH2) 39,70(CH2) 39,78 39,68 39,76 13 42,25(C) 42,25(C) 42,25(C) 42,29 42,29 42,20 14 56,72(CH) 56,72(CH) 56,72(CH) 56,75 56,87 56,75 15 24,20(CH2) 24,20(CH2) 24,20(CH2) 24,30 24,38 24,29 16 28,15(CH2) 28,15(CH2) 28,15(CH2) 28,24 28,24 28,24 17 56,01(CH) 56,01(CH) 56,01(CH) 56,05 55,93 56,04 18 11,84(CH3) 11,84(CH3) 11,84(CH3) 11,87 11,87 11,84 19 19,28(CH3) 19,28(CH3) 19,28(CH3) 19,38 19,38 19,38 20 36,10(CH) 40,20(CH) 36,10(CH) 36,16 40,50 36,13 21 18,92(CH3) 21,11(CH3) 18,92(CH3) 19,03 21,20 18,97 22 33,85(CH2) 138,42(CH) 33,85(CH2) 33,94 138,40 33,69 23 39,70(CH2) 129,36(CH) 28,81(CH2) 39,12 129,27 28,91 24 45,77(CH) 51,19(CH) 56,01(CH) 45,83 51,23 56,08 25 26,00(CH) 31,82(CH) 29,06(CH) 26,03 31,89 29,69 26 18,66(CH3) 19,22(CH3) 18,66(CH3) 18,76 19,00 18,76 27 19,70(CH3) 19,22(CH3) 19,70(CH3) 19,81 19,00 19,81 28 22,95(CH3) 25,30(CH2) 18,66(CH2) 23,06 25,42 18,24 29 11,72(CH3) 12,12(CH3) 11,99 12,27
a- RMN de 13C (CDCl3, 75MHz); b- RMN de 13C (CDCl3, 50,3MHz); c- RMN de 13C
(CDCl3, 75,5MHz);
Os epímeros correspondentes de a, b e c podem ser diferenciados através
dos dados de RMN de 1H dos metilas. Nas Tabelas 17, 18 e 19, estão os valores
dos deslocamentos químicos de RMN de 1H dos metilas da mistura LC-2 e os
dados da literatura para o 24α- metil- colest- 5 enol(campesterol) e 24β- metil-
colest- 5 enol(22,23-diidrobrassicasterol) (Rubinstein e col., 1976), do 24α- etil-
colest- 5,22-dienol(estigmasterol) e 24β- etil- colest- 5,22- dienol(poriferasterol)
(Akihisa e col., 1988), e do 24α- etil- colest- 5- enol(sitosterol) e 24β- etil- colest- 5-
enol(clionasterol) (Thompson e col., 1972), respectivamente.
Tabela 17: Dados de RMN de 1H para os metilas de LC-2(I) e do 24α- metil-
colest- 5 enol(campesterol) e 24β- metil- colest- 5 enol(22,23-diidrobrassicasterol)
(Rubinstein e col., 1976).
Metila LC-2(I)a δ 1H, mult. (J)
24αb δ 1H
24βb δ 1H
18 0,680 0,680 0,678
19 1,010 1,007 1,009
21 0,911, d (J= 6,3) 0,911 0,919
26 0,846, d (J= 6,6) 0,850 0,852
27 0,803, d (J= 6,6) 0,802 0,783
28 0,772, d (J= 6,6) 0,773 0,775
a-RMN de 1H (CDCl3, 300MHz); b- RMN de 1H (CDCl3, 200MHz); As constantes
de acoplamento J entre parêntesis estão em Hertz.
Tabela 18: Dados de RMN de 1H para os metilas de LC-2(II) e do 24α- etil- colest-
5,22-dienol(estigmasterol) e 24β- etil- colest- 5,22- dienol(poriferasterol) (Akihisa e
col., 1988).
Metila LC-2(II)a
δ 1H, mult. (J) 24αb
δ 1H, mult. (J) 24βb
δ 1H, mult. (J) 18 0,699 0,697, s 0,695, s
19 1,033 1,021, s 1,021, s
21 1,033 1,021, d (J= 6,6) 1,025, d (J= 6,6)
26 0,846, d (J= 6,6) 0,846, d (J= 6,6) 0,844, d (J= 6,0)
27 0,786, d (J= 6,6) 0,796, d (J= 7,1) 0,792, d (J= 6,6)
29 0,803, d (J= 6,6) 0,805, t (J= 7,4) 0,812, t (J= 7,4)
a-RMN de 1H (CDCl3, 300MHz); b- RMN de 1H (CDCl3, 400MHz); As constantes
de acoplamento J entre parêntesis estão em Hertz.
Tabela 19: Dados de RMN de 1H para os metilas de LC-2(III) e do 24α- etil-
colest- 5- enol(sitosterol) e 24β- etil- colest- 5- enol(clionasterol)(Thompson e col.,
1972).
Metila LC-2(III)a
δ 1H, mult. (J) 24αb
δ 1H, mult. 24βb
δ 1H, mult. 18 0,680 0,678 0,680
19 1,010 1,010 1,013
21 0,911, d (J = 6,3) 0,922 0,929
26 0,825, d (J = 6,3) 0,834 0,831
27 0,825, d (J = 6,3) 0,834 0,831
29 0,846, d (J = 6,6) 0,846 0,747
a-RMN de 1H (CDCl3, 300MHz); b- RMN de 1H (CDCl3, 400MHz); As constantes
de acoplamento J entre parêntesis estão em Hertz.
O sinal do metila 27 de LC-2(I) ocorre em δ 0,803, Tabela 17, enquanto que
para o 24α- metil- colest- 5 enol(campesterol) encontra-se em δ 0,802, e para o e
24β- metil- colest- 5 enol(22,23-diidrobrassicasterol) em δ 0,783 (Rubinstein e col.,
1976), sugerindo que LC-2(I) pode ser o campesterol.
Para o 24α- etil- colesta- 5,22-dienol(estigmasterol), o sinal do metila 29 é
observado em δ 0,805, Tabela 18, e para o 24β- etil- colest- 5,22-
dienol(poriferasterol) em torno de δ 0,812 (Akihisa e col., 1988), enquanto que o
metila 29 de LC-2(II) ocorre em δ 0,803, portanto semelhante ao estigmasterol.
Os deslocamentos dos metilas 21 (δ 0,911) e 29 (δ 0,846) de LC-2(III), ao
serem comparados com os dos esteróides 24α- etil- colest- 5- enol(sitosterol) e
24β- etil- colest- 5- enol(clionasterol), metila 21 (24α- δ 0,922 , 24β- δ 0,929) e
metila 29 (24α- δ 0,846, 24β- δ 0,747) (Garg & Nes, 1986), Tabela 19,
apresentaram semelhanças com o sitosterol.
4.2.3 – Substância LC-3
A substância LC-3 (37) (12,0mg) foi isolada da fração clorofórmica (LCG-4)
como um sólido branco solúvel em clorofórmio.
(37)
O espectro no IV apresentou uma banda forte de absorção em 3407cm-1 e
outra fraca em 3076cm-1, indicando a presença de dois grupos hidroxila. Na região
de 2942 a 2869 cm-1 apresentou deformação axial de ligação C-H, em 1455 cm-1
uma banda de deformação angular de grupo metileno, em 1375 cm-1 uma banda
de deformação angular de grupo metila, e na região de 1106 a 1033 cm-1
apresentou estiramento de grupo vinílico (=C-H) (Figura 15).
29
24 23OH
26
27
CH2OH25
3
11
5 7
15
13
3021
2218
17
1 9
2019
28
FIGURA 15 – Espectro no IV de LC-3 O espectro de massas obtido na análise por CG/EM, apresentou o pico do
íon molecular em m/e 456 [M.+] (Figura 16), e o pico base em m/e 207 [M.+ -
248]+, o qual sugere uma clivagem nos carbonos C-8/C-14 e C-9/C-11.
FIGURA 16 – Espectro de massas (70 eV) de LC-3
O espectro de RMN de 1H (Figura 17) de LC-3 apresentou em δ 4,58 e δ
4,68, sinais de hidrogênios vinílicos referentes aos hidrogênios H-29 da ligação
dupla terminal. O sinal na região de δ 3,18 (dd; 5,1 e 10,8 Hz) é relativo ao
hidrogênio carbinólico H-3, cujos acoplamentos indicaram a presença de β-
configuração, e os dos metilas ocorrem entre δ 0,97 a δ 1,68.
Os dois dubletos de dubletos em δ 3,78 (dd; 10,2 e 3,9 Hz) e δ 3,31
(dd;10,8 e 3,0 Hz), e a desproteção nos hidrogênios H-16 (δ 1,20 e 1,92) e H-22
(δ 1,02 e 1,84 ), em relação aos de LC-1, evidenciam a presença de um metileno
carbinólico em LC-3 no lugar do metila-28 de LC-1. Os dados de RMN de 1H de
LC-3 foram comparados com os dados da literatura para a betulina, isolado da
espécie Salacia cordata, (Tinto e col. 1992) (Tabela 20).
Tabela 20: Dados de RMN 1H de LC-3 e da betulina (Tinto e col. 1992)
Hidrogênio LC-3a δ 1H, mult. (no H, J)
Betulinab δ 1H, multiplicidade
H-1 1,64, m (1H); 0,89, m (1H) 1,65; 0,89 H-2 1,58, m (2H) 1,58 H-3 3,18, dd (1H; 5,1 e 10,8) 3,18 H-5 0,67, d (1H; 9,0) 0,67 H-6 * 1,52; 1,38 H-7 1,39, m (2H) 1,39 H-9 1,26, m (1H) 1,27 H-11 1,42, m (1H); 1,18, d (1H; 4,2) 1,41; 1,19 H-12 1,63, m (1H); 1,05, m (1H) 1,63; 1,03 H-13 1,62, m (1H) 1,64 H-15 1,68, m (1H); 1,04, d (1H; 2,7) 1,70; 1,04 H-16 1,92, m (1H); 1,20, d (1H; 4,2) 1,93; 1,20 H-18 1,57, m (1H) 1,57 H-19 2,38, m (1H) 2,38 H-21 1,95, m (2H) 1,95; 1,40 H-22 1,84, d (1H; 3,3); 1,02, m (1H) 1,86; 1,02 H-23 0,97, s (3H) 0,96 H-24 0,76, s (3H) 0,76 H-25 0,82, s (3H) 0,82 H-26 1,02, s (3H) 1,02 H-27 0,98, s (3H) 0,98 H-28 3,78, dd (1H;3,9 e 10,2); 3,31, dd (1H;3,0
e 10,8) 3,77; 3,31
H-29 4,68, m (1H); 4,58, m (1H) 4,68; 4,58 H-30 1,68, s (3H) 1,68
a-RMN de 1H (CDCl3, 300MHz); b- RMN de 1H (CDCl3, 400MHz); As constantes
de acoplamento J entre parêntesis estão em Hertz.
* sinal encoberto
FIGURA 17 – Espectro de RMN de 1H (300 MHz, CDCl3) de LC-3
Os assinalamentos dos deslocamentos químicos destes hidrogênios de
LC-3 podem ser confirmados pelos dados obtidos no experimento COSY (1Hx1H)
(Figura 18) (Tabela 21)., onde observa-se as correlações entre o duplo dubleto
em δ 3,18 (H-3) e o metileno em δ 1,58 (H-2), o metila em δ 0,82 (H-25) e o
metileno em δ 1,64 (H-1) e o metino em δ 1,26 (H-9), e entre H-9 e o metila (H-26).
Destaca-se também as correlações entre os hidrogênios vinílicos H-29 da dupla
terminal (δ4,68 e δ 4,58), o sinal em δ 4,58 (H-29) e o metila em e δ 1,68 (H-30) e
o sinal dos metilas em δ 0,97 (H-23) com δ 0,76 (H-24).
FIGURA 18 – Mapa de contornos 1Hx1H COSY (300 MHz, CDCl3) de LC-3 Tabela 21: Correlações observadas nos mapas de contorno HETCOR (13C x 1H)
e COSY ( 1H x 1H) da substância LC-3.
Carbono LC-3
δ13C (DEPT)
HETCOR ( 13C x 1H)
δ 1H
COSY (1H x 1H)
δ 1H
C-1 38,6 (CH2) 1,64; 0,89 0,89; 1,64; 0,82
C-2 27,2 (CH2) 1,58 3,18
C-3 78,9 (CH) 3,18 1,58
C-5 55,2 (CH) 0,67
C-7 27,2 (CH2) 1,39
C-9 50,3 (CH) 1,26 0,82; 1,02
C-11 20,7 (CH2) 1,42; 1,18
C-12 25,0 (CH2) 1,63; 1,05
C-13 37,2 (CH) 1,62
C-15 26,9 (CH2) 1,68; 1,04 1,92
C-16 29,0(CH2) 1,92; 1,20 1,20; 1,92; 1,68
C-18 48,6 (CH) 1,57 2,38
C-19 47,7 (CH) 2,38 1,57
C-21 29,6 (CH2) 1,95
C-22 33,8 (CH2) 1,84; 1,02 1,02; 1,84
C-23 27,8 (CH3) 0,97 0,76
C-24 15,2 (CH3) 0,76 0,97
C-25 15,2 (CH3) 0,82 1,64; 1,26
C-26 15,8 (CH3) 1,02 1,26
C-27 14,6 (CH3) 0,98
C-28 60,5 (CH2) 3,78; 3,31 3,31; 3,78
C-29 109,7 (CH2) 4,68; 4,58 4,58; 4,68
C-30 18,9 (CH3) 1,68 4,58
No espectro de RMN de 13C e DEPT (Figura 19) observa-se os sinais em δ
109,7 referente ao metileno C-29 da dupla terminal, em δ 78,9 ao metino
carbinólico C-3, em δ 60,5 ao metileno carbinólico C-28 e na região entre δ 14,6 a
27,8, aos metilas. Os dados de RMN de 13C foram comparados com os dados da
literatura para a betulina, segundo Tinto e col., (1992), (Tabela 22).
Tabela 22: Dados de RMN de 13C / DEPT de LC-3 e da betulina (Tinto e
col.1992).
Nº carbono (DEPT) LC-3a
δ 13C Betulinab
δ 13C 1(CH2) 38,6 38,7 2(CH2) 27,2 27,2 3(CH) 78,9 78,9 4(C) 38,7 38,8
5(CH) 55,2 55,3 6(CH2) 18,1 18,3 7(CH2) 34,1 34,3 8(C) 40,8 40,9
9(CH) 50,3 50,4 10(C) 37,0 37,2
11(CH2) 20,7 20,8 12(CH2) 25,0 25,3 13(CH) 37,2 37,3 14(C) 42,6 42,7
15(CH2) 26,9 27,0 16(CH2) 29,0 29,2 17(C) 47,7 47,8
18(CH) 48,6 48,8 19(CH) 47,7 47,8 20(C) 150,6 150,6
21(CH2) 29,6 29,8 22(CH2) 33,8 34.0 23(CH3) 27,8 27,9 24(CH3) 15,2 15,4 25(CH3) 15,9 16,1 26(CH3) 15,8 15,9 27(CH3) 14,6 14,8 28(CH2) 60,5 60,2 29(CH2) 109,7 109,6 30(CH3) 18,9 19,1
a- RMN de 13C (CDCl3, 75MHz); b- RMN de 13C (CDCl3, 100,6MHz)
No mapa de contornos HETCOR (13C x 1H) foram verificadas as correlações
entre o metileno carbinólico C-28 (δ 60,5) e os dois dubletos de dubleto em δ 3,78
e δ 3,31; entre o metileno C-29 (δ 109,7) da ligação dupla terminal e os
hidrogênios em δ 4,68 e δ 4,58; entre o metino carbinólico C-3 (δ 78,9) e o duplo
dubleto em δ 3,18 (Figura 20). As demais correlações dos mapas de contornos
COSY e HETCOR estão representadas na Tabela 21.
FIGURA 19 – Espectro de RMN de 13C e DEPT 90o e 135o (75 MHz, CDCl3)
de LC-3
FIGURA 20 – Mapa de contornos 1Hx13C HETCOR (75 MHz, CDCl3) de LC-3
Após análise dos dados espectrais e comparação com os dados da
literatura, conclui-se que a substância (37) trata-se de um triterpeno da série dos
lupanos, a betulina (3β,28-Diidróxilup-20(29)-ene).
4.2.4 – Substância LC-4
A substância LC-4 (38) foi isolada da fração LCG-5 como um sólido branco
(18,0 mg), solúvel em clorofórmio.
(38)
No espectro de RMN de 1H (Figura 21), observa-se os sinais referentes aos
metilas entre δ 0,64 a 0,98. Os sinais dos hidrogênios carbinólicos da unidade
glicosídica foram observados na região entre δ 3,91 a 4,98. Em δ 5,07 encontra-se
um dubleto largo atribuído ao hidrogênio anomérico (H-1’), com constante de
acoplamento de 7,8 Hz, indicando a β-configuração. O dubleto em δ 5,35
corresponde ao hidrogênio H-6 da dupla ligação, e o sinal do hidrogênio
carbinólico H-3α encontra-se na região de δ 3,91 a 4,09, entre os sinais dos
hidrogênios do açúcar. Os valores dos deslocamentos químicos de RMN de 1H de
LC-4 foram comparados com os dados da literatura (Matida e col., 1996) para o
glicopiranosilsitosterol, (Tabela 23).
O
HO
HO
HO OHO
12
3
45
67
89
10
11
12
13
1415
1617
18
19
20
21 22
2324 25 26
27
2829
1'
2'3'4'
5'6'
Tabela 23: Dados de RMN de 1H de LC-4 e do glicopiranosilsitosterol (Matida e
col., 1996)
Hidrogênio LC-4a δ 1H, mult. (no H, J)
Glicopiranosilsitosterolb δ 1H, mult. (no H, J)
H-6 5,35, d (1H) 5,36, d (1H) H-18 0,64, s (3H) 0,66, s (3H) H-19 0,92, s (3H) 0,93, s (3H) H-1’ 5,07, d (1H, 7,8) 5,04, d (1H, 7,6) H-3’ 4,56, dl (1 H, 9,3) 4,56, dl (1H, 10,8)
H-6’b, H-4’, H-2’ 4,45 – 4,25, m 4,48 – 4,21, m H-6’a, H-5’, H-3α 4,09 – 3,91, m 4,17 – 3,82, m
a- RMN de 1H (CDCl3, 300MHz); b- RMN de 1H (C5D5N, 200MHz); Constante de
acoplamento J entre parêntesis estão em Hertz.
FIGURA 21 – Espectro de RMN de 1H (300 MHz, CDCl3) de LC-4
Os espectros de RMN de 13C e DEPT (Figura 22) mostram os sinais dos
carbonos insaturados em δ 140,9 (C) e δ 121,8 (CH). A posição da ligação dupla
Δ5 foi confirmada pela absorção do carbono C-19 em δ 19,2, enquanto que para os
esteróides Δ7 o deslocamento químico do carbono C-19 ocorreria em δ 13,0
(Goulart e col., 1993).
O deslocamento químico em δ 102,5 é característico de carbono anomérico
(CH-1’) e os sinais em δ 78,5 (CH), δ 77,9 (CH), δ 71,5 (CH) e δ 62,6 (CH2) são
atribuídos aos carbonos da unidade glicosídica C-3’, C-5’, C-2’, C-4’ e C-6’,
respectivamente. Os valores dos deslocamentos químicos de RMN de 13C obtidos
para a substância LC-4 foram comparados com os valores dos deslocamentos
químicos encontrados na literatura (Matida e col., 1996) para o 3-O-β-D-
glicopiranosilsitosterol, (Tabela 24).
Tabela 24: Dados de RMN de 13C / DEPT de LC-4 e do 3-O-β-D-glicopiranosilsitosterol (Matida e col., 1996) nº carbono (DEPT) LC-4a
δ 13C 3-O-β-D-glicopiranosilsitosterol b
δ 13C 1(CH2) 37,3 37,2 2(CH2) 30,0 29,9 3(CH) 78,4 78,2 4(CH2) 39,1 39,0 5(C) 140,9 140,6
6(CH) 121,8 122,6 7(CH2) 31,9 31,9 8(CH) 31,8 31,8 9(CH) 50,1 50,0 10(C) 36,7 36,6
11(CH2) 21,0 21,0 12(CH2) 39,7 39,6 13(C) 42,3 42,2
14(CH) 56,6 56,5 15(CH2) 24,3 24,2 16(CH2) 28,3 28,2 17(CH) 56,0 55,9 18(CH3) 11,7 11,7 19(CH3) 19,,2 19,1 20(CH) 36,2 36,1 21(CH3) 18,9 18,9 22(CH2) 34,0 33,9 23(CH3) 26,1 26,1 24(CH) 45,8 45,7 25(CH) 29,2 29,2 26(CH3) 18,7 18,7 27(CH3) 19,7 19,7 28(CH2) 23,1 23,1 29(CH3) 11,9 11,9 1’- (CH) 102,5 102,2 2’- (CH) 75,2 75,0 3’- (CH) 77,9 77,0 4’- (CH) 71,5 71,3 5’- (CH) 78,3 78,1 6’- (CH2) 62,6 62,5
a- RMN de 13C (CDCl3, 75MHz); b- RMN de 13C (C5D5CN, 75,5MHz)
FIGURA 22 – Espectro de RMN de 13C e DEPT 90o e 135o (75 MHz, CDCl3)
de LC-4
Considerando que os deslocamentos químicos de RMN de 13C/DEPT da
substância LC-4 mostraram coerência com os dados do 3-O-β-D-
glicopiranosilsitosterol (3-β-O-glicopiranosídeo-24ξ-etil-colest-5-enol), pode-se
concluir que trata-se da mesma substância.
4.2.5 – Substância LC-5
A substância LC-5 (34) foi isolada da fração LCG-6 (Tabela 4) como um
sólido marrom (9,0mg), solúvel em metanol.
(34)
O espectro no I V (Figura 23) apresenta uma banda larga em 3324 cm-1
característica de estiramento de grupo hidroxila. Observa-se também a presença
de uma banda de absorção referente a deformação axial de ligação C=C em 1628
cm-1 e uma banda de absorção relativa a estiramento de ligação C-O em
1148 cm-1.
FIGURA 23 – Espectro no IV de LC-5
O
OH
HO
OH
OH
OH
78
9
65
10
4
3
21'2' 3'
4'
5'6'
O espectro de massas de baixa resolução, obtido na análise por CG/EM
apresentou o pico do íon molecular em m/e 290 [M.+] (Figura 24), o pico base em
m/e 139, que sugere uma clivagem β ao anel A, com a perda do fragmento m/e
152 (C8H8O3), e ainda o fragmento em m/e 123 [139 - OH/ +H], sugerindo a perda
de um grupo hidroxila e transferência de um hidrogênio através de rearranjo.
FIGURA 24 – Espectro de massas (70 eV) de LC-5
No espectro de RMN de 1H (Figura 25) observa-se cinco sinais
característicos de hidrogênios aromáticos em δ 6,76(d; H-5’), δ 6,80(dd; H-6’), δ
6,96(d; H-2’), δ 5,93(d; H-8), δ 5,91(d; H-6). O dubleto em δ 6,76 (J= 8,1 Hz),
revelou padrão de acoplamento “orto” com H-6’. O duplo dubleto em δ 6,80 (J=1,8
e 8,1Hz), demonstrou padrão de acoplamento “meta” com H-2’ e ”orto” com H-5’, e
o dubleto em δ 6,96 (J=1,8 Hz) confirmou acoplamento ”meta” com H-6’. As
constantes de acoplamento dos hidrogênios H-6 e H-8 em δ 5,91 (d, 2,4 Hz), e
5,93 (d, 2,4 Hz) revelaram padrão de acoplamento “meta”.
A presença dos hidrogênios em δ 2,87 (H-4b, dd, 4,5 e 16,8 Hz) e δ 2,69
(H-4a, dd, 3,0 e 16,8 Hz) indicou que LC-5 poderia pertencer à classe dos flavan-
3-ol, e os sinais de H-2 e H-3 em δ 4,80 (s) e 4,17 (m) evidenciaram a presença de
heteroátomo ligado ao carbono C-2 e de um grupo hidroxila ligado ao carbono
C-3.
Na Tabela 25 estão comparados os dados de RMN de 1H de LC-5 com os
dados da literatura para a (-)-epicatequina, isolado da espécie Licania pittieri por
Mendez e col. (1995).
Tabela 25: Dados de RMN de 1H de LC-5 e da (-)-epicatequina (Mendez e col.
1995)
Hidrogênio LC-5a δ 1H, mult. (nº H, J)
(-)-epicatequinab
δ 1H, mult. (nº H, J) H-2 4,82, s (1H) 4,80 (1H)
H-3 4,17, m (1H) 4,10 (1H)
H-4a 2,69, dd (1H; 3,0 e 16,8 ) 2,78, dd (1H; 5,6 e 16,0)
H-4b 2,87, dd (1 H; 4,5 e 16,8 ) 2,68, dd (1H; 8,1 e 16,0)
H-6 5,91, d (1H; 2,4) 5,91, d (1H; 1,9)
H-8 5,93, d (1H; 2,4) 5,93, d (1H; 1,9)
H-2’ 6,96, d (1H; 1,8) 6,84, d (1H; 1,7)
H-5’ 6,76, d (1H; 8,1) 6,75
H-6’ 6,80, dd (1H; 1,8 e 8,1) 6,75
a – RMN de 1H (CD3OD, 300 MHz); b – RMN de 1H (CD3OD, 200,13 MHz); As
constantes de acoplamento J entre parênteses estão em Hertz
A substância LC-5 foi comparada com a (-)- epicatequina isolada da
espécie L. divaricata por Tanaka (2002). No trabalho citado a técnica de diferença
de NOE foi utilizada para confirmação da estereoquímica dos hidrogênios H-4a, H-
4b, H-3 e H-2, os quais encontram-se em δ 2,72, δ 2,86, δ 4,17 e δ 4,81,
respectivamente. Os deslocamentos químicos dos hidrogênios H-4a, H-4b, H-3 e
H-2 de LC-5 ocorrem em δ 2,69, δ 2,87, δ 4,17, e δ 4,82, respectivamente,
portanto semelhante à (-)- epicatequina.
No espectro de RMN de 13C e DEPT (Figura 26) observou-se os sinais em
δ 132,2; 115,4; 145,9; 146,1; 116,0 e 119,5 relativos aos carbonos aromáticos C-1’
a C-6’. Os sinais em δ 157,8; 96,4; 158,2; 95,9; 157,5 e 100,1, também
característicos para aromáticos são relativos aos carbonos C-5 a C-10. A
presença de um sinal referente a CH2 saturado em δ 29,2, atribuído ao C-4 e os
sinais em δ 79,9 e 67,5, referentes aos carbonos C-2 e C-3, confirmaram que LC-5
tratava-se de um flavonol. Os dados de RMN de 13C foram comparados com os
dados da literatura para a (-)-epicatequina, segundo Agrawal e col.(1989),
conforme Tabela 26.
Tabela 26: Dados de RMN 13C / DEPT de LC-5 e da (-)-epicatequina (Agrawal e
col. 1989).
Nº carbono (DEPT) LC-5a
δ 13C (-)-epicatequinab
δ 13C 2 (CH) 79,9 79,4 3 (CH) 67,5 66,9 4 (CH2) 29,2 29,1 5 (C) 157,8 157,4
6 (CH) 96,4 96,2 7 (C) 158,2 157,4
8 (CH) 95,9 95,7 9 (C) 157,5 157,0 10 (C) 100,1 99,7 1’ (C) 132,2 132,1
2’ (CH) 115,4 115,2 3’ (C) 145,9 145,2 4’ (C) 146,1 145,2
5’ (CH) 116,0 115,5 6’ (CH) 119,5 119,4
a – RMN de 13C (CD3OD, 75,5 MHz); b – RMN de 13C [(CD3)2CO]
FIGURA 25 – Espectro de RMN de 1H (300 MHz, CD3OD) de LC-5
FIGURA 26 – Espectro de RMN de 13C e DEPT 90o e 135o (75 MHz,
CD3OD) de LC-5
Após a análise dos dados espectrais e da comparação com os dados da
literatura, conclui-se que LC-5 é um flavonóide, pertencente à classe dos flavan-3-
ol, a (-)-epicatequina (2-(3,4-diidroxifenil)-3,4-diidro-1-2H-benzopiran-3,5,7-triol).
4.2.6 – Substância LC-6
A substância LC-6 (39) foi isolada da fração LCG-7 (fração CHCl3/ MeOH
75%) como um sólido branco, solúvel em água.
(39)
O espectro de massas de baixa resolução, obtido na análise por CG/EM
(Figura 27), não exibiu o pico do íon molecular e apresentou o pico base em m/e
75 [C6H3]+. Os principais fragmentos apresentados são m/e 135[(C6H2(OCH3)2) +
H], 60, 45 e 43.
FIGURA 27 – Espectro de massas (70 eV) de LC-6
1
5
1"3"
5"O
HO
OH
HO
OHH3CO
H3CO
O
1' 3'
5'1"' 3"'
5"'O OH
HO
OH
HOOCH3
OCH3
O
O
O
HH
9
9'7
7'8
8'
3
O espectro de RMN de 1H (Figura 28) apresentou um singleto em δ 6,82,
com integração para dois hidrogênios aromáticos, um singleto em δ 3,88, com
integração para seis hidrogênios, correspondendo a dois grupos metoxilas. Os
sinais em δ 4,92 (1H) e δ 3,32 (m,1H) são referentes a dois hidrogênios
metilenicos e os sinais em δ 4,35 (dd, J= 6,7 e 2,5 Hz, 1Hb) e δ 4,00 (dd, J=6,7 e
2,5 Hz, 1Ha) a hidrogênio metilenico. O dubleto em δ 5,03 (J= 7,2 Hz), relativo a
hidrogênio anomérico, e os dois duplo dubletos em δ 3,82 (dd, J=12,0 e 2,7 Hz,
1Hb) e δ 3,72 (dd, 12,0 e 4,8 Hz, 1Ha) indicaram a presença de uma unidade
glicosídica. Os sinais referentes aos demais hidrogênios carbinólicos foram
observados na região entre δ 3,35 a 3,57.
FIGURA 28 – Espectro de RMN de 1H (300 MHz, D2O) de LC-6
Os espectros de RMN de 13C e DEPT (Figura 29) apresentaram
sinais de quatro carbonos aromáticos, sendo um relativo a dois CH e três a
carbonos não hidrogenados em δ 107,0, δ 136,1, 141,1 e 155,8, juntamente
com sinais referentes a dois grupos metoxilas em δ 59,3, dois metinos em δ
88,8 e 56,2, e um metileno em δ 74,7. Também foram observados seis
sinais referentes a unidade glicosídica, em δ 106,0, correspondente ao
carbono anomérico (CH), e os demais sinais de carbonos carbinólicos em δ
79,4 (CH), 78,7 (CH), 76,6 (CH), 72,3 (CH) e 63,5 (CH2).
FIGURA 29 – Espectro de RMN de 13C e DEPT 90o e 135o (75 MHz, D2O)
de LC-6
As correlações observadas nos mapas de contornos HMQC,
COSY, NOESY e no mapa de contornos HMBC encontram-se nas Tabelas 27 e 28. O mapa de contornos HMQC permitiu correlacionar os sinais
de CH e CH2 com os respectivos hidrogênios, destacando-se as
correlações do metino carbinólico em δ 88,8 com δ 4,92, do metileno
carbinólico em δ 74,8 com δ 4,35 e 4,00 e também a do metileno da
unidade glicosídica em δ 63,4 com δ 3,72 e 3,82 (Figura 30). A correlação
entre os hidrogênios em δ 5,03 e 3,57, e as demais correlações
observadas no mapa de contornos COSY (Figura 31) entre os hidrogênios
na região de δ 3,35 a 3,83 (Tabela 27), permitiram a confirmação dos sinais
da unidade glicosídica. Ainda foram observadas as correlações entre os
hidrogênios em δ 4,92 com 3,32, em δ 3,32 com 4,92 e 4,35, e de δ 4,35
com 3,32, indicando a presença na estrutura do fragmento abaixo, formado
pelo metino (δH-8 3,32) ligado ao metino carbinólico (δH-7 4,92) e este ao
metileno carbinólico (δH 4,35).
HC CH CH2
O O
FIGURA 30 – Mapa de contornos 13Cx1H HMQC (300 MHz, CDCl3) de LC-6
FIGURA 31 – Mapa de contornos 1Hx1H COSY (300 MHz, D2O) de LC-6
O mapa de contornos NOESY mostrou as correlações do singleto em δ
6,82 com o grupo metoxila em δ 3,89, indicando que o último é substituinte do anel
benzênico e está “orto” em relação ao hidrogênio aromático e com os sinais em δ
4,92 (H-7) e δ 3,32 (H-8) anteriormente observado no mapa de contornos COSY.
Também foram observadas as correlações entre o hidrogênio carbinólico em δ
5,03 e os hidrogênios em δ 3,54 e 3,35 (Figuras 32a e 32b).
FIGURA 32a – Mapa de contornos NOESY (300 MHz, D2O) de LC-6
FIGURA 32b – Mapa de contornos NOESY (300 MHz, D2O) de LC-6 (expansão)
No mapa de contornos HMBC (Figura 33) foram observadas as correlações
entre o hidrogênio aromático em δ 6,82 e os carbonos aromáticos em δ 155,8 e δ
136,1, e ainda a correlação com o metino carbinólico em δ 88,8 (δH 4,92),
indicando que o referido hidrogênio estaria a três ligações deste, e que portanto, o
anel aromático estaria ligado ao mesmo. Observou-se também a correlação entre
o hidrogênio em δ 4,35 (CH2 carbinólico) com o metino carbinólico em 88,8,
indicando que os mesmos estariam a três ligações um do outro, reforçando a
observação no COSY. Ainda foram observadas as correlações entre o grupo
metoxila em δ 3,88 com o carbono aromático em δ 155,8 e do hidrogênio
glicosídico em δ 3,55 (CH) com δ 79,3 (CH) e δ 76,6 (CH) indicando que este
hidrogênio estaria a três ligações em relação ao primeiro carbono e a duas
ligações em relação ao outro.
FIGURA 33 – Mapa de contornos HMBC (300 MHz, D2O) de LC-6
Estes dados indicaram a presença de um anel aromático com substituição
simétrica do tipo 3,5-dimetoxi-4-O-glicosilado ligado ao metino carbinólico do
fragmento proposto anteriormente, resultando na unidade apresentada na Figura 34, como parte da estrutura de LC-6.
FIGURA 34 – Correlações de HMBC de LC-6 Tabela 27: Correlações observadas nos mapas de contornos HMQC (13C x 1H),
COSY (1H x 1H) e NOESY da substância LC-6.
Carbono LC-6 (δ13C / DEPT)
HMQC (3C x 1H) δ 1H
COSY (1H x 1H) δ 1H
NOESY δ 1H
C-2/6 107,0 (CH) 6,82 6,82 4,92, 3,89, 3,32
C-7 88,8 (CH) 4,92 3,32 6,82, 3,89
C-8 56,2 (CH) 3,32 4,92, 4,35 6,82
C-9 74,8 (CH2) 4,35 4,00, 3,32
C-9 74,8 (CH2) 4,00 4,35
2 x OMe 59,9 3,89 6,82, 4,92
C-1” 106,0 (CH) 5,03 3,57 3,35, 3,55
C-2” 76,6 (CH) 3,57 5,03, 3,55
C-3” 78,7 (CH) 3,55 3,57, 3,51 5,03
C-4” 72,3 (CH) 3,51 3,55, 3,35
C-5” 79,3 (CH) 3,35 3,55 5,03
C-6” 63,4 (CH2) 3,72, 3,82 3,72, 3,83, 3,35
Tabela 28: Correlações observadas no mapa de contornos HMBC da substância
LC-6.
Carbono LC-6 (δ13C / DEPT)
HMBC δ 1H
C-2/6 107,0 (CH) 6,82 C-3/5 155,8 (C) 6,82, 3,89 C-1 136,1 (C) 6,82 C-7 88,8 (CH) 6,82, 4,35
C-2” 76,6 (CH) 3,55 C-5” 79,3 (CH) 3,57, 3,55
HOHO
OH
OHO
H3CO
H3CO
O
O
A inexistência de outros sinais nos espectros de RMN de 1H e de 13C
necessários para que se concluísse a proposta estrutural para LC-6, conduziu à
hipótese de uma estrutura simétrica. Assim, através de consulta à literatura
chegou-se à substância simétrica liriodendrina (Deyama, 1983 e Vermes e col.,
1991), cujos dados de RMN de 1H e de 13C foram confrontados com os de LC-6
(Tabelas 29 e 30), mostrando-se concordantes.
Tabela 29: Dados de RMN de 1H de LC-6, e da liriodendrina (Vermes col. 1991)
Hidrogênio LC-6a δ 1H, mult. (nº H, J)
Liriodendrinab
δ 1H, mult. (no H, J) H-2,2’/6,6’ 6,82, s (4H) 6,64, s (4H)
H-7,7’ 4,92, m (2H, J= enc. solv.) 4,68, d (2 H, J= 4,0 Hz) H-8,8’ 3,32, m (2H) 3,09, m (2H) H-9,9’ 4,00, dd (2Ha, J=6,7 e 2,5) 4,20, m (2Ha)
4,35, dd (2Hb, J= 6,7 e 2,5) 4,30, d (2Hb) OCH3 3,89 s (6H) 3,75, s (6 H) OCH3 3,89 s (6H) 3,75, s (6 H)
H-1”,1”’ 5,03, d (2H, J=7,2) 4,99, m (2H) H-2”,2”’ 3,57, d (2H, J=1,8)
H-3’” 3,55, m (2H) H-4”, 4”’ 3,51, dd (2H) H-5”,5”’ 3,35, dd (2H)
H-6”,6”’a 3,72, dd (2H, J=12,0, e 4,8) H-6”,6”’ b 3,82, dd (2H, J=12,0, e 2,7)
a – RMN de 1H (D2O, 300 MHz); b – RMN de 1H (DMSO-d6, 360 MHz)
Tabela 30: Dados de RMN de 13C/DEPT de LC-6, do e da Liriodendrina (Deyama,
1983)
nº carbono (DEPT)
LC-6a
δ 13C Liriodendrinab
δ 13C 1,1’ (C) 136,0 134.0
2,2’/6,6’ (CH) 107,0 104,4
3,3’ /5,5’ (C) 155,8 152,6
4,4’ (C) 141,2 137,1
7,7’ (CH) 88,8 85,0
8,8’ (CH) 56,2 53,6
9,9’ (CH2) 74,7 71,4
2 x OMe 59,3 56,5
1”,1”‘(CH) 106,0 102,8
2”,2”’(CH) 76,6 74,2
3”,3”’ (CH) 78,7 76,5
4”,4”’ (CH) 72,3 70,0
5”,5”’ (CH) 79,3 77,1
6”,6”’ (CH2) 63,4 61.0
a – RMN de 13C (D2O, 75 MHz); b – RMN de 13C (DMSO-d6, 100 MHz).
Após a análise dos dados espectrais e comparação com os dados
encontrados na literatura, conclui-se que LC-6 é uma lignana, a liriodendrina
(siringaresinol-(2,6-Bis(4’,4’-O-bis-β-D-glicosídeo-3’,5’-dimetoxi-fenil)-3,7-
dioxabiciclo).
4.2.7 – Substância LC-7
A substância LC-7 (33) foi isolada da fração LCF-3 como cristais amarelos
(8,0 mg) solúveis em DMSO.
(33)
O espectro no I V (Figura 35) apresentou duas bandas em 3381 cm-1 e
3237 cm-1, características de absorção relativa a estiramento de grupo OH livre.
Observou-se também absorção em 1652 cm-1, relativa a estiramento de carbonila
α,β - insaturada em ligação de hidrogênio. Em 1614 cm-1 observa-se uma banda
de absorção característica de deformação axial de ligação C=C de aromáticos e
em 1189 cm-1 uma banda de absorção relativa a estiramento de ligação C-O.
FIGURA 35 – Espectro no IV de LC-7
O
OOH
HO HO
OH
2
3
45
6
78
9
10
1'
2'3'
4'
5'
6'
1"
2"3"
4"5"
6"
OHO
HO
OH
O espectro de massas de baixa resolução (Figura 36), obtido por inserção
direta via sólido, revelou o pico base em m/e 283, não mostrou o pico do íon
molecular e apresentou os fragmentos em m/e 414 [M.+ - H2O], e em 270 [M.+ -
Glic.].+, sendo o primeiro correspondente a perda de uma molécula de H2O e o
outro a perda de molécula de açúcar e ganho de hidrogênio por rearranjo.
FIGURA 36 – Espectro de massas (70 eV) de LC-7
No espectro de RMN de 1H (Figura 37) observou-se os sinais em δ 6,89 (d;
H-3’ e H-5’) e em δ 8,02 (d; H-2’ e H-6’), com integração para 2 hidrogênios cada,
referentes aos quatro hidrogênios aromáticos da parte aglicona, os quais
apresentaram padrão de acoplamento “orto” (J= 8,4 Hz). Além destes, os dois
singletos em δ 6,26 e 6,77 são referentes aos hidrogênios H-6 e H-3.
Observou-se também um singleto em δ 13,16, com integração para um
hidrogênio, atribuido à hidroxila ligada ao carbono C-5, em ligação de hidrogênio
com a carbonila em C-4. Os dois singletos que aparecem na região acima de δ
10,0, são atribuidos aos hidrogênios das demais hidroxilas da aglicona.
Os sinais referentes aos hidrogênios da unidade glicosídica são observados
na região de δ 3,0 a 3,6. O dubleto em δ 4,69 é referente ao hidrogênio H-1” e o
multipleto em δ 3,78 ao hidrogênio H-2”. As hidroxilas glicosídicas estão situadas
na região de δ 4,60 a 5,03.
Os dados de RMN de 1H obtidos para LC-7 foram comparados com os
dados da literatura para a vitexina isolada por Hilsenbeck e Mabry (1990) (Tabela 31).
Tabela 31: Dados de RMN 1H de LC-7 e da vitexina (Hilsenbeck e Mabry, 1990)
H LC-7a δ 1H, mult. (nº H, J)
Vitexinab
δ 1H, mult. (nº H, J) H-6 6,26, s (1H) 6,20, s (1H)
H-3 6,77, s (1H) 6,40, s (1H)
H-3’ e H-5’ 6,89, d (2H; 8,4) 6,85, d (2H; 9,0)
H-2’ e H-6’ 8,02, d (2H, 8,4) 7,80, d (2H, 9,0)
H-1” 4,69, d (1H, 9,9) 5,0-5,2, d (1H)
H-2” 3,78, m (1H) 3,90, m (1 H)
a – RMN de 1H (DMSO, 300 MHz); b – RMN de 1H (CCl4, 90 MHz). As constantes
de acoplamento J entre parênteses estão em hertz.
Os dados de RMN de 13C e DEPT (Figura 38) de LC-7 sugeriram a
possibilidade da substância ser uma flavona C-glicosilada, devido a ausência de
deslocamento químico na região referente a carbono anomérico. O deslocamento
químico em δ 182,6 indicou a presença de carbonila α,β - insaturada. Os carbonos
não hidrogenados C-4’, C-5 e C-7, ligados a grupos hidroxila, são observados em
δ 161,6, 160,9 e 163,0, respectivamente.
FIGURA 37 – Espectro de RMN de 1H (300, MHz, DMSO-d6) de LC-7
Os sinais em δ 164,5 e 102,8 são atribuidos aos carbonos C-2 e C-3 da
ligação dupla. Os sinais em δ 116,3 e 129,4 são referentes aos carbonos
equivalentes CH-3’/5’ e CH-2’/6’.
Além dos sinais referentes à unidade aglicona, observa-se os sinais
referentes à unidade glicosídica na região de δ 61,0 a 83,0. Os dados de RMNde 13C obtidos para LC-7 foram comparados com os da literatura para a vitexina
(Tabela 32), isolada por Palme e colaboradores (1994).
FIGURA 38 – Espectro de RMN de 13C e DEPT 90o e 135o (75 MHz,
DMSO-d6) de LC-7
Tabela 32: Dados de RMN de 13C / DEPT de LC-7 e da vitexina (Palme e col.,
1994).
Nº carbono (DEPT) LC-7a
δ 13C Vitexinab
δ 13C 2 (C) 164,5 165,3
3 (CH) 102,8 102,6 4(C) 182,6 182,8 5 (C) 160,9 160,8
6 (CH) 98,5 99,0 7(C) 163,0 162,1 8 (C) 104,4 104,3 9 (C) 156,5 160,9 10 (C) 105,0 104,3 1’ (C) 122,0 121,0
2’ (CH) 129,4 128,9 3’ (CH) 116,3 115,9 4’ (C) 161,6 161,1
5’ (CH) 116,3 115,9 6’ (CH) 129,4 128,9 1” (CH) 73,7 73,6 2” (CH) 71,2 71,0 3” (CH) 78,9 78,7 4” (CH) 70,8 71,5 5” (CH) 82,1 81,9 6” (CH2) 61,6 61,2
a – RMN de 13C (DMSO, 75,5 MHz); b – RMN de 13C (DMSO, 50,0 MHz).
Após a análise dos dados espectrais e a comparação com os dados da
literatura, conclui-se que LC-7 é uma flavona C-glicosilada, a vitexina (8-β-D-
Glicopiranosil-5,7-dihidroxi-2-(4-hidroxifenil)-4-H-benzopiran-4-ona).
Do estudo químico de L. candicans foram isolados sete substâncias, os
esteróides (36) e (38), os triterpenos (35) e (37), o flavonóide (34), a flavona (33) e
a lignana (39). Dessa forma, um dos objetivos deste trabalho foi alcançado, pois
através do mesmo , o potencial químico de L. candicans foi avaliado podendo
servir para estudos futuros. As substâncias (35), (36), (37) e (39) foram isoladas
pela primeira vez no gênero.
5 – Estudo da atividade biológica
5.1 – Avaliação da atividade antibacteriana do extrato bruto dos galhos e do extrato bruto das folhas
Os extratos brutos dos galhos e das folhas foram testados frente aos
microorganismos Staphylococcus aureus, Bacillus subtilis e Escherichia coli,
utuilizando-se os padrões antibacterianos penicilina, vancomicina e tetraciclina,
respectivamente, e a técnica de microdiluição, conforme Tabela 33. O teste
realizado com os extratos brutos das folhas e dos galhos não apresentou
resultado significativo frente à maior concentração utilizada.
Tabela 33: Dados da atividade antibactriana dos extratos brutos das folhas e
galhos de L. candicans
Microrganismos
Frações
S. aureus*
ATCC 25923
B. subtilis*
ATCC 6623
E. coli*
ATCC 25922
CMB CMI CMB CMI CMB CMI
Ext. bruto folhas >1000 >1000 >1000 >1000 >1000 >1000
Ext. bruto galhos >1000 >1000 >1000 >1000 >1000 >1000
CMB – concentração mínima bactericida; CMI – concentração mínima inibitória; os
valores de CMB e CMI são dados em μg/mL.
* Todos os microrganismos foram testados na concentração de 1,5 x 105 UFC/mL
5.2 – Avaliação da atividade antifúngica dos extratos brutos das folhas e dos galhos e substâncias isoladas
Os extratos brutos dos galhos e das folhas foram testados frente aos
microorganismos Candida albicans, Candida parapsilosis, Candida krusei e
Candida tropicalis. A avaliação utilizou o teste de susceptibilidade antifúngica pelo
método de microdiluição, usando a micostatina como antifúngico padrão. Os
resultados estão representados na Tabela 34.
Tabela 34: Dados da atividade antifúngica dos extratos brutos das folhas e dos
galhos de L. candicans
Microganismos
Frações
C. albicans C.
parapsilosis
C. krusei C. tropicalis
CMI CMF CMI CMF CMI CMF CMI CMF
Ext. bruto folhas
>1000 >1000 >1000 >1000 >62,5 >125 >1000 >1000
Ext. bruto galhos
>1000 >1000 >1000 >1000 >1000 >1000 >1000 >1000
CMF – concentração mínima fungicida; CMI – concentração mínima inibitória; os
valores de CMF e CMI são dados em μg/mL.
O extrato bruto das folhas de L. candicans apresentou atividade antifúngica
contra a cepa C. krusei com resposta significativa na concentração de 62,5μg/mL
para ação fungiostática e 125 μg/mL para ação fungicida. As demais cepas
demonstraram-se resistentes ao extrato bruto das folhas.
Os testes realizados com os extratos brutos dos galhos e com as
substâncias (LC-1, LC-2, LC-3,LC-4,LC-5 e LC-7) não demonstraram atividade
inibitória ou fungicida através da metodologia e das concentrações testadas.
5.3 – Avaliação da atividade antiproliferativa
A atividade antiproliferativa de L. candicans, extrato bruto das folhas
e suas frações (Tabela 35), extrato bruto dos galhos e frações (Tabela 36) foi
testada utilizando-se as linhagens de células cancerígenas MCF-7 (mama), NCI-
ADR (mama com fenótipo de resistência a múltiplas drogas), UACC-62
(melanoma), NCI460 (pulmão), PCO3 (próstata), HT29 (cólon), OVCAR (ovário),
K562 (leucemia) e 786-0 (rim). O padrão utilizado como controle positivo foi o
quimioterápico doxorrubicina, cuja atividade antiproliferativa concentração
dependente, com efeito citostático (inibição de crescimento), efeito citocida (morte
celular) e seletividade entre as linhagens estudadas pode ser observada na
Figura 39. 5.3.1 – Avaliação da atividade antiproliferativa do extrato bruto das folhas e frações Hexano, CHCl3, AcOEt e MeOH Tabela 35: Dados da atividade antiproliferativa (efeito citostático) dos extratos
brutos das folhas e das frações Hexano, CHCl3, AcOEt e MeOH de L. candicans
(Figuras 40 a 44).
Linhagens
Frações
UACC62
MIC/%
MCF-7
MIC/%
NCI-460
MIC/%
OVCAR
MIC/%
PCO3
MIC/%
HT29
MIC/%
786-0
MIC/%
NCI-ADR
MIC/%
Ext. bruto folhas
Hexano
CHCl3
AcOEt
MeOH
Na
Na
Na
250/65
Na
Na
Na
Na
250/75
Na
Na
Na
Na
250/65
Na
Na
Na
Na
250/75
Na
Na
Na
Na
250/60
Na
Na
Na
Na
250/75
Na
25/85
250/100
250/100
Na
250/100
Na
Na
Na
250/75
Na
MIC – concentração mínima citostática (μg/mL); % – percentagem de inibição de
crescimento celular; Na – não ativa.
O extrato bruto das folhas de L. candicans apresentou atividade
antiproliferativa, com efeito citostático (inibição de crescimento) de 85% na
concentração de 25 μg/mL, bem como morte celular em 25 % na maior
concentração utilizada, somente para células de câncer de rim, demonstrando
seletividade para esta célula cancerígena (Figura 40). As frações Hexano, CHCl3 e MeOH apresentaram somente inibição de
crescimento em 100 % na maior concentração utilizada para a linhagem de células
de câncer de rim, evidenciando a seletividade dessas frações em relação à célula
acima citada (Figuras 41 a 43). A fração AcOEt apresentou baixa atividade
antiproliferativa sem seletividade, somente com efeito citostático (inibição de
crescimento) na maior concentração utilizada para todas as linhagens estudadas,
exceto células de câncer de rim, para a qual não apresentou efeito citocida ou
citostático (Figura 44).
Concentração (μg/mL)
FIGURA 40 – Teste antiproliferativo do extrato bruto das folhas de L. candicans
10-3 10-2 10-1 100 101 102 103
-100
-75
-50
-25
0
25
50
75
100
10-3 10-2 10-1 100 101 102 103
-100
-75
-50
-25
0
25
50
75
100
250252,50,250
UACC.62MCF.7NCI.460OVCARPC0.3HT.29786-0NCI.ADR
Por
cent
agem
de
Cre
scim
ento
Concentração (μg/mL)
FIGURA 41 – Teste antiproliferativo da fração hexano
10-3 10-2 10-1 100 101 102 103
-100
-75
-50
-25
0
25
50
75
100
10-3 10-2 10-1 100 101 102 103
-100
-75
-50
-25
0
25
50
75
100
250252,50,250
UACC.62MCF.7NCI.460OVCARPC0.3HT.29786-0NCI.ADR
Por
cent
agem
de
Cre
scim
ento
Concentração (μg/mL)
FIGURA 42 – Teste antiproliferativo da fração CHCl3
10-3 10-2 10-1 100 101 102 103
-100
-75
-50
-25
0
25
50
75
100
10-3 10-2 10-1 100 101 102 103
-100
-75
-50
-25
0
25
50
75
100
250252,50,250
UACC.62MCF.7NCI.460OVCARPC0.3HT.29786-0NCI.ADR
Por
cent
agem
de
Cre
scim
ento
Concentração (μg/mL)
FIGURA 43 – Teste antiproliferativo da fração MeOH
10-3 10-2 10-1 100 101 102 103
-100
-75
-50
-25
0
25
50
75
100
10-3 10-2 10-1 100 101 102 103
-100
-75
-50
-25
0
25
50
75
100
250252,50,250
UACC.62MCF.7NCI.460OVCARPC0.3HT.29786-0NCI.ADR
Porc
enta
gem
de
Cre
scim
ento
Concentração (μg/mL)
FIGURA 44 – Teste antiproliferativo da fração AcOEt 5.3.2 – Avaliação da atividade antiproliferativa do extrato bruto dos galhos e frações Hexano, CHCl3, CHCl3/ MeOH (50%) e MeOH
10-3 10-2 10-1 100 101 102 103
-100
-75
-50
-25
0
25
50
75
100
10-3 10-2 10-1 100 101 102 103
-100
-75
-50
-25
0
25
50
75
100
250252,50,250
UACC.62MCF.7NCI.460OVCARPC0.3HT.29786-0NCI.ADR
Por
cent
agem
de
Cre
scim
ento
Tabela 36: Dados da atividade antiproliferativa (efeito citostático) dos extratos
brutos dos galhos e frações Hexano, CHCl3, CHCl3/ MeOH (50%) e MeOH de L.
candicans (Figuras 45 a 49).
Linhagens
Fração
UACC62
MIC/%
K562
MIC/%
MCF-7
MIC/%
NCI-460
MIC/%
OVCAR
MIC/%
PCO3
MIC/%
HT29
MIC/%
786-0
MIC/%
NCI-ADR
MIC/%
E. B.
Galhos
Hexano
CHCl3
CHCl3/ MeOH
50%
MeOH
Na
Na
250/75
Na
250/60
0,25/60
Na
250/100
Na
250/95
Na
Na
250/98
Na
250/65
Na
250/60
250/95
250/60
250/95
25/60
Na
250/98
Na
250/60
250/60
Na
250/75
Na
250/65
Na
250/55
250/75
Na
250/65
250/100
Na
250/85
Na
Na
250/100
Na
250/80
Na
Na
MIC – concentração mínima citostática (μg/mL); % – percentagem de inibição de
crescimento celular; Na – não ativa.
O extrato bruto dos galhos de L. candicans apresentou atividade
antiproliferativa concentração dependente com efeito citostático (inibição de
crescimento), efeito citocida (morte celular) e pequena seletividade entre as
linhagens estudadas, destacando-se o efeito citocida frente às linhagens de
células de câncer de ovário, pulmão, mama, melanoma e leucemia produzindo
morte celular na maior concentração utilizada em 25, 30, 45, 60 %,
respectivamente (Figura 45).
A fração Hexano foi seletiva para células de câncer de pulmão e cólon de
útero, inibindo o crescimento em 60 e 55%, respectivamente, na maior
concentração utilizada. E a fração CHCl3/ MeOH (50%) foi seletiva para célula de
câncer de pulmão inibindo o crescimento em 60% na maior concentração utilizada
(Figuras 46 e 47).
FIGURA 45 –Teste antiproliferativo do extrato bruto dos galhos de L. candicans
10-3 10-2 10-1 100 101 102 103
-100
-75
-50
-25
0
25
50
75
100
250252,50,250
UACC.62MCF.7NCI.460K.562OVCARPC0.3C786.0NCI.ADR###
Porc
enta
gem
de
Cre
scim
ento
Concentração (μg/mL)
10-3 10-2 10-1 100 101 102 103
-100
-75
-50
-25
0
25
50
75
100
10-3 10-2 10-1 100 101 102 103
-100
-75
-50
-25
0
25
50
75
100
250252,50,250
UACC.62MCF.7NCI.460K.562OVCARPC0.3C786.0NCI.ADR###
Porc
enta
gem
de
Cre
scim
ento
Concentração (μg/mL)
Concentração (μg/mL)
FIGURA 46 – Teste antiproliferativo da fração Hexano
10-3 10-2 10-1 100 101 102-100
-75
-50
-25
0
25
50
75
100
10-3 10-2 10-1 100 101 102-100
-75
-50
-25
0
25
50
75
100
250252,50,250
UACC.62MCF.7NCI.460K.562OVCARPC0.3HT.29786-0NCI.ADR
Concentração (μg/mL)
FIGURA 47 – Teste antiproliferativo da fração CHCl3/ MeOH (50%)
As frações CHCl3 e MeOH apresentaram somente efeito citostático, sem
seletividade entre as linhagens estudadas, sendo que a fração MeOH não
apresentou atividade antiproliferativa para as linhagens de células de câncer de
rim e de mama com fenótipo de resistência a múltiplas drogas como apresentado
para a fração CHCl3 (Figuras 48 e 49).
10-3 10-2 10-1 100 101 102 103
-100
-75
-50
-25
0
25
50
75
100
10-3 10-2 10-1 100 101 102 103
-100
-75
-50
-25
0
25
50
75
100
250252,50,250
UACC.62MCF.7NCI.460OVCARPC0.3HT.29786-0NCI.ADR
Por
cent
agem
de
Cre
scim
ento
Concentração (μg/mL)
FIGURA 48 – Teste antiproliferativo da fração CHCl3
10-3 10-2 10-1 100 101 102-100
-75
-50
-25
0
25
50
75
100
10-3 10-2 10-1 100 101 102-100
-75
-50
-25
0
25
50
75
100
250252,50,250
UACC.62MCF.7NCI.460K.562OVCARPC0.3HT.29786-0NCI.ADR
Por
cent
agem
de
Cre
scim
ento
Concentração (μg/mL)
FIGURA 49 – Teste antiproliferativo da fração MeOH
Estudos demonstram que muitas plantas com atividade antitumoral contém
o triterpeno lupeol como um de seus principais constituintes (Miles & Kokopol,
1976), (Saleem et al., 2001). Desta forma, levando-se em consideração que esta
substância foi isolada tanto nos galhos como nas folhas de L. candicans e que
ambos os extratos brutos e principalmente a fração CHCl3 dos galhos
demonstraram capacidade antiproliferativa contra algumas células tumorais
humanas, pode-se esperar que o resultado seja atribuído à presença desta
substância, necessitando-se de mais estudos para avaliação de resultados. E
ainda, o lupeol é reportado na literatura como possuidor de várias propriedades
farmacológicas como antinflamatória, antiartrítica, antimutagênica (Geetha e col,
1998) e no controle de formação de pedras no rim ( Vidya & VaralaKshmi, 2000).
Assim, torna-se necessário dar continuidade aos estudos quanto a atividade
farmacológica de L. candicans.
10-3 10-2 10-1 100 101 102-100
-75
-50
-25
0
25
50
75
100
10-3 10-2 10-1 100 101 102-100
-75
-50
-25
0
25
50
75
100
250252,50,250
UACC.62MCF.7NCI.460K.562OVCARPC0.3HT.29786-0NCI.ADR
Por
cent
agem
de
Cre
scim
ento
6 – CONCLUSÕES
O estudo fitoquímico de Luehea candicans resultou no isolamento das
substâncias LC-1 a LC-7, identificadas com base na análise de seus dados
espectrais de IV, EM, RMN de 1H e de 13C e comparação com os dados existentes
na literatura.
Dos galhos de L. candicans foram isolados dois triterpenos denominados
como LC-1 e LC-3, pertencentes à série dos lupanos, o lupeol (lup-20(29)-en-3β-
ol) (LC-1) e a betulina (3β,28-diidróxilup-20(29)-ene) (LC-3).
As substâncias LC-2 e LC-4 foram identificadas como esteróides. LC-2 uma
mistura dos esteróides 24ξ- etil- colest- 5 enol (sitosterol) (LC-2(I)), 24ξ- etil-
colesta- 5, 22- dienol (estigmasterol) (LC-2(II)) e 24ξ- metil- colest- 5 enol (LC-
2(III)) e LC-4 o esteróide glicosilado 3-O-β-D-glicopiranosilsitosterol (3-β-O-
glicopiranosídeo-24ξ-etil-colest-5-enol).
A substância LC-5 foi identificada como um flavonóide, pertencente à
classe dos flavan-3-ol, a (-)-epicatequina (2-(3,4-diidroxifenil)-3,4-diidro-1-2H-
benzopiran-3,5,7-triol).
Ainda dos galhos de L. candicans foi isolado a substância LC-6, identificada
como uma lignana, a liriodendrina (siringaresinol-(2,6-Bis(4’,4’-O-bis-β-D-
glicosídeo-3’,5’-dimetoxi-fenil)-3,7-dioxabiciclo).
O estudo fitoquímico das folhas de Luehea candicans resultou no
isolamento da substância LC-7, identificada como uma flavona C-glicosilada, a
vitexina (8-β-D-Glicopiranosil-5,7-dihidroxi-2-(4-hidroxifenil)-4-H-benzopiran-4-
ona).
As substâncias LC-1 e LC-2 foram também isoladas nas folhas de L.
candicans e a substância LC-3 foi também detectada nas folhas através de CCD.
As substâncias isoladas são conhecidas e o isolamento de LC-5 e LC-7, também isoladas da espécie L. divaricata, pode ser indicativo de possíveis
marcadores taxonômicos do gênero.
Os triterpenos da série dos lupanos LC-1 e LC-3 e a lignana LC-6 foram
isolados no gênero pela primeira vez, assim como a mistura de esteróides LC-2.
Os testes de atividade antibacteriana do extrato bruto das folhas e galhos
dessa espécie não apresentaram resultados significativos frente aos
microrganismos e às concentrações testadas através da metodologia empregada.
A avaliação da atividade antifúngica do extrato bruto dos galhos e das
substâncias (LC-1, LC-2, LC-3,LC-4,LC-5 e LC-7) não apresentou resultado
significativo frente aos microorganismos nas concentrações testadas através da
metodologia da microdiluição.
O extrato bruto das folhas de L. candicans apresentou atividade antifúngica
contra a cepa C. krusei com ação fungicida na concentração de 125 μg/mL (CMF)
e fungiostática na concentração de 62,5 μg/mL (CMI).
O extrato bruto das folhas de L. candicans e as frações Hexano, CHCl3 e
MeOH foram seletivas para células de câncer de rim apresentando atividade
antiproliferativa, com efeito citostático (inibição de crescimento) em 85% na
concentração de 25 μg/mL para o extrato bruto e 100% (250μg/mL) para as
frações. O extrato bruto das folhas apresentou morte celular em 25 % na maior
concentração utilizada para células de câncer de rim.
O extrato bruto dos galhos de L. candicans apresentou atividade
antiproliferativa concentração dependente com efeito citostático (inibição de
crescimento), efeito citocida (morte celular) e pequena seletividade entre as
linhagens estudadas, destacando-se o efeito citocida frente as linhagens de
células de câncer de ovário, pulmão, mama, melanoma e leucemia produzindo
morte celular na maior concentração utilizada em 25, 30, 45, 60 %,
respectivamente. A fração Hexano foi seletiva para células de câncer de pulmão e
cólon de útero, inibindo o crescimento em 60 e 55%, respectivamente, na maior
concentração utilizada. E a fração CHCl3/ MeOH (50%) foi seletiva para célula de
câncer de pulmão inibindo o crescimento em 60% maior concentração utilizada.
Concluindo este trabalho, destacamos a atividade antifúngica frente a cepa
C. krusei e a atividade antiproliferativa, seletiva para células de câncer de rim
apresentada pelas folhas L. candicans, verificando-se entretanto, a necessidade
de maiores estudos em relação à capacidade farmacológica da espécie L.
candicans, uma vez que tanto os triterpenos isolados quanto os flavonóides são
reportados na literatura como tendo propriedades terapêuticas.
7 – REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS
AGRAWAL, P. K. et al.; Carbon-13 NMR of Flavonoids – Studies in Organic Chemistry 39; Editora Elsevier Science Publishers B. V.; Amsterdam; v. 39;
pp. 446; 1989.
AGUINALDO, A. M.; READ, R. W. “A major piperidine alkaloid from Microcos
philippinensis”. Phytochemistry, V. 29, 1990, pp. 2309-2313.
AHMAD, V. U.; ALI, A.; ALI, Z.; BAQAI, F. T.; ZAFAR, F. N.; “Cycloartane
triterpene glucosides from Corchorus depressus”. Phytochemistry, V. 49 (3), 1998, pp. 829-834.
AKIHISA, T.; MATSUBARA, Y.; GHOSH, P.; et al. “The 24α- and 24β-Epimers of
24-Ethylcholesta- 5,22-Dien-3β-ol in two Clerodendrum species.”
Phytochemistry, 27 (4), 1988, pp. 1169-1172.
AKIHISA, T.; SHIMIZU, N.; GHOSH, P.; et al. “Sterols of the Curcubitaceae.” Phytochemistry, 26 (6), 1987, pp. 1693-1700.
ALICE, C. B.; SILVA, G. A. A. B. “Levantamento fitoquímico de alguns vegetais
utilizados na medicina popular do Rio Grande do Sul (Parte I)”. Cad. Farm., 1 (2), 1985, pp. 83-94.
ANGELY, J. Flora analítica do Paraná. São Paulo, Phyton, 1965, pp. 728.
BANDARA, P. K. A. N.; KUMAR, V.; JACOBSSON, U.; MOLLEYRES, L-P.
“Insecticidal piperidine alkaloid from Microcos paniculata stem bark”,
Phytochemistry, 54 (1), 2000, pp. 29-32.
BARROSO, G. M. et al. Sistemática de angiospermas do Brasil. Rio de
Janeiro, Livros Técnicos e Científicos; São Paulo, Editora da
Universidade de São Paulo, V. 1 de 4, 1978, pp. 124-127 e pp. 147-155.
BRAGA, RENATO. Plantas do Nordeste, Especialmente de Ceará. ll
Congresso Brasileiro de Florestas Tropicais, Mossoró – 18/24 de julho,
1976, pp. 09.
BRANCO, A., & PIZZOLATTI, M. G. “ CGAR e CGAR-EM na Análise dos
Constituintes Químicos Isolados do Extrato Hexanico de Sebastiania
arguntideus (Euphorbiaceae).” Química Nova. V. 25, (1), 2002, pp.
15-19.
CRONQUIST, A. An integrated system of classification of flowering plants.
New York, Columbia University Press, 1988.
DEYAMA T. “The Constituints of Eucommia ulmoides OLI.I. Isolation of (+)-
Meridioresinol Di-O-β-glucopyranoside.” Chemycal Pharmacological
Bulletin, 31 (9), 1983, pp. 2993- 2997.
GARG, V. K.; NES, W. R. “Occurrence of Δ5–Sterols in Plants Producing
Predominantly Δ7–Sterols: Studies on the Sterol Compositions of Six
Curcubitaceae Seeds.” Phytochemistry, 25 (11), 1986, pp. 2591-2597.
GEETHA, T.; VARALAKSHMI, P.; MARYLATHA, R.; “Effect of triterpene from
Crataeva nurvala stem bark on lipid peroxidation in adjuvent induced
arthritis in rats.” Pharmacological Research, V. 37, 1998, pp. 191-195.
GOULART, M. O. F.; SANT’ANA, A. E. G.; LIMA, R. A. de; CAVALCANTE, S. H.
“Fitoconstituintes químicos isolados de Jatropha elliptica. Atribuição dos
deslocamentos químicos dos átomos de carbono e hidrogênio dos
diterpenos jatrofolanos A e B.” Química Nova. V. 16, n. 2, 1993, pp. 95-
100.
HASAN, C. M.; ISLAM, A.; AHMED, M.; AHMED, M-D.; WATERMAN, P. G.
“Capsugenin, a Dammarane Triterpene from Corchorus capsularis.”
Phytochemistry, 23 (11), 1984, pp. 2583-2587.
HILSENBECK, R. A. & MARBRY, T. J. “Flavonoid Chemstry of Siphonoglossa.”
Phytochemistry, v. 29 (7), 1990, pp. 2181-2185.
KHAN, M. S. Y.; JAVED, K.; KHAN, M. H.; SHAMSI, M. A.; SIDDIQUI, A. A. “α-
Amyrin derivatives from Corchorus depressus.” Phytochemistry, v. 30 (6), 1991, pp. 1989-1992.
LAKSHMI, V.; AGARWAL, S. K.; CHAUHAN, J. S. “A new δ–Lactone from the
flowers of Grewia asiatica”. Phytochemistry, v. 15, 1976, pp. 1397-
1399.
LORENZI, H.; Árvores brasileiras: manual de identificação e cultivo de plantas arbóreas nativas do Brasil / Harri Lorenzi; 2ed; Nova Odessa –
SP; Editora Plantarum; V. 1 de 2.,1998, pp.338.
MAHATO, S.B.; KUNDU, A. P.; “13C NMR spectra of pentacyclic triterpenoids - a
compilation and some salient features”. Phytochemistry, 37 (6), 1994, pp. 1517-
1575.
MAHATO, S.B.; Pal, B. C.; Sarkar, S. K. “New triterpenoid saponins from
Corchorus acutangulus”. Phytochemistry, 27 (5), 1988, pp. 1433-1437.
MATIDA, A. K.; BLUMENTHAL, E. E. A.; SCHUQUEL, I. T. A. ; MALHEIROS, A.
; VIDOTTI, G. J. ; Anais Assoc. Bras. QUÍM., 45 (3), pp. 147-151, 1996.
MENDEZ, J.; BILIA, A. R.; MORELLI, I. “Phytochemical investigations of Licania
genus. Flavonoids and Triterpenoids from Licania pittieri”. Pharmaceutica Acta Helvetiae, 70, 1995, pp. 223-226.
MILES, D. H.; KOKOPOL, U.; “Tumor inhibitors-2, Constituints and antitumor
activity of Serracenia flava.” Journal Pharmacol Science, V. 65, 1976, pp.
284-285.
MONKS, A.; et al. “Feasibility of a High-Flux Anticancer Drug Screen Using a
Diverse Panel of Cultured Human Tumor Cell Lines.” Journal of the National Cancer Institute, V. 83, 1991, pp. 757-766.
NAKAMURA, T.; GODA, Y.; SAKAI, S.; KONDO, K.; AKIYAMA, H.; TOYODA, M.
“Cardenolide glycosides from seeds of Corchorus olitorius.” Phytochemistry, V.
49 (7), 1998, pp. 2097-2101.
PALME, E.; BILIA, A. R.; FEO V.; MORELLI, I. “Flavonoid glycosides from
Cotoneaster thymaefolia”. Phytochemistry, 35 (5), 1994, pp. 1381-1382.
REYNOLDS, W. F.; MCLEAN, S.; POPLAWSKI, J. “ Total assignment of 13 C
and 1H spectra of isomeric triterpenol derivatives by 2D NMR”.
Tetrahedron, 42 (13), 1986, pp. 3419-3428.
ROSLER, H.; FRAMM, H.; BLOMSTER, R. N. “Isolation of 6-hydroxyarmane
from Grewia mollis”. The Journal of Natural Products, V. 41 (4), 1978, pp.
383-384.
RUBINSTEIN, I.; GOAD, L. J.; CLAGUE, A. D. H.; MULHEIRN, L. J. “The 220
MHz NMR spectra of phytosterols”. Phytochemistry, V. 15, 1976, pp.
195-200.
SAÉNZ, J.A. & NASSAR M. C.; “Phytochemical Screening of Costa Rica Plants:
Alkaloid Analysis III”. Rev. Biol. Trop., 15 (1), 1968, pp. 195-202.
SALEEM, M.; ALAM, ª; ARIFIN, S.; SHAH, M. S.; AHMED, B.; SULTANA, S.;
“Lupeol, a triterpene, inhibits early responses of tumor promotion induced
by benzoyl peroxide in murine skin.” Pharmacological Research, 43,
(2), 2001, pp. 128-133.
SILVERSTEIN, R. N. et al.; Identificação Espectrométrica de Compostos Orgânicos; 5a ed.; Editora Guanabara Koogan; Rio de Janeiro, 1994.
SKERAN, P.; et al. “New Colorometric Cytotoxicity Assay for Anticancer-Drug
Screening.” Journal of the National Cancer Institute, V. 82, 1990, pp.
1107-1118.
TANAKA, J. C. A. “Estudo Químico da Espécie Vegetal Luehea divaricata Mart.
(Tiliaceae).” Dissertação de Mestrado, Maringá, UEM, 2002, pp. 110.
TANAKA, J. C. A.; VIDOTTI, G. J.; SILVA, C. C. “A New Tormentic Acid Derivative
from Luehea divaricata Mart. (Tiliaceae).” Journal Brazillian Chemical Society. V. 14 (3). 2003. pp. 475-478.
THOMPSON, M. J.; DUTKY, S. R.; PATTERSON, G. W.; GOODEN, E. L.
“NMR Spectra of C-24 Isomeric Sterols.” Phytochemistry, V. 11, 1972, pp.
1781-1790.
TINTO, W. F.; BLAIR, L. C.; ALLI, A. “Lupane triterpenoids of Salacia cordata”.
Journal of Natural Products; 55 (3), 1992, pp. 395-398.
VAZZOLER, A. E. A. et al.; A Planície de inundação do alto rio Paraná: aspectos físicos, biológicos e socioeconômicos; EDUEM; Maringá,
1997.
VENKATA RAO, D.; VENKATA RAO, E. “New cardenolides from seeds of
Corchorus trilocularis.” Phytochemistry, V. 14, 1975, pp. 533- 537.
VERMES, B., SELIGMANN, O., WAGNER, H. “Synthesis of Biologically Active
Tetrahidro-furanlignan-(Syringin, Pinoresinol)- Mono- and Bis Glucosides.”
Phytochemistry, V. 30 (9), 1991, pp. 3087- 3089.
VIDYA, L.; VARALAKSHMI, P.; “Control of urinary risk factors of stones by
betulin and lupeol in experimental hyperoxaluria.” Fitoterapia, V. 71,
2000, pp. 535-543.
WENKERT, E.; BADDELEY, G. V.; BURFITT, I. R.; MORENO, L. N. “ Carbon- 13
Nuclear Magnetic Resonance Spectroscopy of Naturally-occurring
Substances LVII. Triterpenes Related to Lupane and Hopane.” Organic Magnetic Resonance, 11 (7), 1978, pp. 337-343.
WOODS, G. L.; WASHINGTON, J. A. Antibacterial susceptibility tests: dilution and disk difusion methods. Manual of clinical microbiology. 6ª ed.
Washington, D. C. ASM Press, 1995 Porto Alegre / Florianópolis: E. UFRGS
/ UFSC. 2000, pp. 113.
ZACCHINO, S. et al. “In vitro antifungal evaluation and studies on mode of
action of eight selected species from the Argentine flora”.
Phytomedicine; 5 (5), 1998, pp. 389-395.
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