View
2
Download
0
Category
Preview:
Citation preview
LIETUVOS SVEIKATOS MOKSLŲ UNIVERSITETAS
FARMACIJOS FAKULTETAS
ANALIZINĖS IR TOKSIKOLOGINĖS CHEMIJOS KATEDRA
Mindaugas Kirjanovas
Vitamino E preparatų analizė efektyviosios skysčių
chromatografijos metodu
Magistro darbas
Darbo vadovas:
prof. dr. L. Ivanauskas
KAUNAS, 2014
2
LIETUVOS SVEIKATOS MOKSLŲ UNIVERSITETAS
FARMACIJOS FAKULTETAS
ANALIZINĖS IR TOKSIKOLOGINĖS CHEMIJOS KATEDRA
TVIRTINU:
Farmacijos fakulteto dekanas Vitalis Briedis
Data:
Vitamino E preparatų analizė efektyviosios skysčių chromatografijos būdu
Magistro baigiamasis darbas
Darbo vadovas
Liudas Ivanauskas
Data
Recenzentas Darbą atliko
Magistrantas
Mindaugas Kirjanovas
Data Data
KAUNAS, 2014
3
TURINYS
SANTRAUKA ......................................................................................................................................... 5
SUMMARY ............................................................................................................................................. 6
1. ĮVADAS ............................................................................................................................................... 7
2. DARBO TIKSLAS IR DARBO UŽDAVINIAI .................................................................................. 8
3. LITERATŪROS APŽVALGA ............................................................................................................ 9
3.1. Vitaminas E. Cheminė struktūra ir fizikinės savybės. .................................................................. 9
3.2. Vitamino E absorbcija žarnyne ................................................................................................... 10
3.3. Vitamino E metabolizmas ........................................................................................................... 11
3.4. Antioksidacinis poveikis ............................................................................................................. 13
3.4.1. Laisvųjų radikalų neutalizacija. Neutralizacijos mechanizmas ............................................ 13
3.4.2. Antioksidacinis poveikis in vivo. Kai kurių ligų gydymas bei profilaktika vitaminu E ...... 14
3.5. Vitamino E trūkumas .................................................................................................................. 16
3.6. Rekomenduojamos vitamino E paros normos ............................................................................. 17
3.7. Pagrindiniai Vitamino E šaltiniai ................................................................................................ 17
3.8. Vitamino E preparatai, jų sudėtis ................................................................................................ 18
3.8.1. Receptiniai vaistai ................................................................................................................ 18
3.8.3. Kai kurie kompleksiniai preparatai ir maisto papildai, į kurių sudėtį įeina vitaminas E ..... 19
3.8.4. Preparatų sudėties apibendrinimas ....................................................................................... 21
3.9. Vitamino E preparatų analizė ...................................................................................................... 22
3.9.1. Tokoferolio acetato kiekybinio nustatytmo efektyviosios skysčių chromatografijos sistema
pavyzdžiai ....................................................................................................................................... 22
4. TYRIMO OBJEKTAS IR METODIKA ............................................................................................ 25
4.1. Tyrimo objektas ........................................................................................................................... 25
4.2 Efektyviosios skysčių chromatografijos metodika ....................................................................... 25
5. REZULTATAI ................................................................................................................................... 27
5.1. Metodo validacija ........................................................................................................................ 27
5.1.1. Metodikos specifiškumas ..................................................................................................... 27
4
5.1.2. Tiesiškumas .......................................................................................................................... 29
5.1.3 Glaudumas ............................................................................................................................. 30
5.1.4. Tikslumas ............................................................................................................................. 31
5.2. Tokoferolio acetato preparatų analizės rezultatai ........................................................................ 32
6. REZULTATŲ APTARIMAS ............................................................................................................ 40
7. IŠVADOS ........................................................................................................................................... 42
8. LITERATŪROS SĄRAŠAS .............................................................................................................. 43
5
SANTRAUKA
M. Kirjanovo magistro baigiamasis darbas/ mokslinis vadovas prof. Dr. L. Ivanauskas; Lietuvos
sveikatos mokslų universiteto, Farmacijos fakulteto, Analizinės ir toksikologinės chemijos katedra. –
Kaunas
Nuolatos plečiantis maisto papildų rinkai ir augant naujai sukuriamų papildų kiekiui
būtina sukurti greitas, tikslias ir efektyvias papildų analizės metodikas, norint užtikrinti į rinką
tiekiamų farmacinių prepartų kokybę. Vitamino E nustatymui efektyviosios skysčių chromatografijos
būdu yra sukurta nemažai įvairių metodikų, tačiau svarbu žinoti, kuri metodika yra efektyviausia
būtent vitamino E preparatams.
Tyrimo tikslas - atlikti kokybinį ir kiekybinį tokoferolio acetato nustatymą pritaikant
efektyviosios skysčių chromatografijos metodą bei surasti efektyviausią tokoferolio acetato
ekstrakcijos metodiką vaistinių preparatų analizei.
Tyrimo uždaviniai - surinkti ir apibendrinti informaciją apie vitaminą E, jo poveikį
organizmui, maisto papildus su tokoferolio acetatu bei jų analizę; optimizuoti metodiką tokoferolio
acetato preparatų analizei efektyviosios skysčių chromatografijos būdu ir ją validuoti; atlikti
tokoferolio acetato preparatų (maisto papildo ir vaistinio preparato) paruošimą analizei įvairiomis
ekstrakcijos metodikomis; išanalizuoti gautus duomenis ir padaryti išvadas apie efektyviausias
ekstrakcijos metodikas bandinių paruošimui bei skirtumus tarp vaistinio preparato ir maisto papildo
analizės.
Metodas – tyrimas atliktas chromatografine sistema su fotodiodų matricos detektoriumi.
Mobilioji fazė – metanolis:distiliuotas vanduo (95:5), tekėjimo greitis – 1.2 ml/min, bandinio tūris – 10
µl, trukmė – 14 min, bangos ilgis – 282 nm. Išbandytos preparatų ekstrakcijos metodikos – tirpinimas
etanolyje, tirpinimas etanolyje ir ekstrakcija heksanu, muilinimo reakcija ir muilinimo reakcija
pridėjus antioksidanto (askobro rūgšties).
Tyrimo rezultatai – geriausias duomenų atkūrimas gautas ištirpinus preparatus etanolyje
(1,151 mg/ml tokoferolio acetato tirpalui ir 0.992 mg/ml kapsulėms) bei vykdant ekstrakciją heksanu
(atitinkamai 1.193 mg/ml ir 0.787 mg/ml).
Išvados – tinkamiausia metodika aliejinio tokoferolio acetato tirpalo paruošimui -
ekstrakcija heksanu, o kapsulėms – tirpinimas etanolyje kaitinant tirpalą, kad geriau suirtų apvalkalas.
Muilinimo reakcijos preparatams nerekomenduojamos. Vaistinis preparatas yra dozuotas tiksliau nei
maisto papildas.
6
SUMMARY
The food supplements market is constantly growing and new products are entering it
everyday. In order to assure the quality of these pharmaceuticals it is important to develop methods of
analysis which are fast, precise and effective. There are many methods created for the analysis of
vitamin E using high-performance liquid chromatography so it is important to know which of them are
the most effective for vitamin E food supplements.
The aim – to perform a qualitative and a quantitive assey of tochopherol acetate using
high performance liquid chromatography and to find the most effective method of extracting
tocopherol acetate from food suplements.
The tasks – to collect and to summarize the data on vitamin E, its effects on human body,
on the supplements containing tocopherol acetate and their analysis; to develop a high-performance
liquid chromatography method of analysis suitable for the pharmaceuticals containing tocopherol
acetate ant to validate it; to perform a tocopherol acetate (a food supplement and a drug) samples
preparation using different techniques chosen; to analyze the data collected and to make conclusions
about the most effective way of preparing samples for the analysis and about the differences between a
drug and a food supplement analysis.
The method – the study was conducted by high-performance liquid chromatography
using a photodiode matrix detector. Mobile phase – methanol:purified water (95:5), flow-rate – 1.2
ml/min, injection volume – 10 µl, detection was performed at 282 nm and each run lasted 14 min.
Sample preparation – dissolving in ethanol, dissolving in ethanol and extracting in hexane,
saponification and saponification adding antioxidants (ascorbic acid) – were tested.
The findings – the best results were reached by dissolving the pharmaceuticals in ethanol
(1,151 mg/ml for the tocopherol acetate solution and 0.992 mg/ml for the capsules) and by performing
an extraction in hexane (1,193 mg/ml and 0.787 mg/ml respectively).
The conclusions – the best method for preparing samples of a tocopherol acetate solution
is its extraction in hexane and for the capsules it’s heating them up in ethanol to remove their coating.
A drug is dosed more precisely than a food supplement.
7
1. ĮVADAS
Vitaminai – tai būtini ir nepakeičiami junginiai, padedantys pagerti žmonių sveikatą ir
gyvenimo kokybę. Maisto papildai, į kurių sudėtį įeina įvairūs vitaminai, tai viena didžiausių ir
plačiausiai vartojamų farmacinių produktų kategorijų. Kochanskienės ir kt (2010) atliktoje Lietuvos
vaistinių klientų apklausoje paaiškėjo, jog 100 procentų respondentų per pastaruosius metus vartojo
maisto papildus. Dažniausiai buvo vartoti multivitaminų preparatai, tačiau monovitaminų preaparatai
vartojami irgi dažnai. Vitamino E preparatus per paskutinius metus vartojo daugiau nei 20 %
respondentų [2]. Kadangi tai tikrai svarbi ir labai dažnai vartojama produktų grupė, būtina sukurti
patikimas papildų analizės metodikas, kurios leistų greitai, efektyviai ir nebrangiai užtikrinti
gaminamų papildų kokybę.
Farmakopėjoje aprašyta tokoferolio acetato analizė naudojant dujų chromatografiją,
tačiau efektyviosios skysčių chromatografijos metodas yra labiau paplitęs ir prieinamesnis, todėl
svarbu sukurti ir validuoti tokoferolio acetato analizės metodą, kas užtikrintų paprastesnę tokoferolio
acetato papildų kontrolę.
Riebaluose tirpių vitaminų preparatuose vitaminai visada būna ištirpinti nedideliame
kiekyje aliejaus. Tai kelia papildomų sunkumų analizuojant preparatus, nes aliejinio tirpalo negalima
tiesiogiai injekuoti į chromatografijos sistemą. Mokslinėje literatūroje siūloma nemažai skirtingų
metodų riebaluose tirpių vitaminų bandiniams ekstrahuoti. Visi jie turi savų teigiamų ir neigiamų
savybių, todėl svarbu žinoti, koks paruošimo būdas geriausiai tinka tiriamajai medžiagai, šiuo aveju
tokoferolio acetato papildams.
Darbo tikslas
Tyrimo tikslas - atlikti kokybinį ir kiekybinį tokoferolio acetato nustatymą pritaikant efektyviosios
skysčių chromatografijos metodą bei surasti efektyviausią tokoferolio acetato ekstrakcijos metodiką
vaistinių preparatų analizei.
8
2. DARBO TIKSLAS IR DARBO UŽDAVINIAI
Darbo tikslas
Tyrimo tikslas - atlikti kokybinį ir kiekybinį tokoferolio acetato nustatymą pritaikant efektyviosios
skysčių chromatografijos metodą bei surasti efektyviausią tokoferolio acetato ekstrakcijos metodiką
vaistinių preparatų analizei.
Darbo uždaviniai
1. Susisteminti mokslinę literatūrą, susijusią su vitaminu E, jo poveikiu organizmui,
tokoferolio acetato vaistiniais preparatais bei jų analize.
2. Optimizuoti efektyviosios skysčių chromatografijos metodiką, ją validuoti ir
pritaikyti tokoferolio acetato preparatų analizei.
3. Atlikti tokoferolio acetato preparatų (maisto papildo ir vaistinio preparato) ekstrakciją
įvairiais literatūroje aprašytais metodais.
4. Apibendrinti gautus rezultatus bei pateikti išvadas apie atliktą tyrimą.
9
3. LITERATŪROS APŽVALGA
3.1. Vitaminas E. Cheminė struktūra ir fizikinės savybės.
Vitaminas E buvo atrastas 1922 metais mokslininkų Evans ir Bishop, kurie ištyrė jog jis
yra būtinas apsaugoti nėščias žiurkes nuo vaisiaus resorbcijos. (Evans, Bishop, 1922; cit iš Traber,
2007) [63]. Vitamino E poveikiu pasižymi aštuoni struktūra labai panašūs tokoferoliai ir
tokotrienoliai, kurie visi yra kilę iš 6- chromanolio. Tokoferoliai ir tokokotrienoliai žymimi
graikiškomis raidėmis α-, β-,γ-, δ-. Jie vienas nuo kito skiriasi metilo grupių skaičiumi ir išdėstymu
benzolo žiede.[1].
1 pav. Vitamino E poveikiu pasižymintys tokoferoliai ir tokotrienoliai (Brigelius-Flohé ir kt. [10]).
In vivo, biologinis šių junginių vitamininis E aktyvmas skiriasi. Tam įtakos turi: 1 -
metilo grupių buvimas arba nebuvimas žiedo 5, 6 ar 8 padėtyse, 2 - anglies atomų skaičius šalutinėje
grandinėje, 3 - 2, 4’ ir 8’ anglies atomų stereospecifiškumas, 4 – šaulutinės grandinės šakotumas, 5 –
chromanolio žiedas lyginant su furanolio žiedu, 6 – šalutinės grandinės prisijungimo prie žiedo vieta
[17].
10
Stipriausiu vitamininiu E aktyvumu pasižymi alfa-tokoferolis. Tai chiralinė molekulė,
turinti aštuonis stereoizomerus. Gamtoje randamas RRR-alfa-tokoferolis (chiraliniai anglies atomai yra
R-konformacijoje, 2‘ , 4‘ ir 8‘ pozicijose [9], o sintetiškai gaminamas all-rac-alfa-tokoferolis (arba dl-
alfa-tokoferolis), visų aštuonių stereoizomerų mišinys [33]. Vitamino E papilduose dažnai vartojami ir
tokoferolių acetatų ar sukcinatų esteriai, norint prailginti tokoferolių stabilumą ir preparatų galiojimo
laiką. Visi šie junginiai (alfa-tokoferolis, jo acetato ar sukcinato esteris) organizme absorbuojami
panašiai [14]. Visi stereoizomerai turi vienodas antioksidantines, bet skirtingas biologines savybes. [9]
Tokoferoliai yra bespalviai aliejai, gerai tirpstantys riebaluose ir riebalų tirpikliuose,
atsparūs temperatūros poveikiui, tačiau greitai suyra, veikiami ultravioletinės spinduoliuotės [1].
3.2. Vitamino E absorbcija žarnyne
Visų riebaluose tirpių vitaminų absorbcija yra susijusi su riebalų absorbcija žarnyne.
Riebalai yra būtini vitamino E absorbavimu. Jeans ir kt (2004) įrodė, jog vitamino E preparatus
vartojant su riebalų turinčiu maistu, vitamino E koncentracija kraujyje būna žymiai didesnė [31].
Be riebalų, riebaluose tirpių vitaminų absorbcijai būtinos tulžies rūgštys ir kasos
fermentai. Jų svarbą įrodo vitamino E trūkumas, kuris pasireiškia pacientams, sergantiems cistine
fibroze arba cholestatine kepenų liga [42]. Su maistu gauti riebaluose tirpūs vitaminai ištirpsta
suvartotuose riebaluose. Tulžies pagalba riebalai yra emulguojami iki micelių. Labai susmulkintos
micelės įsiurbiamos. Specifiniai mechanizmai kaip micelėse ištirpęs vitaminas E įsiurbiamas į žarnų
enterocitus nėra iki galo ištirti [61]. Atliktas tyrimas in vivo ir in vitro parodė, jog baltymas Niemann-
Pick C1-like 1 (NPC1L1), būtinas cholesterolio absorbcijai, gali transportuoti alfa-tokoferolį [47]. Taip
pat tiriamas ir Scavenger receptoriaus B klasės I tipo (SR-BI) poveikis vitamino E pernešimui per
enterocitą. Studija parodė, jog žarnyne išskiriami SR-BI kiekiai bent dalinai įtakoja vitamino E pernašą
[54].
Enterocito įsiurbtas vitaminas E pakuojamas į chilomikronus ir taip patenka į limfos
cirkuliaciją bei yra išnešiojamas po periferinius audinius.
Skirtingai nei kiti riebaluose tirpūs vitaminai, turintys specifinius transporto baltymus
plazmoje, vitaminas E transportuojamas nespecifiškai, visais plazmos lipoproteinais. Chilomikrono
likučiui, turinčiam vitamino E, pasiekus kepenis, atrenkama tik vienintelė vitamino E forma, alfa-
tokoferolis. Alfa-tokoferolio iš visų vitamino E aktyvumą turinčių junginių atrinkimas kepenyse
vykdomas dar iki galo nežinomu procesu, kuriam būtinas kepenų alfa-tokoferolio transporto baltymas
11
[42]. Tai buvo įrodyta tyrimu su pelėmis, šertomis maistu tik su gama tokoferoliu 550, tai pat gama
tokoferoliu 60 ir pėdsakais alfa tokoferolio, taip pat kontroline dieta su mažu kiekiu tokoferolių.
Rezultatai parodė, jog nepaisant didelių gama tokoferolių kiekių maiste, kepenys į plazmą sekretavo
panašų kiekį alfa ir gama tokoferolių [62]. Jei nebūtų alfa-tokoferolio transporto baltymo, plazmoje
būtų buvę žymiai daugiau gama-tokoferolio. Taip pat teigiama, jog alfa tokoferolio transporto baltymo
ekspresiją sukelia oksidacinis organizmo stresas bei hipoksija [66]. Kadangi pagrindinis alfa-
tokofoerolio poveikis – antioksidacinis, tai laisvųjų radikalų, susidarančių organzime hipoksijos ar
oksidacinio streso metu, koncetracijos padidėjimas turėtų aktyvinti alfa tokoferolio transporto baltymo
veiklą ir didinti alfa tokoferolio koncentraciją plazmoje. Alfa-tokoferolis yra kepenų sekretuojamas į
plazmą kartu su labai-mažo-tankio-lipoproteinais (LMTL) [9]. LMTL yra katalizuojamas lipoproteazės
lipazės, suformuojant mažo tankio lipoproteinus (MTL), kurie yra pagrindiniai vitamino E nešėjai į
periferinius audinius. Hidrolizės būdu MTL gali būti perkeliami į DTL ir į audinius [42].
3.3. Vitamino E metabolizmas
Mechanizmai, kuriais reguliuojama tokoferolių koncentracija periferiniuose audiniuose,
dar nėra iki galo išaiškinti, tačiau iš kelių atliktų tyrimų galima daryti išvadą, jog tokoferolių
koncentracija yra reguliuojama. Pirmiausia, dideli pavartoto alfa-tokoferolio kiekiai tik truputį
padidina jo koncentraciją plazmoje. Antra, tokoferolio kiekiai audiniuose ir kraujo plazmoje
neatsipindi suvartoto tokoferolio kiekio [58].
Tokoferolis turi du metabolinius kelius. Vienas veda į šalutinės grandinės degradaciją
prieš tai suskaldžius chromano žiedą o kitas- šalutinės grandinės degradacija išlaikant chromano žiedą
[36].
Žmogaus citochromas P450 4F2 (CYP4F2) katalizuoja pradinę omega-hidroksilacinę
reakciją iš tokoferolių ir tokotrienolių į karboksichromanolus ir yra vienintelis fermentas, galintis
metabolizuoti vitaminą E. Tokoferoliai ir tokotrienoliai yra metabolizuojami iki vandenyje tirpių
metabolitų kai jų šalutinė grandinė sutrumpinama iki 3‘ anglies atomo. Pirmiausia vyksta galutinio
šalutinės grandinės metilo atomo omega-hidroksilacija, katalizuojama CYP4F2 fermento, kuris veikia
kaip tokoferol-omega-hidroksilazė. Šio proceso greičiui įtakos turi metilo grupių išsidėliojimas
chromanono žiede, ypač 5 padėtyje. Ten esanti metilo grupė pagreitina metabolizmą. Taip pat svarbus
sočiųjų jungčių skaičius šalutinėje grandinėje. Tokotrienoliai, turintys nesočiųjų jungčių,
metobolizuojami lėčiau nei tokoferoliai. Vėliau seka susidariusio 3‘ karboksichromanolio beta-
12
oksidacija. Karboksichromanolai vėliau palaipsniui yra sujungiami su gliukouronatu ir palaipsniui
išskiriami į šlapimą [58].
Pagrindinė vitamino E metabolizmo vieta yra kepenų ląstelės ir tai yra patvirtinta
daugybe tyrimų, atliktų su kepenų hepG2 ląstelėmis, tačiau nauji duomenys rodo, kad vitaminą
metabolizuoti gali ir plaučių epitelio ląstelės [30].
13
3.4. Antioksidacinis poveikis
3.4.1. Laisvųjų radikalų neutalizacija. Neutralizacijos mechanizmas
Vitaminas E yra radikalus neautralizuojantis antioksidantas, kuris apsaugo membranas ir
plazmos lipoproteinus nuo laisvųjų radikalų. Iš visų vitamino E formų, geriausiu antioksidaciniu
poveikiu in vitro pasižymi alfa tokoferolis, nepriklausomai nuo tirpiklio, kuriame vykdoma reakcija
[64]. Kai susiformuoja peroksilo radikalai (ROO•), jie 1000 kartų greičiau reaguoja su vitaminu E (vit.
E-OH) nei su nesočiosiomis riebiosiomis rūgštimis (RH) [9]. Taip vitaminas E apsaugo membranas ir
plazmos lipoproteinus.
Esant vitaminui E peroksilo radikalai reaguoja taip:
ROO• + Vit.E-OH → ROOH + Vit. E-O•
Vitamino E neesant, reakcija vykta taip:
ROO• + RH → ROOH + R•
R• + O2 → ROO• [9]
Vitamino E radikalų neutralizavimo greitis yra lygus greičio konstantos kE (ji priklauso
nuo radikalų tipo ir reakcijos aplinkos sąlygų), vitamino E koncentracijos ir radikalų koncentracijos
sandaugai :
Radikalų neautralizavimo greitis = kE[Vit.E][radikalo]
Radikalų neautralizavimo greitį lemia tirpiklio, kuriame vyksta reakcija, prigimtis. Pavydžiui, jeigu
susiformuoja vandenilinės jungtys tarp vitamino e ir tirpiklio, tokio kaip etanolis, reakcija lėtės. Taip
pat vitamino E reaktyvumas mažėja membranose, lipoproteinuose ir micelėse, turbūt dėl pasunkinto
molekulių judėjimo juose.
Susidaręs vitamino E radikalas vit. E-O• gali reaguoti su kitu radikalu susidarant stabiliems
produktams, gali reaguoti su lipidais arba su redukuojančiomis medžiagomis, tokiomis kaip askorbatai.
Šiuo būdu regeneruojamas vitamino E kiekis [49]. Svarbiausia yra vitamino E reakcija su vitaminu C.
Vyksta reakcija:
Vit. E-O• + AH → Vit. E- OH + A•
14
Ši reakcija vadinama “Vitamino E perdirbimu”. Jos metu vitamin E antioksidacinį veikimą atstato kiti
antikosidantai [9]. Tiesa, vitaminas E yra riebaluose tirpus, o vitaminas C – vandenyje, todėl nėra
aišku, ar šis mechanizmas tikrai veikia ir in vivo. Atliktos studijos nevienareikšmiškos. R. Bruno ir kt.
(2006) atliktame tyrime nustatyta, jog rūkančių asmenų alfa ir gama tokoferolių kiekis kraujyje
sumažėja, tačiau jį pavyksta atsatyti vitamino C papildais [12]. Taip pat buvo tirtas UV sipndulių
poveikis alfa tokoferoliui odoje. Nustatyta, jog alfa tokoferolis, absorbavęs UV spindulius, skyla į
laisvuosius radikalus bei tai, jog askobro rūgštis padeda atsistatyti vitamino C koncentracijai [34]. Šis
„Vitamino E perdirbimas“ svarbus apsaugant mažo tankio lipoproteinus, kuriais dažniausiai ir
transportuojamas vitaminas E. VE Kagan ir kt. (1992) atliktame tyrime nustatyta, jog mažo tankio
lipoproteinuose askorbatai gali „perdirbti“ vitamino E laisvuosius radikalus į vitaminą E [35].
Vitaminas E, esantis eritrocitų membranose ir kuris saugo jas nuo oksidacinio streso, saugomas jo
laisvuosius radikalus verčiant į vitaminą E dviem būdais – fermentiniu NADH – citochromo B5 keliu
arba nefermentiniu askorbatų arba dihidrolipoidinės rūgšties keliu [16]. Kita vertus, GW Burton ir kt.
(1990) atliktame tyrime su jūros kiaulytėmis nepastebėta tokoferolių koncetracijų skirtumų kraujyje ir
audiniuose tarp jūrų kiaulyčių grupių, šertų vienodu kiekiu tokoferolio ir skirtingų kiekių vitamino C
dieta. Daroma išvada, jog vitamino E ir vitamino C sąveika svarbi tik in vitro [13].
3.4.2. Antioksidacinis poveikis in vivo. Kai kurių ligų gydymas bei profilaktika
vitaminu E
Vitaminas E in vivo apsaugo ląstelių membranas ir plazmos lipoproteidus. Tai gali
užkirsti kelią kai kurioms ligoms atsirasti. Yra nustatytas ryšys tarp padidėjusios ląstelinių oksidantų
koncentracijos ir pagausėjusios ląstelių mutacijos, sukeliančios vėžį, taip pat radikalų sukeltas
pažeidimas ląstelių membranose sukelia lipidų peroksidaciją, kuri sąlygoja laisvųjų radikalų,
žalojančių ląsteles, atsiradimą [38].
Taigi, vitamino E vartojimas galėtų padėti vežio profilaktikai ir gydymui. Atlikti tyrimai
nevienareikšmiški. A Barve ir kt. (2009) atliktas tyrimas parodė, jog gama ir alfa-tokoferoliais
praturtinta dieta sumažino prostatos karcinogenezę pelėse [7] tačiau ME Wright ir kt. (2007) atliktas
tyrimas parodė, jog vitamino E papildai neapsaugo nuo prostatos vėžio, tačiau sumažina kliniškai
reikšmingos ligos pasireiškimą [70]. Tiriant rūkančių asmenų riziką susirgti plaučių vežiu ir vitamino
E įtaką plaučių vėžio atsiradimui, gauti duomenis ir patvirtina [69] ir paneigia [4] vitamino E
antivėžinį poveikį. Didelės vitamino E, ypač vartojant su vitaminu C ir betakarotenu, dozės mažina
15
gaubtinės žarnos vėžio riziką [8]. E Riboli ir R Kaaks atlikta didelės apimties studija EPIC (European
Prospective Investigation into Cancer and Nutrition) atlikta tiriant krūties vėžio rizikos sumažėjimą dėl
vartojamų vitamino D, E ir C, nerado reikšmingo vitamino E antivėžinio poveikio, tačiau pastebėtas
nedidelis antivėžinis poveikis postmenopauzinėje moterų grupėje [55].
Manoma, jog antioksidantai, tokie kaip vitaminas E, mažindami oksidacinį stresą, užkerta
kelią širdies ir kraujagyslių ligoms, taip pat mažina cholesterolio kiekį kraujyje ir mažina riziką
aterosklerozei. Su triušiais atliktas tyrimas parodė, jog hipercholesterolemijos širdžiai sukeliamas
oksidacinis stresas yra sumažinamas vitamino E pagalba [51]. Su žiurkėmis atliktas tyrimas parodė,
jog vitaminas E apsaugo aortą nuo pažeidimų ir trombų esant padidėjusiam cholesterolio kiekiui
kraujyje [37]. Tačiau pacientams, sergantiems širdies ir kraujagyslių ligomis, antioksidantų poveikis,
gerinantis ligos eigą, nenustatytas. Y Ye ir kt. (2013) atliktoje didelės apimties meta-analizėje, kurioje
buvo apžvelgtos 293 studijos ir tirti 188209 pacientai, buvo nustatyta, jog antioksidantai (vitaminas E,
betakarotinas ir vitaminas C) neturi jokios įtakos širdies ir kraujagyslių ligų, tokių kaip miokardo
infarktas ar insultas, atsiradimui [29]. Dar daugiau, ER Miller 3rd ir kt. (2005) atlikta meta-analizė net
teigia, jog didelės suvartoto vitamino E dozės (daugiau nei 400 UI per dieną) didina ligonių
mirtingumą [45]. Tačiau yra ir prieštaringų nuomonių. Yakoot M (2012) savo publikacijoje teigia, jog
taikant vitaminą E pacientams, būtina atsižvelgti ne tik į meta-analizes, kurios analizuoja populiacijas,
bet ir į individualius pacientus, jų vartojamus vaistus ir galimą antioksidantų naudą [28].
Didelį oksidacinį stresą patiria pacientai, sergantys cukriniu diabetu. Tai lemia plazmoje
padidėjęs gliukozės kiekis. Tai sukelia plazmos ir ląstelių glikozilinimą, kuris labiausiai pakenkia
kraujagyslių endoteliui. Dėl to diabetu sergantys pacientai patiria daugiau širdies ir kraujagyslių ilgų
komplikacijų nei juo nesergantys [24]. Tai, jog sergant diabetu padidėja organizmo oksidacinis stresas,
yra įrodyta diabetikams sumažėjusia antioksidantų koncentracija kraujyje [26]. Yra užtektinai
mokslinių įrodymų, jog būtų galima teigti, kad vitaminas E sumažina diabeto sukeliamų komplikacijų
riziką. Jain AB ir kt. (2012) atliktoje studijoje nustatyta, jog I ir II tipo diabetu sergantiems pacientams,
vartojusiems insuliną (I tipo diabetas) arba hipoglikeminius vaistus (II tipo diabetas) ir vitamino E
papildus, reikšmingai sumažėjo gliukozės, cholesterolio kiekis kraujyje ir diastolinis kraujo spaudimas,
pasireiškė mažiau širdies ir kraujagyslių ligų bei retinopatijos, lyginant su pacientais, vartojusiais tik
insuliną (I tipo diabetas) arba tik hipoglikeminius (II tipo diabetas) vaistus [32]. Kita studija įrodo, jog
vartojant hipoglikeminius vaistus kartu su vitaminu E labiau sumažinamas oksidacinis stresas ir
kraujagyslių pažaida nei vartojant vien tik hipoglikeminius vaistus [57].
Manoma, jog oksidacinis stresas yra labai svarbus tokių neurodegeneracinių ligų kaip
Azheimerio, Parkinsono liga, išsėtinė sklerozė ar senatvinė demensija patogenezei. Arikangolu ir kt.
(2013) atliktame tyrime buvo tiriami Alzheimerio liga sergančiųjų ir nesergančiųjų kraujo oksidantų ir
16
antioksidantų lygiai. Buvo nustatyta, jog Alzheimerio liga sergančiųjų antioksidantų lygis kraujyje
buvo statistiškai reikšmingai žemesnis nei nesergančiųjų, o oksidantų – aukštesnis [6]. Taigi, tokie
antioksidantai kaip vitaminas E turėtų sumažinti riziką susirgti Alzheimerio liga, tačiau atlikti tyrimai
ir meta-analizės nevienareikšmės. Li ir kt. (2012) atlikta meta-analizė rodo, jog antioksidantai, ypač
vitaminas E, gali sumažinti riziką susirgti Alzheimerio liga [41]. Tačiau A. Isaac ir kt. (2008) atlikta
meta-analizė parodė, jog nėra jokio ryšio tarp vitamino E papildų vartojimo ir Alzheimerio ligos
prevencijos [43]. Tokius prieštaringus duomenis interpretuodami OB Usoro ir SA Mousa (2010) teigia,
jog galbūt neigiamiems gydymo rezultatams įtakos turi tai, jog buvo pacientams buvo skirti vitamino E
preparatai, kuriuose yra alfa-tokoferolis. Jis teigia, jog Alzheimerio ligos prevencijai veiksimingiau
naudoti visų tokoferolių ir tokotrienolių mišinį [67].
A. Hadžović-Džuvo ir kt. (2011) savo darbe įrodė jog pacientų, sergančių išsėtine
skleroze, antioksidantų kiekiai kraujyje irgi būna sumažėję, lyginant su ja nesergančiais. Tai rodo, jog
oksidacinis stresas yra svarbus išsėtinės sklerozės patogenezėje ir kad antioksidantai yra svarbūs šios
ligos terapijoje. [25] Vitamino E poveikiui išsėtinės sklerozės atsiradimui ištirti atlikta meta-analizė
rodo, jog kuo ilgiau buvo vartojami vitamino E papildai, tuo mažesnė buvo sklerozės pasireiškimo
rizika [68] Parkinsono liga sergantiems asmenims taip pat nustatytas antioksidantų kiekio kraujyje
sumažėjimas, o oksidantų – padidėjimas [15]. Gydymui antioksidantais įvertinti atliktos meta-analizės
rodo, jog vitaminas E gali turėti neuroprotekcinį efektą ir sumažinti Parkinsono ligos riziką. M.
Etminam ir kt. (2005) atlikta meta-analizė rado ryšį tarp vitamino E, bet ne vitamino C ar A, ir
sumažėjusios rizikos sirgti Parkinsono liga [19]. Šį poveikį įrodo ir Y. Myake ir kt. (2011) atlikta
studija, rodantį ryšį tarp didesnio vitamino E ir betakaroteno suvartojimo ir mažesnės rizikos sirgti
Parkinsono liga [44].
Apibendrinus gautus duomenis galima daryti išvadą, jog vitamino E efektyvumas širdies
ir kraujagyslių bei vėžinių susirgimų gydymui ir profilaktikai yra abejotinas, tačiau diabeto bei
neurodegeneracinių ligų gydyme ir ypač profilaktikoje jis yra ganėtinai naudingas.
3.5. Vitamino E trūkumas
Riebaluose tirpiųjų vitaminų trūkumas yra ganėtinai retas, nes jie kaupiasi organzimo
riebaluose. Žmonėms jų trūkumas dažniausiai pasireiškia esant genetiniams alfa tokoferolio transporto
baltymo ar lipoproteinų sintezės sutrikimams, taip pat esant įvairiems malabsorbcijos sindromams [9].
Kadangi vitaminas E yra svarbus nervų sistemos antioksidantas, jo trūkumas lemia įvairias
17
neurologines disfunkcijas [65]. Su žiurkėmis atliktas tyrimas parodė, jog vitamino E trūkumas lemia
didesnį jų nervingumą [50]. Vitamino E trūkumas pažeidžia ir kitas sritis – rageną [39], mažina kaulų
masę [21]. Nėštumo metu, trūkstant vitamino E, gali sutrikti vaisiaus centrinės nervų sistemos
vystymasis [46], gali atsirasti hemolizinė mažakraujystė, ypač neišnešiotiems kūdikiams [18].
3.6. Rekomenduojamos vitamino E paros normos
Amerikos maisto ir mitybos tarnyba įvertino rekomenduojamas suvartoti alfa tokoferolio
paros normas, atsižvelgdama į dirbtinai žmonėms sukeltą vitamino E trūkumą ir ryšį tarp vandenilio
peroksido sukeltos eritrocitų lizės ir alfa-tokoferolio koncentracijos plazmoje. Rekomenduojama paros
dozė vyrams ir moterims yra 15 mg alfa-tokoferolio [48].
Tyrimas, atliktas su deuteriu pažymėtu alfa-tokoferoliu impregnuotais obuoliais
patvirtino, jog esant vidutinei 33% alfa-tokoferolio absorbcijai, reikia apie 15 mg alfa-tokoferolio
kasdien, norit pakeisti negrįžtamus jo nuostolius [11].
3.7. Pagrindiniai Vitamino E šaltiniai
Gausiausiu Vitamino E kiekiu pasižymi įvairios sėklos ir aliejai, grūdiniai produktai, taip
pat lapinės daržovės. Jungtinių Amerikos Valstijų žemės ūkio departamento duomenimis, gausiausi
vitaminu E produktai yra įvairių javų dribsniai ( nuo 45 iki net 230 mg/100 gramų produkto), taip pat
aliejai ( kviečių gemalų – 149.4 mg/100 ml, lazdyno riešutų – 47.20 mg/100 ml, saulėgrąžų sėklų –
41.08 mg/100 ml), sėklos ir riešutai (saulėgrąžos – 36.33 mg/100 g, migdolai – 25.97 mg/100 g).
Dideliu vitamino E kiekiu taip pat pasižymi margarinai, įvairūs prieskoniai, užkandžiai su riešutais [5].
Kasdieninėje dietoje didžiausi vitamino E kiekiai gaunami būtent iš aliejų ir sėklių bei vaisių. Garcia-
Closas ir kt. (2004) atliko tyrimą, siekdama išsiaiškinti, kokie pagrindiniai vitamino E šaltiniai ispanų
dietoje. Nustatyta, kad daugiausiai vitamino E gaunama iš augalinių aliejų (26 % iš saulėgrąžų aliejaus
ir 14% iš alyvuogių aliėjaus), daugiau nei 25 procentai – iš vaisių (obuolių ir kriaušių) bei daržovių
(pomidorų ir salotų). Kiti riebalų šaltiniai, tokie kaip margarinas, majonezas ar sviestas suteikė mažiau
nei 5% viso suvartoto vitamino E [22].
18
3.8. Vitamino E preparatai, jų sudėtis
Buvo apžvelgti įvairūs Lietuvos rinkoje esantys vitamino E preparatai arba kompleksiniai
preparatai, į kurių sudėtį įeina vitaminas E. Įvertinta preparatuose naudota vitamino E forma, kitos
sudedamosios medžiagos, naudotos pagalbinės medžiagos, vitamino E kiekis. Informacija apie
preparatų sudėtį imta iš www.vaistai.lt
3.8.1. Receptiniai vaistai
Lietuvos rinkoje yra šie tokoferolio acetato preparatai, parduodami tik su receptu:
Vitaminas E Medana geriamieji lašai, tirpalas 300mg/ml, 10ml – gamina įmonė „Medana Pharma“.
Sudėtis: alfa-tokoferolio acetatas (300 mg/ ml tirpalo), žemės riešutų aliejus.
Vitaminum E HASCO-LEK 100mg kapsulės N30 – gamina "Przedsiebiorstwo Produkcji
Farmaceutycznej HASCO-LEK". Sudėtis: visų racematų alfa-tokoferolio acetatas (100 mg /
kapsulėje), žemės riešutų aliejus. Kapsulės korpuse: želatina, glicerolis, kochinelo raudonasis.
Vitaminum A+E HASCO - LEK 30000TV/70mg kapsulės N30 - gamina "Przedsiebiorstwo Produkcji
Farmaceutycznej HASCO-LEK". Sudėtis: retinolio palmitatas (30000 TV / kapsulėje), visų racematų
alfa- tokoferolio acetatas (70 mg / kapsulėje), žemės riešutų aliejus. Kapsulės korpusas – želatina,
glicerolis.
3.8.2. Nereceptiniai preparatai ir maisto papildai
Vitaminas E 90mg kapsulės N20 – gamina „Mialteks“. Sudėtis: alfa-tokoferilacetatas (90 mg /
kapsulėje), augalinis aliejus, maistinė želatina, drėgmę išlaikanti medžiaga glicerolis.
Vitaminas E Dr.Smiths 200mg kapsulės N10x10 – gamina „Cipla Ltd“. Sudėtis: alfa-tokoferolio
acetatas (200 mg / kapsulėje), žemės riešutų aliejus.
19
Vitaminas E Dr.Smiths 400mg kapsulės N10x10 – gamina „Cipla Ltd“. Sudėtis: alfa-tokoferolio
acetatas (400 mg / kapsulėje), žemės riešutų aliejus.
Vitamin E 400 I.U. Highway N30 – gamina „Contract Pharmacal Corporation“. Sudėtis: DL – alfa
tokoferilacetatas 400 mg), želatina, sojų aliejus, drėgmę išlaikanti medžiaga – glicerolis.
Vita ES 200mg kapsulės N30 – gamina “Vitabalans oy”. Sudėtis – d-alfa-tokoferolis (200 mg /
kapsulėje).
3.8.3. Kai kurie kompleksiniai preparatai ir maisto papildai, į kurių sudėtį įeina
vitaminas E
Vitaminas A+E GSK 2500TV/50mg kapsulės N30 – gamina „GlaxoSmithKline Pharmaceuticals“.
Sudėtis: retinolio acetatas (2500 TV / kapsulėje), visų racematų alfa-tokoferolio acetatas (50 mg /
kapsulėje), oktilo galatas, žemės riešutų aliejus. Kapsulės korpusas – želatina, glicerolis, išgrynintas
vanduo.
Highway Vitamin A+E kapsulės N30 – gamina „Contract Pharmacal Corporation“. Sudėtis: retinilo
acetatas (825 mkg / kapsulėje), DL – alfa-tokoferilacetatas (75 mg / kapsulėje), lipnumą
reguliuojančios medžiagos: dikalcio fosfatas, silicio dioksidas; stearino rūgštis; magnio stearatas;
stabilizatorius: skersinio ryšio natrio karboksimetilceliuliozė; kapsulę sudaranti medžiaga: želatina.
Selezin ACE tabletės N30 – gamina „Walmark“. Sudėtis: laktozė, lipnumą reguliuojančios medžiagos:
mikrokristalinė celiuliozė, magnio stearatas, talkas,silicio dioksidas; cinko gliukonatas, L-askorbo
rūgštis, selenu papildytos mielės, D-alfa-tokoferilacetatas (15 mg / tabletėje), stabilizatoriai:
hidroksipropilmetilceliuliozė, hidroksipropilceliuliozė; piridoksino hidrochloridas, retinilo acetatas,
dažiklis titano dioksidas, medvilnės sėklų aliejus.
CRAZYVIT šnypščiančiosios čiulpiamosios tabletės N60 – gamina „Nycomed“. Sudėtis: Kalcio
karbonatas, rūgštingumą reguliuojanti medžiaga citrinų rūgštis, natrio vandenilio karbonatas, askorbo
rūgštis, emulsiklis riebalų rūgščių magnio druskos, nikotinamidas, dl-α-tokoferolio acetatas (10 mg /
tabletėje), kvapiosios medžiagos, saldikliai: sorbitolis, aspartamas, acesulfamas K; kalcio D-
pantotenatas, riboflavinas, tiamino mononitratas, retinolio palmitatas, piridoksino vandenilio chloridas,
folio rūgštis, biotinas, cholekalciferolis, ciankobalaminas.
20
Eunova Direkt 1.5g granulės N20 – gamina „Hemofarm“. Sudėtis: Kalcio karbonatas, sorbitolis,
rūgštingumą reguliuojanti medžiaga natrio citratas, magnio oksidas, L-askorbo rūgštis, užpildai:
manitolis, magnio citratas, natrio askorbatas, citrinų rūgštis, kvapiosios medžiagos, BHA , BHT ir
askorbilpalmitatas , želatina, gumiarabikas, antioksidantas liuteinas, kukurūzų krakmolas,
maltodekstrinas, riebiųjų rūgščių vidutinės grandinės trigliceridai, mono- ir digliceridai, modifikuotas
krakmolas, natrio selenatas, nikotinamidas, palmių aliejus, acesulfamas K ir aspartamas, magnio
stearatas) ir silicio dioksidas, natrio karboksimetilceliuliozė, retinilo palmitatas, tiamino mononitratas,
natrio riboflavin-5-fosfatas, piridoksino hidrochloridas, cianokobalaminas, cholekalciferolis, D-alfa-
tokoferilo rūgšties sukcinatas (12 mg / granulėje), fitomenadionas, D-biotinas, kalcio D-pantotenatas,
pteroilmonoglutamo rūgštis, cinko citratas.
Jamieson Vita Vim kramtomosios tabletės N60 – gamintojas „Jamieson laboratories“. Sudėtis:
Gliukozė, ortofosforo rūgšties kalcio druskos, lipnumą reguliuojanti medžiaga mikrokristalinė
celiuliozė, saldiklis manitolis, rūgštingumą reguliuojanti medžiaga citrinų rūgštis, L-askorbo rūgštis,
debetinė kvapioji medžiaga (maltodekstrinas, modifikuotas maistinis krakmolas, bevandeniai pieno
riebalai, iš dalies hidrintas sojų aliejus), magnio oksidas, augalinė stearino rūgštis, nikotinamidas,
augalinis magnio stearatas, braškių kvapioji medžiaga, vaivorų kvapioji medžiaga, lipnumą
reguliuojanti medžiaga silicio dioksidas, D-alfa-tokoferilacetatas (16,8 mg / tabletėje), aviečių kvapioji
medžiaga, geležies fumaratas, kalcio d- pantotenatas, dažiklis karminas, riboflavinas, piridoksino
hidrochloridas, sacharozė, tiamino mononitratas, vario citratas, beta-karotenas, retinilo acetatas,
liuteinas (iš didžiojo serenčio (Tagetes erecta) žiedų), pteroilmonoglutamo rūgštis, kalio jodidas, D-
biotinas, cianokobalaminas, cholekalciferolis.
NUTRISAVE Multivitaminai tabletės N60 – gamintojas „Principle Healthcare International“. Sudėtis:
kalcio karbonatas, lipnumą reguliuojanti medžiaga mikrokristalinė celiuliozė, askorbo rūgštis,
nikotinamidas, lipnumą reguliuojanti medžiaga silicio dioksidas, DL-alfa-tokoferilacetatas, kalcio D-
pantotenatas, maltodekstrinas, emulsiklis hidroksipropilmetilceliuliozė, emulsiklis akacijų sakai,
lipnumą reguliuojanti medžiaga magnio stearatas, cukrozė, kukurūzų krakmolas, piridoksino
hidrochloridas, dažiklis titano dioksidas, tiamino hidrochloridas, retinilo acetatas, riboflavinas,
hidroksipropilceliuliozė, DL-alfa-tokoferolis (10 mg / tabletėje), vidurinės grandies trigliceridai,
lipnumą reguliuojančios medžiagos trikalcio fosfatas ir dikalcio fosfatas, propileno glikolis, folio
rūgštis, cholekalciferolis, ciankobalaminas.
21
3.8.4. Preparatų sudėties apibendrinimas
Iš pasirinktų preparatų, didžiojoje daugumoje yra sintetinio alfa-tokoferolio, kuris, kaip
jau minėta, yra visų aštuonių stereoizomerų mišinys. Preparatų sudėtyje jis įvardinamas skirtingai – d-
alfa-tokoferolis (pavyzdžiui Selezin ACE), dl-alfa-tokoferolis (Vita ES 200mg), visų racematų alfa-
tokoferolis (Vitaminum E HASCO-LEK). Iš 15 apžvelgtų preparatų, 11 buvo naudotas šis sintetinis
alfa-tokoferolis, o keturiuose (Vitaminas E Medana geriamieji lašai, Vitaminas E 90mg, Vitaminas E
Dr.Smiths 200mg, Vitaminas E Dr.Smiths 400mg) – natūralus alfa-tokoferolis. Tik dviejuose
preparatuose (Vita ES 200mg, NUTRISAVAVE) naudojama neesterifikuota alfa-tokoferolio forma.
12 preparatų alfa-tokoferolis vartojamas acetato esterio pavidalu, viename (Eunova Direkt) – sukcinato
esterio. Alfa-tokoferolio esterių naudojimas farmacijos produktams prailgina produktų galiojimo laiką,
o, kaip jau minėta, šio vitamino absorbcijai neturi jokios įtakos tad tai nėra neigiamas dalykas.
Preparatai, į kurių sudėtį įeina tik alfa-tokoferolis arba alfa-tokoferolis kartu su riebaluose tirpiais
vitaminais, pateikiami kapsulių ar lašų forma, o vitaminai ištirpinti aliejuje. Dažniausiai naudojamas
žemės riešutų aliejus, viename preparate (Vitaminas E 90mg) nurodytas tiesiog augalinis aliejus ir
nepatikslinta jo rūšis, dar viename preparate (Vitamin E 400 I.U.) vartojamas sojų aliejus. Duomenų,
jog būtent žemės riešutų aliejus yra geriausias šiai vaistų formai ruošti nepavyko rasti. Preparatuose
vartojami įvairūs alfa-tokoferolio kiekiai. Tuose preparatuose, kuriuose yra vien tik alfa-tokoferolis
arba jis kartu su riebaluose tirpiais vitaminais, alfa-tokoferolio dozės labai didelės, iki 400 mg vienoje
kapsulėje. Šie preparatai skirti vartoti esant vitamino E avitaminozei, tad šios dozės yra racionalios.
Multivitaminų preparatuose dozės skiriasi nuo 10 mg iki 16,8 mg, tad varijuoja nedaug nuo vidutinės
alfa-tokoferolio paros dozės – 15 mg.
22
3.9. Vitamino E preparatų analizė
Nors farmakopėjoje aprašytas kiekybinis tokoferolio aceatato nustatymo metodas yra
dujų chromatografija [20], jis jau yra kiek pasenęs ir praktikoje dažniausiai naudojamas efektyviosios
skysčių chromatografijos metodas, kuris yra greitesnis ir efektyvesnis
Bandinių paruošimui egzistuoja daugybė įvairių metodikų. Metodikos parinkimas
paprastai priklauso nuo bandinių kilmės, priemaišių kiekio ir tipo ir panašių salygų.
Anot Ruperez ir kt. „Išskyrus vitamino E analizę aliejuose, kurie gali būti tiesiogiai
injekuoti į efektyviosios skysčių chromatografijos sistemą po ištirpinimo, vitaminas E turi būti
ekstrahuotas iš bandinio matricos ir kai kuriais atvejais koncetruojamas“ [65]. Bandinys turi būti
paveikiamas organiniu tirpikliu, norint suardyti struktūras, kurios gali būti susijungusios su su
tokoferolio acetatu (lipoproteinais, riebalų lašeliais). Beveik visada naudojamas etanolis, tačiau kartais
naudojamas ir metanolis [56]. Tokoferolio acetato ekstrakcijai iš matricos naudojami įvairūs tirpikliai-
heksanas, heksano – benzeno mišinys, heksano – etilo acetato mišinys, chloroformas, chloroformo –
acetono mišinys ir kiti. Dažniausiai naudojamas heksanas, tačiau Qian ir kt. (1998) įrodė, kad kai
kuriais atvejais heksanas nėra efektyviausias ir labiau tinka acetono-chloroformo mišinys [52].
Naudojant heksaną kaip ekstrahentą, ir bandinį analizuotant atvirkštinės fazės chromatografijos būdu,
būtina tirpiklį pakeisti kitu, poliškesniu. Tai atliekama išgarinant heksaną skysto azoto srove ir
išekstrahuotą tokoferolio acetato likutį ištirpinant poliniame tirpiklyje [56]. Kai kuriais atvejais
atliekamos saponifikacijos reakcijos, kuomet ištirpintas bandinys ištirpintas organiniame tirpiklyje,
kaitinamas su šarmu. Tokiu atveju nesaponifikuoti komponentai, tokie kaip vitaminas E, pereina į
organinio tirpiklio fazę, o riebiosios rūgštys, glicerolis ir kitos medžiagos, galinčios trukdyti analizei
lieka šarmo fazėje [52]. Temeratūriniai ir cheminiai veiksniai gali suardyti dalį tokoferolio acetato.
Sukeliamą ardantį cheminį ir temperatūrinį bandoma sumažinti į tirpalą pridėjus antioksidantų –
butilohidroksitolueno, pirogalolio ar askobro rūgšties [56].
3.9.1. Tokoferolio acetato kiekybinio nustatytmo efektyviosios skysčių
chromatografijos metodu pavyzdžiai
SK Jensen ir C Lauridsen (2007) aprašytas metodas, kuriuo galima nustatyti kiekybinę ir kokybinę
tokoferolio sudėtį naudojant normalios fazės aukšto slėgio skysčių chromatografiją (ASSC) bei vėliau
23
sekančio alfa tokoferolio stereoizomerų metilo esterių pavidalu atskyrimo naudojant chiralinę ASCC
[33].
Proceso eiga:
Homogenizuoti tiriamąjį pavyzdį šaltame etanolyje
↓
Muilinimo reakcija su KOH esant 80º C
↓
Ekstraktas su heptanu, 10 ml
↓ ↓
100µL tirpalo ištirti bendram Likę 9,9 ml išgarinami naudojant N2
tokoferolio kiekiui naudojant ASCC ↓
alfa-tokoferolių metilo esterių gavimas
↓
Chiralinė ASCC alfa-tokoferolių metilo esteriams
Naudojant šį metodą, alfa tokoferolio stereoizomerai yra atskiriami penkiais pikais. Pirmasis pikas
susideda iš keturių 2S izomerų (SSS-, SSR-,SRR-, SRS-), antrasis RSS-, trečiasis RRS -, ketvirtasis
RRR-, o penktasis iš RSR-alfa tokoferolio.
2 pav. ASSC chromatograma, kurioje vaizduojami alfa tokoferolio metilo esterių išsiskyrimo pikai.
Jensen ir kt. [33]
24
H. Iwase (2002) publikacijoje buvo įvertintas vitamino E ir betakaroteno kiekis
emulsifikuotuose maisto papilduose, po kietosios fazės ekstrahavimo [27].
Standartinio vitamino E paruošimas: 125 mg buvo iš anksto ištirpinti etanolyje 50 ml
matavimo kolboje. 5 ml pradinio tirpalo vėl buvo praskiesti etanolio iki 50 ml matavimo kolboje. 500
µl šio tirpalo buvo vėl praskiesta kolboje iki 50 ml etanolio. 100 µl šio tirpalo buvo praskiesta iki 10
ml etanoliu. Gauta galutinė koncetracija 2,5 µl / 100 ml.
Tiriamojo pavyzdžio paruošimas: 100 ml matavimo kolboje maisto papildas (10 g) buvo
ištirpintas 5% vandeniniame natrio sulfato tirpale, kuriame buvo 1 mM etilendiaminetetraacetinės
tūgšites dinatrio dihidrato (EDTA). 1 ml šio tirpalo buvo supilti į naudotą Bond Elut C18 kasetę, kuri
prieš tai buvo praplauta distiliuotu vandeniu ir etanolio tirpalu.
Eluentu buvo vartotas etanolis, jo buvo sušviršksta po 2 ml, sušvirkštus standartinius
tirpalus. Naudotas fluorescencinis detektorius. Kolona 15 cm ilgio ir 0,46 cm skersmens, mobilioji
fazė – etanolis ir metanolis (50:50), tekėjimo greitis – 0,6 ml/min, 40ºC.
3 pav. Vitamino E chromatograma, tirta emulsikuotame maisto papilde. Iwase [27]
25
4. TYRIMO OBJEKTAS IR METODIKA
4.1. Tyrimo objektas
Vaistinio preparato analizei buvo naudotas vitaminas E Medana, geriamieji lašai,
300mg/ml, 10ml – gamintojas „Medana Pharma“ (Lenkija). Maisto papildo analizė atlikta su papildu
„Vitaminas E – Mik“, 30 mg/kapsulėje, gamintojas UAB „Minskinterkaps“ (Baltarusija).
4.2. Efektyviosios skysčių chromatografijos metodika
Naudotas etalonas
Eksperimentams naudotas standartizuotas α-tokoferolio acetatas (50.8 % acetato), kurį
suteikė UAB „Aconitum“ (Lietuva).
Įranga
Eksperimentas buvo atliktas chromatografinė sistema „Waters Alliance 269“5 su
fotodiodų matricos detektoriumi. Kolonėlė - ACE C18, 250 mm ilgio, 4,6 mm vidinio skersmens, 5μm
porų dydžio.
Reagentai
Vartoti reagentai – heksanas, NaOH, metanolis, askobro rūgštis („Sigma – Aldrich“,
Vokietija), 96 % etanolis („Stumbras“, Lietuva). Dejonizuotas vanduo buvo paruoštas išgryninto
vandens paruošimo sistema „Millipore“.
Chromatografavimo sąlygos
Buvo išbandytos kelios mobiliosios fazės ir nustatyta, jog efektyviausiai tokoferolio
acetatas iš kolonėlės išplaunamas naudojant metanolio:distiliuoto vandens mišinį santykiu 95:5.
Lanina ir kt. (2007) patvirtino, jog metanolinė fazė yra efektyvesnė prieš kitą dažniausiai naudojamą
fazę- acetonitrilinę. [41] Mobiliosios fazės tekėjimo greitis buvo 1.2 ml/min, bandinio injekuojamas
tūris – 10 µl. Tyrimo trukmė – 14 minučių. Tokoferolio acetato aptikimui buvo naudojama 282 nm
banga. Sistemoje buvo palaikoma 25º temperatūra.
Duomenų rinkimui ir analizei buvo naudojama Empower Chromatography Data Software
(Waters Corporation, Milford, JAV) programinė įranga.
26
Etaloninio tirpalo paruošimas
Etaloninis tirpalas buvo ruošiamas iš standartizuoto α-tokoferolio acetato miltelių.
Pasvertas tikslus kiekis, 111.00 mg tokoferolio acetato, jis subertas į 25 ml matavimo kolbą ir
ištirpintas apytiksliai 15 ml metanolio. Šis tirpalas buvo 15 minučių įdėtas į ultragarso vonelę kol
tokoferolio acetatas visiškai ištirpo ir tada praskiestas metanoliu iki 25 mililitrų. Gautas tirpalas buvo
nufiltruotas per 0,45 µm membraninį filtrą.
Kadangi milteliuose buvo 50.8% α-tokoferolio acetato, paruošta etaloninio tirpalo koncentracija yra:
111.00 mg x 0.508 / 25 ml = 2.255 mg/ml
27
5. REZULTATAI
5.1. Metodo validacija
Validacija atlikta pagal šiuos parametrus:
Specifiškumą
Tiesiškumą
Tikslumą
Glaudumą
Metodo validacija atlikta remiantis Tarptautinės konferencijos techninių reikalavimų, dėl žmonėms
skirtų vaistinių preparatų registravimo, suderinamumo klausimais parengtomis gairėmis [60].
5.1.1. Metodikos specifiškumas
Šis parametras parodo, jog metodika galima vienareikšmiškai įrodyti analitės buvimą.
Parametrui įvertinti lyginamos tiriamųjų mėginių ir etalonų chromatogramos, įvertinami spektrai ir
sulaikymo laikai.
Etaloninio tirpalo chromatograma:
Piko pavadinimas Sulaikymo laikas (min) Plotas Koncentracija (mg/ml)
Tokoferolio acetato etalonas 10.350 2604709 2.255
4 pav. Etaloninio tokoferolio acetato tirpalo chromatograma
28
1 lentelė. Tokoferolio acetato sulaikymo trukmė preparatų mėginiuose
Bandinio paruošimo būdas Sulaikymo trukmė, min
Aliejinio tirpalo tirpinimas etanolyje 10.538
Kapsulių tirpinimas etanolyje 10.437
Kapsulių tirpinimas etanolyje jas kaitinant 10.455
Aliejinio tirpalo tirpinimas etanolyje ir tirpalo ekstrakcija
heksanu 10.392
Kapsulių tirpinimas etanolyje ir tirpalo ekstrakcija heksanu 10.430
Aliejinio tirpalo paruošimas vykdant muilinimo reakciją 10.384
Kapsulių paruošimas vykdant muilinimo reakciją 10.263
Aliejinio tirpalo paruošimas vykdant muilinimo reakciją
pridėjus askobro rūgšties 10.260
Kapsulių paruošimas vykdant muilinimo reakciją pridėjus
askobro rūgšties 10.246
Vidurkis 10.378
Lygiant etalono ir tiriamųjų preparatų sulaikymo trukmės (atitinkamai 10.321 ir 10.378
minučių) matyti, jog jie sutampa.
Taip pat buvo palyginti etalono ir tiriamosios medžiagos spektrai:
5 pav. Etaloninio tokoferolio acetato UV šviesos absorbcijos spektras
29
6 pav. Tokoferolio acetato kapsulių UV šviesos absorbcijos spektras
Abu tokoferolio acetato tirpalai turi UV šviesos absorbcijos maksimumą prie 282.3 nm
bangos ilgio.
Remiantis tuo, jog sutampa lygintos etalono ir tiriamojo preparato sulaikymo trukmės ir
UV absorbcijos spektrai, galima teigti, jog specifiškumo kriterijus yra tenkinamas.
5.1.2. Tiesiškumas
Tiesiškumas buvo įvertintas analizuojant alfa tokoferolio skirtingų koncentracijų
standartus. Koncentracijos buvo nuo 1.69 mg/ml iki 0.02 mg/ml. Gauta tiesinė priklausomybė su
koreliacijos koeficientu r = 0,999929
2 lentelė. Analičių kalibracinės kreivės charakteristikos
Analitės
pavadinimas
Sulaikymo laikas
(min)
Koreliacijos
koeficientas
Kalibracinės
kreivės lygtis
Tiesiškumo ribos
(mg/ml)
Tokoferolio
acetatas 10.378 0.999929
Y = 7,90e+005
X + 7,38e+003 0,021 – 1,69
30
7 pav. Alfa tokoferolio kalibracinis grafikas
Gautas kalibracinės kreivės koeficientas yra > 0.99, tad tiesiškumo kriterijus yra
tenkinamas.
5.1.3. Glaudumas
Glaudumas nustatomas eilę kartų analizuojant tą patį mėginį. Glaudumas yra įvertinamas
nustatant santykinį standartinį nuokrypį (SSN%), kuris yra apskaičiuojamas atsižvelgiant į smailių
sulaikymo laikų, smailių plotų vidurkius bei standartinį nuokrypį. SSN neturėtų viršyti 5 procentų.
Glaudumą galima įvertinti trimis lygiais - pakartojamumu (tas pats mėginys leidžiamas keletą kartų
per trumpą laiko tarpą), tarpiniu preciziškumu (vertinamas atlikus eksperimentus per kelias dienas,
dalyvaujant skirtingiems mokslininkams) bei atkuriamumu (vertinamas rezultatų tikslumas tarp
skirtingų laboratorijų). Šiame darbe pasirinkta patikrinti pakartojamumą.
Atliktos 5 etaloninio tirpalo injekcijos:
31
8 pav. Penkis kartus pakartota tokoferolio acetato etalono chromatograma
Apskaičiuotas santykinis standartinis nuokrypis yra 0.64 %. Tai yra mažiau nei 5% tad
glaudumo kriterijus yra tenkinamas.
5.1.4. Tikslumas
Tikslumas išreiškia nustatytų rezultatų glaudumą jų tikrąjai vertei. Farmacinių preparatų
analizei tikslumas gali būti įvertintas patvirtinus metodikos specifiškumą, tiesiškumą ir glaudumą. Šie
parametrai šioje metodikoje jau įteisinti, tad papildomai nustatinėti tikslumą nereikia.
32
5.2. Tokoferolio acetato preparatų analizės rezultatai
Kadangi darbe siekiama įvertinti įvairių vitamino E bandinių ekstrahavimo metodikų
įtaką analizės tikslumui, buvo apžvelgta mokslinė literatūra šia tema ir pasirinkti keli bandinių
paruošimo būdai, kurie buvo taikomi ir maisto papildui – kapsulėms, ir vaistiniam preparatui – tirpalui.
Taip bus galima palyginti ne tik skirtingų metodikų įtaką analizės efektyvumui, tačiau ir skirtumus tarp
bandinio paruošimo iš kapsulių ir iš tirpalo bei skirtumus tarp vitamino E koncentracijos tikslumo
maisto papilde ir vaiste. Visų paruoštų tirpalų koncentracija buvo 1.2 mg/ml.
Buvo paruošti ir chromatografu analizuoti tokie tirpalai:
1. Tirpinimas etanolyje
a. Aliejinio tirpalo tirpinimas etanolyje.
Pipete pamatuojamas 0.1 ml aliejinio tirpalo, kuris perkeliamas į 25 ml
tūrio kolbą ir ištirpinamas nedideliame kiekyje 96 % etanolio. Pipetė praplaunama
etanoliu, kadangi aliejinis tirpalas yra klampesnis ir gali būti likęs prie pipetės vidinių
sienelių. Tirpalas šildomas vandens vonelėje, maišomas, vėliau veikiamas ultragarsu 15
minučių. Atvėsinama iki kambario temperatūros, praskiedžiama etanoliu iki 25 mililitrų
ribos.
Piko pavadinimas Sulaikymo laikas (min) Plotas Koncentracija (mg/ml)
Tokoferolio acetato
tirpalas etanolyje 10.538 1475469 1.151
9 pav. Tokoferolio acetato aliejinio tirpalo, ištirpinto etanolyje, chromatograma
33
b. Kapsulių tirpinimas etanolyje.
1 kapsulė įdedama į cheminę stiklinę ir užpilama nedideliu kiekiu 96 %
etanolio. Kapsulė praduriama ir stengiamasi iš jos išleisti visą viduje esantį aliejinį
tirpalą. Toliau tirpalas šildomas vandens vonelėje, veikiamas ultragarsu 15 minučių,
atvėsinamas iki kambario temperatūros, perkeliamas į 25 mililtrų matavimo kolbą ir
praskiedžiamas etanoliu iki žymos.
Piko pavadinimas Sulaikymo laikas (min) Plotas Koncentracija (mg/ml)
Kapsulių tirpalas etanolyje 10.437 1042217 0.813
10 pav. Tokoferolio acetato kapsulių, ištirpintų etanolyje, chromatograma
2. Kapsulių tirpinimas etanolyje jas kaitinant.
Kadangi kapsules gaubia apvalkalas, norėta patikrinti hipotezę, jog veikiant karščiu
apvalkalas suirs ir bus lengviau suardyti kapsulę ir išleisti viduje esantį tirpalą nei vien tik
mechaniškai veikiant kapsulę. Viena kapsulė įdedama į cheminę stiklinę ir užpilama nedideliu
kiekiu 96% etanolio. Stiklinė kaitinama vandens vonelėje kol kapsulės apvalkalas suyra.
Etanolio tirpalas nupilamas, likusios apvalkalo dalys praplaunamos etanoliu kad būtų surinti
visi vitamino E aliejinio tirpalo likučiai. Gautas etanolinis tirpalas pašildomas ir veikiamas
ultragarsu kad gerai ištirptų. Tirpalas perkeliamas į 25 ml matavimo kolbą ir praskiedžiamas
etanoliu iki žymos.
34
Piko pavadinimas Sulaikymo laikas (min) Plotas Koncentracija (mg/ml)
Kapsulių tirpalas etanolyje
kaitinant 10.455 1271626 0.992
11 pav. Tokoferolio acetato kapsulių, ištirpintų etanolyje kaitinant, chromatograma
3. Ekstrakcija heksanu
a. Aliejinio tirpalo tirpinimas etanolyje ir ekstrakcija heksanu
0,1 ml aliejinio vitamino E tirpalo atmatuojama pipete ir perkeliama į
cheminę stiklinę. Užpilama maždaug du mililitrai 96 % etanolio, aliejinis tirpalas
ištirpinamas etanolyje šildant. Į tirpalą įpilama apie du militrus heksano ir vykdoma
vitamino E ekstrakcija iš etanolinės fazės į heksano. Ekstrakcijai pagreitinti naudojamas
vortex aparatas, mėginys juo plakamas apie minutę. Baigus plakimą į tirpalą įpilamas
apie mililitras 1M NaOH tirpalo siekiant pagerinti fazių atsikyrimą. Tirpalas paliekamas
nusistovėti kol fazės visiškai atsiskiria. Heksano fazė kruopščiai nusiurbiama pipete ir
perkeliama į mėgintuvėlį. Kadangi heksano tirpalų negalima tirti efektyviosios skysčių
chromatografijos apartu, nes tiriamas tirpalas turi būti kuo panašesis į naudojamą
judriąją fazę, heksanas išgarinamas azoto dujomis ir vitamino E likutis ištiripinamas
mažame kiekyje 96% etanolio, perkeliamas į 25 ml matavimo kolbą ir praskiedžiamas
iki 25 ml žymos etanoliu.
35
Piko pavadinimas Sulaikymo laikas (min) Plotas Koncentracija (mg/ml)
Tirpalo ekstrakcija heksanu 10.392 1529782 1.193
12 pav. Tokoferolio acetato aliejinio tirpalo etanolyje, ekstrahuoto heksanu, chromatograma
b. Kapsulių tirpinimas etanolyje ir ekstrakcija heksanu
1 kapsulė įdedama į cheminę stiklinę, užpilama nedideliu kiekiu etanolio, praduriama ir
mechaniškai išspaudžiamas visas joje esantis aliejinis tirpalas. Etanolinis tirpalas
nupilamas į mėgintuvėlį, užpilamas antra tiek heksano, o toliau bandinio paruošimas
vykdomas kaip ir tirpalo ekstrakcijos su heksanu.
Piko pavadinimas Sulaikymo laikas (min) Plotas Koncentracija (mg/ml)
Kapsulių ekstrakcija heksanu 10.430 1007955 0.786
13 pav. Tokoferolio acetato kapsulių tirpalo etanolyje, ekstrahuoto heksanu, chromatograma
36
4. Bandinio paruošimas vykdant muilinimo reakciją
Tiriant riebaluose tirpių vitaminų kiekį įvairiose medžiagose efektyviosios skysčių
chromatografijos būdu, saponifikacija vykdoma norint visiškai pašalinti visas pašalines
medžiagas, riebalus, galinčius trukdyti tiksliai nustatyti vitaminų kiekį. Saponifikacija dažniau
taikoma tiriant pašarus [54] ar maisto produktus [3],
nes grynus aliejinius tirpalus galima
tiesiogiai tirpinti organiniuose tirpikliuose ir injekuoti į chormatografą. Visgi norima patikrinti
hipotezę, jog aliejuje ištirpintą tokoferolio acetatą sunkiau ekstrahuoti heksanu, todėl atlikus
muilinimo reakciją, kurios metu, reaguojant natrio šarmui su trigliceridais, pastarieji būtų
visiškai pašalinti ir iš tokio tirpalo, tokoferolio acetatas būtų ekstrahuojamas žymiai lengviau ir
tiksliau.
a. Aliejinio tirpalo paruošimas vykdant muilinimo reakciją
0,1 ml aliejinio vitamino E tirpalo ištirpinama 2 ml 96% etanolio. Į tirpalą
pridedama apie 2 ml 1M NaOH tirpalo (perteklius, kad reakcija pilnai įvyktų). Tirpalas
perkeliamas į saponifikacijai skirtą indelį užtvirtinamu dangteliu. Saponifikacija
vykdoma 60 laipsnių vandens vonelėje 10 minučių. Tirpalas atvėsinamas iki kambario
tenperatūros ir sumaišomas su 4 ml heksano. Dėl likutinio NaOH fazės gerai atsiskiria
todėl papildomai jo pilti nereikia. Tirpalas maišomas vortex aparatu 30 sekundžių.
Kruopščiai nusiurbiamas viršutinis heksano sluoksnis ir jis perkeliamas į kitą
mėgintuvėlį. Heksanas išgarinamas skystu azotu, o likęs tokoferolio acetato tirpalas
ištirpinamas mažame kiekyje etanolio, vėliau perkeliamas į 25 ml matavimo kolbą ir
praskiedžiamas iki žymės.
Piko pavadinimas Sulaikymo laikas (min) Plotas Koncentracija (mg/ml)
Tirpalo ekstrakcija muilinant 10.384 416100 0.325
14 pav. Tokoferolio acetato tirpalo paruošimas vykdant muilinimo reakciją
37
b. Kapsulių paruošimas vykdant muilinimo reakciją
1 kapsulė įdedama į cheminę stiklinę, užpilama apie 2 ml etanolio, kapsulė
praduriama ir kapsulės turinys mechaniškai išspaudžiamas į etanolį. Į tirpalą įpilama
2 ml 1M NaOH tirpalo ir jis toliau ruošiamas kaip ir aliejinis tirpalas.
Piko pavadinimas Sulaikymo laikas (min) Plotas Koncentracija (mg/ml)
Kapsulių paruošimas
muilinant 10.263 967329 0.755
15 pav. Tokoferolio acetato kapsulių paruošimas vykdant muilinimo reakciją
5. Bandinio paruošimas vykdant muilinimo reakciją ir pridėjus askobro rūgšties
Vykdant muilinimo reakciją tokoferolio acetatas veikiamas įvairiais cheminiais regentais
– alkoholiu, heksanu, azotu, natrio šarmu, taip pat veikiamas karščiu, maišomas vortex
prietaisu. Tai gali suardyti dalį tokoferolio acetato molekulių ir iškreipti analizės rezultatus.
Todėl kai kurie autoriai (3), atlikdami saponifikacijos reakcijas, prideda antioksidantų. Iškelta
hipotezė, jog pridėjus antioksidacinį poveikį turinčių medžiagų, tokoferolio acetato molekulės
bus geriau apsaugotos nuo cheminio ir fizikinio ardančio poveikio ir bus gauti tikslesni analizės
rezultatai. Kaip antioksidantas pasirinkta askobro rūgštis.
Tiek tirpalas tiek kapsulės paruošiamos taip pat kaip ir aprašyta muilinimo metode, tačiau
į tirpalą prieš įpilant natrio šarmo dar įberiama 30 mg askobro rūgšties miltelių ir gerai
išmaišoma.
38
Piko pavadinimas Sulaikymo laikas (min) Plotas Koncentracija (mg/ml)
Tirpalo ekstrakcija muilinant
pridėjus askobro rūgšties. 10.260 349782 0.273
16 pav. Tokoferolio acetato tirpalo paruošimas muilinant ir pridėjus askobro rūgšties
Piko pavadinimas Sulaikymo laikas (min) Plotas Koncentracija (mg/ml)
Kapsulių ekstrakcija muilinant
pridėjus askobro rūgšties 10.246 556431 0.434
17 pav. Tokoferolio acetato kapsulių paruošimas muilinant ir pridėjus askobro rūgšties
Įvairiais būdais paruoštus mėginius išanalizavus efektyvios skysčių chromatografijos
būdu, buvo apskaičiuota faktinė tokoferolio acetato koncentracija kiekviename mėginyje. Skaičiavimai
atlikti remiantis kalibraciniu grafiku (5 pav.). Geriausi gauti rezultatai paryškinti.
39
3 lentelė. Įvairių tokoferolio acetato prepratų bandinių chromatogramoje gautų
smailių plotas ir apskaičiuota koncentracija
Bandinio paruošimo būdas Smailės plotas
chromatogramoje
Medžiagos
koncentracija
(mg/ml)
Nustatyta
koncentracija lyginant
su teoriškai
apskaičiuota
koncentracija (%)
1.a. Aliejinio tirpalo tirpinimas etanolyje 1475469 1.151 95.52
1.b. Kapsulių tirpinimas etanolyje 1042217 0.813 67.75
2. Kapsulių tirpinimas etanolyje jas
kaitinant 1271626 0.992 82.67
3.a. Aliejinio tirpalo tirpinimas
etanolyje ir tirpalo ekstrakcija heksanu 1529782 1.193 99.42
3.b. Kapsulių tirpinimas etanolyje ir
tirpalo ekstrakcija heksanu 1007955 0.786 65.5
4.a. Aliejinio tirpalo paruošimas vykdant
muilinimo reakciją 416100 0.325 27.08
4.b. Kapsulių paruošimas vykdant
muilinimo reakciją 967329 0.755 62.92
4.a. Aliejinio tirpalo paruošimas vykdant
muilinimo reakciją pridėjus askobro
rūgšties
349782 0.273 22.75
4.b. Kapsulių paruošimas vykdant
muilinimo reakciją pridėjus askobro
rūgšties
556431 0.434 36.17
40
6. REZULTATŲ APTARIMAS
Visose tiriamųjų mėginių chromatogramose tokoferolio acetato smailė atsiskiria apie 10
minutę. Tačiau vykdant muilinimo reakcijas gaunamos chromatogramos, pavyzdžiui 14 ar 15 pav., turi
žymiai daugiau pašalinių smailių, kartais net didesnių už tokoferolio acetato smailę (16 pav.), nei
chromatogramos, gautos iš mėginių, paruoštų neatliekant muilinimo reakcijos, pavyzdžiui 9 ar 10 pav.
Visi tirti mėginiai buvo gaminti vienodos koncentracijos (1.2 mg/ml), pagal gamintojo
nurodytas preparatų koncentracijas, tačiau chromatografu nustatytos koncetracijos skiriasi nuo 0,273
mg/ ml (16 pav.) iki 1.193 mg/ml (12 pav.). Šius koncentracijų skirtumus nulėmė skirtingi
ekstrakcijos metodų efektyvumai.
Atliekant eksperimentus nustatyta, jog efektyviausias metodas tirti aliejinį tirpalą yra jo
ištirpinimas etanolyje ir gauto tirpalo ekstrakcija heksanu (12 pav.). Taip paruoštame mėginyje
nustatytas didžiausias tokoferolio acetato kiekis, 1,193 mg/ml ir tai sudaro 99.42 % teoriškai
apskaičiuotos koncentracijos. Jis yra truputį efektyvesnis nei preparato tirpinimas etanolyje be
ekstrakcijos heksanu, nes be ekstrakcijos heksanu gauta koncentracija yra 3.9 % mažesnė nei vykdant
ekstrakciją. Efektyviausias metodas kapsulėms tirti – jų ištirpinimas etanolyje kaitinant tirpalą, kad
geriau suirtų kapsulės apvalkalas (11 pav.). Taip gauta koncentracija – 0.992 mg/ml ir tai sudaro 82.67
% teoriškai apskaičiuotos koncentracijos. Efektyviausias metodas aliejinio tirpalo analizei –
ekstrakcija heksanu – kapsulėms mažiau tinkamas, juo gauta koncentracija buvo 0.786 mg/ml, t.y.
0.206 mg/ml mažesnė nei kapsules kaitinant etanolyje.
Gimano ir kt. (2000) teigia, jog analizuojant aliejinius tokoferolio acetate tirpalus
geriausia juos tiesiog ištirpinti organiniame tirpiklyje be ekstrakcijos. Aliejuose esančios priemaiškos
nekliudo tokoferolio analizei, be to, neatliekant papildomų procedūrų sutrumpinama analizės trukmė
[23]. Tačiau šiame darbe aprašytas eksperimentas įrodo, kad atlikti ekstrakciją heksanu yra verta, nes
gaunami tikslesni duomenys.
Prastesni rezultatai gauti vykdant muilinimo reakciją, o patys prasčiausi – muilinant ir
pridėjus askobro rūgšties. Akivaizdu, jog poveikis karščiu ir stipriomis cheminėmis medžiagomis
(šarmu) muilinant suardo dalį tokoferolio acetato. Tačiau iškelta hipotezė, jog askobro rūgštis, kaip
stiprus antioksidantas, apsaugos tokoferolio acetatą, neapsiteisino, netgi priešingai, gauti dar prastesni
rezultatai nei muilinant be askobro rūgšties (gautos koncentracijos yra 0.325 mg/ml muilinant be
askobro rūgšties ir 0.273 mg/ml muilinant su askobro rūgštimi tokoferolio acetato tirpalui ir 0.755
mg/ml muilinant be askobro rūgšties ir 0.434 mg/ml muilinant su askobro rūgštimi tokoferolio acetato
41
kapsulėms). Vykdant muilinimo reakciją su askobro rūgštimi, tirpale atsirado nuosėdų, tirpalas
nusidažė švelniai oranžine spalva, todėl galima spėti, jog dėl askobro rūgšties priedo mėgintuvėlyje
įvyko cheminės reakcijos, suardžiusios dar didesnį kiekį tokoferolio acetato. Muilinimo reakcijos
analizuojant tokoferolio acetato preparatus nėra rekomenduotinos, nes užtrunka ilgai, reikalauja
daugiau įrenginių ir regentų, o gautas rezultatas būna prastesnis. Tačiau Albala - Hurtado ir kt. (1997
m.) pasiūlyta metodika tokoferolio acetatui nustatyti vykdant saponifikaciją ir pridėjus askobro
rūgšties, buvo sėkmingai pritaikyta analizei [3]. Joje saponifikacija buvo atlikta kambario
temepratūroje visą naktį, tuo tarpu šiame tyrime saponifikacija atlikta trumpą laiką aukštoje
temperatūroje, kas galbūt turėjo įtakos prastiems rezultatams. Būtų galima atlikti tolesnius tyrimus dėl
askobro rūgšties naudojimo tokoferolio acetatui apsaugoti, keičiant reakcijos sąlygas ar naudojant kitus
tirpiklius, kad neįvyktų jokios cheminės reakcijos.
Lyginant vaistinio preparato ir maisto papildo dozavimo tikslumą nustatyta, jog tiksliau
dozuotas yra vaistinis preparatas. Sudarytas grafikas (18 pav.) rodo skirtumus tarp nustatytų vaisto ir
maisto papildo koncentracijų naudojant tuos pačius ekstrakcijos būdus (ekstrakcijos būdai vykdant
muilinimo reakcijas neįtraukti nes jais nustatyti rezultatai ganėtinai prasti). Nors abu preparatai buvo
pagaminti vienodos 1.2 mg/ml koncentracijos pagal gamintojo nurodytas preparatų koncentracijas,
vaistinio preparato – tirpalo – koncentracija ir gauta panaši į teoriškai apskaičiuotą, tuo tarpu maisto
papilde nustatytas tokoferolio acetato trūkumas. Nors iš visų registruotų vitamino E preparatų
dauguma yra maisto papildai, akivaizdu, jog remiantis gautomis išvadomis, maisto papildai yra
dozuojami ne taip tiksliai kaip vaistiniai preparatai ir yra tikslinga vartoti vaistinius vitaminų
preparatus norit pasiekti geriausio terapinio efekto.
18 pav. Nustatytos tokoferolio acetato vaistinio preparato ir maisto papildo koncentracijos
Tirpinimasetanolyje
Tirpinimasetanolyjekaitinant
Ekstrakcijaheksanu
Tirpalas (vaistinis preparatas) 1.151 1.193
Kapsulės (maisto papildas) 0.813 0.992 0.786
0
0.2
0.4
0.6
0.8
1
1.2
1.4
Ko
nce
ntr
acija
, mg/
ml
Išekstrahuoti preparatų kiekiai
42
7. IŠVADOS
1. Apžvelgus mokslinę literatūrą,buvo aprašyta vitamino E struktūra, metabolizmas
organizme ir jo poveikis, apžvelgti ir apibendrinti Lietuvoje registruoti vitamino E
prepratai, taip pat farmakopėjiniai ir nefarmakopėjiniai jų analizės būdai.
2. Paruošta ir validuota metodika, tinkama vitamino E preparatų analizei efektyviosios
skysčių chromatografijos metodu.
3. Nustatyta, jog efektyviausias būdas aliejinių tirpalų bandinių ekstrakcijai – etanolinio
tirpalo ekstrakcija heksanu, o kapsulėms – jų kaitinimas etanolyje.
4. Muilinimo reakcijos su ar be askobro rūgšties priedo nėra tinkamos tokoferolio acetato
preparatų analzei. Vaistinis preparatas yra dozuotas tiksliau nei maisto papildas.
43
8. LITERATŪROS SĄRAŠAS
1. Ivanovienė L, Praškevičius A. Stasiūnienė N, redaktoriai. Biochemija, antras leidimas. Kaunas:
Vitae Litera, 2006. p. 173-75
2. Kochanskienė, Ieva, et al. "Suaugusių žmonių maisto papildų vartojimo ypatybės." Lietuvos
bendrosios praktikos gydytojas 7-8 (2010).
3. Albala´-Hurtado, S., Novella-Rodri´ guez, S., Veciana-Nogue´ s, M. T., & Mariné-Font, A.
(1997). Determination of vitamins A and E in infant milk formulae by high-performance liquid
chromatography. Journal of Chromatography A, 778(1-2), 243-246.
4. Albanes, Demetrius, et al. "α-Tocopherol and β-carotene supplements and lung cancer
incidence in the Alpha-Tocopherol, Beta-Carotene Cancer Prevention Study: effects of base-
line characteristics and study compliance." Journal of the National Cancer Institute 88.21
(1996): 1560-1570.
5. Amerikos žemės ūkip departamento maisto produktų duomenų bazė. Žiūrėta 2014-04-29
Prieiga internetu : http://ndb.nal.usda.gov/ndb/nutrients/
6. Arikanoglu, Adalet, et al. "Relationship of cognitive performance with prolidase and oxidative
stress in Alzheimer disease." Neurological Sciences (2013): 1-5.
7. Barve A, Khor TO, Nair S and al. Gamma-tocopherol-enriched mixed tocopherol diet inhibits
prostate carcinogenesis in TRAMP mice. 2009 April.
8. Bostick, Roberd M., et al. "Reduced risk of colon cancer with high intake of vitamin E: the
Iowa Women's Health Study." Cancer research 53.18 (1993): 4230-4237.
9. Bowman B, Russell R, redaktoriai. Present knowledge in nutrition, devintas leidimas, I dalis.
Washington DC:International life sciences institute, 2006. p. 211 – 218
10. Brigelius-Flohe, Regina, and Maret G. Traber. "Vitamin E: function and metabolism." The
FASEB Journal 13.10 (1999): 1145-1155.
11. Bruno SR, Leonard SW, Park S et al. Human vitamin E requirements assessed with the use of
apples fortified with deuterium-labeled α-tocopheryl acetate. Iš American Society for Clinical
Nutrition, 2006 February.
12. Bruno, Richard S., et al. "Faster plasma vitamin E disappearance in smokers is normalized by
vitamin C supplementation." Free radical biology & medicine40.4 (2006): 689.
13. Burton GW, Wronska U, Stone L, et al. Biokinetics of dietary RRR-alpha-tocopherol in the
male guinea pig at three dietary levels of vitamin C and two levels of vitamin E. Evidence that
vitamin C does not "spare" vitamin E in vivo. 1990 April.
44
14. Cheeseman KH, Holley AE, Kelly FJ, Wasil M, Hughes L, Burton G. Biokinetics in humans of
RRR-alpha-tocopherol: the free phenol, acetate ester, and succinate ester forms of vitamin E.
1995 November (online). Žiūrėta 2013-03-20. Prieiga per internetą
http://www.ncbi.nlm.nih.gov
15. Chen, Chiung-Mei, et al. "Increased oxidative damage in peripheral blood correlates with
severity of Parkinson's disease." Neurobiology of disease 33.3 (2009): 429-435.
16. Constantinescu, Anastasia, Derick Han, and Lester Packer. "Vitamin E recycling in human
erythrocyte membranes." Journal of Biological Chemistry268.15 (1993): 10906-10913.
17. Diplock, Anthony T., et al. "Relationship of Tocopherol Structure to Biological Activity,
Tissue Uptake, and Prostaglandin Biosynthesisa." Annals of the New York Academy of
Sciences 570.1 (1989): 72-84.
18. Dommergues, J. P., and B. Bader-Meunier. "Nutritional anemia in children." La Revue du
praticien 39.24 (1989): 2117.
19. Etminan, Mahyar, Sudeep S. Gill, and Ali Samii. "Intake of vitamin E, vitamin C, and
carotenoids and the risk of Parkinson's disease: a meta-analysis." The Lancet Neurology 4.6
(2005): 362-365.
20. European Pharmacopoeia, 7th edition, volume 2. Strasbourg: Council of Europe;2011. p. 3104-
3110.
21. Fujita, Koji, et al. "Vitamin E decreases bone mass by stimulating osteoclast fusion." Nature
medicine 18.4 (2012): 589-594.
22. García-Closas, Reina, et al. "Dietary sources of vitamin C, vitamin E and specific carotenoids
in Spain." British Journal of Nutrition 91.06 (2004): 1005-1011.
23. Gimeno, E., et al. "Rapid determination of vitamin E in vegetable oils by reversed-phase high-
performance liquid chromatography." Journal of Chromatography A 881.1 (2000): 251-254.
24. Goldenstein, Hagit, et al. "Patient selection and vitamin E treatment in diabetes
mellitus." Expert Review of Cardiovascular Therapy 11.3 (2013): 319-326.
25. Hadžović-Džuvo, Almira, et al. "Serum total antioxidant capacity in patients with multiple
sclerosis." Bosn J Basic Med Sci 11.1 (2011): 33-6.
26. Illison, Vanessa K., et al. "The relationship between plasma alpha-tocopherol concentration and
vitamin E intake in patients with type 2 diabetes mellitus."International journal for vitamin and
nutrition research. Internationale Zeitschrift fur Vitamin-und Ernahrungsforschung. Journal
international de vitaminologie et de nutrition 81.1 (2011): 12.
27. Iwase, Hiroshi. "Simultaneous sample preparation for high-performance liquid
chromatographic determination of Vitamin A and β-carotene in emulsified nutritional
supplements after solid-phase extraction." Analytica Chimica Acta463.1 (2002): 21-29.
45
28. Yakoot, Mostafa. "Vitamin E and Omega-3: What to believe: Observational studies or
randomized controlled trials?." Heart Views: The Official Journal of the Gulf Heart
Association 13.2 (2012): 66.
29. Ye, Yizhou, Jing Li, and Zhongxiang Yuan. "Effect of Antioxidant Vitamin Supplementation
on Cardiovascular Outcomes: A Meta-Analysis of Randomized Controlled Trials." PloS
one 8.2 (2013).
30. You, Cha-Sook, et al. "Long-chain carboxychromanols are the major metabolites of
tocopherols and tocotrienols in A549 lung epithelial cells but not HepG2 cells." The Journal of
nutrition 135.2 (2005): 227-232.
31. Yvonne M. Jeanes, Wendy L. Hall, Susan Ellard, Elizabeth Lee and John K. Lodge (2004). The
absorption of vitamin E is influenced by the amount of fat in a meal and the food matrix.
British Journal of Nutrition, , pp 575-579.
32. Jain AB, and Jain VA. "Vitamin E, Its Beneficial Role in Diabetes Mellitus (DM) and Its
Complications." Journal of clinical and diagnostic research: JCDR 6.10 (2012): 1624.
33. Jensen, Søren Krogh, and Charlotte Lauridsen. "Alpha-tocopherol stereoisomers." Vitamins
and hormones 76 (2007): 281.
34. Kagan, Valerian E., et al. Recycling of vitamin E in human low density lipoproteins. 1992
March.
35. Kagan, Valerian, et al. "Ultraviolet light-induced generation of vitamin E radicals and their
recycling. A possible photosensitizing effect of vitamin E in skin." Free Radical Research 16.1
(1992): 51-64.
36. Kaneko, Kazuyo, et al. "Studies of the metabolism of α-tocopherol stereoisomers in rats using
[5-methyl-14C] SRR-and RRR-α-tocopherol."Journal of Lipid Research 41.3 (2000): 357-367.
37. Kirac, Deniz, Yesim Negis, and Nesrin Kartal Ozer. "Vitamin E attenuates homocysteine and
cholesterol induced damage in rat aorta." Cardiovascular Pathology (2013).
38. Klaunig, James E., and Lisa M. Kamendulis. "The role of oxidative stress in
carcinogenesis." Annu. Rev. Pharmacol. Toxicol. 44 (2004): 239-267.
39. Ko, Mei-Lan, et al. "Dietary deficiency of vitamin E aggravates retinal ganglion cell death in
experimental glaucoma of rats." Current eye research 35.9 (2010): 842-849.
40. Lanina, Svetlana A., et al. "Comparison of reversed-phase liquid chromatography–mass
spectrometry with electrospray and atmospheric pressure chemical ionization for analysis of
dietary tocopherols." Journal of chromatography A 1157.1 (2007): 159-170.
41. Li, Feng-Jiao, Liang Shen, and Hong-Fang Ji. "Dietary Intakes of Vitamin E, Vitamin C, and β-
Carotene and Risk of Alzheimer's Disease: A Meta-Analysis."Journal of Alzheimer's
Disease 31.2 (2012): 253-258.
46
42. LODGE, JOHN K., et al. "Physiological factors influencing vitamin E biokinetics." Annals of
the New York Academy of Sciences 1031.1 (2004): 60-73.
43. MG Isaac, R. Quinn, and N. Tabet. "Vitamin E for Alzheimer's disease and mild cognitive
impairment." Cochrane Database Syst Rev 3 (2008).
44. Miyake, Y., et al. "Dietary intake of antioxidant vitamins and risk of Parkinson’s disease: a
case–control study in Japan." European Journal of Neurology 18.1 (2011): 106-113.
45. Miller, Edgar R., et al. "Meta-analysis: high-dosage vitamin E supplementation may increase
all-cause mortality." Annals of internal medicine 142.1 (2005): 37-46.
46. Miller, Galen W., et al. "The α-Tocopherol Transfer Protein Is Essential for Vertebrate
Embryogenesis." PloS one 7.10 (2012): e47402.
47. Narushima, Kazuya, et al. "Niemann-Pick C1-like 1 mediates α-tocopherol
transport." Molecular pharmacology 74.1 (2008): 42-49.
48. National Research Council. Dietary Reference Intakes for Vitamin C, Vitamin E, Selenium,
and Carotenoids . [Žiūrėta 2013-05-27] Washington, DC: The National Academies Press, 2000.
Prieiga internetu http://www.nap.edu
49. Niki E. Role of vitamin E as a lipid-soluble peroxyl radical scavenger: in vitro and in vivo
evidence. Free Radical Biology and Medicine. April 2013. Žiūrėta 2013-04-10. Prieiga per
internetą http://www.sciencedirect.com/
50. Okura, Yuki, et al. "Dietary vitamin E deficiency increases anxiety‐related behavior in rats
under stress of social isolation." Biofactors 35.3 (2009): 273-278.
51. Prasad, Kailash, et al. "Vitamin E slows the progression of hypercholesterolemia-induced
oxidative stress in heart, liver and kidney."Molecular and cellular biochemistry 368.1-2
(2012): 181-187.
52. Qian, H., and M. Sheng. "Simultaneous determination of fat-soluble vitamins A, D and E and
pro-vitamin D< sub> 2</sub> in animal feeds by one-step extraction and high-performance
liquid chromatography analysis." Journal of Chromatography A 825.2 (1998): 127-133.
53. Rachieru, D., Duca, R., & Olteanu, M. (2009). Validation of a method to determine vitamin E
(alpha tocopherol) from feed ingredients by HPLC using reversed phase
chromatography. Universitatea de Ştiinţe Agricole şi Medicinǎ Veterinarǎ la lucrări ştiinţifice.
Ser Zootehnie, 52, 543-547.
54. Reboul, Emmanuelle, et al. "Scavenger receptor class B type I (SR-BI) is involved in vitamin E
transport across the enterocyte." Journal of Biological Chemistry 281.8 (2006): 4739-4745.
55. Riboli, Elio, and Rudolf Kaaks. "The EPIC Project: rationale and study design. European
Prospective Investigation into Cancer and Nutrition." International Journal of
Epidemiology 26.suppl 1 (1997): S6.
47
56. Ruperez, F. J., et al. "Chromatographic analysis of α-tocopherol and related compounds in
various matrices." Journal of chromatography A 935.1 (2001): 45-69.
57. Shinde, Sarita N., Vithal N. Dhadke, and Adinath N. Suryakar. "Evaluation of oxidative stress
in type 2 diabetes mellitus and follow-up along with vitamin E supplementation." Indian
Journal of Clinical Biochemistry 26.1 (2011): 74-77.
58. Sontag, Timothy J., and Robert S. Parker. "Cytochrome P450 ω-Hydroxylase Pathway of
Tocopherol Catabolism NOVEL MECHANISM OF REGULATION OF VITAMIN E
STATUS." Journal of Biological Chemistry 277.28 (2002): 25290-25296.
59. Sontag, Timothy J., and Robert S. Parker. "Influence of major structural features of tocopherols
and tocotrienols on their ω-oxidation by tocopherol-ω-hydroxylase." Journal of lipid
research 48.5 (2007): 1090-1098.
60. The international conference on harmonisation of technical requirements for registration for
pharmaceuticals for human use. Validation of analytical procedures: text and methodology Q2
(R1). 1996. Prieiga per internetą:
http://www.ich.org/fileadmin/Public_Web_Site/ICH_Products/Guidelines/Quality/Q2_R1/Step
4/Q2_R1__Guideline.pdf
61. Traber M. Mechanisms for the prevention of vitamin E excess. The Journal of Lipid Research.
Kovas, 2013.
62. Traber MG, Siddens LK, Leonard SW ir kt. Alpha-tocopherol modulates Cyp3a expression,
increases gamma-CEHC production, and limits tissue gamma-tocopherol accumulation in mice
fed high gamma-tocopherol diets. 2005 March. Žiūrėta 2013-03-22. Prieiga per internetą
http://www.ncbi.nlm.nih.gov/
63. Traber, Maret G. "Vitamin E regulatory mechanisms." Annu. Rev. Nutr. 27 (2007): 347-362.
Žiūrėta 2013-03-20.
64. Traber, Maret G., and Jeffrey Atkinson. "Vitamin E, antioxidant and nothing more." Free
Radical Biology and Medicine 43.1 (2007): 4-15.
65. Ueda, Naohisa, et al. "Correlation between neurological dysfunction with vitamin E deficiency
and gastrectomy." Journal of the neurological sciences 287.1 (2009): 216-220.
66. Ulatowski L, Dreussi C, Noy N, ir kt. Expression of the α-tocopherol transfer protein gene is
regulated by oxidative stress and common single-nucleotide polymorphisms. 2012, October.
Žiūrėta 2013-03-22. Prieiga per internetą http://www.ncbi.nlm.nih.gov/
67. Usoro, Owoedimo B., and Shaker A. Mousa. "Vitamin E forms in Alzheimer's disease: A
review of controversial and clinical experiences." Critical reviews in food science and
nutrition 50.5 (2010): 414-419.
48
68. Wang, Hao, et al. "Vitamin E intake and risk of amyotrophic lateral sclerosis: a pooled analysis
of data from 5 prospective cohort studies." American journal of epidemiology 173.6 (2011):
595-602.
69. Woodson, Karen, et al. "Serum α-tocopherol and subsequent risk of lung cancer among male
smokers." Journal of the National Cancer Institute 91.20 (1999): 1738-1743.
70. Wright, Margaret E., et al. "Supplemental and dietary vitamin E intakes and risk of prostate
cancer in a large prospective study." Cancer Epidemiology Biomarkers & Prevention 16.6
(2007): 1128-1135.
Recommended