Wann Genom Sequenzierung – Unterschied zu Syndrom ......1st generation (Sanger sequencing) Maxam,...

Wann Genom Sequenzierung –Unterschied zu Syndrom basierten

Multiplex-PCR-Verfahren?

WGS vs. mpPCR

1st generation (Sanger sequencing) Maxam, Gilbert & Sanger (1975): maximum sequencing length ~1000bp

(>30€/sample) First bacterial genome 1995 (Haemophilus influenzae, genome size ~1.9

Mill. basepairs; costs ~1.3 Mio€)

2nd generation (Pyro sequencing) 454 Life Sciences = 1st NGS instrument (costs 25.000€/ sample)

3rd generation (massive parallel sequencing of shortfragments <500 bp) Illumina, Fisher scientific (IonTorrent)

4th generation (single molecule sequencing) PacBio & Oxford Nanopore: very long reads; >300€/sample

Evolution of sequencing

NGS - Analyse

16S rDNA Databases:• Greengenes• SilvaPathogen discovery tools: • Taxonomer, Flygare et al. (2016).

Pathoscope, Francis et al. (2013)

MikrobielleNGS-Reads

Amplicon

Shot-gun

16S rDNA

Metagenom

Virulenzen

Resistenzen

InfiziertesHumangewebe

Reinkultur

…

Contigs Scaffolds

Artenprofil

Res/ Vir Profile

Artenprofil

Pathogennachweisl

De novoMapping

Annotierung

SurveillancePhylogenie

Identifizierung

Syntenie & Genomorganisation

Assemblierung

PCR Signaturen

Isolierung genomischerDNAHerstellung der DNA Library• Fragmentierung der gDNA• Ligation von Adaptern und

Barcodes (Indices)• Normalisierung/

Quantifizierung(Emulsions-PCR – nur ABI Technologie)

NGSAllgemeiner Workflow

©Illumina

Clusterbildung• Bindung der Fragmente auf

der Flow Cell• Bridgeamplifizierung

NGSAllgemeiner Workflow

©Illumina

• Sequenzierung• Demultiplexing• Output file = Raw Reads + QC Info• Weitere Datenanalyse

NGSSequenzierung

Assemblierung von Sequenzen

D. Harmsen, 2016

Zusammenfassung Workflow NGS

gDNA isolation Library Preparation

Data analysis

~1 Woche für 128 Listeria/ MRSA

Assembled genome(Contigs)

Sequence reads(300 bp max)

contig 1 contig 2

Assembly(de novo or reference based

MLST, cgMLST, SNPSerotype, Spoligotype, MIRUResistance, Virulence, ToxingenesPlasmidsEtc.

Report

MST

WGS vs. mpPCRWGS Charakterisierung von

Isolaten (Phylogenie, Virulenz, Resistenz, etc.)

Ausbruchsaufklärung Identifizierung der

Infektionsquelle Identifizierung „Metagenomanalyse“ Kosten!? Ergebnis in Tagen Analyse ev. aufwändig Kultivierung meist nötig

mpPCR Direkte Analyse aus

Probenmaterial Ergebnis in Stunden

verfügbar Methode der Wahl für eine

schnelle Diagnostik/ Screening

Kosten!? Bekannte Erreger Ungenaue Identifizierung Keine Charakterisierung

1995: 1. mikrobielle Genomsequenz - Haemophilusinfluenzae - Kosten 1,5 Mio$

Kosten aktuell (mittlere Genomgröße) ab ~ 10€!?; MiSeq ~50€

Humangenom: 2003 3 Milliarden € (& 2,5 Jahre); 2011 ~1000€ (~3 Tage)

Daten NGS

Beispiel – schnelle Diagnostik & WGS

WGS Endergebnis AusbruchsaufklärungMinimum spanning tree basierend auf einem Vergleich von 1127 Genen

„Die unbekannte Ursache, welche so entsetzliche Verheerungen anrichtete, war demnach in den an der Hand klebenden Cadavertheilen der Untersuchenden an der ersten Gebärklinik gefunden.“ – Ignaz Semmelweis[6]

Cluster I: Oktober 2013 – März 2014Cluster II: Jänner 2014Ergebnis:• Cluster I ein lokales, kein KH-weites

Problem• Ursache für Cluster II unklar• Unklar auch die diversen Isolate von

P18Etablierung Surveillance für MDR A.b.Kosten 120€Finanzielle Auswirkung auf Krankenpflege unklar!

´´

NGS ist eine offene Plattform

Möglichkeit Bakterien, Pilze, Viren in einem Assay zu detektieren

NGS ist quantitativ! (Anzahl der Sequenzierreads)

NGS ergibt eine unverzerrte und ungezielte DNA Sequenzinformationaus Patientenproben - höhere Sensitivität und Spezifität

Nachweis von Resistenzen

Nutzen - Vorteile

Metagenomanalyse

Deurenberg RH et al., Journal of Biotechnology, Volume 243, 2017, 16–24

Noch nicht für die Diagnostik etabliert

18

How to type bacteria

Phenotypic features Morphology on diverse culture

media Serotyping (1900) Phagetyping (1920‘s) Resistance

Genotypic featuresVariations in DNA – Genetic

fingerprint Fragment based methods Sequence based methods

NGS ist der neue Goldstandard für die BakterientypisierungNGS liefert ein Maximum an Informationen• Charakterisierung/ Typisierung

• Ausbruchsaufklärung (Epidaten!)• Übertragungswege & Infektionsquellen (Epidaten)• Überwachung/ Surveillance• Virulenzgene• Resistenzgene• Toxingene• Plasmiddaten

KostenersparnisVerbesserte Behandlung+ Nutzen für die KH Hygiene

Metagenom Analytik – Amplicon Sequenzierung• Eine Zeitfrage bis zur Routineanwendung!

Zusammenfassung