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Enzimas
Concepto de enzima• Los enzimas son generalmente proteínas
o asociaciones de proteínas y otras moléculas orgánicas e inorgánicas que actúan catalizando los procesos químicos que se dan en los seres vivos.
• ¿Qué es catalizar?– Acelerar las reacciones químicas– Disminuir la energía de activación
“Energía de activación” Es la energía necesaria para que una sustancia A se transforme en otra B
Para que una reacción se lleve a cabo las moléculas deben alcanzar un estado energético determinado (energía de activación).Puede conseguirse esta energía, de dos formas:
B) CON ENZIMAS
Aumentando la temperatura. Sin embargo, las enzimas se desnaturalizan a esa T. Además, esa energía debe proceder de otra reacción, lo que aumenta el gasto energético.
Con enzimasLas enzimas rebajan la energía de activación
PROPIEDADES GENERALES• AUMENTAN LA VELOCIDAD DE REACCIÓN
– De 106 a 1012 veces vs sin enzima.– Aún más rápido que los catalizadores químicos.
• CONDICIONES DE REACCIÓN– Temperatura 25-40 oC (algunas hasta 75 oC)– pH neutro (5-9), la mayoría 6.5 – 7.5– Presión atmosférica normal
• CAPACIDAD DE REGULACIÓN– Por concentración de sustrato– Por concentración de enzima– Por inhibidores competitivos (semejantes al sustrato)– Por inhibidores no competitivos (no semejantes al sustrato)– Por regulación alostérica
• ALTA ESPECIFICIDAD DE REACCIÓN– Interacción estereoespecífica con el sustrato– No hay productos colaterales
Características de las Enzimas
1. Especificidad. Cada enzima cataliza un solo tipo de reacción, y casi siempre actúa sobre un único sustrato o sobre un grupo muy reducido de ellos.
2. No forman nunca parte del producto o productos.
3. No se consumen.
4. Son necesarios, por tanto, sólo en una pequeña cantidad.
Ene
rgía
Progreso de la reacción
Variación de la energía
Energía de activación con la enzima
Energía de activación sin la enzima
Energía de los productos
Energía de los reactivos
Las enzimas actúan como un catalizador:
Disminuyen la energía de activación.
No cambian el signo ni la cuantía de la variación de energía libre.
No modifican el equilibrio de la reacción.
Aceleran la llegada del equilibrio.
Al finalizar la reacción quedan libres y pueden reutilizarse.
Mecanismo de la acción enzimática1.- se forma un complejo enzima- sustrato2.- los restos de los aminoácidos que configuran el
centro activo catalizan el proceso. Para ello debilitan los enlaces necesarios para que la reacción química se lleve a cabo a baja temperatura y no se necesite una elevada energía de activación.
3.- los productos se separan del centro activo y la enzima se recupera intacta para nuevas cataísis
Centro activo: Región del enzima que se une al sustrato y donde se realiza la catálisis
• Es un bolsillo o hendidura tridimensional compuesto por residuos de aminoácidos de diferentes partes de la molécula que producen un microambiente específico.
• Es relativamente pequeño en comparación con el volumen total del enzima.
• Los sustratos se unen mediante múltiples interacciones débiles. Las interacciones proveen de la energía necesaria para reducir la energía de activación.
• Proporciona la especificidad a la enzima.
Enzima (E)Sustratos (S)
Complejo enzima-sustrato (ES)
Enzima (E)
Productos (P)
Esquema general de la reacción enzimática
E + S ES E + P
Modelo de Llave y CerraduraModelo de Llave y Cerradura (Emil Fischer) (Emil Fischer)
Substrato y enzima se acoplan de forma estereospecífica,de la misma manera que una llave se ajusta a su cerradura.
Modelo aceptado durante mucho tiempo; hoy se considera insuficiente al no explicar algunos fenómenos de la inhibición enzimática
Sustrato
Enzima
Complejo enzima- sustrato
Modelo de Ajuste InducidoModelo de Ajuste Inducido (Koshland) (Koshland)
Tanto la enzima como el substrato sufren una alteración en su estructura por el hecho físico de la unión.
Está mucho más de acuerdo con todos los datos experimentales conocidos hasta el momento.
Sustrato
Enzima
Complejo enzima- sustrato
• Nomenclatura histórica:– SUSTRATO + ACTIVIDAD + SUFIJO(asa)
(v.g. glucoquinasa)– SUSTRATO + SUFIJO(asa)
(v.g. ureasa)– DONADOR + ACEPTOR + ACTIVIDAD + SUFIJO(asa)
(v.g. oxalacetilaminotransferasa)
• Nomenclatura IUB (1972): 6 grupos según la reacción catalizada. Código numérico encabezado por las letras EC( enzyme commission). Cuatro números separados por puntos
Nomenclatura
EC 1.x OxidorreductasasEC 2.x TransferasasEC 3.x HidrolasasEC 4.x LiasasEC 5.x IsomerasasEC 6.x Ligasas
Clasificación de enzimas por Grupos
Sin transferencia de hidrógenos
1. OXIDORREDUCTASAS
• Regulan reacciones REDOX
• Existen dos tipos esenciales:
• Con transferencia de hidrógenos
• Sin transferencia de hidrógenos
Con transferencia de hidrógenos
AH2 + B A + BH2
2. TRANSFERASAS • Transfieren grupos funcionales
3. HIDROLASAS •Rotura de enlaces por medio de agua
4. LIASAS •Rotura o formación de moléculas sin intervención de agua.
•Suele producirse adición a dobles enlaces: C=C, C=O, C=N
5. ISOMERASASCambio de posición de grupos dentro de la molécula
6. LIGASAS O SINTETASAS Formación de enlaces con rotura de ATP
Pepsina Tripsina
Cada enzima actúa a un pH óptimo. Cada enzima tiene una temperatura óptima para actuar.
pH óptimo Tª óptimapH óptimo
Los cambios de pH alteran la estructura terciaria y por tanto, la actividad de la enzima.
Las variaciones de temperatura provocan cambios en la estructura terciaria o cuaternaria, alterando la actividad del enzima.
Influencia del pH y la temperatura en la actividad enzimática
Factores que influyen en la actividad enzimática
Efecto del pH
Todas las enzimas presentan un pH óptimo de actividad. El pH puede afectar de varias maneras:
El centro activo puede contener aminoácidos con grupos ionizados que pueden variar con el pH.
El sustrato puede verse afectado por las variaciones del pH.
Algunas enzimas presentan variaciones peculiares. La pepsina del estómago, presenta un óptimo a pH=2, y la fosfatasa alcalina del intestino un pH= 12
Efecto de la temperatura
• Influye en la actividad. El punto óptimo representa el máximo de actividad.
• A temperaturas bajas, las enzimas se hallan "muy rígidas" y cuando se supera un valor considerable la actividad cae bruscamente porque, como proteína, la enzima se desnaturaliza.
Factores que influyen en la actividad enzimática
Algunas enzimas requieren la presencia de una molécula no proteica para la catálisis: son las proteínas CONJUGADAS u HOLOENZIMAS
APOENZIMA: parte proteica
COFACTOR: parte no proteica
Según la complejidad de la porción no proteica:
• Ión
• Coenzima
• Grupo prostético
Cinética de la reacción enzimática
La velocidad de una reacción enzimática aumenta de forma lineal hasta alcanzar un máximo en el que se produce la saturación de la enzima
Baja concentración de sustrato
ALTA concentración de sustratoSATURACION
v
[s]
Efecto de la concentración de substrato
..
. . . . . .
Representación directa
s0 20 40 60 80 100
v
0
20
40
60
80
100
Km
Vmax
vV sK s
mx
m
1 1 1v
KV s V
m
m x m x -1/Km
1/Vmax
Representación Lineweaver-Burke
La concentración de sustrato a la que la velocidad de reacción es la mitad de la velocidad máxima es la constante de Michaelis (Km).El valor de Km también indica la afinidad de la enzima por el sustrato o eficacia catalítica
Cálculo de Actividad Enzimática
• La velocidad de reacción catalizada por 0,1ml de una dilución 1:100 de Fosfatasa Alcalina es 0,3umoles / min. de producto. ¿Cuál es su actividad enzimática?
• 0,1ml-------- 0,3umoles producto / min. 1,0ml------------3,0umoles producto / min. dil 1:100-------------300umoles producto / min. Respuesta: 300U/ml
Inhibición enzimática
Inhibidor:
Efector que hace disminuir la actividad enzimática, a través deinteracciones con el centro activo u otros centros específicos(alostéricos).
Esta definición excluye todos aquellos agentes que inactivan ala enzima a través de desnaturalización de la molécula enzimática
De esta forma, habrá dos tipos de inhibidores:
I. Isostéricos: ejercen su acción sobre el centro activo
II. Alostéricos: ejercen su acción sobre otra parte de la molécula, causando un cambio conformacional con repercusión negativa en la actividad enzimática.
Inhibición enzimática isostérica
Los inhibidores isostéricos pueden ser de dos tipos:
1. Inhibidor reversible: establece un equilibrio con la enzima libre, con el complejo enzima-substrato o con ambos:
E + I EI
2. Inhibidor irreversible: modifica químicamente a la enzima:
E + I E’
ES + I ESI
Inhibición reversible
(a) El inhibidor se fija al centro activo de la enzima libre, impidiendo la fijación del substrato: Inhibición Competitiva
(b) El inhibidor se fija a la enzima independientemente de que lo haga o no el substrato; el inhibidor, por tanto, no impide la fijación del substrato a la enzima, pero sí impide la acción catalítica: Inhibición No Competitiva
(c) El inhibidor se fija únicamente al complejo enzima-substrato una vez formado, impidiendo la acción catalítica; este tipo se conoce como Inhibición Anticompetitiva
Inhibición Competitiva
Inhibidores Competitivos
• Compiten con el sustrato por el sitio activo de la enzima
• Se une solo a la enzima libre• V máx no se altera y K M cambia
Inhibición competitiva
Al aumentar la cantidad Al aumentar la cantidad de SUSTRATO el de SUSTRATO el inhibidor competitivo es inhibidor competitivo es desplazado y se forma desplazado y se forma productoproducto
E ES
EI
I
SE + P
Características:- Las fijaciones de substrato e inhibidor son mutuamente exclusivas- A muy altas concentraciones de substrato desaparece la inhibición- Por lo general, el inhibidor competitivo es un análogo químico del substrato.- El inhibidor es tan específico como el substrato
Se define una constante deequilibrio de disociación delinhibidor:
Ki = [E] [I]
[EI]
En condiciones de equilibrio rápido, llamando y a la concentración del complejo EI, para la inhibición competitiva obtenemos el siste-ma de ecuaciones
vV s
KiK
s
m x
mi
1
Ke x y s
x
Ke x y i
y
m
i
( )
( )
0
0
Que resuelto para x nos da
xe s
KiK
smi
0
1
De donde
Por tanto, en la inhibición competitiva,
1. El efecto cinético del inhibidor es el aumento aparente de la Km, que aparece multiplicada por el factor (1 + i/Ki)
2. La Vmax no aparece modificada; para concentraciones muy altas del substrato, v = Vmax, igual que en ausencia de inhibidor
3. Cuanto más pequeño sea el valor de Ki mayor será la potencia del inhibidor competitivo.
KmSin
inhibidor
Kmcon
inhibidor
Sin inhibidor
Con inhibidor
El inhibidor competitivo aumenta la Km
1/s-0.3 -0.2 -0.1 0.0 0.1 0.2 0.3 0.4 0.5 0.6
1/v
0.00
0.01
0.02
0.03
0.04
0.05
0.06
0.07
-1/Km
-1/(Km(1 + i/Ki))
1/Vmax
Inhibición competitiva - Representación recíproca doble
Ejemplo Inhibidor Competitivo
• Ácido succínico + FAD == ácido fumárico + FADH2
• El inhibidor competitivo es el ácido malónico
• Es un análogo estructuralmente parecido al ácido succínico
Ácido Fólico y Sulfanilamida• La sulfanilamida es un análogo estructural
del ácido p - aminobenzoico (PABA)• PABA es el punto de partida para la síntesis
de ácido fólico en las bacterias• El ácido fólico es una vitamina esencial para
la proliferación (división) bacteriana• Sulfanilamida se usa en el tratamiento
algunas infecciones
Metotrexato y Dihidrofolato• El ácido fólico en sus formas de dihidro y
tetrahidrofolato es coenzima de la reacción catalizada por la dihidrofolato reductasa
• Esta reacción es parte del metabolismo de los nucleótidos para la síntesis de DNA
• Metotrexato se usa en la terapia de algunos cánceres, inhibiendo la síntesis de DNA
Inhibidor competitivosu estructura es similar a la del sustrato
No se forma producto
Inhibición No Competitiva
Inhibidor No Competitivo
• Se une a un lugar diferente del sitio activo la enzima
• Se une a la enzima libre y también al complejo enzima-sustrato
• Por acción del inhibidor disminuye la Vm pero el valor de Km no se altera
Inhibición NO competitivaInhibición NO competitiva
Inhibidor NO competitivoInhibidor NO competitivoEl inhibidor NO competitivo se une a la enzima en un
sitio diferente del sitio activo
E ES
EI
I
SE + P
I
ESI
SInhibición
No Competitiva
El inhibidor se fija indistintamente a la enzima libre Ey al complejo enzima-substrato ES; ni el complejo EIni el complejo ESI son productivos
Inhibición Anticompetitiva o Incompetitiva
Inhibidor IncompetitivoEn este tipo de inhibición el inhibidor se enlaza al centro activo pero solo después de que el sustrato lo haya hecho y, por tanto, inhibidor y sustrato no compiten. De esta manera, aunque todo el sustrato esté saturando la enzima y toda la enzima esté como complejo ES, el inhibidor puede enlazarse produciendo un complejo inactivo ESI.
Como I solo se une a ES estimula la formación de ES y, por tanto, incrementa la unión del sustrato a la enzima, disminuyendo Km . Sin embargo, el complejo ESI no conduce a productos y Vm disminuye.
Inhibidor Incompetitivo
• Se une a un lugar diferente del sitio activo de la enzima
• Se une sólo al complejo enzima-sustrato
• Los efectos que tiene: disminuye el valor de Km y también el de Vmáx
E ESS
E + PI
ESIInhibición
Anticompetitiva
El inhibidor sólo puede fijarse al complejo ES;el complejo ESI no es productivo
Modelo Kap Vap
Inh comp Km(1+i/Ki) Vm
Inh no comp total Km Vm/(1+i/Ki)
Inh anticomp Km/(1+i/Ki) Vm/(1+i/Ki)
Determinación de parámetros cinéticos de inhibición
Inhibición Irreversible- Los inhibidores irreversibles reaccionan con un grupo químico de la enzima, modificándola covalentemente
- Su acción no se describe por una constante de equilibrio Ki, sino por una constante de velocidad ki:
E + I E’
- A diferencia de la inhibición reversible, el efecto de los inhibidores irreversibles depende del tiempo de actuación del inhibidor.
- Los inhibidores irreversibles son, por lo general, altamente tóxicos.
Inhibidores Irreversibles
• Producen inactivación permanente de la actividad enzimática
• Se interfiere con el normal desarrollo de una reacción o vía metabólica
• Ejemplos: p-cloromercuribenzoato, yodoacetato, diisopropilfluorfosfato
Algunos tipos de inhibidores irreversibles
1. Reactivos de grupos -SH
2. Organofosfóricos
3. Ligandos de metales
4. Metales pesados
Inhibición enzimática alosterica
Enzimas Alostéricas• Son enzimas cuya estructura proteica está formada
de varias subunidades• No se rigen por la cinética de M - M• Además del sitio o centro activo tienen sitios
alostéricos o de regulación• Sitio activo/sustratos; • Sitio alostérico/moduladores o reguladores• La relación entre la velocidad de reacción y la
concentración de sustrato sigue cinética sigmoídea
Enzimas alostéricas• Las enzimas alostéricas
presentan estructura cuaternaria.
• Tienen diferentes sitios activos, unen mas de una molécula de sustrato
• La unión del sustrato es cooperativa
• la curva de velocidad presenta una forma sigmoidal
Concepto de Cooperatividad• La unión de los sustratos al sitio activo de
una subunidad produce un cambio conformacional que por contacto físico se transmite a las subunidades vecinas, facilitando las interacciones
• Modelos de unión: secuencial y concertado• Ejemplos: unión Hb-O2, enzimas alostéricas
y sus sustratos
Moduladores Alostéricos
• También reciben el nombre de efectores y pueden ser positivos o negativos
• Se unen al sitio alostérico que puede estar en la misma subunidad que tiene al sitio activo o en las subunidades regulatorias
• Su unión produce un cambio conformacional que afecta al sitio activo
Aspartato Transcarbamilasa• Ác L-asp + Carbamil-P === Carbamil-
asp + Pi . Primera reacción en la síntesis de pirimidinas
• Efector positivo: CTP Efector negativo: ATP
• Tiene dos subunidades catalíticas para los sustratos y tres subunidades regulatorias para los efectores
Modificación covalente de las enzimas. En los enzimas de vías degradativas la forma fosforilada es más activa que la desfosforilada. En los procesos biosintéticos ocurre exactamente lo contrario.
Rutas metabólicas
Tipos de sistemas multienzimáticos:
Isoenzimas o Isozimas• Son formas moleculares diferentes de una
misma enzima• Catalizan la misma reacción• Ejemplo: Lactato deshidrogenasa• Lactato + NAD ==== Piruvato + NADH• M4, M3H1, M2H2, M1H3 y H4
• Se diferencian por su movilidad electroforética• Usadas en clínica: sueros normales y sueros
con alguna patología
• EXCEPCIÓN: RIBOZIMAS. En 1982, Thomas Cech, y Sidney Altman las descubrieron. No eran proteínas, sino ARN.
En 1989 les concedieron el premio Nobel de Química
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