Colture amalia stud

MICROBIOLOGIAMICROBIOLOGIA

Le ColtureLe Colture

Porta Amalia

CAPPA A FLUSSO LAMINARE VERTICALE

-Proteggere sia il

campione che l’operatore

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Sterilità e lavoro al bunsen

fiamma ossidante(azzurra)

fiamma riducente(gialla)

30 cm30 cm

area sterile intorno alla fiamma

Lavorare in condizioni sterili

1. Pipette cotonate e NON pipettare MAI a bocca.

2. Lavorare sotto cappa possibilmente con un bunsen da cappa a portata di mano.

3. Mettere tutto il necessario dentro la cappa prima di cominciare. Tutti i movimenti perturbano flusso laminare, rendendo inefficiente la cappa.

4. Tenere solo quanto necessario.

5. Tenere le pipette in modo che puntino verso avanti e non verso l'operatore. Evitare che la punta superi il piano forellato dove si crea la barriera d'aria.

6. Richiudere le cose il piu' presto possibile.

7. Non passare MAI sulle fiasche o sulle bottiglie aperte con le mani o con le braccia.

8. Apposito recipiente per materiale di scarto.

9. Passare alla fiamma del bunsen il materiale prima e dopo.

10. dopo passare etanolo al 70%.

CAPPE A FLUSSO LAMINARE

Flusso d’aria unidirezionale formato da filetti di aria sterili paralleli che si muovono alla stessa velocità in tutti i punti creando una corrente d’aria omogenea senza turbolenze

Si ottiene combinando un filtro assoluto (HEPA) con una massa d’aria che lo attraversa alla velocità costante di 0,45 m/sec.

Filtro HEPA (High Efficiency Particulate Air) :• E’costituito da un sottile foglio a base di fibre di vetro

submicroniche montato in un telaio di alluminio o di legno.• Ha un efficienza del 99.999% su particelle di 0,3 micron

TERRENI DI COLTURA

In campo microbiologico e’ di primaria importanza riuscire a Coltivare e perpetuare i microrganismi

Agar: polisaccaride complesso che deriva dalle alghe rosse.

•non tossico per microbi, o altre forme di vita.•si scioglie solo a 100ºC, ma solidifica a circa 45ºC•è fisiologicamente inerte

1877 La Capsula Julius Richard Petri, assistente di Robert Koch.

diametro tra i 50 e 100 mm e un'altezza di 15 mm.

Fanny Angelina Eilshemius

Walther Hesse

Spatolamento

Striscio

Per Inclusione

PIASTRAMENTO ?PIASTRAMENTO ?

Figura 4.7 Tecnica della piastra per diffusione. Preparazione di una piastra per diffusione. (1) Deporre con una pipetta una goccia di materiale al centro di una piastra contenente agar. (2) Immergere un’apposita bacchetta di vetro in un beaker contenente etanolo. (3) Flambare per breve tempo la bacchetta bagnata di etanolo e lasciarla raffreddare. (4) Distribuire uniformemente, strisciando, il campione sulla superficie dell’agar mediante la bacchetta sterile. Incubare.

Spatolamento

Striscio

Koch inventò l’ansa di platino

Colonie isolate

Per Inclusione

ColonieColonie

Forma:

•Puntiforme

•Circolare

•Filamentosa

•Fusiforme

•Irregolare

Spessore:

•Piatto

•Sopraelevato

•Convesso

•Cupoliforme

•Umbonato

Margine:

•Regolare

•Ondulato

•Lobato

•Eroso

•Filamentoso

•Increspato

Colture AXENICHE O PURE• Colture che contengono 1 sola specie

• Normalmente non uniformi geneticamente

POPOLAZIONE MISTACOMUNITA’ MICROBICA

condizione naturale di convivenza (es. nel suolo, nell’intestino..).

Le varie procedure di arricchimento forniscono una miscela di specieKoch colonie tutte diverse

Da una colonia:

COLTURE PURECOLTURE PURE

• Colture Axeniche derivano da una cellula singola o da CFU

–Colony-Forming-Unit

• Ogni colonia e’ Geneticamente uniforme

Procedure asettiche che portano a COLTURE PURE

• Sterilizzazione del terreno di coltura

• Diluzione Seriale

• Striscio su piastra

• Diffusione su piastra

• Inclusione in piastra

CONTA VITALE SU PIASTRA

Diluizioni seriali

calcolo del titolo in cfu (Colony Forming Units) / ml

Pro: molto sensibile;

titolazione selettiva in popolazioni miste

grow o/n

Modificato da ”Brock Biology of Microorganisms, 9th Ed.”, di Madigan, Martinko e Parker, Prentice Hall

Il campione originale è sottoposto a diluizioni seriali, in modo da ridurre in misura sufficiente il numero delle cellule microbiche presenti. Inclusione: diluizione più alta in agar caldo, quindi in piastre di petri. Le cellule isolate crescono formando colonie e possono essere usate per costituire colonie pure. Le colonie in superficie sono circolari, quelle al di sotto della superficie in genere hanno forma lenticolare.

COLTURE PURECOLTURE PURE

Inconvenienti della Diluzione Seriale

• Costosa (mezzi di crescita e vetreria)

• Molti pipettamenti, e

• Non attendibile al 100%

COLTURE PURECOLTURE PURE

Quadrant Streak TechniqueQuadrant Streak Technique - -

Robert Koch in 1880Robert Koch in 1880

• Richiede mezzi solidi

• Diluisce la cultura iniziale in DUE DIMENSIONI

TERRENI Calssificati in base alla

FUNZIONE ed alla COMPOSIZIONE:

•Terreni per uso generico

•Terreni arricchiti con particolari nutrienti

•Terreni selettivi

•Terreni differenziali (es. cromogeni).

Terreni cromogeni

Sostanze nutritive essenzialiSostanze nutritive essenzialiCromogeni (cromoforo+zucchero)Cromogeni (cromoforo+zucchero)

CC

ZZ

Chromogenic E.coli O 157 Chromogenic E.coli O 157 agaragar:E.coli non O 157 (colonie porpora)Non E.coli (colonie blu)E.coli O 157 (colonie bianche)

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18-24 ore/37°C

Non fermenta il sorbitolo colonie biancheTest di agglutinazione al lattice

Metodi di contamicrobica

Conta in piastra

Si basa sulla produzione di CFU su terreni agarizzati

Le cellule devono essere vive e vitali

Il terreno deve essere appropriato

Quantificazione spettrofotometrica

Lo spettrofotometro è uno strumento che misura la assorbanza di un fascio di luce che attraversa un campione in soluzione

Relazione lineare tra assorbanza e concentrazione di un soluto

Densità ottica (1 OD600nm 8,0 x 108 cellule di

E. coli)

Torbidità e misurazione della massa microbica

Determinazione della massa microbica tramite misurazione dell’assorbimento della luce. Al crescere della popolazione, e quindi della torbidità, aumenta la dispersione della luce per cui aumentano i valori dell’assorbanza forniti dallo spettrofotometro.

MISURA DELLA TORBIDITA’

La torbidità è dovuta alla rifrazione della luce da parte delle cellule presenti nella sospensione.

La densità ottica (OD) misurata a 600 nm con uno spettrofotometro è proporzionale al numero totale di cellule (vive e morte).

http://www.prenhall.com/brock

COMPARTIMENTO CELLE• Le celle o cuvette sono di vario tipo a

seconda dell’uso e del tipo di strumento.

• Le celle di quarzo e di vetro sono utilizzate nel UV/Vis.

• Sono utilizzate anche celle monouso di polistirene.

Miceli non spettrofotometro, peso secco

Conta delle cellule

Emocitometri (conteggio al microscopio): piu’ lento e faticoso, ma ci permette di valutare lo

stato di salute delle cellule.

Camera di Bürker 2 identici ruled glass

con2 quadrati di

3 x 3 mm.

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Conta delle cellule

Camera di Burker Emocitometro che porta incisa sulla camera di conteggio

questa griglia:

Ogni griglia ha

9 quadrati grandi di 1 mm2 o 16 quadrati piccoli. QuickTime™ e un

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• wet the ridges of the hemocytometer. place a cover slip and press until you see

• load it by capillarity.

• allow cells to settle.

• to avoid evaporation, count within on minute: the light of the microscope heats the sample

• count 4 squares located at the 4 corners.

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Se consideriamo che lo spessore verticale tra il vetrino portaoggetto e il coprioggetto e’ di 0,1 mm, avremo che il quadratino piccolo corrisponde ad un volume di 1/250 di microlitro, mentre il quadrato piu’ grande corrisponde ad un volume di 1/10 di microlitro.

1/101/10 1/2501/250

Se contiamo le cellule che troviamo nel quadrato piccolo moltiplicheremo il risultato per 250 per avere le cellule per microlitro o per 250.000 per avere le cellule per mL.

Se abbiamo diluito il campione dovremo moltiplicare per il fattore di diluizione: ad es. se abbiamo diluito 1:1 con Trypan blu per evidenziare le cellule morte, dovremo moltiplicare per 2.

Dobbiamo contare le cellule che troviamo nel quadrato grande e moltiplicare per 10 per avere le cellule per microlitro o per 10.000 (104) per avere le cellule per mL.

Se abbiamo diluito il campione dovremo moltiplicare per il fattore di diluizione: ad es. se abbiamo diluito 1:1 con Trypan blu per evidenziare le cellule morte, dovremo moltiplicare per 2.

Ovviamente dovremo fare una statistica, contando piu’ quadrati

Attenzione alle cellule sui bordi, si devono contare solo quelle su due lati, per non correre il rischio di sovrastime o sottostime.

PROCEDURA PER LA CONTA CELLULARE

- Si effettua una diluizione 1:10-Si carica la camera con 10 ul di sospensione

cellulare - Si procede alla conta delle cellule in ciascuno dei

4 quadrati d’angolo

C = n°x 10 x 104 x V

C = cellule per mLn° = (n1+n2+n3+n4)/410 = fattore di diluizione104 = fattore conversioneV= volume sospensione cellulare

Altri tipi di camere hanno “griglie” che corrispondono a diversi volumi, ma sono ovviamente riportati dalle case venditrici.

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Osservare i MicrobiOsservare i Microbi

• Batteri non-colorati non sono facilmente

osservabili.

• La colorzione é essenziale per un accurato

studio morfologico.

• Sono disponibili molti coloranti.

Batteri Non colorati

Coloranti Acidi (anionici)Coloranti Acidi (anionici)• Molecole coloranti hanno una carica negativa;• Vengono a reagire con componenti cellulari

carichi positivamente;• Buoni coloranti per eucarioti - legano istoni

(proteine cariche positivamente)• Pessimi coloranti per batteri• I2KI, Eosin, Congo Red, Fuchsin

Osservare i MicrobiOsservare i Microbi

Coloranti Basici (cationici)Coloranti Basici (cationici)• Molecole coloranti hanno una carica positiva;

• Reagiscono con componenti cellulari carichi negativamente (DNA, proteine);

• Buoni coloranti per procarioti ed eucarioti

• Methylene blue, crystal violet, gentian violet, safranin.

Osservare i MicrobiOsservare i Microbi

Coloranti neutriColoranti neutri

• Molecole idrofobiche;

• Legano componenti cellulari non carichi (depositi di grasso, PHB*)

• Sudan IV, Sudan Black, etc.

*Poly-b-Hydroxy Butyric Acid

Osservare i MicrobiOsservare i Microbi

Colorazione sempliceColorazione semplice

PROCEDURE di COLORAZIONEPROCEDURE di COLORAZIONE

COLORAZIONE DIFFERENZIALECOLORAZIONE DIFFERENZIALE

• Lo scopo è di colorare cellule in maniera diversa da altre.

• Comprende l’uso di almeno 2 coloranti– Colorazione primaria– Colorazione secondaria

• Tra le 2 colorazione c’è uno step di decolorazione per rimuovere il colorante primario da alcune cellule

Con il coloranteSecondario

Hans Gram

PROCEDURE di COLORAZIONEPROCEDURE di COLORAZIONE

GRAMGRAM

d Decolorare con EtOH 95% (rimuove colorante primario dalle cellule G-)

e Immergere in safranina “colorante secondario”

f lavare, dry, osservare

a Stendere; air dry; fissare al calore

b Immergere in crystal violet (“colorante primario”)

c Lavare, aggiungere I2KI (Mordente)

SIGNIFICATO della COLORAZIONESIGNIFICATO della COLORAZIONE GRAMGRAM

• Representa una reale differenza tassonomica fra gruppi di batteri.

• Largamente dovuto alla natura della parete cellulare (peptidoglicano).

• Si pensa che il PG si “denaturi” nello step con EtOH, bloccando il CVI* all’interno delle cellule.

*CVI = Crystal Violet Iodine Complex

RISULTATI GRAM STAINRISULTATI GRAM STAIN

Cellule Gram positive sono VIOLAVIOLA– Staphylococcus aureus

Cellule Gram negative sono ROSAROSA– Escherichia coli

Cellule Gram variabili sono miste VIOLAVIOLA e ROSAROSA - Bacillus subtilis

Cellule che non reagiscono al Gram sono senza coloresenza colore– Mycobacterium tuberculosis

Solo colorante primario

DopoDecolorizazione

Con il coloranteSecondario

GRAM VARIABILI