Efecto Letal y mutagénico de la radiación ultravioleta sobre los microorganismos

Instituto Politécnico NacionalEscuela Nacional de Ciencias Biológicas

Departamento de MicrobiologíaLaboratorio de Microbiología General

“Efecto Letal y mutagénico de la radiación ultravioleta sobre los microorganismos”

Introducción. • Una mutación es una

modificación heredable en una secuencia de bases del genoma.

• En una población bacteriana suelen aparecer mutaciones sin interferencia experimental, se denominan mutaciones espontaneas.

Genotipo-Fenotipo.• De acuerdo al tipo de

mutación que se presente, las características fenotípicas pueden variar de la cepa progenitora.

Tipos de Mutaciones. • Mutaciones puntuales.• Deleciones: Perdida de un

segmento cromosómico.• Duplicación• Translocación: Intercambio

de segmentos. • Inversión: Rotación 180°.

Tipos de Mutantes.• Auxótrofo• Sensible a las temperaturas.• Resistentes.• Sin pigmento.• Colonias rugosas.• Cápsula.• Inmóvil.• Fermentación de azucares.

Luz UV.• Radiación electromagnética

emitida por la región del espectro que ocupa la posición intermedia entre la luz visible y los rayos X.

• Regiones del espectro UV- vacío UV entre 100 y 200nm, UVC entre 200 y 280nm, UVB entre 280 y 315nm, y UVA entre 315 y 400nm

• Rango germicida se encuentra entre 240 y 280 nm

• Se obtiene la máxima eficiencia desinfectante cerca de los 260 nm

Mutaciones por luz UV.

• La radiación UV es absorbida por los nucleótidos, los bloques constitutivos del ADN y ARN de la célula y las proteínas .

• La UV absorbida promueve la formavión de fotoproductos (dimeros e hidratos de pirimidina).

• La formación de dímeros dentro de un microorganismo, impide que éste replique su ADN y ARN, lo cual inhibe su crecimiento incluso pudiendo llegar a ser letal.

Reparación foto-enzimática.

• Se debe a la acción de una enzima denominada fotoliasa o enzima fotorreactivante

• Las fotoliasas reparan directamente los dímeros de pirimidina, en una reacción que requiere luz visible de 300-500 nm de longitud de onda

• Fotoliasas: flavina reducida (FADH2) y una pterina.

Mecanismo.• La primera fase del mecanismo

es independiente de la luz.• La fotoliasa reconoce el dímero

de pirimidina, formando un complejo enzima-sustrato [E-S].

• La flavina reducida (FADH2) de la fotoliasa, en presencia de luz , se excita, y dona electrones al anillo de ciclobutano del dímero de pirimidina, rompiéndolo, y regenerando las dos pirimidinas sin alterar.

Reparación por escisión-resíntesis.• Complejo proteico con

actividad de endonucleasa correctora, conocido como correndonucleasa o escinucleasa

• Las bases dañadas se eliminan y el hueco resultante se rellena por resíntesis reparadora de ADN.

Mecanismo.1. Un complejo proteico (Uvr[A2B])

desenrolla localmente la doble hélice.

2. Se une la proteína UvrC, formando el complejo Uvr[A2BC], es decir, la correndonucleasa, unido a la cadena dañada del ADN, cerca del dímero.

3. La correndonucleasa realiza dos cortes en la cadena afectada por el dímero

4. Este hueco es ocupado ahora por la ADN-polimerasa-I y por la ADN-helicasa-II (codificada por el gen uvrD), que llevan a la síntesis de nuevo ADN

5. La ADN-ligasa sella la cadena

Reparación SOS. • Ocurre cuando el DNA es

lesionado por dosis elevadas de agentes mutagénico y los mecanismos anteriores no son suficientes para reparar el daño.

• Tienen lugar modificaciones profundas, entre otras, un retraso en la división celular (tabique transversal), respiración disminuida, etc.

Mecanismo.• Dirigida por las proteínas LexA

y RecA.

• LexA inhibe funciones celulares y en condiciones SOS pierde su capacidad represora, por lo que la proteína queda sometida a una proteólisis y pierde su capacidad para unirse al DNA, la proteólisis se ve estimulada de nuevo por la proteína RecA.

• Tiene una elevada tasa de error. (umuDC)

Modelo de Holliday.o Se inicia con roturas de cadena

sencilla en ambos cromosomaso Formación de la estructura de

Holliday.o Migración de la estructura de

Holliday y formación de regiones heteroduplexas.

o Resolución de la estructura por corte de las cuatro cadenas sencillas

o Resolución de la estructura por corte de dos cadenas:• Rotación de la estructura:

estructura isométrica de Holliday

• Corte longitudinal en la estructura y posterior ligación de extremos.

• Corte transversal en la estructura y posterior ligación de extremos.

Esquema del modelo de Holliday.

Serratia marcescens.1. Bacilo G(-)2. Anaerobios facultativos. 3. Móviles.4. Produce pigmento

característico conocido como prodigiosina.

5. Colonias altamente mucoides.6. Oxidasa (-) y reducen el

nitrato.7. Indol (-)8. VP (+)9. Citrato y Malonato (+)10. Se encuentra en suelo, agua y

plantas.

Objetivos.1. Realizar una técnica que nos ayude a realizar una mutación.2. Identificar colonias mutantes.3. Observar la eficacia de los diferentes métodos de

reparación.

Serie A

0, 15, 30, 45, 60, 90, 120, 210 y 300 segundos.

Serie B

0, 15, 30, 45 y 60 segundos. S.

marcescens

Serie A

Serie B

Exposición a luz UV durante los tiempos marcados

Incubación 37°C por 48hr.

Conteo de colonias apigmentadas y pigmentadas en cada placa de Serie A y Serie B

RESULTADOS Y DISCUSIÓN•Laboratorio 3

SERIE A (OSCURIDAD)Tiempo de exposición

0 15 45 60 90 120 210 300

R B T R B T R B T R B T R B T R B T R B T R B T

1 IN IN IN

9 IN

29

0 29

17

0 17

2 0 2 0 0 0 0 0 0

2 IN IN 28

12

40

24

2 26

13

0 13

7 0 7 0 0 0 0 0 0

3 IN IN IN

7 IN

21

0 21

19

0 19

5 0 5 0 0 0 2 0 2

4 IN 53

37

90

7 0 7 43

2 45

0 7 7 2 0 2 1 0 1 7 3 7

5 IN IN 4 20

24

2 12

14

0 10

10

0 2 2 0 0 0 0 0 0

6 IN 109

65

174

2 2 4 9 0 9 1 0 1 2 0 2 4 0 4 0 0 0

7 IN IN 84

7 91

8 5 13

62

1 63

18

3 21

7 3 10

8 1 9

8 IN IN

5 IN

25

0 25

10

0 10

12

0 12

10

0 10

5 0 5 3 0 3

CÁLCULOS SERIE A

Tiempo de exposición

15 45 60 90 120 210 300

%M

%M

%S

%M

%S

%M

%S

%M

%S

%M

%S

%M

%S

1 0% 3% / 0% 11.6%

0% 58.6%

0% 11.7%

0% 0% 0% 0%

2 0% 30% 16% 7.6% 65% 0% 50% 0% 53.8%

0% 0% 0% 0%

3 0% 2.8% 0% 0% 8.4% 0% 90.4%

0% 26.3%

0% 0% 0% 0%

4 41.1% 0% 7.7% 4.4% 642% 100%

15.5%

0% 28.5%

0% 50% 43%

700%

5 0% 83.3%

9.6% 85.7%

58.3%

100%

71.4%

100% 20% 0% 0% 0% 0%

6 37.5% 50% 2.29% 0% 225% 0% 11.1%

0% 200% 0% 200%

0% 0%

7 0% 7.69%

36.4% 38.4%

14.2%

1.5% 485% 14.2% 33.3%

30%

48% 11%

90%

8 2% 0% 10% 0% 40% 0% 120% 0% 83.3%

0% 50% 0% 60%

0 50 100 150 200 250 3000

2

4

6

8

10

12

14

Relación entre el número de colonias mu-tadas y el tiempo de irradiación con luz UV

(Serie A)

Tiempo de irradiación con luz UV (segundos)

Prom

edio

de

colo

nias

des

pig-

men

tada

s

0 50 100 150 200 250 3000

50

100

150

200

250

300

Relación entre el número de colonias totales y el tiempo de irradiación con luz UV (Serie

A)

Tiempo de irradiación con luz UV (segundos)

Prom

edio

de

colo

nias

tot

ales

SERIE B (LUZ)Tiempo de exposición

0 15 30 45 60

R B T R B T R B T R B T R B T

1 IN 27 83

110 27 83 110 112 26 128 15 15 30

2 IN IN 14 0 14 60 0 60 5 0 5

3 IN IN IN 4 INC 45 9 54 25 4 29

4 IN IN 166 20 186 50 1 51 25 20 45

5 IN IN 10 34 44 4 63 67 3 6 9

6 IN 105

24

129 8 1 9 7 8 15 0 0 0

7 IN IN IN 32 9 41 15 2 17

8 IN IN IN 10 IN 22 1 23 13 1 14

CÁLCULOS SERIE B

Tiempo de exposición

15 30 45 60

%M

%M

%S

%M

%S

%M

%S

1 75.4% 75.4% 100% 20.3% 116.3% 50% 23.4%

2 / 0% 5.6% 0% 428.5% 0% 8.3%

3 / 1.6% / 16.6% 21.6% 4% 53.7%

4 / 10.7% 74.4% 1.9% 27.4% 44.4% 88.2%

5 / 77.2% 17.6% 77.2% 152.2% 66.6% 13.4&

6 / 11.1% 6.9% 11.1% 166.6% 0 0

7 / 0% / 21.9% 16.4% 11.7% 41.4%

8 18.6% 4% / 4.34% 9.2% 7.1% 60.8%

0 10 20 30 40 50 6002468

101214161820

Relación entre el número de colonias mu-tadas y el tiempo de irradiación con luz UV

(Serie B)

Tiempo de irradiación con luz UV (segundos)Prom

edio

de

colo

nias

api

gmen

tada

s

0 10 20 30 40 50 600

50

100

150

200

250

300

Relación entre el número de colonias totales y el tiempo de irradiación con luz UV (Serie

B)

Tiempo de irradiación con luz UV (segundos)

Prom

edio

de

colo

nias

tot

ales

0 10 20 30 40 50 6002468

101214161820

Relación entre el número de colonias mu-tadas y el tiempo de irradiación con luz UV

(Comparación).

Serie BSerie A

Tiempo de irradiación con luz UV (segundos)

Prom

edio

de

colo

nias

des

pig-

men

tada

s

0 10 20 30 40 50 600

50

100

150

200

250

300

Relación entre el número de colonias totales y el tiempo de irradiación con luz UV (Com-

paración)

Serie BSerie A

Tiempo de irradiación con luz UV (segundos)

Prom

edio

de

colo

nias

tot

ales

Serie A – E.5 L.3

Serie B – E.1 L.3

RESULTADOS Y DISCUSIÓN•Laboratorio 4

SERIE A (OSCURIDAD)Tiempo de exposición

0 15 30 45 60 90 120 210 300

R B T R B T R B T R B T R B T R B T R B T R B T R B T

1 INC 49

75

124

0 0 0 6 17

23

4 13

17

1 4 5 0 0 0 0 0 0 0 0 0

2 INC 304

68

372

25

78

103

8 1 9 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0

3 INC 29

91

120

2 23

25

5 9 14

3 0 3 0 0 2 0 0 0 0 0 0 0 0 0

4 INC 0 0 0 14

1 15

5 1 6 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0

5 INC 38

56

94

12

0 12

8 0 8 6 0 6 2 0 2 0 0 0 0 0 0 0 0 0

6 INC 0 0 0 6 0 6 11

3 14

9 1 10

0 0 0 3 1 4 11

2 13

2 0 2

7 INC 6 11

17

3 2 5 0 0 0 15

4 19

0 1 1 1 1 2 0 1 1 0 0 0

8 INC 52

120

172

19

2 21

15

2 17

9 0 9 5 0 5 4 0 4 0 0 0 0 0 0

CÁLCULOS (SERIE A)

Tiempo de exposición

15 30 45 60 90 120 210 300

%M %M %S %M %S %M %S %M %S %M %S %M %S %M

%S

1 60%

/ / 74%

/ 76%

74%

80%

29%

0% 0% 0% 0% 0% 0%

2 18%

75% 28%

11%

8.7%

/ / 0% 0% 0% 0% 0% 0% 0% 0%

3 76%

92% 21%

64%

56%

0% 21%

0% 67%

0% 0% 0% 0% 0% 0%

4 0% 6.6% / 17%

40%

0% 0% 0% 0% 0% 0% 0% 0% 0% 0%

5 59.5$

0% 13%

0% 67%

0% 75%

0% 33%

0% 0% 0% 0% 0% 0%

6 0% 0% / 21%

233%

10%

71%

0% 0% 25%

/ 15%

325%

0% 15%

7 6% 67% 29%

0% 0% 21%

0% 100%

5% 50%

200%

100%

50%

0% 0%

8 69.7%

9.5% 12%

12%

81%

0% 53%

0% 56%

0% 80%

0% 0% 0% 0%

0 50 100 150 200 250 300-7

3

13

23

33

43

53

Relación entre el número de colonias mu-tadas y el tiempo de irradiación con luz UV

(Serie A)

Tiempo de irradiación con luz UV (segundos)

Prom

edio

de

colo

nias

des

pig-

men

tada

s

0 50 100 150 200 250 3000

50

100

150

200

250

300

Relación entre el número de colonias totales y el tiempo de irradiación con luz UV (Serie

A)

Tiempo de irradiación con luz UV (segundos)

Prom

edio

de

colo

nias

tot

ales

SERIE B (LUZ)Tiempo de exposición

0 15 30 45 60

R B T R B T R B T R B T R B T

1 INC INC 55 8 63 26 2 28 0 0 0

2 INC INC INC 95 10 105 INC

7 INC

3 INC INC 35 95 130 13 2 15 10 2 12

4 INC 0 0 0 36 12 192 18 4 88 0 0 0

5 INC INC 160

92 252 19 2 21 17 1 18

6 INC INC 48 4 52 8 1 9 6 0 6

7 INC INC 16 INC 11 6 17 8 2 10 10 0 10

8 INC INC 174

11 185 37 1 38 26 0 26

CÁLCULOS (SERIE B)

Tiempo de exposición

15 30 45 60

%M %M %S %M %S %M %S

1 0% 12.6% 25.2% 7.14% 44.4% 0% 0%

2 0% 0% / 9.52% 42% 2.8% /

3 0% 73% 52% 13.3% 11.5% 16.6% 80%

4 0% 6.2% / 4.54% 45.8% 0% 0%

5 0% 36.5% / 9.5% 8.3% 5.5% 85.7%

6 0% 7.6% 20.8% 11.1% 17.3% 0% 66.6%

7 6.4% 35.2% 6.8% 20% 58.8% 0% 100%

8 0% 5.9% 74% 2.6% 20.5% 0% 68.4%

0 10 20 30 40 50 600

5

10

15

20

25

30

Relación entre el número de colonias mu-tadas y el tiempo de irradiación con luz UV

(Serie B)

Tiempo de irradiación con luz UV (segundos)Prom

edio

de

colo

nias

api

gmen

tada

s

0 10 20 30 40 50 600

50

100

150

200

250

300

Relación entre el número de colonias totales y el tiempo de irradiación con luz UV (Serie

B)

Tiempo de irradiación con luz UV (segundos)

Prom

edio

de

colo

nias

tot

ales

0 10 20 30 40 50 60 700

10

20

30

40

50

60

Relación entre el número de colonias mu-tadas y el tiempo de irradiación con luz UV

(Comparación).

Serie BSerie A

Tiempo de irradiación con luz UV (segundos

Prom

edio

de

colo

nias

des

pigm

en-

tada

s

0 10 20 30 40 50 60 700

50

100

150

200

250

300

Relación entre el número de colonias totales y el tiempo de irradiación con luz UV (Comparación)

Serie BSeire A

Tiempo de irradiación con luz UV (segundos)

Prom

edio

de

colo

nias

tot

ales

Serie B E-6 L-4

Serie A E-8 L-4

Conclusiones• Al irradiar con luz UV pudimos poner en practica una técnica para producir una

mutación que se puso de manifiesto con la observación de colonias pigmentadas y no pigmentadas y se pusieron de manifiesto algunos mecanismos mediante la comparación de la serie A con la serie B.

• No se logró demostrar cual mecanismo presenta mayor eficiencia en la reparación de dímeros de pirimidina.

• Se logró poner de manifiesto la relación que existe entre el tiempo de exposición a la radiación UV y el efecto mutagénico y/o letal que éste presenta.

Bibliografía• HOWARD-FLANDERS, P. (1982): Reparación inducible del ADN. Inv. y

Ciencia 64 (enero): 28-37.• SANCAR, A., G.B. SANCAR (1988): DNA repair enzymes. Ann. Rev.

Biochem. 57: 29-67.• http://

www.biologia.edu.ar/microgeneral/micro-ianez/18_micro.htm#uv• Madigan M.. (2009). Brock. Biologia de los microorganismos..

México: Pearson Education.