I Topi Transgenici

I topi transgeniciI topi transgenici

Erika AspergesErika Asperges4°D a.s. 08/094°D a.s. 08/09

Liceo Scientifico S. AllendeLiceo Scientifico S. Allende MilanoMilano

IndiceIndice

Introduzione all’ingegneria geneticaIntroduzione all’ingegneria genetica Introduzione ai topi transgeniciIntroduzione ai topi transgenici

Ottenere cellule knockoutOttenere cellule knockoutSelezionare cellule knockoutSelezionare cellule knockout

Ottenere una generazione knockoutOttenere una generazione knockoutKnockout condizionatoKnockout condizionato

La bioingegneria geneticaLa bioingegneria genetica

Insieme di tecniche che Insieme di tecniche che isolano, clonano, introducono isolano, clonano, introducono e esprimono genie esprimono geni in un ospite eterelogo. in un ospite eterelogo.

Altera le sequenze originali Altera le sequenze originali in favore di altre più in favore di altre più adatteadatte..

Esprimere nuove proteine.Esprimere nuove proteine. Creare gli OGM, guarire malattie genetiche.Creare gli OGM, guarire malattie genetiche.

I topi transgeniciI topi transgenici

Topo in cui viene soppressa l’espressione Topo in cui viene soppressa l’espressione di un determinato gene di un determinato gene (gene knockout)(gene knockout)..

Usati per lo studio di disordini genetici.Usati per lo studio di disordini genetici.Creati negli anni ’80, nel 2007 hanno Creati negli anni ’80, nel 2007 hanno consentito ai loro inventori di ottenere il consentito ai loro inventori di ottenere il

Nobel .Nobel .

Ottenere cellule knockoutOttenere cellule knockout

Studio approfondito del gene da Studio approfondito del gene da disattivare.disattivare.

Disattivazione del gene.Disattivazione del gene.Scelta del vettore (spesso plasmidi)Scelta del vettore (spesso plasmidi) Inserimento del gene per elettroporazione.Inserimento del gene per elettroporazione.Ricombinazione omologa in cellule Ricombinazione omologa in cellule

staminali.staminali.

Selezionare cellule knockoutSelezionare cellule knockout

Raramente la ricombinazione avviene

correttamente!!!

Per selezionare le cellule correttamente transfettate si usano vettori che contengono

marker di selezione.

Primo marker:Primo marker:

È un plasmide resistenzaÈ un plasmide resistenza

che contiene il gene knockoutche contiene il gene knockoutSi aggiunge l’antibioticoSi aggiunge l’antibiotico

È avvenuta la ricombinazione omologa:

la cellula sopravvive

Non è avvenuta la ricombinazione:

la cellula muore

Secondo marker:Secondo marker:È una sequenza per la TK che rende È una sequenza per la TK che rende

tossico il Ganciclovir.tossico il Ganciclovir.

Ricombinazione omologa: la TK non

viene prodotta

Ricombinazione non omologa: la TK viene

prodotta

Si aggiunge il GanciclovirSi aggiunge il Ganciclovir

Le cellule sopravvivono

Le cellule muoiono

Ottenere una generazione Ottenere una generazione knockoutknockout

Le cellule selezionate sono inserite nella Le cellule selezionate sono inserite nella blastocisti di una femmina di topo gravidablastocisti di una femmina di topo gravida Per controllare se le cellule knockout Per controllare se le cellule knockout attecchiscono si usa il colore del pelo: la attecchiscono si usa il colore del pelo: la

blastocistiblastocisti è per il è per il neronero, le , le cellule cellule staminali staminali knockoutknockout per il per il biancobianco..

Le chimere devono essere bianche e nere, i topi Le chimere devono essere bianche e nere, i topi knockout solo bianchi.knockout solo bianchi.

Legenda dei simboliLegenda dei simboli

♀♀……………………………………………………………………...Femmina...Femmina♂♂…………………………………………………………………….....Maschio.....MaschioNN.………..Allele dominante per il pelo nero.………..Allele dominante per il pelo neronn.……….Allele recessivo per il pelo bianco.……….Allele recessivo per il pelo biancoññ………………………………Allele recessivo transgenico Allele recessivo transgenico

per il pelo biancoper il pelo bianco ..……………………...…………………….NNon passa on passa ilil turno turno!! …………………………… ……………………………Passa il turnoPassa il turno!!

Fase 1Fase 1

Si impiantano cellule staminali knockout Si impiantano cellule staminali knockout per pelo bianco in blastocisti per pelo per pelo bianco in blastocisti per pelo nero.nero.

Cellule staminali con allele ñ

Blastocisti con alleli NN

NN ♂ o ♀

Nñ ♀ (chimera)

Nñ ♂ (chimera)

♀

♂

♂

♀

Le chimere maschio sono incrociate con Le chimere maschio sono incrociate con femmine bianche.femmine bianche.

Fase 2Fase 2

N

ñ

n n

Nn Nn

nñ nñ

Fase 3Fase 3

Gli eterozigoti knockout sono incrociati fra Gli eterozigoti knockout sono incrociati fra loro.loro.

♀

♂n

n ñ

ñ

nñ

nñ

nn

ññ

Omozigote non knockout o knockout

eteroziogote

Omozigote knockout

Per capire se un topo è eterozigote o Per capire se un topo è eterozigote o omozigote e/o maschio o femmina prima omozigote e/o maschio o femmina prima che nasca, si usa la che nasca, si usa la PCRPCR..

Se la Se la mutazionemutazione è è incompatibileincompatibile con la con la vita, vita, i knockouti knockout omozigoti ottenuti omozigoti ottenuti (l’ oggetto di studio) (l’ oggetto di studio) muoionomuoiono durante la durante la vita uterina o poco dopo la nascita.vita uterina o poco dopo la nascita.

Il knockout condizionatoIl knockout condizionato

Per evitare la morte precoce del topo, si Per evitare la morte precoce del topo, si usa il knockout condizionato, cioè si usa il knockout condizionato, cioè si sopprime il gene solo in un tessuto.sopprime il gene solo in un tessuto.

L’inattivazione avviene solo dopo il L’inattivazione avviene solo dopo il processo differenziativo, perché la processo differenziativo, perché la ricombinazione omologa avviene tardi solo ricombinazione omologa avviene tardi solo in alcuni tessuti.in alcuni tessuti.

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