Genové inženýrství (Josef „Faskal“ Novák)

Genové inženýrství

Genové inženýrství

● Genové inženýrství je soubor technik určených k cílené manipulaci genetické informace

● Cílené manipulaci?– alternativně: aplikace

genetických poznatků na křížení zvířat a rostlin

Centrální „dogma“ molekulární biologie

ÚvodStruktura DNA

● Určena 1953● Primární sekvence: pořadí bazí● Dvoušroubovice tvořená dvěma

antiparalelními vlákny● Hlavní nositel genetické informace

(spolu s RNA a epigenetickou informací)

ÚvodCo je gen

● Definováno každým oborem jinak● Pro genové inženýrství – úsek DNA kódující

protein+příslušné regulační oblasti● Pro klasického genetika - „vloha“● Identifikace genu:

– Genetické metody (mutace+mapování)

– Biochemické metody – nalezení proteinu => zpětné určení zodpovědného genu

Univerzální genetický kód

● Všechny organismy používají stejný genetický kód (několik výjimek, hlavně obsazení nekódujících pozic)

● DNA z různých organismů je vzájemně kompatibilní

Základyvztah genotypu a fenotypu

● Gen kóduje protein, který má nějakou funkci● Monogenní znaky● Polygenní znaky

– Výška, inteligence, hmotnost, krevní tlak

– Většina chorob

– Neléčitelné genovou terapií

Inspirace přírodouMobilní elementy

● Transpozomy a retroelementy● Úseky DNA, které jsou schopné se množit v

rámci genomu– Nosí informaci pro svou replikaci a často selekční

výhodu – resistenci nebo vyvolávají patogenitu

– Často se nesprávně vloží● Inaktivace rozrušeného místa => rakovina● Při vyštěpení mohou vzít část hostitelské DNA

– Genová duplikace

● Bakteriální integrativní plasmidy

Restrikčně modifikační systém

Inspirace přírodouSelekční znaky

● Využívání resistence na antibiotika● Obnova poškozených biosyntetických drah● Umožňují vybrat jednotlivé buňky, které si

osvojily vnesenou DNA

● Poznámka – existující resistence

bakterií proti těžkým kovům (stříbro)

Nová metodaSekvenace

Nová metodaPCR

● Vyžaduje znalost sekvence

Izolace „speciální“ DNA

● Forenzní analýza

– Mitochondriální DNA, DNA pro určení identity

– aDNA maximálně sto (stovky?) tisíc let (izolace DNA z dinosaurů nepotvrzena)

● DNA musí být rychle zmražena nebo vysušena (mumie)

● Izolace DNA pro potřeby genového inženýrství

● Praktická ukázka izolace DNA z rostlinného vzorku dnes večer!

Bezpečnost

● Biohazard I – běžná laboratoř, bakterie a viry neinfekční pro člověka

● Biohazard II – málo infekční (obtížně šiřitelné)● Biohazard III – nebezpečné a exotické

choroby● Biohazard IV – choroby

smrtelné, neléčitelné

a bez známé prevence

Otázka – zařaďte: ebola chřipka (běžná), SARS, salmonela, tuberkulóza, HIV, GMO

Hlavní využitíprimární výzkum

● Knock-out● Knock-down● Knock-in● Zkoumání lokalizace a exprese● Úpravy pro usnadnění biochemických analýz

Bakteriální beta-svorka+GFP

Zeleně:Tubulin+GFP

Otázka:Jak se liší uspořádání tubulinu v buňkách s průduchy a bez nic?

Zeleně:

14-3-3-φ/GFP transgene

Červeně:

Autofluorescence chlorofylu

Využití:produkce proteinů ve velkém

● První – inzulin v bakteriích (1977)● Rostlinné očkování● Produkce enzymů

– Vylepšení produkce „přírodních“ enzymů

● Hypoteticky možnost libovolný protein produkovat ve velkém množství– Protein pavoučího vlákna => lepší, než kevlar

GMO Plodiny

● Cílené úpravy, technicky stejné, jako ty probíhající přirozeně, které jsou ale velmi nepravděpodobné

● Plodiny nesoucí Bt toxin – v „běžných podmínkách“ (využívání pesticidů) srovnatelný výnos, bez použití pesticidů výnos +80 %

– Budoucí uplatnění GMO hlavně v rozvojových zemích

● Možný přenos DNA na člověka?

– „Rostliny mají geny ?!?“

● Pokud je GMO riziko, pak hlavně pro životní prostředí (ryby)

● 25 let zkoumání, 130 nezávislých týmů, konsenzus – bezpečné při dodržení předběžné opatrnosti

Únik resistence na antibiotika

● Horizontální genový transfer– Běžný jev, hlavně prokatyota a nižší eukaryota

– Genom bakterie Wolbachia (endosymbiont) se v evoluci přenesl do některých druhů hmyzu

– Separovaná germinální linie u zvířat

● Používané selekční znaky se běžně vyskytují– Resistence na ampicilin nese 10 % půdních

bakterií

– Přenos resistence

Výhody

● Omezení využití pesticidů a zvýšení resistence– Využitelné pro rozvojové země

– „Obsahuje GMO x 12x povrchově ošetřeno pesticidy“

● Úprava obsahu živin– Zlatá rýže, sója s upraveným obsahem

aminokyselin

Nevýhody

● Mezinárodní korporace● Závislost zemědělce na výrobci (i u konvenčních –

heterózní efekt)● Možnost vzniku resistence u příbuzných plevelů (x

DNA jako DNA – stejně dobře se může přenést i „přirozená“ resistence)

● Možnost úniku GMO do prostředí => ekologická katastrofa?

● Bt toxin a ničení včelstev? Úhyn motýla monarch?● Setkání s látkami, se kterými se člověk v evoluci

nesetkal? (x kiwi, mechanismus trávení)

Nechvalně známýPusztai affair

● Jedna z prvních velkých nezávislých studií o bezpečnosti GMO (1998)

● Lektin ze sněženky do brambor

=> imunodeficience u potkanů a pomalejší růst

● Špatný pokus

– Kontrolní brambory obsahovaly +20 % proteinů a potkanům byly podávány především brambory

– Dalším skupinám se výsledky nepodařilo zopakovat

– Peer Review: „experiments were poorly designed, contained uncertainties in the composition of diets, did not have a large enough number of rats, used incorrect statistical methods and lacked consistency within experiments“

● Hysterie ze strany tisku, předtím snad snaha umlčet Puszataiho

Nová plodina musí být testována

● Výzkum vložené DNA a syntetizovaných proteinů● Analýza chemického složení plodiny, měření

obsahu živin (ptáci preferují GMO před BIO), přítomnost známých toxinů a alergenů (vnesení genu může změnit jejich regulaci)

● Určení, jestli nevznikají nové alergeny– Odhad průměrné spotřeby

– Test na zvířatech: krátkodobý (několik dní), dlouhodobý (několik málo generací)

● Lepší kontrola, než u konvenčních metod

„přírodní experimenty“

● Experimenty s blokací myostatinu● Vychází z přirozeně vzniklých mutantů

– Stovky let testování konzumenty

Využití:Genová terapie

● Úprava genetické informace za účelem opravit existující chybu

● Odpůrci: velmi emocionální apokalyptické vize, „pokoušení osudu a hraní na boha“

● Zastánci: zázračná léčba umožňující vymýcení nemocí

● Reálně: poměrně omezená metoda na pouze některé cíle, v současnosti stále experimentální procedura

Nosiče DNA

● Stabilní/dočasná● Vnesení nahé DNA● Lipozomy● Virové

– Odvozené od (vykuchaných) virů

– Integrativní – nebezpečí vzniku rakoviny (x chemoterapie, imunosuprese, rengen/CT)

– Stabilně přítomné

Čas na diskuzi

● Aplikované flebotonium

Děkuji za pozornost

Mgr. Josef „Faskal“ Novákfaskal@seznam.cz