实验 1 特殊显微镜结构及操作技术

【目的】 了解 TE2000-U 型倒置显微镜的基本组件、

原理，掌握其基本操作。【材料】 1 ．高等动、植物各类组织永久制片； 2 ．培养皿（瓶）中的活细胞或微生物； 3 ．口腔上皮细胞的临时装片。

【实验用品】

1 ．试剂： 10μg/mL 罗丹明 123 的磷酸缓冲液（ PBS ）荧光染料。

2 ．器材：倒置显微镜，相差显微镜附件（相差物镜、转盘聚光器、对中环形光阑和绿色滤色镜等），微分干涉显微镜附件（起偏镜、检偏镜和渥拉斯顿棱镜等），荧光显微镜附件（荧光发射器、激发滤片和阻断滤片等），载玻片，盖玻片，牙签，滤纸条，擦镜纸，镊子，滴管。

【实验原理和方法】

倒置显微镜是一种用于生物组织细胞离体培养观察的光学显微装置，能直接对培养皿、培养瓶的标本进行显微观察。由于它的物镜、物体和光源位置刚好与立式显微镜颠倒，被称为倒置显微镜。倒置显微镜的物镜在下，聚光器在上，被观察样品置于位于上方的聚光器之下，聚光器具有远大于物镜的工作距离。因此，适应于培养皿或培养瓶中样品的观察。高档倒置显微镜可根据不同观察要求，增加相差、微分干涉反差物镜或荧光发射装置，构建成相差显微镜、微分干涉显微镜或荧光显微镜。

一、倒置显微镜的构造与使用

（一）倒置显微镜的构造 倒置显微镜由目镜、透射照明器、聚光器、载

物台、物镜和显微镜机体等部件构成，以TE2000-U 显微镜为例介绍。

TE2000-U 显微镜配有： T-DH 100W 透射照明器、 LHS-H100P-1 12V100W 灯室、 12V100W 卤素灯、 TE2-PS100W 电源、 T-SR 矩形载物台、 T-TD 双目镜筒 D 、CFI 10X 目镜、 T-N6 六孔物镜转换器，系统聚光器、物镜、电源线等。

1. 目镜筒及目镜 A: 屈光度调节环 B: 目镜 C: 目镜筒转盘 O: 开 B: 勃氏镜 ( 带有聚焦螺钉 ) C: 关 ( 光闸 ) M:2.5 倍放大

2. 显微镜机体

3. 透射照明器 : 透射照明器必须根据规定使用灯泡 (12V100W 或 6V30W) 。 T-DH 100W 透射照明器需灯室。

A ： 视场光阑调节杆 B ： 滤色片滑片C ： 聚光器再聚焦制动器 D ： 聚光器调焦旋钮E ： 聚光器固定螺钉 F ： 聚光器安装定位孔G ： 聚光器安装定位槽 H ： 聚光器转动指紧螺钉I ： 聚光器调中螺钉 J： 聚光器安装 ( 可转动 ) 支架K ： LHS-H100P-1 12V100W 灯室 L ： 灯室固定螺

钉M ： 灯室盖指紧螺钉 N ： 聚光器支架 ( 可移动 )

O ： 聚光器支架指紧螺钉 P ： 灯室线Q ： 聚光器支架下降定位螺钉

T-DS 30W 透射照明器 A ： 防尘滑片 ( 可移动 ) B ： F 堵口滑片 ( 可移动 ) C ： 聚光器安装支架 D ： 6V30W 灯室 E ： 滤色片滑片 F ： 安装附加装置 M4 螺纹孔

系统聚光器

T-DH 100W 透射照明器 A ： 聚光器孔径光阑B ： 聚光器模块C ： 聚光器模块固定螺钉D ： 聚光镜 ( 有三种可选：ELWD 、 LWD 、 HMC)E ： 环形光阑调中螺钉 (仅用于相差模块中 )

T-DS 30W 透射照明器 (霍夫曼观察 )

ELWD-S 聚光器

A ：调中杆指紧螺钉B ：调中杆 C ：转盘

SLWD 聚光器

T-SR 矩形载物台

A ：载物环湾

B ：载物台 Y 轴方向移动控制旋钮

C ：载物台 X 轴方向移动控制旋钮

（二）由 TE2000-U ， 100W 透射照明器，系统聚光器，以及 T-TD 目镜筒 D 组成的显微镜系统。

明视场 (BF) 镜检关键点： 从光路中卸下其它形式观察需要

的所有光学组件，聚光器调节好（调节聚焦和对中），转动孔径光阑调节好像的清晰度。

1. 复位

1 ） 逆时针转动，松开透射照明器中的“聚光器再聚焦指紧螺钉”。

2 ） 把“目镜筒转盘”设置到＜ O＞位。3 ） 把显微镜右侧的“中间放大倍数刻度

盘”打到＜ 1X＞。4 ） 逆时针转动，松开显微镜右侧粗∕微

调旋钮后面的“物镜再聚焦定位环”

2. 打开透射照明器

1 ） 把电源后部的“外部开关”打到开的位置；

2 ） 把电源“电源开关”打开。 (把开关拨至│ ) ；

3 ） 按下显微镜左侧的“照明器开关”接通灯泡。

3. 调节灯泡亮度保证色彩真实。

1 ） 把显微镜左侧的“亮度调节盘”设置成＜ 12V100W＞；

2 ） 把透射照明器中的“ NCB11 滤色片”插入光路中；

3 ） 把透射照明器中的“ ND4 滤色片”插入光路中。

4. 调节光路

1 ） 把 10X 物镜转到光路中。2 ） 把显微镜右侧的“光路转换盘”转到＜ 1 ＞

的位置。（ 100% 光到观察口）3 ） 向上推透射照明器上的“视场光阑杆”完全打开视场光阑。4 ） 将系统聚光器上的“孔径光阑杆”转至右侧极限处把“孔径光阑”完全打开。5 ） 转动聚光器调焦旋钮把聚光器调至最低位置。

5. 明视场观察时对显微镜的调整

把“聚光器转盘”转到＜ A ＞位置。

6 ．调节视度及瞳距

1 ）将显微镜前部的“摄影取景框转盘”逆时针旋转，使摄影取景框进入光路。

2 ）用左眼对着左侧目镜，转动目镜 “屈光度调节环”，使取景框中的双十字线清晰成像。

3 ）用右眼对着右侧目镜，转动目镜 “屈光度调节环”，使取景框中的双十字线清晰成像。4 ）将显微镜前部的“摄影取景框转盘”顺时针

旋转，使其退出光路。5 ）调节目镜瞳距，将两目镜视场所见的影像重合在一起。

7. 调焦

1 ）将样品放置载物台中。2 ）转动同轴粗微调旋钮，将标本对好焦。

8. 聚光器中心调节

1 ）确信 10X 物镜在光路中。2 ）将“视场光阑调节杆”降低直到能从目镜看到视场光

阑像。3 ）转动“聚光器调焦钮”升降聚光器，使视场光阑像清晰地成象在标本面上。

4 ）转动两个“聚光器中心调节螺钉”，使视场光阑像在视场中心。

5 ）更换 40X 物镜。6 ）调节“视场光阑调节杆”，使视场光阑的象与视场大致相同。

7 ）转动两个“聚光器中心调节螺钉”，使视场光阑像在视场正中。

9. 进行观察

1 ）选择要使用的物镜2 ）移动系统聚光器上的“孔径光阑调节杆”，使孔径为物镜数值孔径的 70 － 80% 。（“把目镜筒转盘”设到＜ B＞位置，转动勃氏镜调焦螺钉使其聚焦，当观察到物镜的出瞳和孔径光栏的象时，调节其大小。）

3 ）调节“视场光阑调节杆”使视场光阑像与视场相大致相同。4 ）把透射照明器里的“ ND 减光片”进入或退出光路以调节视场亮度。

10. 更换样品

利用显微镜主体上的“物镜再聚焦定位环”，照明器上的“倾斜装置”，“聚光器再聚焦指紧螺钉，可容易更换样品。

11. 显微镜操作结束后

1) 关闭电源开关 ( 开关拨至 O)2) 灯室冷却后，把显微镜上的聚乙烯防尘罩盖好。

相差（ PH ）显微术

观察透明细胞或其他透明样品，需配相衬聚光器、相衬物镜、相衬环等附件。相衬板将衍射光推迟 1/4波长，振幅相减，样品暗，背景亮，称正反差或暗反差，分正低（ DL ）、正低低（ DLL ）和中型暗相差（ DM ）。折光率较强的样品用后者。相衬板将直射光推迟1/4波长，振幅相加，样品亮，背景暗，称负反差或明反差，分负中（ NM ）和负高（ NH ）。折光率较小的样品用后者。

关键点：将有 ph 标记的物镜与物镜相同 ph 标记的聚光器模块一起送入光路，在进行显微术前，校正 ( 对中 ) 物镜里的相差板及聚光器模块里的环形光阑。

1. 用明视场（ BF ）显微术对样品聚焦。2. 相差观察时对显微镜的调整。

1) 将 ph 物镜转入光路。2) 转动“聚光器转盘”，使其与在光路中

的物镜 (步骤 1 中所安置的 ) 具有相同的 ph 标记。

3) 向右转动聚光器上的“孔径光阑调节杆”，完全打开孔径光阑。

3. 对中环形光阑

1) 把“目镜筒转盘”设到<B> 位置，转动勃氏镜聚焦螺钉，使环形光阑像清晰。

2) 用六角起子转动聚光器模块中的两个“环形光阑对中螺钉”，使环形光阑像与物镜中的相差板环形像同心。

3) 把目镜筒转盘位置再转到<O> 上。调中心手轮

4. 进行观察

1) 把聚光器“孔径光阑”完全打开。2) 移动透射照明器上的“视场光阑调节杆”，使视场光阑像大小与视场大小接近。

3) 把透射照明器上的“ NCB11 滤色片”从光路中移开，把“ GIF 滤色片”移进光路。 (提高反差 )

4) 可通过把“ ND 滤色片”移进或移出光路来调节视场亮度。

5. 使用不同放大倍数的物镜进行观察

1) 把所需放大倍数的相差物镜移入光路。2) 转动“聚光器转盘”，使其与在光路上

物镜（步骤 1 中所安置的）具有相同的ph 标记。

3) 调节放入光路中的环形光阑中心。 (见程序 3)

6. 更换样品 利用使用显微镜主机上的“物镜再聚焦

定位环”，透射照明器上的“倾斜”装置及“聚光器再聚焦指紧螺钉”，可容易更换样品。

7. 显微镜操作结束后与明视场显微术步骤相同。

微分干涉（ DIC ）显微术

可观察到样品的立体感，适用于显微操纵等，彩色图像。因塑料培养皿的不均衡张力在 DIC下呈现干涉条纹、 DIC 不宜用于普遍使用的塑料培养皿。 DIC 的光通亮大，可用到 100 倍物镜。需配 DIC 聚光器等附件，使用明场物镜。

1 ．用明场找到视野2 ．压入起偏器，选择相应模块3 ．调节孔径光栅至最佳效果。

荧光（ E ）显微术

适用于本身属于或被染色后形成荧光体的样品。荧光体在一定波长光（紫外或可见）的激发下发光（即荧光，波长长于激发光）。需配荧光附件和滤光器等。前者主件为激发光源，一般分汞灯系统和卤灯系统，汞灯既适用于紫外光激发也适用于可见光激发，且能量较高；后者只适用于可见光激发。（此处插入拍摄图片）

1. 操作之前要求：

（ 1 ）检查荧光装置的工作时间，如荧光灯的工作时间超过使用寿命，应予以更换。

（ 2 ）使用物荧光载波片（ 3 ）每次使用之间必须间隔 20 分钟。

2. 用明场找到视野。3. 关闭明场光源，打开荧光电源预热 5

分钟。4. 开启荧光盘，并根据要求选择荧光通

道。5. 激发荧光发生器，打开光闸，即可进

行观察。