第二组成员：夏常艳第二组成员：夏常艳学号：学号： 1080805310808053

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2020 世纪人类对微生物的利用世纪人类对微生物的利用 目前一般将微生物分为真菌、放线菌、细菌、螺旋体、立克次体、

衣原体、支原体和病毒。 自从 19 世纪后期巴斯德在酿酒、蚕病及狂犬病疫苗方面发展了微

生物生理学及其应用以来，由病原微生物改造制成的预防疾病的疫苗是微生物对人类最突出的贡献。

1929 年弗莱明在进行细菌培养时，偶尔观察到青霉菌周围有明显的抑制金黄色葡萄球菌生长的“抑菌圈”，从而发现了青霉素，开创了抗生素研究的时代。

应用微生物产物作为畜用添加剂，研究固氮菌及其质粒以促进农业生产，利用微生物处理垃圾及污水，用微生物处理废弃的化学武器等均是微生物在各个领域的贡献所在。

微生物基因组研究微生物基因组研究 20 世纪 90 年代后期开始了微生物基因组的研究。这项研究是从

对微生物完整的全基因核苷酸测序入手，在分析基因结构的基础上，认识微生物的完整生物学功能。微生物基因组计划（ Microbi

al Genome Program ）被认为是生命科学领域的一项大工程。 到 1999 年 2 月，已完成了对 15 种细菌基因组的测序，其中包括

幽门螺杆菌、结核杆菌、梅毒螺旋体、酿酒酵母菌、肺炎支原体等 。微生物基因组研究成果转入开发应用周期短，具有更高的经济价值。

微生物基因组研究具有目标明确、相对投入少、收效快、成果易于转化为产品等许多优点。

微生物基因组及其功能的研究将导致一场影响深远的生命科学的革命。

基因测序技术基因测序技术

目前应用的快速序列测定技术可以总的概括为两种：合成法和降解法。基于 Sanger 等（ 1977 ）提出的酶法及 Maxam 和 Gilbert(1977) 提出的化学降解法这两种基本思想。

传统用于 DNA 测序的方法有毛细管微阵列电泳测序和焦磷酸测序等，这些方法往往技术要求高、成本贵，而且容易出错。

焦磷酸测序 (Pyrosequencing) 技术

DNA 聚合酶作用

释放出一个分子的焦磷酸

ATP硫酸化酶作用，形成 ATP；荧光素酶催化，产生可见光。

通过 CCD光学系统即可获得一个特异的检测峰，峰值的高低则和相匹配的碱基数成正比。

降解残余底物

加入另一种 dNTP ，重复反应，根据获得的峰值图即可读取准确的 DNA 序列信息。

截至 2007 年，第二代基因测序方法已经普遍推广应用，极大地降低了测序的成本和时间，实现了高通量测序。

2008 年又提出了更快更好的第三代测序方法 ---单分子测序（ SMS ）

基本思想： DNA 由 4 种碱基的“砖块”搭建而成，即鸟嘌呤、腺嘌呤、胞嘧啶和胸腺嘧啶。对这 4 种碱基染上不同的颜色，然后使染了色的碱基“砖块”自动排列成与该 DNA片段互补的一个新片段。通过逐个观察 DNA片段上碱基的颜色来确定序列，这种方法精确度很高。核苷测定方法包含了一个模块可以确保在一簇类似的碱基情况下一次只能测定一个碱基。一旦它标记的颜色被检测并记录下来后，激光就会将染色与模块分开，进行下一个核苷的测定。

sequencing of single microbial cells

基因测序需要一定量的 DNA模板，所以测序前需对微生物进行分离和培养，但是环境中大多数的微生物是不可培养或对培养条件要求很高的，这无疑给测序增添了难度。

通过一种叫做多重置换扩增（ multiple displacement amp

lification ， MDA ）的技术，不需要进行微生物培养，可以直接扩增放大单个细菌中的 DNA获得作为模板所需的微克 DNA 。

整个实验包括环境样品的准备、单细胞分离、 MDA扩增DNA 和 DNA 测序等。

环境样品的处理环境样品的处理 富集环境样品中的微生物片段以利于分离单个细富集环境样品中的微生物片段以利于分离单个细胞。分离单细胞前土壤先经过密度梯度离心预处胞。分离单细胞前土壤先经过密度梯度离心预处理。如果是水样本，假如对生物体浓度有要求则理。如果是水样本，假如对生物体浓度有要求则要考虑附带过滤。 要考虑附带过滤。

离心、液体加压冲击法、过滤和静电沉积法 。离心、液体加压冲击法、过滤和静电沉积法 。 液压冲击型空气收集器可使细胞悬浮在用于分离液压冲击型空气收集器可使细胞悬浮在用于分离单细胞的溶液中，可高效地捕获液体基质中单细胞的溶液中，可高效地捕获液体基质中 1-101-10

μmμm 的微粒。 的微粒。

分离单细胞分离单细胞 根据所需要的生产量、环境以及靶生物体等情况，可以通根据所需要的生产量、环境以及靶生物体等情况，可以通过采用稀释法、荧光活性细胞筛选（过采用稀释法、荧光活性细胞筛选（ FACSFACS ）、显微操作）、显微操作和微流体分离到单个细胞用于和微流体分离到单个细胞用于 MDAMDA ，采用，采用 FACSFACS 可以在可以在一分钟内分离到上千个细胞。 一分钟内分离到上千个细胞。

单细胞分离结合荧光原位杂交（单细胞分离结合荧光原位杂交（ FISHFISH ）可以富集特异的）可以富集特异的菌属，机械的显微操作（基于体外受精的装备）结合现代菌属，机械的显微操作（基于体外受精的装备）结合现代研究显微镜方法可以高效地分离到单细胞，如跟研究显微镜方法可以高效地分离到单细胞，如跟 FISHFISH 结结合从环境样本中筛选出特异的种类用于合从环境样本中筛选出特异的种类用于 MDAMDA扩增单细胞扩增单细胞DNADNA实验。 实验。

细胞分选细胞分选

大小大小 悬浮在溶液中的相互离散颗粒。悬浮在溶液中的相互离散颗粒。 大小范围：大小范围： 0.2uM-300uM0.2uM-300uM 。。

对象类型对象类型 细胞类型：细胞类型： （（ 11 ） 高等真核细胞；） 高等真核细胞； （（ 22 ）酵母；）酵母； （（ 33 ）细菌；）细菌； （（ 44 ）多细胞的聚集体，如胰岛等。）多细胞的聚集体，如胰岛等。 非生命颗粒：非生命颗粒： 细胞核、染色体、和其它细胞器以及乳化微球等。细胞核、染色体、和其它细胞器以及乳化微球等。

流式细胞仪的测量对象

通过通过 MDAMDA 扩增扩增 DNADNA

多重置换扩增 (Multiple dilacementamplification ， MDA) 是 199

8 年由耶鲁大学 Lizardi博士首次提出。这种恒温扩增的方法依赖于链置换扩增原理，利用噬菌体 Φ29DNA聚合酶，高度扩增DNA 。该酶对于模板有很强的模板结合能力，能连续扩增 100

Kb  的 DNA模板而不从模板上解离。同时这种酶具有 3’ -5’外切酶活性，错误率仅为 5 x 10-6 ，大约比 Taq DNA聚合酶低 100

倍，因此可以保证扩增的高保真性。 Φ29DNA聚合酶强大的向前延伸活性和高保真度，使得通过M

DA 可从极少量的 DNA样本获取大量高质量的 DNA ，是到目前为止对整个基因组覆盖最广、各位点扩增偏倚最小的 WGA

方法。

全基因组扩增 (WGA) 是一组对全部基因组序列进行非选择性扩增的技术，其目的是在没有序列倾向性的前提下大幅度增加 DNA 的总量。该技术通过对微量组织样本，甚至单个细胞的整个基因组 DNA扩增，再将其扩增产物作为模板，进行后续分析，进而完成多位点、多基因以及全基因组 DNA 组成的研究。

WGA 技术发展至今主要 IRS-PCR(interspersed repeat sequence PCR ) 、LA-PCR(1inker adaptor PCR) 、 Alu PCR 、 T-PCR (tagged random pri

mer PCR． T-PCR) 、扩增前引物延伸 (primer extension preamplificatio

n ， PEP) 和简并寡核苷酸引物 PCR (degenerate oligonucleotide primer-

PCR ， DOP-PCR) 。但是，由于发生非特异性扩增，位点覆盖不完全，DNA 产物片段小于 1 kb 等缺点，限制了这些方法的应用。

多重置换扩增（ MDA ）的示意图： 首先随机六碱基引物在多个位点与模板 DNA退火，接下来 Phi 29 DNA 聚合酶在 DNA 的多个位点同时起始复制，它沿着 DNA模板合成 DNA,同时取代模板的互补链。被置换的互补链又成为新的模板来进行扩增，因此最终我们可以获得大量高分子量的 DNA.

模板

引物

引物

初始模板量分别为： 0.1ng,1ng,10ng,100ng ，产量均为 40μg左右。

MDA 反应的产量受起始 DNA浓度的影响较小， Dean 等通过对不同量的模板 DNA 进行MDA反应，发现终产量较一致。这对于大范围的遗传学应用十分有利，因为不需要测量或平衡DNA浓度而直接进行扩增，而能产生同样量的 DNA 。

MDAMDA 的应用的应用 SNPs 和 STRs 基因型检测

基因拷贝数改变的检测

DNA 测序

总的来说， MDA 由于其基因型的可靠性、高敏感性、高基因组覆盖率以及较低的扩增偏向性等优点，使得该方法成为目前最有优势的 WGA 方法。 MDA 已经广泛的应用于包括定量 PCR 、 SNP 基因型分析、 Southern印迹分析、染色体图谱中。

Thanks for your attentions！

实验设计实验设计 弧菌外膜蛋白弧菌外膜蛋白 OmpUOmpU 基因的克隆表达基因的克隆表达

★Genebank 中检索的弧菌和其他非弧菌外膜蛋白 OmpU氨基酸序列及基因序列根据保守区序列设计简并引物

★优化条件，进行 PCR扩增，克隆基因

基因克隆

基因测序★切胶回收，并纯化目的基因；

★将所得目的基因连入 T载体，转化大肠杆菌感受态；

★挑选阳性克隆子，测序。

基因表达

★PCR扩增，得到带酶切位点的目的基因片段；

★切胶回收纯化 PCR 产物；

★酶连到表达质粒中；

★转化大肠杆菌感受态；

★阳性克隆子即可在合适条件下表达目的基因；

★提取和纯化表达的外膜蛋白 OmpU