Zbl. Bakt. II. Abt. 136 (1081), 324- 329

[Aus der Forschungsabteilung dt's VEB Prowiko Sch6nebeck und dem Institut fUr Garungsindu· strie, Berlin]

P-l,3-1,4-Glucanase in sporenbildenden Mikroorganismen V. Die Wirkung der p-Glucanasen auf die Viskositat von Brauwiirze

p-l,3-1,4-Glucanase in Spore-forming Microorganisms

V. The Efficiency of p-Glucanases in Reducing the Viscosity of Wort

R. BORRISS und K.-L. SCHRODER

Mit 2 Abbildungen

Summary

Six preparations of p·glucanases produced by different members of the genus Bacillus were compared for their efficiency to reduce the viscosity of wort in mashing in the laboratory scale Test mashings containing 50 % barley followed by wort viscosity measurements give reliable infor­mation on the efficiency of p.glucan-hydrolyzing enzymes in brewing.

The results which were found differed in dependence of substrate specifity, optimum pH, and temperature tolerance of the used enzymes. The best results were obtained with a thermo­stable p-1,3-glucan-glucanohydrolase ("laminarinase") produced by Bacillus macerans ATCC 8244.

Zusammenfassung

Die von sechs unterschiedlichen Bacillus-Stammen gebildeten p-Glucanasen wurden hinsicht­lich ihres Einflusses auf die Senkung del' Brauwurzeviskositat in Labormischversuchen verglei­chend untersucht. Fur die Beurteilung der Wirkung p·Glucan·hydrolysierender Enzyme erwiesen sich Maischansatze mit einem Gerstenrohfruchtanteil von 50 % als geeignet.

Die erhaltenen Ergebnisse unterschieden sich in Abhangigkeit von der Substratspezifitat sowie dem pH- und Temperaturverhalten der untersuchten Enzyme. Durch eine thermostabile p-l,3-Glucan-Glucanohydrolase ("Laminarinase") von Bacillus macerans ATCC 8244 wurden die besten Resultate erreicht.

Obwohl die Anwendung mikrobieller Enzympraparate im BrauprozeB seit mehr als zwei Jahrzehnten praktiziert wird, ist die Bedeutung der p-Glucanase flir diesen Vor­gang lange nicht erkannt worden. Der Nachweis von p-Glucanasen, die gemischte p-Polyglucane (Gerstenglucan, Lichenin) abbauen, erfolgte zuerst in kommerziellen Amylasepraparaten (BASS, MEREDITH u. ANDERSON 1952). BOURNE u. PIERCE (1972a) zeigten, daB in 18 von insgesamt 22 industriellen Amylasepraparaten p-Glucanase­aktivitat enthalten war. In zunehmendem MaBe fand diese Komponente, der als Amylase deklarierten Enzymgemische, das Interesse der Brauindustrie, da p-Glu­canase die technologischen Schwierigkeiten, die mit dem Einsatz erh6hter Gersten­rohfruchtanteile in der Wlirze entstehen (Filtration und Lauterung), weitgehend zu beseitigen vermag (BEUBLER, DEMPWOLF u. NIELEBOCK 1968).

Bei nicht ausreichender p-Glucanaseaktivitat, mit der insbesondere bei erh6hten Gerstenroh­fruchtanteilen zu rechnen ist, erh6ht sich die p·Glucankonzentration wahrend des technologischen Fertigungsprozesses des Bieres gravierend. Der Anteil des Gerstenglucans an der Gesamtsubstanz

tJ-l,3-1,4-Glucanase in sporenbildenden Mikroorganismen. V. 325

der Karyopse variiert je nach Bestimmungsmethode und Gerstensorte zwischen 1,5 - 2,6 % (BOURNE u_ PIERCE 1972b). Bei gleicher Malzqualitat betrug jedoch die auf tJ-Glucane rlickfiihr­bare Viskositat in der Vorderwlirze 20--25 %' in del' Ausschlagwlil'ze 30-35 % (BEUBLER, DEMP­WALF U. NIELEBOCK 19(18).

Mit der Zugabe gereinigter p-Glueanase von Bacillus IMET B 376 zur Maisehe konnten wir zeigen, daB dieses Enzym tatsaehlieh aHein fUr die Viskositatserniedrigung der Wiirze - dem vom Brauer mit dem Enzymeinsatz angestrebten teehnologisehen Effekt - verantwortlieh ist.

1m Rahmen der vorliegenden Veroffentliehungsreihe wurden die Auswahl p-glu­canaseaktiver Bacillus-Stamme (BORRISS, ZEMEK, AUGUSTIN, PACOVA U. KUNIAK 1980), die lsolierung der von diesen Stammen gebildeten extrazellularen Gluea­nasen, Substratspezifitat und Hydrolysespektrum (BORRISS u. ZEMEK 1980), sowie die Eigensehaften dieser Enzyme, insbesondere das Temperatur- und pH-Verhalten (BORRISS u. ZEMEK 1981), besehrieben. An dieser Stelle werden die Resultate mit­geteilt, die bei dem Einsatz der Enzympraparate in einem Labormaisehverfahren er­halten wurden.

Material und Methoden

Herkunft und Selektion tJ-glucanaseaktiver Bacillus-Stamme (BORRISS, ZEMEK, AUGUSTIN, PAC OVA U. KUNIAK 1980), Kultivierungsbedingungen und die Isolierung p-glucanaseaktiver Rohenzympraparate aus del' Kulturlosung del' jeweiligen Stamme (BORRISS u. ZEMEK 1980) wurden vorher beschrieben.

Ein gereinigtes tJ·Glucanasepraparat wurde aus dem Kulturfiltrat von Bacillus IMET B 376 durch fraktionierte Salzfallung und Ionenaustauschchromatographie mit DEAE-Sephadex pra­pariert (BORRISS 1978). Eine Charakteristik des Enzyms VOl' und nach del' Reinigung wird in der Tabelle 1 gegeben.

80

70

u 0

::> 60 '0 e. a. E ~

50

0 1.0 80 120 160 200

Zeit (min)

Abb. 1. Temperaturprogramm fUr das Labormaischverfahren.

326 R. BORRISS und K.-L. SCHRODER

Bei dem vergleichend eingesetzten "Brauereienzym" handelt es sieh urn ein industrielles Praparat des VEB Prowiko Schiinebeck mit standardisierter ,B-Glucanase- und Proteaseaktviitat (DDR-TGL 29 166/01).

DurchfUhl'ung del' Labol'-Maischvorsuche: lOO g Schrot (60 Gewichts-% Gerste, 40 Gewiehts-% Malz) wurdenin einem Maisehbecher mit 350 ml Leitungswasser versetzt und nach dem in del' Abb. 1 dal'gestellten Maisehverfahren behandelt. Die Zugabe del' Enzyme (40 Glueanase-Einheiten/ Ansatz, wenn nieht andel'S im Text angegeben) erfolgte zu Beginn del' 50° Rast. Nach dem Mai­sehen wurden die Becher gewogen und mit Leitungswasser wieder auf 450 ml aufgefiillt, kriiftig umgeriihrt und durch Faltenfiltel' filtl'iert. Die "Vorderwiirze" wurde auf etwa 11 % verdiinnt und im Kiihlschrank aufbewahrt. Die analyti~chen Bestimmungen erfolgten am nachsten Tag.

,B-Glucanase-Bestimmung: Dul'chfUhrung naeh TGL 29 166/02 (1973). Eine Glucanase-Einheit ist als diejenige Enzymmenge ddfiniert, die bei 25°C aus einer O,5%igen Licheninliisung so viel Substratbruehstiicke pro Min. freisetzt, deren reduzierende Wirkung l,uMol Glucose entspricht.

Protease-Bestimmung beruht auf del' photometrisehen Bestimmung del' Peptidbruehstiicke, die dureh enzymatische Hydr'Olyse des Hamoglobins entstehen. Die entstandenen Bruchstiicke werden auf ein ,uMol Tyrosin bezog(·n und die Aktivitat in Tyrosineinheiten ausgedriickt. Die Durchfiihrung der Best,immnng erfolgte entspreehend dem Fachbereichstandard Brauereienzym TGL 29 166/02 (1973).

Alpha-Amylase, Lipase und Cellulase wurden unter Anwendung des Agar-DiHusionstestes nachgewiesen (BORRISS- 1978).

Die Extraktbestimrnung erfolgte pyknometl'iseh nach KRUGER und BIELIG (1976). Die Viskositat wurdp mittels HOPPLER-Viskosimeter bei 20,00 ± 0,02 °C gemessen und in cp

bezogen auf 10 % Extl'akt df'r \Viirze (BEFBLER, DEMPwoLF und NIELEBOCK 19(8) angegeben.

Tabelle 1. Charakteristik del' ,B-Glucanase von Bacillu8 IMET B 376 vor und nach del' Roinigung

,B-Glueanase E/mg Protein

Anreicherungsfaktor Protease E/mg Pl'Otein

Verhaltnis Protease/Glucanase

Alpha-Amylase

Lipase

CMCase

"Rohenzym" (konz. Kulturfiltrat)

25

6,1

1:4

(+)

Gereinigte ,B-Glucanase

380

ca. 15

3,0

1: 127

(+)

'l'abelle 2. Der Einflu1l glneanasehaltiger Enzympraparationen unterschie<llichen l{einheitsgrades auf die Wiirzeviskositat. Eingesetzte Enzymmenge: 100 E/Maischansatz

Enzym

Brauereienzym

Kultur-Konzentmt von Bacillus IMET B 376

Gereinigtc Glucanase Yon

Bacillu8 B 376

Viskositatsdifferenz zllr Kont rolle ohne Enzymzusatz

O,2f12 c1'

0,293 cP

0,297 cP

f3-1,3-1,4-Glucanase in sporenbildenden Mikl'ool'ganismen_ V. 327

Ergebnisse und Diskussion

Wirkung gereinigter p-Glucanase auf die Viskositat der Ausschlagwiirze

Zur Untersuchung des Einflusses von p-Glucanase auf die Wiirzeviskositat wurde eine Enzympraparation von Bacillus IMET B 376 eingesetzt, in der st6rende Neben­aktivitaten weitgehend entfernt worden waren (Tabelle 1).

Die in der Tabelle 2 zusammengefaBten Ergebnisse weisen nach, daB der EinfluB des gereinigten Enzyms auf die Viskositat der Ausschlagwiirze der Wirkung komplexer technischer Enzympraparate (Brauereienzym, Glucanase-Konzentrat von Bacillus IMET B 376) vollkommen entspricht.

Somit ist die p-Glucan-hydrolysierende Komponente der komplexen technischen Brauereienzympraparate entscheidend fiir die Herabsetzung der Wiirzeviskositat und dem damit verbundenen positiven technologischen Effekt auf Filtration und Lauterung.

EinfluB verschiedender Bacillus-p-Glucanasen auf die Wiirzeviskositat

p-Glucanase, prapariert aus den KuIturfiltraten verschiedener Bacillus-Stamme unterschiedlicher taxonomischer Herkunft, wurden in Labormaischversuchen (Ver­MUnis MalzjRohfrucht: 1: 1) eingesetzt. Wahrend sich hinsichtlich des Extraktgehal­tes kaum Unterschiede zur Kontrolle ergaben, wurden die Viskositaten der resultieren­den Wiirzen durch die Enzymzugabe deutlich erniedrigt (Tabelle 3).

Tabelle 3. Del' EinfluLl vel'schiedE'ner Bacillus-f3-Glucanasen auf die Viskositat und den Extl'akt­gehalt del' Wiirze. Die angE'gebene Viskositat stellt die Diffel'enz zwischen del' Kontl'olle ohne Enzym­zusatz und del' in GegE'nwart des jew<'lligen Enzympl'aparatcs beobachteten Viskositatserniedrigung dar

Enzym-Klassif. Produzenten-Stamm

E.C. 3.2.1.73 B. sllbtiZis

Endo-l,3-1,4-p-Glucan- (Bl'auE'reienzym)

Glucanohydrolase 11. s1)btiiis Hi8 (CCM 2267)

H. circuZans SG 124

E.C. 3.2.1.6 Endo-l,3-f3-Glncan­Glucanohydrolase

B. iater08porus ATCC (\4

B. pumil1l8 ATCC 72

B. m({cer({IIS ATCC 8244

Extrakt Viskositatsdifferenz

11,41 % 0,195 cP

11,21 % 0,194 cP

11,47% 0,207 cP

11,31 % 0,195 c1'

11,27% 0,202 "p

11,59% 0,265 cP

Das eindeutig beste Resultat wurde mit der p-Glucanase von B. macerans erhalten. Bereits weniger als 20 % dieser Enzympraparation bewirken die gleiche Viskositats­erniedrigung wie das Brauereienzym bei TGL-gerechtem Einsatz (40 EjAnsatz, Abb.2).

1m Gegensatz zu allen anderen eingesetzten p-Glucanasen hydrolysiert das B. macerans-Enzym neb en gemischten p-1,3-1,4-Glucanen auch das reine p-1,3-Glucan Laminarin und ist somit als "Laminarinase" (1-3-P-D-Glucan Glucanohydrolase, E. 0.3.2.1.6) anzusehen. Bei der Hydrolyse von Lichenin und Gerstenglucan wurden von den iibrigen Enzympraparaten (1,3-1,4-p-Glucan Glucanohydrolase, E.O. 3.2.1.73) abweichende Hydrolysespektren erhalten (BORRISS u. ZEMEK 1980).

328 R. BORRISS uml K.-L. SCHRODER

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Abb. 2_ Der Effekt deR Zusatzes von Brauereienzym und B. macerans-Glucanase auf die Wiirze­viskositat.

Damit unterscheidet sich das B. macerans-Enzym deutlich von den bisher in den Brauereien eingesetzten kommerziellen Enzympraparaten vom B. subtilis-Typ (AN­DERSON u. STONE 1975) und ahnelt in seinem Wirkungsmechanismus mehr den bei B. circulans WL-12 (FLEET u. PHAFF 1974) und Rhizopus arrhizus (CLARK, .JOHNSON, CHUNG u. KIRKWOOD 1978) beschriebenen Endo-tJ-Glucanasen. Inwieweit die mit diesem Enzym erhaltene verstarkte Viskositatsreduktion der Wiirze auf die differie­rende Substrat- und Spaltungsspezifitat oder auf die gute pH- und Temperatur-Sta­bilitat zuriickzufiihren ist, kann nach den bisherigen Ergebnissen nicht entschieden werden. Von ENARI u. MARKKANEN (1974) wurde darauf hingewiesen, daB tJ-Gluca­naseaktivitat und Reduktion der Wiirzeviskositat nicht unbedingt proportional ver­laufen miissen. Die relativ giinstige Wirkung pilzlicher tJ-Glucanasen im Vergleich zu bakteriellen Enzymen wurde von diesen Autoren ebenfalls auf Unterschiede in deren Substratspezifitat sowie ihrem pH- und Temperaturverhalten zuriickgefiihrt.

Literatur

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Anschrift des Autors:

Dr. se. H. BORRISS, VEB Prowiko, DDR - 3300 Sch6nebeck (EIbe), WelsIeber StraI.lc 61.