蓝光诱导气孔开放

生物科学与技术学院王慧慧

2007 年 5 月

光是控制气孔运动的最主要环境信号，通常气孔在光下开放，暗中关闭。

用光合电子传递的抑制剂 DCMU 处理叶片，只能部分抑制气孔在光下开放。这表明气孔开放除保卫细胞叶绿体的光合作用外还有其他反应参与。

图 红光背景下气孔对蓝光的反应用饱和的红光照射鸭跖草的离体表皮，在气孔开度达定值时给於蓝

光照射，会使气孔孔径明显增加。(Schwartz & Zeiger ， 1984)

在双光实验中，首先用红光饱和保卫细胞叶绿体的光合作用，在红光照射使气孔开度达定值时如果再给予蓝光照射，会进一步引起气孔开度明显增加。

测定红光背景下蓝光促进气孔开放的作用光谱，观察到在 400 ～ 500 nm 区域内呈现出特征性的“三指”图案（“ three finger” pattern ）。

这些研究结果表明气孔对光的反应除了保卫细胞光合作用以外还包括蓝光反应。气孔对蓝光的反应发生在保卫细胞中，快速且可逆。

一、蓝光激活保卫细胞质膜中的质子泵 蓝光通过激活保卫细胞质膜中的质子泵和诱导有

机溶解物（如蔗糖）的合成来调节保卫细胞的渗透势，引起保卫细胞吸水膨胀，从而导致气孔开放。

在以保卫细胞原生质体为材料的双光实验中，在饱和红光照射的背景下，蓝光的照射会激活质膜 H+-ATPase引起 H+ 流出细胞，使悬浮原生质体的介质的 H+ 浓度提高而发生酸化。

图 30s 蓝光脉冲刺激下蚕豆保卫细胞原生质体悬浮介质的酸化作用(Shimazaki et al.1986)

蓝光激活 H+-ATPase 建立的质膜 H+电化学势梯度可驱动离子的跨膜转移从而调节保卫细胞的渗透势。

保卫细胞的渗透势通常由 K＋以及相关平衡离子的浓度变化来调节。当气孔开放时，保卫细胞 K＋浓度从关闭时的 100mM 提高到 400 ～ 800mM ，浓度变化幅度与植物种类及试验条件有关。很多植物中，保卫细胞中由 K＋的积累所具有的正电荷需运入 Cl- 和苹果酸 2-等负离子来平衡。

二、参与蓝光诱导气孔开放的光受体一直以来向光素被广泛认为是保卫细胞中的蓝光受体 (Tosh

inori Kinoshita, Nature,2001) ；

然而对 phot1/phot2 双突变体的研究表明在缺乏向光素的条件下，其仍然保持了专一性的蓝光反应。

我国杨洪全等人，发现拟南芥的 cry1/cry2 双突变体的气孔表现减弱的对蓝光的反应，而过量表达 CRY1 的转基因植株（ CRY1-ovx）的气孔表现对蓝光的超敏感反应，这些研究结果表明隐花色素也参与了蓝光诱导的气孔开放。 (Jian Mao, Hong-Quan Yang,PNAS,2005)

(E) Confocal images of stomata of the WT, cry1, cry2, cry1 cry2, CRY1-ovx, and CRY2-ovx plants. Epidermal strips were illuminated with 5molm2s1 blue light under background 50molm2s1 red light for 3 h. (F) Stomatal apertures under different light conditions in the WT, cry1, cry2, cry1 cry2, CRY1-ovx, and CRY2-ovx plants. Stomatal opening was induced by 50 molm2s1 red light and 20 molm2s1 blue light plus 50 molm2s1 red light. Stomata of the WT plants open significantly wider than those of the cry1 single and cry1 cry2 double mutant under 20 molm2s1 blue light plus 50 molm2s1 red light respectively. (G) Fluence rate dependency of stomatal opening in response to blue light. The measurements represent stomatal apertures obtained at different fluence rates of blue light under background 50 molm2s1 red light.

一些研究表明玉米黄素在蓝光诱导的气孔开放反应中起了核心的作用。

玉米黄素是叶绿体叶黄素循环的三种成分之一，它保护了光合色素免受过量的激发能量破坏。

由入射辐射作用导致的保卫细胞中玉米黄素含量的变化明显不同于叶肉细胞中的变化。

玉米黄素介导了保卫细胞中蓝光的光感受主要证据如下：①玉米黄素吸收光谱与蓝光诱导气孔开放的作

用光谱基本相一致

图 10-18 蓝光诱导气孔开放的作用光谱与玉米黄素吸收光谱

(A) 蓝光诱导气孔开放的作用光谱 ( 背景光为红光 ) 。 (B) 以乙醇为溶剂的玉米黄素吸收光谱。 (Karlsson 1986)

图 10-19 保卫细胞中玉米黄素含量与光合有效辐射及

气孔开度较为一致

(A)温室中栽培的番茄叶蚕豆叶叶肉细胞和保卫细胞中玉米黄素的日变化，以及到达叶片表面的光合有效辐射

的日变化。 (B) 被用来测定玉米黄素含量的同一叶片气孔开度的日

变化。(Srivastava & Zeiger,199

5)

②保卫细胞中含有比叶肉细胞多的玉米黄素，气孔开度随保卫细胞中玉米黄素含量增高而增大

③玉米黄素的形成可以被二硫苏糖醇 (DTT)阻断， DTT做为一种还原剂可以将 S－ S键还原为－ SH基团从而有效地抑制了将紫黄素转换为玉米黄素的酶的活性。蓝光诱导的气孔开放能够被 3mM DTT完全抑制，这种抑制效应依赖其浓度；

④拟南芥玉米黄素缺陷型突变体 npq1 (nonphotochemical quenching)由于缺乏紫黄素脱环氧化酶，不能将紫黄素转变成玉米黄素，因而不论是叶肉细胞叶绿体还是保卫细胞叶绿体都不能够积累玉米黄素。实验表明 npq1 突变体的气孔缺乏专一性的蓝光反应。

三、蓝光诱导气孔开放的调控 H+-ATPase 的 C端有一个调控此酶活性的自抑制

结构域（ autoinhibitory domain ）。 C端的自抑制结构域被认为是通过阻挡其催化位点来降低酶活性的。

在蓝光照射下， H+-ATPase 对 ATP显示出较低的Km 和较高的 Vmax，这表明蓝光激活了 H+-ATPase 。 H+-ATPase 的活化包括 C端结构域丝氨酸和苏氨酸发生磷酸化反应。 C端结构域的磷酸化能够使 C端自抑制结构域离开酶的催化位点。

一种 14-3-3 蛋白已被发现能够与保卫细胞 H+-ATPase磷酸化的 C端结合 ,但是 14-3-3 蛋白并不与非磷酸化的 C端结合。

14-3-3 蛋白是真核生物中的泛素调节蛋白，它可以与一系列靶蛋白相互作用。在植物中， 14-3-3 蛋白在调控关键性代谢酶的活性上起了重要的作用。

最近也有研究证实蓝光下保卫细胞向光素发生磷酸化并与 14-3-3 蛋白结合。（ Toshinori Kinoshita,Plant Physiol. 2003)

14-3-3 proteins are conserved phosphopeptide-binding proteins. 14-3-3 proteins exist as dimers, with each monomer able to bind a target peptide sequence within the groove created on the conserved inner face of the protein. Shown here are (a) side and (b) front views of a molecular model of a human 14-3-3z monomer with a bound phosphopeptide shown in black .

Generic function of 14-3-3 proteins. Proteins phosphorylated on serine residues within specific motifs become targets for 14-3-3 binding. Interaction can result in an altered behaviour of the target protein through one of a range of different mechanisms that are summarised in the figure.

我国杨洪全等人研究发现缺乏 COP1 的拟南芥 cop1 （ Constitutive Photomorphogenesis ）突变体的气孔在黑暗条件下表现组成型开放的表型，即其气孔开度与在蓝光、红光和远红光条件下的开度相当，由此证明 COP1 是气孔开放的主要负调控因子。 (Jian Mao, Hong-Quan Yang,PNAS,2005)

Fig. Stomata opening of the cop1 mutant, GUS-CCT1, and GUS-CCT2 plants in darkness and under different light conditions. (A) Confocal images showing that stomata of the cop1-4 mutant, GUS-CCT1, and GUS-CCT2 plants are constitutively open in darkness, and open wider than those of the WTunder 50 molm2s1 red, 50 molm2s1 far-red, and 5 molm2s1 blue light plus 50 molm2s1 red light. (B) Stomatal apertures in the cop1 mutant, GUS-CCT1, and GUS-CCT2 plants under the same conditions in A.

COP1蛋白是一个分子量为 76 kD 的核蛋白，它由 3个特殊的结构域组成即环形锌指结合域、卷曲螺旋形结构域和WD-40重复序列，并含有一个核定位信号和一个新型细胞质定位信号，它是光调控植物发育的分子开关。

核内 COP1 通过与特异转录因子相互作用来调节光形态建成。

杨洪全等人通过构建 cry1/cry2/cop1 和 phot1/phot2/cop1 三突变体，并分析了在蓝光下这 2个三突变体的气孔开度，发现与cop1 的单突变体的表型相似，即气孔完全开放。

由此从遗传上证明了 COP1 在 CRY 和 PHOT 信号转导途径的下游起作用，即 CRY 和 PHOT介导的蓝光信号都必须经过 COP1 来完成对气孔开放的调节。 (Jian Mao, Hong-Quan Yang,PNAS,2005)

Signaling pathways illustrating coactions of CRY and PHOT in the regulation of stomatal opening presumably through negative regulation of COP1. Solid line indicates the defined direct CRY–COP1 interaction ,and the dashed line denotes the presumptive interactions. X, postulated intermediate signaling partner(s) acting between phototropins and COP1.

目前已有实验证据表明蓝光下 cry 可以和 COP1结合，从而抑制了 COP1 的活性，气孔开放。

图 蓝光下隐花色素抑制了 COP1 的活性。在这一作用模型中，两个相同的隐花色素分子通过其N端光吸收结构域（ CNTs ）结合形成二聚体，通过其 C端结构域（ CCTs ）与 COP1 的WD40 结构域结合。在黑暗中，隐花色素同源二聚体处于无活性状态，使得 COP1 抑制光信号转导；然而在吸收了蓝光后，隐花色素 N端结构域发生电子转移反应，导致 C端结构域构象改变进而引起分子间自磷酸化反应，并最终激活了隐花色素。活化了的隐花色素通过某种目前尚未确定的机制抑制了 COP1 的活性。三角形代表了每个隐花色素分子生色团的结合位点。

蓝光诱导气孔开放的信号转导级联放大途径的几个关键性的步骤已被阐明

此外，还可能有其他的信号传导途径参与此过程。蛋白激酶、磷酸酶、三磷酸肌醇(IP3) 以及钙调素等都可能与蓝光诱导的气孔开放有关，因此在细胞质中的信息传递过程是相当复杂的。

蓝光调控气孔运动信号转导

Light Regulation of Stomatal Movement. Annu. Rev. Plant Biol. 2007. 58:219–47

红光与蓝光调控气孔运动

四、绿光可以逆转蓝光诱导的气孔开放 最近研究发现绿光可以逆转蓝光诱导的气孔开放。这一

反应类似于光敏色素红光 /远红光可逆反应。

Figure 1 Green light reversal of blue light-stimulated opening in continuous light experiments. Stomata were illuminated with 10 µmol m–2s–1 blue light given alone or together with green light of 10 or 20 µmol m–2s–1. Results are shown as the percent reduction of the opening stimulated by blue light. The inset shows the average final aperture values. Data after Frechilla et al., 2000.

蓝光诱导气孔开放的绿光逆转作用光谱非常类似于蓝光诱导气孔开放的作用光谱，但是红移（向光谱长波长的红光条带移动）了大约 90nm 。

Figure 2 Action spectrum for the inhibition of blue light-stimulated stomatal opening by green light in Vicia faba. Inhibition curves similar to that shown in Figure 1 were obtained for each wavelength and the action spectrum was obtained by calculating the fluence rate of light at that wavelength necessary to obtain 50% inhibition (green curve). Data after Frechilla et al., 2000. The action spectrum for blue light-stimulated opening (blue curve) is shown for comparison (Karlsson, 1986).

在蓝光、红光和绿光中生长的拟南芥叶片上的气孔在绿光关闭的条件下开放，在绿光再次打开的条件下关闭（ Talbott 等 2006 ）。当仅用红光和绿光照射叶片的条件下，气孔对绿光的这一敏感性并没有被观察到。这表明气孔对绿光的反应源于蓝光和绿光之间的相互作用，自然条件下太阳辐射中的绿光光量子下调了气孔对蓝光的反应。

在缺乏玉米黄素的拟南芥 npq1 突变体中蓝光诱导的气孔开放不能被绿光所逆转，相反在 phot1/phot2 双突变体中蓝光诱导的气孔开放是可以被绿光逆转的（ Talbott 等 2003）。以上结果表明气孔蓝光反应的绿光逆转需要玉米黄素而非向光素。

野生型 气孔开度（ μm ） npq1 气孔开度（ μm ） phot1/phot2 气孔开度（ μm ） 绿光 红光 蓝光 图 18.26 在蓝光、红光和绿光中生长的拟南芥完整连体叶片

上的气孔在绿光关闭的条件下开放，在绿光再次打开的条件下关闭。蓝光在气孔对绿光敏感性反应中是必需的。缺乏玉米黄素的 npq1 突变体的气孔不能对绿光作出反应。然而 phot1/phot2 双突变体具有类似于野生型的反应。（ Talbott et al.2006 ）

最近分光镜的研究结果显示绿光在玉米黄素的异构化中非常有效。在蓝光下无生理活性的玉米黄素异构体转变成了有生理活性的异构体。绿光将会使有生理活性的异构体转变成无生理活性的异构体，因而能够逆转蓝光诱导的气孔开放信号。

气孔的蓝光 / 绿光可逆反应已在多个物种中被报导，其中双子叶植物包括拟南芥、鸭跖草、烟草以及豆科植物蚕豆和碗豆，单子叶植物包括洋葱和大麦。

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