РОССИЙСКАЯ АКАДЕМИЯ НАУК

ИНСТИТУТ МИКРОБИОЛОГИИ

ИМ. С.Н. ВИНОГРАДСКОГО РАН

НАУЧНЫЙ СОВЕТ ПО МИКРОБИОЛОГИИ РАН

РОССИЙСКИЙ ФОНД ФУНДАМЕНТАЛЬНЫХ ИССЛЕДОВАНИЙ

МОО «МИКРОБИОЛОГИЧЕСКОЕ ОБЩЕСТВО»

V МОЛОДЕЖНАЯ ШКОЛА–КОНФЕРЕНЦИЯ

С МЕЖДУНАРОДНЫМ УЧАСТИЕМ

«АКТУАЛЬНЫЕ АСПЕКТЫ СОВРЕМЕННОЙ МИКРОБИОЛОГИИ»

ТЕЗИСЫ

26 – 27 ОКТЯБРЯ 2009 г.

Москва – 2009

3

СЕКЦИЯ I

РАЗНООБРАЗИЕ И ФИЗИОЛОГИЯ МИКРООРГАНИЗМОВ

ВИДОВОЕ РАЗНООБРАЗИЕ АКТИНОМИЦЕТОВ РОДА KRIBBELLA

А. Н. Автух1, Н. В. Присяжная2

, Н. В. Василюк2, А. С. Шашков3

, Н. Г. Винокурова1,

Ф. М. Хасаева2, Л. М. Барышникова1

1Институт биохимии и физиологии микроорганизмов им. Г.К. Скрябина РАН, Пущино, Россия

2Московский государственный университет им. М.В. Ломоносова, Москва, Россия 3Институт органической химии им. Н.Д. Зелинского РАН, Москва, Россия

Род Kribbella принадлежит к семейству Nocardioidaceae порядка Actinomycetales.

Представители разных видов рода Kribbella образуют воздушный и разветвленный субстратный мицелий с тонкими гифами, содержат LL-диаминопимелиновую кислоту в клеточной стенке и имеют высокую степень сходства по 16S рРНК (до 99,5%). От видов рода Nocardioides криббеллы отличаются наличием фосфатидилхолина в составе фосфолипидов и менахинонами МК-9(Н4).

В работе использовали 15 штаммов актиномицетов, выделенных из образцов почв и лиственного опада различных районов Центральных областей РФ, Кавказа и Урала. Изученные штаммы имели 97–99% сходства нуклеотидных последовательностей 16S рРНК генов между собой и с типовыми штаммами известных видов рода.

Результаты исследования морфологических, хемотаксономических и физиолого-биохимических характеристик (рост на различных источниках углерода, разложение сложных органических соединений, рост при различных значениях pH, температуры, концентрации солей, рост в аэробных и анаэробных условиях), а также масс-спектрометрический анализ пептидов (MALDI–TOF) позволяют предполагать, что изученные штаммы относятся не менее чем к 7 новым видам рода Kribbella. Штаммы потенциально новых видов характеризуются уникальным сочетанием физиолого-биохимических признаков, необычным составом полисахаридов клеточных стенок, в состав которых входят псевдаминовая кислота (5,7-диамино-3,5,7,9-тетрадеокси-L-глицеро-L-манно-нонулозоновая кислота), бутират, мадуроза (3-O-метил-D-галактоза), 2,3-ди-O-метил-D-галактоза и др., а также набором полярных липидов, включающих неописанные ранее компоненты. Вопрос о видовой принадлежности штаммов будет решен на основании сопоставления полученных фенотипических характеристик и данных ДНК-ДНК гибридизации геномной ДНК.

4

РАСТЕНИЯ КАК ВОЗМОЖНЫЕ РЕЗЕРВУАРЫ

ПАТОГЕННЫХ ДЛЯ ЧЕЛОВЕКА БАКТЕРИЙ

А. Л. Алексеенко, Ю. А. Маркова, И. А. Граскова,

Ю. В. Омеличкина, Т. Н. Шафикова, А. С. Романенко

Сибирский институт физиологии и биохимии растений СО РАН, Иркутск, Россия

В природных условиях растения вынуждены существовать с огромным количеством различных видов микроорганизмов. Некоторые из них способствуют росту и урожайности растений, другие являются патогенами. Среди такого разнообразия обнаруживаются и патогенные для человека бактерии, которые могут попадать в растение через поливную воду, удобрение, руки рабочих, а также сохраняться в семенах и реализовывать свой патогенный потенциал в следующих поколениях [1, 2]. Это, главным образом, касается энтеробактерий, вызывающих вспышки кишечных заболеваний во многих странах мира.

В связи с этим, целью наших исследований стало изучение особенностей колонизации растений картофеля in vitro Escherichia coli (E. coli) (штамм XL-1Blue), а также выявление ответных реакций растений картофеля Solanum tuberosum и табака Nicotiana tabacum на внедрение этого микроорганизма. Исследования по взаимодействию Clavibacter

michiganensis ssp. sepedonicus (Cms) (штамм CsR14), вызывающей кольцевую гниль клубней картофеля, с растениями картофеля, ведется в лаборатории фитоиммунологии СИФИБР СО РАН много лет, что определило выбор объекта для сравнения с E. coli.

При изучении особенностей колонизации E. coli картофеля in vitro было установлено, что бактерии уже через сутки достигали верхушки растения. Интересным моментом было то, что бактерии не вызывали симптомы болезни (некрозы, хлороз листьев), в то время как зараженные растения отставали в росте по сравнению с контрольными [3]. Результаты определения динамики активности пероксидазы у картофеля показало, что в корнях защитная реакция наступает через 15 минут после заражения. Особый интерес представляют результаты, полученные при исследовании активности пероксидазы верхушечной части стебля растения. Ее изменение через 15-30 минут после заражения как Cms, так и E. coli, когда микроорганизмы еще не успели распространиться по растению, свидетельствует о системной защитной реакции растения.

Для наблюдения генерации активных форм кислорода (АФК) в ходе взаимодействия растения с патогеном удобной модельной системой служит суспензионная культура клеток. Для эксперимента использовалась суспензионная культура картофеля сорта Жуковский ранний. Пик образования АФК при инокуляции E.coli приходился на 40 минут после заражения. При взаимодействии с Cms через 40 минут уровень H2O2 также возрастал, но при этом его количество было примерно в два раза меньше. Таким образом, образование АФК у картофеля при взаимодействии с E. coli происходит более интенсивно, чем с Cms. Возможно, это связано с неспецифическим окислительным «взрывом», который возникает при несовместимых взаимодействиях.

При заражении суспензионной культуры клеток табака E. coli и Cms наблюдалось двухфазное повышение уровня АФК, причем при первом повышении концентрация в обоих вариантах была практически одинакова. Такое повышение уровня АФК, по-видимому,

5

связано с неспецифическим «взрывом», так как ни для одной из исследуемых бактерий табак не является хозяином.

Для выяснения действия E. coli также использовали растения табака in vitro. Ранее в нашей лаборатории было показано, что Cms вызывала локальные некрозы на листьях табака. Представляло интерес исследовать реакции табака при заражении E. coli. Листья растений инокулировали бактериальной суспензией. Спустя 5 дней после нанесения капли бактериальной суспензии E. coli на поверхность листовой пластинки табака, некротических пятен не наблюдалось. В варианте с предварительно зараженным Cms табаком, а затем инокулированным E. coli через 5 дней обнаруживались значительные некрозы в местах нанесения E. coli. Возможно, такая реакция связана с развитием у растения системного ответа.

Таким образом, патогенная для человека Escherichia coli способна проникать и распространяться в растении картофеля. В свою очередь растение системно реагирует на вторжение данного микроорганизма. Возникает ответная реакция в виде окислительного «взрыва», причем по сравнению с окислительным «взрывом», возникающим в ходе совместимых взаимодействий фитопатогенной бактерии с растением-хозяином он более выражен. По сравнению с окислительным «взрывом» несовместимых взаимодействий, его интенсивность практически не отличалась.

1. Guo, X., J. Chen, R. E. Brackett, L. R. Beuchat. 2001. Survival of salmonellae on and in

tomato plant from the time of inoculation at flowering and early stages of fruit development through fruit ripening // Appl.Environ. Microbiol. V.68. P.4760-4764.

2. Ingham S. C., Losinski J.A., Andrews M.P., Breuer J.E., Breuer J.R., Wood T.M., T.H.

Wright. 2004. Escherichia coli Contamination of Vegetables Grown in Soils Fertilized with Noncomposted Bovine Manure: Garden-Scale Studies // Appl. and Environ. Microbiology, V.70. No. 11. P. 6420-6427.

3. Маркова Ю.А., Романенко А.С., Алексеенко А.Л., Саляев Р.К. Колонизация растений картофеля in vitro условно-патогенной бактерией Escherichia coli ApPTZ19 // Доклады РАН. 2008. Т. 420. № 2. С. 279 – 281.

ИЗМЕНЕНИЕ МЕТАБОЛИЧЕСКОЙ АКТИВНОСТИ КОРНЕЙ ПШЕНИЦЫ

ПОД ВЛИЯНИЕМ ЛЕКТИНОВ АЗОСПИРИЛЛ

С. А. Аленькина1, О. И. Наконечная2

, Матора Л.Ю.1, В. Е. Никитина1

1Институт биохимии и физиологии растений и микроорганизмов РАН, Саратов, Россия 2Саратовский государственный университет, Саратов, Россия

К настоящему времени многие аспекты функционирования ассоциативных симбиозов

остаются неясными и неизученными, что тормозит процесс понимания и осмысления этого интереснейшего явления природы. К числу совершенно не изученных вопросов относится вопрос о молекулярных сигналах, лежащих в основе формирования и успешного функционирования ассоциативного симбиоза. Неясным является вопрос о том, как влияют макропартнер и микропартнер друг на друга.

6

В этой связи большой интерес представляют лектины, т.к. известно, что они выполняют информационные функции в различных биологических системах. В частности, в ассоциации пшеница-азоспирилла интересны в этом отношении лектины азоспирилл.

Ранее с поверхности клеток Azospirillum brasilense Sp7 и его мутанта по лектиновой активности Azospirillum brasilense Sp7.2.3 были выделены лектины, являющиеся гликопротеинами с молекулярной массой 36 кDa, проявляющие специфичность к L-фукозе и к D-галактозе. Лектин мутантного штамма имел структурные и антигенные различия с лектином родительского штамма [1]. Было показано, что лектины азоспирилл способны не только осуществлять наряду с другими факторами адгезию - "заякоривание" белков на мембранах растительной клетки, но также стимулировать прорастание семян, проявлять по отношению к растительной клетке митотическую и ферментмодифицирующую активности [2, 3]. Все эти факты позволили предположить, что лектины азоспирилл могут играть роль вещества-сигнала для растительной клетки.

Ответом на многие биотические и абиотические воздействия может быть резкое увеличение образования растительными клетками перекиси водорода. Синтез перекиси водорода – один из наиболее быстрых ответов растительной клетки на индуцирующие воздействия. Считается, что основным источником перекиси водорода в клетках растений является дисмутация молекулы кислорода, катализируемая супероксиддисмутазой. Однако в последнее время большой интерес вызывают альтернативные пути образования перекиси водорода с помощью пероксидазы и оксалатоксидазы. Среди индукторов, способных вызывать быструю продукцию Н2О2 в клетках растений, наиболее хорошо исследована активность гликопротеинов, входящих в состав клеточных стенок многих фитопатогенных организмов[4]. Для оценки способности лектинов A. brasilense Sp7 и его мутанта по лектиновой активности A. brasilense Sp7.2.3 индуцировать активность пероксидазы и оксалатоксидазы в корнях проростков пшеницы были взяты корни 3-х суточных проростков пшеницы Саратовская 29. Об активности ферментов судили по интенсивности окисления ОФД. Как показали результаты исследований, лектины обоих штаммов во всех изучаемых концентрациях (оценивали три концентрации – 10, 20 и 40 мкг/мл) вызывали увеличение активности пероксидазы, но только в том случае, когда время выдерживания корней с лектинами составляло 20 мин (изучались временные интервалы 10 и 20 мин). Самой эффективной концентрацией для обоих лектинов явилась концентрация 40 мкг/мл. Лектин родительского штамма вызывал увеличение пероксидазной активности в большей степени, чем лектин мутантного штамма. 10-минутная обработка корней проростков растений препаратами лектинов вызывала активацию оксалатоксидазы. Лектины родительского и мутантного штамма проявляли различия. Если лектин родительского штамма при указанной экспозиции вызывал эффект при концентрации 10 мкг/мл, лектин же мутантного штамма – при 20 мкг/мл. Так, активность для родительского и мутантного штаммов составила через 8 мин после инициации реакции 11,2 ± 1,3 и 7,2 ± 0,5 ед. на 1 г сырой массы, соответственно, в контрольных проростках, т.е. не инкубированных с лектинами она была 6,0 ± 0,2 ед.

К настоящему времени накоплен большой экспериментальный материал о функционировании аденилатциклазной сигнальной системы в растениях. Аденилатциклазная сигнальная система участвует в формировании функциональных и структурных ответов организма на внешние раздражители. Об активности данной системы преимущественно

7

судят по количеству эндогенного цАМФ. Влияние лектинов родительского и мутантного штаммов на изменение содержания ц-АМФ в клетках корней проростков изучали методом иммуноферментного анализа. В результате было показано, что лектин родительского штамма вызывал снижение концентрации цАМФ в растительных клетках на 30, 25 и 27% для 15, 30 и 60 мин инкубации, соответственно. Аналогичная зависимость была обнаружена для лектина мутантного штамма. Лектин также проявлял ингибирующий эффект, хотя уровень выраженности эффекта был несколько ниже по сравнению с лектином родительского штамма.

Полученные данные свидетельствуют о том, что лектины азоспирилл могут изменять метаболизм растения в направлении, благоприятном для роста и развития путем регулирования содержания цАМФ и перекиси водорода.

1. Аленькина С.А., Петрова Л.П., Никитина В.Е. Микробиология. 1998. T. 67. N.6. C.782-

787. 2. Никитина В.Е., Богомолова Н.В., Пономарева Е.Г., Соколов О.И. Известия АН. Серия

биологическая. 2004. №4. С.431-435. 3. Alen’kina S.A., Payusova O.A., Nikitina V.E. Plant and Soil. 2006.V.283. № 1-2. P. 147-151. 4. Хайруллин Р.М., Яруллина Л.Г., Трошина Н.Б., Ахметова И.Э. Биохимия. 2001. Т. 66. В.

3. С.354-358.

ИНАКТИВЦИЯ ГЕНА ГЛУТАМИЛЭНДОПЕПТИДАЗЫ

В ГЕНОМЕ BACILLUS INTERMEDIUS

А. И. Ахметова, А. Р. Каюмов, М. Р. Шарипова

Казанский государственный университет им. В.И.Ульянова-Ленина, Казань, Россия Глутамилэндопептидаза из Bacillus intemedius была впервые выделена и очищена в

нашей лаборатории. Ген фермента клонирован и секвенирован. Ранее было показано, что фермент имеет два пика накопления активности в стационарной фазе роста. Экспрессия гена протеиназы контролируется двухкомпонентной системой DegS/DeqU, системой Spo0A фосфопередачи, глабальных регуляторов CodY и CcpA. Однако вопрос о физиологической роли фермента остается открытым. Одним из подходов к выяснению функции белка в клетке является инактивация его гена и сравнительное изучение исходного и мутантного штаммов в различных условиях.

Целью работы явилась инактивация гена глутамилэндопептидазы в клетках B.

intermedius 3-19. В работе решались следующие задачи: создание рекомбинантной последовательности ДНК для инактивации гена глутамилэндопептидазы в штамме B.

intermedius 3-19 и получение мутантного штамма с нокаутированным геном фермента. Для инактивации гена протеиназы было выбрано 2 подхода. В первом случае с

помощью ПЦР синтезировали последовательность ДНК, содержащую ген глутамилэндопептидазы. В качестве матрицы была использована плазмида pD58.21, содержащая полный клонированный ген фермента. Полученный амплификат клонировали в бациллярный вектор pUP110 по сайтам BamHI и HindIII для образования плазмиды pUPG.

8

Лигазной смесью трансформировали лабораторный штамм B. subtilis BJ2036, из хромосомы которого делетированы гены внеклеточных протеиназ. Из полученных колоний, образующих зоны гидролиза казеина, выделяли плазмиды и проводили реакцию амплификации с праймерами, гомологичными к последовательности гена gseBi. Плазмиды, давшие положительный результат, рестрицировали и анализировали на наличие протеолитической активности по гидролизу субстрата, специфичного для глутамилэндопептидазы, что подтверждает наличие активного гена глутамилэндопептидазы на плазмиде pUPG. Полученную плазмиду pUPG рестрицировали по сайту EcoRV и использовали для трансформации в B. intermedius 3-19.

В случае положительной гомологичной рекомбинации между хромосомой B.

intermedius 3-19 и полученной линейной ДНК ген глутамилэндопептидазы должен вырезаться из генома бактерии. При этом встраивание гена устойчивости к антибиотику (канамицину) не определено и происходит с очень низкой частотой. В нашем случае не удалось получить рекомбинантные штаммы на селективной среде с канамицином. Поэтому было решено использовать другой подход к нокаутированию гена глутамилэндопептидазы, а именно получить конструкцию ДНК, в которой ген устойчивости к антибиотику находится внутри открытой рамки считывания гена.

Полученный с плазмиды pD58.21 амплификат, несущий ген глутамилэндопептидазы, рестрицировали по сайтам BamHI и HindIII и лигировали в вектор pUC19, рестрицированный по этим же сайтам для конструирования вектора pUCG. Лигазной смесью трансформировали штамм E. coli XL1 Blue. Из колоний, не образующих синюю окраску на среде с IPTG и X-Gal, выделяли плазмидную ДНК и анализировали ее размер в агарозном геле по сравнению с исходным вектором. Отобрали клоны, плазмиды которых имели больший молекулярный вес, чем исходный вектор. Проводили реакцию амплификации с праймерами к гену глутамилэндопептидазы. В случаях, где был получен положительный результат, свидетельствующий о наличии вставки ДНК, несущей ген глутамилэндопептидазы, проводили рестрикцию по сайтам BamHI и HindIII и получали два фрагмента, один из которых соответствует ожидаемому размеру остатка вектора pUC19, а второй имеет молекулярный вес несколько меньше, чем исходный ампификат гена gseBi. Это объясняется тем, что при рестрикции продукта амплификации происходит его укорочение на 100 п.о.

На следующем этапе амплифицировали ген устойчивости к эритромицину с плазмиды pCB22 и клонировали в предварительно рестрицированные по сайту EcoRV, находящемуся в открытой рамке считывания гена gseBi, плазмиды pUCG. С клонов имевших молекулярную массу выше исходной pUCG проводили ПЦР с праймеров, комплементарных к гену эндопептидазы, к гену устойчивости к эритромицину. Полученные плазмиды рестрицировали по уникальному сайту HindII в гене устойчивости к эритромицину. При рестрикции по сайтам BamHI и HindIII образуется два фрагмента, один из которых соответствует остатку плазмиды pUC19, а второй имеет вес 2.4kb соответствующий гену gseBi со вставкой гена EmR. Этот фрагмент выделяли из геля и использовали в качестве нокаутирующей конструкции при трансформации в штамм B. intermedius 3-19

В результате трансформации были получены клоны, которые анализировали на наличие протеолитической активности на синтетическом субстрате, специфичном для глутамилэндопептидаз. Активность клонов была нулевой. Для подтверждения нокаута гена

9

глутамилэндопептидазы проводили ПЦР – анализ на наличие в геномной ДНК гена устойчивости к эритромицину. Таким образом, нами получен штамм B. intermedius с инактивированным геном глутамилэндопептидазы.

РОЛЬ ПОЛИАМИНОВ В ЗАЩИТЕ БАКТЕРИАЛЬНОЙ ДНК

ОТ ПОВРЕЖДАЮЩЕГО ДЕЙСТВИЯ ФТОРХИНОЛОНОВ

А. В. Ахова, М. С. Шумков, Е. В. Зырянова

Институт экологии и генетики микроорганизмов УрО РАН, Пермь, Россия

Известно, что основной мишенью для антибиотиков из группы фторхинолонов в клетках E. coli является ДНК-гираза, а одним из аспектов бактерицидного действия – фрагментация ДНК. В наших экспериментах in vivo левофлоксацин аналогичным образом вызывал фрагментацию плазмидной ДНК (pBR322), что выражалось в появлении на электрофореграмме фрагментов плазмидной ДНК в виде «шмера», причем степень расщепления зависела от концентрации антибиотика.

Мы обнаружили, что в ответ на добавку фторхинолоновых антибиотиков в клетках Escherichia coli индуцируется активность полиаминсинтезирующей системы, в частности орнитиндекарбоксилазы. Возрастание активности орнитиндекарбоксилазы, которая является ключевым ферментом синтеза путресцина и спермидина, приводило к накоплению данных полиаминов в бактериальной клетке.

Полиамины, являясь поликатионами, способны взаимодействовать с нуклеиновыми кислотами. Среди природных полиаминов именно путресцин и спермидин (благодаря особому расположению положительных зарядов в молекуле) обладают наибольшим сродством к ДНК. Связывание полиаминов приводит к компактизации молекулы ДНК и более прочному удерживанию комплементарных нитей от расхождения. Повышение синтеза путресцина и спермидина в ответ на добавку фторхинолонов могло бы быть адаптивной реакцией, направленной на предохранение ДНК.

Для выявления роли полиаминов в защите бактериальной ДНК путресцин, кадаверин и спермидин вносили в культуры с добавкой левофлоксацина. Мы установили, что путресцин и спермидин оказывали протекторное действие на плазмидную ДНК, практически полностью нивелируя разрушающее действие антибиотика. В то же время другой исследованный полиамин – кадаверин – даже несколько усиливал повреждающее действие фторхинолона.

Предполагается, что фрагментация ДНК является следствием взаимодействия фторхинолона с ДНК-гиразой и ДНК, сопровождающегося формированием тройного комплекса. Возможно, полиамины, присоединяясь к ДНК, каким-либо образом препятствуют его образованию.

С другой стороны, повреждение ДНК может быть вызвано активными формами кислорода (АФК), роль которых в противомикробном действии широкого спектра антибиотиков в настоящее время обсуждается все чаще. Наибольший вред нуклеиновым кислотам наносит гидроксильный радикал, образующийся в реакции Фентона при участии металлов с переменной валентностью. Полиамины могут вступать в конкурентные

10

взаимоотношения с катионами металлов и вытеснять их с мест связывания с ДНК, отводя, таким образом, продукты реакции Фентона от мишени. Наряду со способностью полиаминов компактизировать нуклеиновые кислоты, вытеснение ионов металлов с переменной валентностью ограничивает доступ АФК к ДНК.

Кроме того, обнаруженное нами протекторное действие полиаминов может быть связано с их способностью непосредственно улавливать АФК.

Предположение, что в основе протекторного действия полиаминов могут лежать их антиоксидантные свойства, подтверждается исследованием уровня экспрессии гена soxS. Данный ген кодирует транскрипционный регулятор генов адаптации к окислительному стрессу, и уровень его экспрессии прямопропорционален количеству супероксида в клетке. Сублетальные концентрации антибиотиков вызывали индукцию soxS. Добавка путресцина и спермидина в этих условиях снижала экспрессию soxS, что свидетельствует о снижении количества АФК в их присутствии. Добавка же кадаверина не изменяла экспрессию soxS, индуцированную антибиотиком.

В конечном итоге протекторное действие полиаминов сопровождалось повышением устойчивости E. coli к антибиотикам. Так в культурах с добавкой левофлоксацина в концентрации, приводящей практически к полной гибели клеток к 6 часу культивирования, в присутствие путресцина количество жизнеспособных клеток достигало 20%. Определение минимальных ингибиторных концентраций методом двукратных серийных разведений также показало, что в присутствие полиаминов происходит повышение антибиотикоустойчивости E. coli. МИК левофлоксацина и соответственно антибиотикоустойчивость возрастала с увеличением концентрации добавляемого полиамина, причем максимальный эффект также оказывали путресцин и спермидин.

Таким образом, полиамины путресцин и спермидин, уменьшая повреждающее воздействие фторхинолонов на ДНК, способствуют повышению устойчивости E. coli к антибиотикам данного класса.

Работа выполнена по программе МКБ Президиума РАН и поддержана грантом РФФИ №09-04-99006-р-офи.

11

ИЗМЕНЕНИЕ ФАКТОРОВ ПАТОГЕННОСТИ МИКРООРГАНИЗМОВ

ПОД ВЛИЯНИЕМ ВНЕШНИХ УСЛОВИЙ

Ю. М. Бардаева, Е. А. Жигалова, Ю. В. Журавлева

Иркутский государственный медицинский университет, Иркутск, Россия

В процессе эволюции представители мира микробов, переходя на симбиотические взаимоотношения, адаптировались к существованию в организме человека. Являясь открытой саморегулирующей биологической системой – «макроорганизм и его микрофлора», способна противостоять в пределах нормы реакции изменяющимся условиям внешней среды и колебаниям плотности микробных популяций. Вместе с тем, многочисленные и разнообразные факторы внешней среды могут приводить с одной стороны к нарушению гомеостатического равновесия в организме человека, а с другой – к стрессовому воздействию на микрофлору. Это ведет к микроэкологическим нарушениям, которые нередко служат запускающим механизмом возникновения, а в последующем и поддерживают патологические процессы, возникающие в организме человека под влиянием инфекционных агентов.

В связи с этим целью представленной работы явилось изучение влияния факторов внешней среды на изменчивость патогенного потенциала в структуре микробных популяций, вызывающих инфекционные заболевания у человека. В качестве объектов исследования были выбраны бактерии рода Staphylococcus и дрожжеподобные грибы рода Candidae, принадлежащие к нормальной микрофлоре человека, а также простейшее семейства Тrichomonadidae, отнесенная к классическим патогенам.

В ходе исследования была установлена взаимосвязь между цитоморфологической формой Тrichomonas vaginalis и клиническим состоянием больного. У 21% больных возбудитель трихомонадной инфекции имел грушевидную форму и преимущественно встречался при остро протекающей форме заболевания. У больных с хроническим течением инфекции были выделены атипичные формы возбудителя, среди которых округлая и овальная формы паразита обнаруживались соответственно у 36,0% и 15,0% обследованных. Достаточно часто отмечалось одновременное присутствие различных цитоморфологических форм возбудителя у одного обследуемого (25,3%). Амебоидные трихомонады встречались крайне редко (2,0%) у больных со стертым течением трихомонадной инфекции. Изменение морфологических форм возбудителя инфекционной болезни человека является результатом его защитной реакции на воздействие лекарственных препаратов, используемых для лечения, а также ответной реакции со стороны макроорганизма на внедрение возбудителя.

Микроэкосистема человека в норме имеет сбалансированный набор разных видов микроорганизмов, находящихся в состоянии близком к стационарному. Благодаря системе кооперации между микробными популяциями и человеком, выступает как единое целое и работает в их интересах. Так, в популяции здоровых людей выделены культуры S. aureus, обладающие факторами патогенности, спектр которых характеризовался большим разнообразием. 53,2% проанализированных культур S. aureus имели полный набор, определяемых факторов патогенности: лецитиназа, фибринолизин, гемолизины, ДНКаза, антилизоцимная активность. Сочетание трех факторов патогенности, в разных комбинациях,

12

было отмечено у 31,1% идентифицированных культур. Вместе с тем, среди выделенных штаммов 92,2%, по уровню вирулентности, дифференцированы как низко вирулентные штаммы. И только у 3,9% здоровых людей биотип S. aureus был охарактеризован как средне вирулентный.

В то же время, если по каким-либо причинам биологическая система выводится из состояния равновесия с превышением ее компенсаторных возможностей, то в микробиоценозе происходят сукцессионные изменения, способные формировать патологические состояния в организме человека. Качественные изменения в состоянии нормальной микрофлоры были обнаружены у онкологических больных. Было установлено, что частота встречаемости S. aureus, выделяемого из естественного биотопа у онкологических больных, не отличается от таковой у здоровых людей. Но степень гетерогенности у данной категории больных значительно ниже, чем в популяции S. aureus, выделенной от здоровых. Между качественными изменениями в микрофлоре и степенью злокачественности у онкологических больных установлена прямая корреляционная связь. Кроме того, штаммы S. aureus отличаются повышенной степенью вирулентности, а спектр выделенных факторов патогенности носит специфический характер. Сукцессии, особенно на ранних этапах развития онкологического заболевания, характеризуются быстрой сменой одних эковариантов другими, резкими изменениями численности в микробной популяции, нарушается взаимоотношения с иммунными механизмами, что и создает условия для развития патологического процесса. Микроэкологический дисбаланс в микробиоценозе может формировать клоны с повышенным потенциалом патогенности, устойчивые к действию антимикробных препаратов и другими свойствами.

В условиях внешнего воздействия возникают предпосылки для формирования «искусственных экосистем» с измененными параметрами среды обитания микроорганизмов. В таких условиях филогенетически сложившиеся взаимоотношения коактантов экологической системы «человек – микроорганизмы» претерпевают изменения. Одним из его проявлений может быть синдром нарушения колонизацонной резистентности, который ведет к развитию эндогенной инфекции, вызванной грибами рода Candidae и проявляющихся в виде поверхностных форм кандидозной инфекции. Среди клинических штаммов Candidae оценивалась их агрессивность в условиях действия разных температур. Полученные результаты свидетельствовали о том, что повышение температуры, подавляющее жизнедеятельность этих микроорганизмов, с другой стороны индуцирует не только большую устойчивость к факторам внешней среды, но и вызывает большую интенсивность их проявления.

На основании выше изложенного становится понятным, что важнейшей задачей экологической микробиологии является сохранение биоразнообразия в естественной микрофлоре человека. Механизм взаимодействия в биологической системе «макроорганизм и его микрофлора» носит симбиотический характер. При этом межвидовые взаимоотношения в биоценозах сложны, разнообразны и динамичны. Но их форма определяется биологическими свойствами микробов.

13

БИОРАЗНООБРАЗИЕ СУЛЬФАТРЕДУЦИРУЮЩИХ БАКТЕРИЙ

В ВОДАХ ЧЕРНОГО МОРЯ

А. Л. Брюханов1,2, В. А. Корнеева1

, Т. А. Канапацкий2, Е. Е. Захарова2

, Е. В. Менько2,

Н. В. Пименов2

1Московский государственный университет им. М.В. Ломоносова, Биологический факультет, кафедра микробиологии, Москва, Россия

2Институт микробиологии им. С.Н. Виноградского РАН, Москва, Россия

Черное море представляет собой самый большой в мире меромиктический водоем [Lin et al., 2006]. В центральной части аэробные воды простираются от поверхности до глубин около 100 м, тогда как исчезновение кислорода в водной толще континентального склона наблюдается в районе 130–170 м. Глубже границы аэробных и анаэробных вод в черноморских водах присутствует сероводород, концентрация которого на глубине 2000 м достигает 370 мкМ. Накопление H2S в водной толще Черного моря происходит, главным образом, в результате жизнедеятельности сульфатредуцирующих бактерий (CPБ) [Ivanov, Lein, 2006]. Наибольший интерес при исследовании биоразнообразия и интенсивности микробиологических процессов в Черном море представляет именно граница аэробных и анаэробных вод (так называемый хемоклин). В серии биогеохимических работ было показано, что в зоне хемоклина наблюдаются активные процессы микробной трансформации окисленных и восстановленных соединений серы [Pimenov, Neretin, 2006].

Считается, что CPБ являются строго анаэробными микроорганизмами, однако многие виды сульфатредукторов (в частности, представители рода Desulfovibrio) сохраняют жизнеспособность и даже метаболическую активность в поверхностных аэробных водах, обладая эффективными механизмами антиокислительной защиты [Dolla et al., 2006].

В данном исследовании был проведен анализ распространения СРБ в водах Черного моря с помощью метода гибридизации in situ с 16S рРНК-специфичными олигонуклеотидными зондами, меченными флуоресцентным красителем цианином 3 (метод FISH). Пробы воды отбирались с борта НИС «Профессор Штокман» в глубоководной зоне Черного моря в марте 2009. Для определения СРБ методом FISH, отобранные с глубин от 30 до 1940 м водные пробы фиксировали 4%-ным раствором формальдегида, концентрировали на поликарбонатных мембранных фильтрах Ø 25 мм (объем фильтрата составлял от 7 до 15 мл) и проводили гибридизации в рекомендованных условиях с олигонуклеотидными зондами. Общую численность микроорганизмов в пробах оценивали с помощью универсального ДНК-красителя ДАФИ в концентрации 0,5 нг/мкл. Микроскопический анализ осуществляли с использованием люминесцентного микроскопа AxioImager.D1 (Carl Zeiss, Германия) с цифровой камерой AxioCam HRc. Кроме того, проводили FISH анализ накопительных культур сульфатредуцирующих бактерий, полученных из водных проб с глубин 30, 70 и 180 м.

В работе использовали следующие зонды в концентрации 50 нг/мкл: DSV214 (на большинство Desulfomicrobium), DSV1292 (на некоторые Desulfovibrio), DSV698 (на некоторые Desulfovibrio), SRB385 (на большинство Desulfovibrionales), Dtm229 (на

14

Desulfotomaculum cluster I), DSB129 (на большинство Desulfobacter) и DSB985 (на Desulfobacter, Desulfobacula, Desulfospira и Desulfotignum).

В аэробной зоне на глубине 30 м были обнаружены СРБ родов Desulfotomaculum и Desulfovibrio. Иная картина наблюдалась в пробах, отобранных с глубины 115 м, где содержание O2 не превышает 0,1 мг/мл. Здесь преобладали представители рода Desulfomicrobium (они же обнаруживались в относительно большом количестве и в накопительных культурах, полученных из проб с глубины 70 м). Однако необходимо отметить, что количество обнаруженных СРБ как в поверхностных водах, так и на глубинах в районе хемоклина было значительно меньше, чем в водных пробах, отобранных в летний период на континентальном склоне в районе Геленджика.

Присутствие жизнеспособных СРБ в аэробных водах Черного моря коррелирует с данными гидрохимиков [Волков и др., 1992], которые отмечали следы восстановленных форм серы в аэробной зоне моря. 1. Lin X., Wakeham S.G., Putnam I.F., Astor Y.M., Scranton M.I., Chistoserdov A.Y., Taylor

G.T. Comparison of vertical distributions of prokaryotic assemblages in the anoxic Cariaco Basin and Black Sea by use of fluorescence in situ hybridization // Appl. Environ. Microbiol. 2006. V. 72. No. 4. P. 2679-2690.

2. Ivanov M., Lein A. In “Past and present water column anoxia.” / NATO Science series. Ed. L. Neretin 2006. Springer. Fractionation of stable isotopes of carbon and sulfur during biological processes in the Black Sea. P. 373-418.

3. Pimenov N., Neretin L. In “Past and present water column anoxia.” / NATO Science series. Ed. L. Neretin 2006. Springer. Composition and activities of microbial communities involved in carbon, sulfur, nitrogen and manganese cycling in the oxic/anoxic interface of the Black Sea. P. 501-522.

4. Dolla A., Fournier M., Dermoun Z. Oxygen defence in sulfate-reducing bacteria // J. Biotechnol. 2006. V. 126. No. 1. P. 87-100.

5. Волков И.И., Розанов А.Г., Демидова Т.П. Соединения неорганической восстановленной серы и растворенный марганец в воде Черного моря. Ред. М.Е. Виноградов. / Зимнее состояние экосистемы открытой части Черного моря. 1992. ИО РАН. Москва. С. 38-50.

15

СЕРОЛОГИЧЕСКОЕ РАЗНООБРАЗИЕ

ПОЧВЕННЫХ АССОЦИАТИВНЫХ БАКТЕРИЙ РОДА AZOSPIRILLUM

Г. Л. Бурыгин1, Ю. А. Филипьечева2

, А. Е. Беляков1, И. А. Попова2

, Э. В. Шувалова2,

Л. Ю. Матора1,2

1Институт биохимии и физиологии растений и микроорганизмов РАН, Саратов, Россия 2Саратовский государственный университет им. Н.Г. Чернышевского, Саратов, Россия

Почвенные азотфиксирующие бактерии рода Azospirillum являются модельным

объектом в исследовании феномена ассоциативности благодаря их способности увеличивать продуктивность сельскохозяйственных растений. Предполагается существование нескольких возможных факторов стимулирующего действия азоспирилл на растение: азотфиксация, гормональный эффект, общее улучшение роста корней, нитратредукция, улучшение минерального и водного питания растений, а также подавление развития растительных патогенов. При этом данные бактерии не проявляют жёсткой специфичности по отношению к растению-хозяину и являются основными колонизаторами корней многих растений

Мажорные антигены азоспирилл играют определяющую роль в начальных этапах формирования симбиоза с растением-партнёром. Так, специфическое распознавание бактериальных антигенов растением в процессе формирования симбиоза обеспечивает успешное взаимодействие симбионтов.

Целью данной работы было изучение разнообразия штаммов азоспирилл и закономерностей их распространения в почвах Юго-Востока России. Были проведены исследования иммунохимических свойств поверхностных антигенов 60-ти штаммов азоспирилл, относящихся к четырем видам: A. amazonense, A. brasilense, A. irakense и

A. lipoferum. Родоспецифичные антитела, полученные на интактные клетки типового штамма A.

brasilense Sp7, выявляли в экстрактах наружных мембран всех исследованных штаммов консервативные термолабильные белковые антигены. Термостабильный Н-антиген азоспирилл – гликозилированный флагеллин полярного жгутика – продемонстрировал, с одной стороны, высокую консервативность белковых детерминант, а с другой – штаммовую вариабельность антигенных свойств углеводных фрагментов исследованных флагеллинов.

Анализ результатов изучения разнообразия липополисахаридов (О-антигенов) азоспирилл позволил разделить на 4 группы каждый из видов A. brasilense и A. lipoferum. При этом в каждом из этих видов выявлено по 5 штаммов, не имеющих антигенных перекрёстов с О-антигенами модельных штаммов, но взаимодействующих с родоспецифичными антителами. Для видов A. brasilense (33 штамма) и A. lipoferum

(19 штаммов) предложена система серотипирования штаммов, основанная на способности и характере взаимодействия липополисахаридов с антителами к О-антигенам 5 модельных штаммов азоспирилл.

Два исследованных нами штамма A. irakense оказались иммунохимически близкими между собой, но отличались от представителей других видов. Так, они с одинаковой интенсивностью взаимодействовали с антителами к О-антигену типового штамма A. irakense KBC-1, а родоспецифичные антитела выявляли только по одному термолабильному

16

белковому антигену в экстрактах их наружных мембран. Также серологически обособленным оказался и единственный изученный нами представитель вида A. amazonense

штамм Am14. Полученные данные говорят о широкой вариабельности углеводных детерминант

наружной мембраны азоспирилл и весьма высокой консервативности мажорных белковых антигенов данных бактерий. Эти результаты были использованы для иммунохимического выявления азоспирилл в различных почвах Юго-Востока России с применением антител к О-антигенам модельных штаммов.

Было проведено исследование распространённости представителей серологических групп азоспирилл в основных типах почв Саратовской области (солонец, аллювиальная, серая лесная, чернозём типичный и чернозём южный) методом сравнительного иммуноферментного анализа почвенных суспензий. Было обнаружено, что для всех проанализированных почв характерно преобладание антигенов азоспирилл, относящихся к серотипу модельного штамма Sp245, при этом чернозём южный и серая лесная почва демонстрировали наибольший уровень выявления этих детерминант. В то же время, чернозём южный отличался также более заметным присутствием антигенов серотипа штамма Sp7.

Таким образом, иммунохимический подход к изучению разнообразия азоспирилл позволил разделить штаммы на серотипы и идентифицировать представителей этих серотипов в почвенных суспензиях.

Работа поддержана грантом Президента РФ НШ-3171.2008.4.

ВЫДЕЛЕНИЕ И ХАРАКТЕРИСТИКА

БАКТЕРИЙ–СИМБИОНТОВ МИКРОНУКЛЕУСОВ ИНФУЗОРИЙ

PARAMECIUM BURSARIA И PARAMECIUM CAUDATUM

Н. Д. Ваккеров–Коузова1, М. С. Раутиан2

1Агрофизический институт, Санкт-Петербург, Россия 2Санкт-Петербургский государственный университет, Санкт-Петербург, Россия

Инфузории рода Paramecium являются хозяевами разнообразных внутриклеточных

бактерий. Местом локализации симбионтов могут быть как цитоплазма, так и оба ядра хозяина – макронуклеус (МА) или микронуклеус (МИ). Внутриядерные бактерии впервые были описаны почти 120 лет назад Владимиром Хавкиным [Hafkin, 1890], который и дал название роду Holospora. Оказалось, что внутриядерные бактерии проявляют специфичность не только к виду, но и к типу ядра: каждый вид Holospora обитает в определенном виде парамеций и только в одном из ядер – МА или МИ.

Для Holospora характерен сложный жизненный цикл, в котором представлены две основные формы: репродуктивные (вегетативные, РФ) и инфекционные (ИФ). Репродуктивные формы способны к делению, они попадают в дочерние ядра при делении клетки-хозяина, обеспечивая вертикальную передачу симбионта. Они дифференцируются в неделящиеся инфекционные формы, которые могут выводиться из клетки парамеции и

17

заражать новых хозяев, обеспечивая, таким образом, горизонтальную передачу симбионтов [Осипов, 1981]. Формирование инфекционных форм сопряжено со сложной цитодифференцировкой, включающей, в частности, значительную гипертрофию периплазматического пространства, которое у зрелой ИФ занимает до половины клетки. После проникновения бактерий в ядро, периплазма вновь сокращается.

В настоящее время описано девять видов рода Holospora. Секвенирование полноразмерного гена 16S рРНК для H. obtusa и фрагмента гена для H. elegans показало, что они относятся к Alphaproteobacteria [Amann et al., 1990], формируя самостоятельную ветвь, рано дивергировавшую от основного ствола Rickettsia [Emelyanov, 2003]. Показано, что геномы голоспор представлены единственной хромосомой и не содержат естественных плазмид [Тимофеева и Раутиан, 1997]. Размер генома небольшой для грамотрицательных бактерий и варьирует у разных видов от 1,2 Mb до 2 Mb.

В литературе высказывались предположения об искусственном объединении в роде Holospora неродственных бактерий [Fokin, 1997]. Однако анализ нуклеотидных последовательностей 16S рДНК для нескольких изолятов ранее не исследованных видов рода показал, что они формируют компактную в эволюционном отношении группу внутри порядка Rickettsiales [Rautian and Wackerow-Kouzova, 2007]. Также нами было показано, что в исследуемой симбиотической системе сначала сформировалась видовая специфичность партнеров, а затем, внутри вида и независимо в каждом виде хозяина дивергировали виды симбионтов, специфичные к разным ядрам – микронуклеусу и макронуклеусу.

В настоящей работе мы получили и проанализировали последовательности гена, кодирующего 16S рДНК, для изолятов микронуклеусов двух видов инфузорий - P.caudatum и P. bursaria, а именно для H. undulata, H. elegans, H. recta и H. acuminata. Для изолятов H. undulata было выявлено отличие по 1 из 1492 нуклеотидов. Различия между разными видами Holospora составляет от 3% (48 замен H .curviuscula vs. H. undulata) до

1,6 один штамм H. elegans. Полученная нами последовательность 16S рДНК (1235 п.н.) отличалась на 1 и на 2 нуклеотида (< 0,01% и 0,015%, соответственно) от последовательностей двух изолятов H. undulata. Сравнение полученной последовательности с небольшим фрагментом (346 п.н.) 16S рДНК H. elegans в BLAST показал, что этот фрагмент полностью идентичен соответствующему фрагменту нашей последовательности. Исследованный изолят H .recta также имел отличие только по одному нуклеотиду от H. elegans из GenBank. Полученные данные показывают, что уровень различий между H.

undulata, H. elegans и H. recta по крайней мере на два порядка меньше уровня межвидовых различий. Это позволяет нам предположить, что они представляют собой один вид. То, что H. undulata, H. elegans и H. recta в действительности представляют один вид мы предполагали ранее, т.к. они выделены на основании только морфологических отличий инфекционных форм (ИФ) этих симбионтов: ИФ извитые или прямые. В нашей коллекции линий симбионтов был представлен клон Holospora undulata, популяция симбионтов в котором была представлена смесью прямых и извитых ИФ бактерий. Используя метод предельных разведений, была экспериментально получена клетка P. caudatum, инфицированная единственной извитой формой. Процесс инфекции контролировался под микроскопом с интерференционным контрастом Номарского и хорошо документирован. Полученный от этой клетки клон первоначально содержал лишь извитые ИФ, но затем

18

начали появляться и прямые, доля которых постепенно возрастала. Таким образом, прямые ИФ могут образовываться у обычных H. undulata, возможно, в результате геномных перестроек. H. acuminata, симбионт микронуклеуса другого вида инфузорий – P. bursaria, представлял собой отдельный вид, более близкий H. curviuscula.

МОНИТОРИНГ БАКТЕРИАЛЬНОГО РАЗНООБРАЗИЯ ПОЧВЫ

Н. Д. Ваккеров–Коузова, А. Ф. Петрушин

Агрофизический институт, Санкт-Петербург, Россия

Основную роль в процессах саморегуляции и самовосстановления любой экосистемы играет биота, т.е. совокупность всех её живых организмов. Биоразнообразие (качественный и количественный состав видов, составляющих экосистему) является критерием и признаком устойчивости экосистемы. Искусственно создать устойчивую экосистему, способную к саморегуляции и длительному поддержанию своего биологического разнообразия, практически невозможно, поэтому глобальной экологической проблемой современности является изучение и сохранение биоразнообразия природных экосистем.

Среди естественных местообитаний живых организмов почва, вследствие своей гетерогенности, является наиболее сложной для изучения средой. Гетерогенность почвы связана с тем, что она является полифункциональной трёхфазной системой и образуется в результате жизнедеятельности организмов и выветривания горных пород, т.е. биогенных и абиогенных факторов. Благодаря своим широким метаболическим возможностям микроорганизмы играют ключевую роль во всех процессах, протекающих в почве. Они участвуют в формировании гумуса, и, следовательно, плодородия почвы. Микроорганизмы принимают участие в химических превращениях основных биогенных элементов – C, N, H, O, P и S, которые входят в состав основных полимеров любой живой клетки. Их превращения в биосфере во многом определяют работу главного звена биологического цикла – образование первичной растительной продукции. Микроорганизмы энергично изменяют как органическую, так и минеральную часть почвы. Почвенные микроорганизмы влияют также на свойства почвенного покрова, например, поглотительную способность почвы, и в определённой степени влияют на её агрегатный состав, склеивая мелкие минеральные компоненты почвы. Микроорганизмы в почве выполняют также функцию регуляции своего состава, находясь в постоянном взаимодействии между собой. Некоторые из них выделяют вещества, способствующие росту растений.

Разнообразие почвенных микроорганизмов велико, поскольку почва служит «буфером», куда поступают микроорганизмы из воздуха, воды, с поверхности растений и животных. Однако истинно почвенными целесообразно считать функционально активные микроорганизмы, которые способны размножаться и функционировать в почве, а не только сохраняться. Последние десятилетия в микробиологии идёт оживлённая дискуссия по поводу оценки реального прокариотического разнообразия естественных местообитаний. В англоязычной литературе [Staley and Konopka, 1985] даже был предложен термин “great plate count anomaly”, описывающий следующий феномен: численность прокариот при микроскопическом изучении всегда значительно превышает численность, полученную при

19

подсчёте КОЕ. В связи с этим, считается, что значительная часть (до 99%) прокариот естественных местообитаний является некультивируемыми. Молекулярными методами было показано, что в 1 г почвы может содержаться свыше 1000 различных видов [Torsvik et al., 1990]. На самом деле, на различие между данными микроскопического анализа и подсчёта КОЕ обращали внимание ещё в 30-е годы Виноградский С.Н. и его современники [Виноградский, 1952]. Понятно, что некоторые бактерии до сих пор некультивированы только потому, что их пищевые потребности до сих пор неизвестны. Важно также учитывать различные условия культивирования. Некоторые патогенные бактерии, такие как Salmonella

и Vibrio, могут переходить в некультивируемое состояние под воздействием различных факторов, например, соленость воды или низкие температуры [Amann et al., 1995].

В настоящей работе на основании Bergey's Manual of Systematic Bacteriology и

The Prokaryotes были составлены ключи для идентификации почвенных прокариот, выделены и фенотипически идентифицированы почвенные прокариоты. Полученные изоляты были также идентифицированы с помощью анализа последовательности гена rrs. Затем был проведён сравнительный анализ результатов фенотипической идентификации и филогенетического анализа. Эти результаты совпали в большинстве случаев родовой идентификации, кроме рода Ochrobactrum (был выделен свободноживущий азотфиксирующий штамм, хотя известны только азотфиксирующие симбионты этого рода или патогены человека), Arthrobacter (один из изолятов не имел характерного для рода цикла «палочка-кокк»), некоторые изоляты родов Sphingomonas и Stenotrophomonas иногда было трудно фенотипически отличить от рода Pseudomonas. Для изолятов семейства Bacillacea совпали даже данные видовой идентификации. Фенотипические признаки, по которым обнаруживалось по некоторым изолятам несовпадения с описанием рода, мы исключили из финального ключа для идентификации почвенных прокариот до рода. Для экологической оценки биоразнообразия на основании общепринятых индексов [Одум, 1986] нами было разработано программное обеспечение BIODIVERSITY с целью дальнейшего анализа сельскохозяйственно-ценных почв.

20

НОВЫЕ АЭРОБНЫЕ МЕТИЛОБАКТЕРИИ – СИМБИОНТЫ РАСТЕНИЙ

А. А. Гоглева

Пущинский государственный университет, Пущино, Россия Институт биохимии и физиологии микроорганизмов РАН, Пущино, Россия

Аэробные метилотрофные бактерии, использующие окисленные или замещённые производные метана (метилобактерии) в качестве источников углерода и энергии, широко распространены в природе и часто ассоциированы с растениями. Относительно недавно стало известно, что метан, метанол и другие летучие C1-соединения являются естественными продуктами метаболизма растений. Основным источником метанола, выделяемого растениями, служит деметилирование пектина в клеточных стенках под действием пектинметилэстеразы. Наряду с метаном и метанолом, растения могут выделять метилированные амины, галометаны, метилсернистые соединения, хотя их вклад в глобальный цикл углерода намного меньше. Следовательно, образование растениями большого количества различных С1-соединений, и прежде всего метанола, создает предпосылки постоянной взаимосвязи с метилобактериями. Преобладающим типом метилотрофов, обнаруженных ранее на поверхности растений, являются типичные представители розовоокрашенных факультативных метилобактерий (РОФМ) рода Methylobacterium.

Из филлосферы дуба (Quercus robur L.) и берёзы (Betula pendula L.) нами выделены два штамма бесцветных метилобактерий Db и 1ж, использующих метанол и метиламины в качестве источников углерода и энергии. Изоляты представлены грамотрицательными подвижными клетками размером 0,5–0,7 × 1,0–1,2 и 0,3 × 0,35 мкм соответственно. В жирнокислотном составе клеток преобладают омега-7-октадеценовая (18:1 ω7) и

11-метил-октадеценовая (11 Me18:1). В фосфолипидном составе обоих изолятов доминируют фосфатидилхолин, фосфатидилэтаноламин и фосфатидилглицерол.

Судя по данным секвенирования гена 16S рРНК, оба штамма принадлежат к классу Alphaproteobacteria и наиболее близки представителям родов Methylopila и Hanssсhlegelia (Рис.1).

Изоляты окисляют метанол классической PQQ-зависимой метанолдегидрогеназой, и имеют высокие активности ключевых ферментов серинового пути: L-серин-глиоксилатаминотрансферазы и оксипируватредуктазы. У обоих штаммов отсутствует активность изоцитратлиазы, следовательно, они реализует ицл–

вариант серинового пути С1-метаболизма. Штамм 1ж способен окислять метиламин аминооксидазой (8-10 нмоль/мин/мг белка), однако у него отсутствуют метиламиндегидрогеназа и

N-метилглутаматдегидрогеназа. Ассимиляция аммония у штаммов Db и 1ж осуществляется через глутаматный цикл, о чём свидетельствуют активности глутаминсинтетазы и глутаматсинтазы. Помимо этого, штамм Db обладает НАДФН-зависимой формой глутаматдегидрогеназы и способен к восстановительному аминированию α-кетоглутората.

21

Рис. 1 Филогенетическое положение штаммов Db и 1ж, основанное на сравнении нуклеотидных последовательностей 16S рДНК. Масштаб соответствует 2 нуклеотидным заменам на каждые 100 нуклеотидов (эволюционным расстоянием). Корень определен включением последовательности E. coli в качестве внешней группы. Цифрами показана статистическая достоверность порядка ветвления, определенная с помощью «bootstrap»-анализа 100 альтернативных деревьев.

Исследуемые штаммы способны синтезировать фитогормоны – ауксины, и таким образом влиять влиять на рост и развитие колонизованных растений. Полученные данные существенно расширяют представление о биоразнообразии метилотрофных фитосимбионтов.

0.02

Escherichia coli O157:H7 (AY513502)

Methylosulfonomonas methylovora M2 (U62893)

Paracoccus denitrificans LMG 4218T (X69159)

1g

Db

Methylobacterium extorquens TKOO1 (AF531770)

Agrobacterium tumefaciens CCBAU 65237 (AY504963)

Hansschlegelia plantiphila S4 DQ 404190

Methylopila capsulata IM1 (AF004844)

Hansschlegelia plantiphila S2 DQ 404189 Hansschlegelia plantiphila S1

T DQ 404188

Methylopila helvetica IFO13257 (D14501) Albibacter methylovorans DM10T (AF273213)

Xanthobacter autotrophicus T102 (U62888) Ancylobacter aquaticus ATCC 25396 (M62790)

Methylosinus trichosporium OBBP (AF150804) Methylocystis parvus SM6 (AF150805)

Rhizobium tropici IFO15247 (D11344)

Agrobacterium rhizogenes IFO13257 (D14501)

100

100

63

53

100

93

67

93

99

9999

100

84

100

100

22

ИСПОЛЬЗОВАНИЕ МЕТОДА

ЭЛЕКТРООПТИЧЕСКОГО АНАЛИЗА КЛЕТОЧНЫХ СУСПЕНЗИЙ

ДЛЯ ОПРЕДЕЛЕНИЯ СИНЕРГИДНОГО ДЕЙСТВИЯ

АНТИБИОТИКОВ АМПИЦИЛЛИНА И КАНАМИЦИНА

В ОТНОШЕНИИ МИКРОБНЫХ КЛЕТОК

О. И. Гулий, О. В. Игнатов

Институт биохимии и физиологии растений и микроорганизмов РАН, Саратов, Россия

Для предупреждения возникновения устойчивых к антибиотикам форм микроорганизмов и повышения эффективности антибиотикотерапии могут применятся одновременно два и более антибиотика. Особый интерес, с нашей точки зрения, представляет изучение синергидного действия антибиотиков на микробные клетки. Ранее нами была показана возможность определения чувствительности микробных клеток по отношению к некоторым антибиотикам с помощью электрооптического (ЭО) анализа клеточных суспензий. С нашей точки зрения, перспективным направлением дальнейших исследований является использование метода ЭО анализа клеточных суспензий при одновременном воздействии на них антибиотиков с различными механизмами действия. Можно предположить, что деструкция мембраны в результате проникновения антибиотиков внутрь клетки и последующие нарушения биохимических процессов в них должны приводить к изменению электрофизических свойств микробных клеток. Последние отражаются в изменениях ЭО характеристик клеточных суспензий, регистрируемых с использованием эффекта ориентации клеток в электрическом поле. При использовании антибиотиков важное значение имеет определение оптимальных доз препаратов с учетом их синергидного действия. Оптимальными являются такие дозы антибиотиков, при которых концентрация антибиотиков в 2–3 раза превышает величину его минимальной подавляющей концентрации (МПК) в отношении возбудителя. Имеются данные об усилении антибактериального эффекта ампициллина при сочетанном применении с другими антибиотиками, например, с канамицином. В наших исследованиях изучалось влияние ампициллина и канамицина на электрофизические свойства клеток Escherichia coli К-12. Установлено, что существенные изменения в ориентационных спектрах (ОС) суспензий клеток, инкубированных с различными концентрациями антибиотиков ампициллина и канамицина, имели место только на первых пяти частотах ориентирующего электрического поля (10–1000 кГц). Показано, что ампициллин в концентрации 1,0 мкг/мл и канамицин в концентрации 0,5 мкг/мл практически не оказывали влияние на величину электрооптического (ЭО) сигнала клеток чувствительного к данным антибиотикам штамму, однако зафиксировано. значительное изменение величины ЭО сигнала при одновременной инкубации клеток К-12 с ампициллином (1 мкг/мл) и канамицином (0,5 мкг/мл), что объясняется синергидным действием двух антибиотиков.

Полученные данные свидетельствуют о принципиальной возможности использования ЭО анализа клеточных суспензий для контроля воздействия антибиотиков на микроорганизмы. В том числе, показана эффективность электрофизических методов анализа микробных клеток для регистрации синергетического эффекта антибиотиков.

23

Работа была частично поддержана грантом Президента РФ для молодых докторов наук МД-57.2008.4 и государственной поддержки ведущих научных школ Российской Федерации НШ-3171.2008.4.

БИОЛОГИЧЕСКИЕ СВОЙСТВА ГРИБОВ РОДА CANDIDA,

ИЗОЛИРОВАННЫХ ПРИ ВАГИНАЛЬНЫХ ИНФЕКЦИЯХ

В. А. Дробкова

ГОУ ВПО ПГМА им. ак. Е.А.Вагнера Росздрава, Пермь, Россия Актуальность проблемы кандидоза обусловлена, прежде всего тем, что это - наиболее

распространенная грибковая инфекция. На его долю приходится подавляющее большинство случаев грибковых поражений слизистых оболочек. Вызывает кандидоз около 20 видов Candida, при этом наиболее частыми возбудителями остаются Candida albicans

(А.Ю. Сергеев, 2001; С.А. Лисовская, 2008). На практике их потенциальную патогенность принято характеризовать на основе «феномена ростовых трубок», определения адгезивных свойств и активности ферментов изолируемых культур. Гидролитические ферменты нарушают целостность эпителиального покрова слизистых оболочек, способствуя проникновения элементов гриба в ткани. Более того, это создает условия для внедрения возбудителей бактериальной природы, минуя барьер, который представляет собой неповрежденная слизистая для большинства микробов. Уровень продукции ферментов инвазии может существенно отличаться у разных штаммов, а степень их активности зависит от целого ряда причин. Так, среди C. albicans, например, регистрируются фосфолипазоположительные и фосфолипазоотрицательные штаммы, их протеолитическая активность подвержена значительным колебаниям.

Цель настоящего исследования – анализ ферментативной активности штаммов C. аlbicans, изолированных от пациенток гинекологического стационара.

Материалы и методы. Объектом исследования служили 40 штаммов грибов рода Candida, изолированных из вагинального отделяемого женщин, проходивших лечение в гинекологическом отделении МУЗ ГКБ №7 в 2008 г. Первичный посев клинического материала проводили на среду Сабуро с левомицетином. Инкубировали 48 часов при 37°С. Выросшие колонии микроскопировали, идентифицировали культуры Candida на основе морфологических, культуральных и биохимических (ферментация сахаров) признаков. Способность к филаментации и образованию хламидоспор оценивали на специальных средах («Hi-Media», Индия). Фосфолипазную активность грибов определяли на среде Сабуро с добавлением яичного желтка и CaCl2

.2H2O при pH = 5,6 и 7,4, длительность инкубации –

10 суток. Протеолитическую способность Candida оценивали на среде с добавлением бычьего альбумина. Для получения эндоплазмакоагулазы готовили взвесь культуры C.

albicans в физиологическом растворе. После центрифугирования, осадок ресуспендировали в физиологическом растворе в соотношении 1 : 2 и замораживали, затем растирали до оттаивания. Процедуру повторяли 3 раза. Вновь центрифугировали, надосадочную жидкость смешивали с 0,5 мл разведенной кроличьей плазмы, инкубировали при 37°С в течение 24 часов (Н.П. Елинов, 1964).

24

Результаты и обсуждение. Исследованные штаммы в значительной степени различались по культуральным свойствам, набору и уровню продукции определяемых ферментов. Процессы филаментации и образования хламидоспор у грибов происходили значительно быстрее на средах с pH = 7,4, чем при pH = 5,6, зависели от температуры и продолжительности инкубации. Спустя 48 часов хламидоспоры наблюдали у 68,4% культур C. albicans, к концу 6 суток при 37°С и pH среды 7,4 процессы филаментации регистрировали у всех штаммов. При идентичном температурном режиме, но pH = 5,6 способность грибов к образованию ростовых трубок значительно снижалась. На 7-е сутки культивирования только 15,8% изолятов были способны к филаментации. Параллельно с изучением культуральных особенностей оценивали ферментативную активность C. albicans. Продукция фосфолипазы проявлялась на 4 сутки инкубации лишь у 2% культур, а на 10 сутки при 37°С у каждого четвертого штамма. На питательной среде с pH = 5,6 половина изолятов продуцировали фосфолипазу через 8 дней культивирования. В условиях инкубации грибов при T = 22°С продукция этого фермента на протяжении 10 дней не выявлена. Значительно активнее C. albicans экскретировали протеиназу. Помутнение среды с добавлением бычьего альбумина наблюдали у 10% культур через 24 часа, у 17,5% через 72 часа, а на 10-е сутки инкубации при 37°С – у 92,5% штаммов. 90% Candida обладали эндоплазмакоагулазой в то время как ни одна из изученных культур не проявляла липазной активности.

Таким образом, изолированные из вагинального отделяемого штаммы C. albicans, обладали разнообразным спектром фементативной активности: высокой протеолитической, фосфолипазной и плазмокоагулирающей способностью. Примечательно, что при культивировании изолятов в условиях, сходных с обычно существующими в вагинальном биотопе (рН = 5,6; Т =37°С), продукция ферментов была наиболее значительной. Штаммы, проявляющие наибольшую ферментативную активность при рН = 5,6, были изолированы от кандидоносителей и больных острым кандидозом. Изоляты, характеризующиеся выраженной фосфолипазной активностью и способностью к филаментации

при рН = 7,4 выделены от женщин, страдающих бактериальным вагинозом. Следовательно, проявление тех или иных свойств C. albicans – это в значительной степени адаптивная реакция в ответ на особенности микроэкологических условий, формирующихся в вагинальном биотопе при различных состояниях.

25

РОЛЬ СЕРИН–ТРЕОНИНОВЫХ ПРОТЕИНКИНАЗ

В РЕГУЛЯЦИИ ОТВЕТА НА ТЕПЛОВОЙ СТРЕСС

У ЦИАНОБАКТЕРИИ SYNECHOCYSTS SP. PCC 6803

А. А. Зорина, М. П. Синетова, Д. А. Лось

Институт физиологии растений им. К. А. Тимирязева РАН, Москва, Россия zorina.anna@yahoo.com

Цианобактерии являются уникальными представителями мира микроорганизмов.

Заселяя почти все освещаемые места обитания, обладая пластичным метаболизмом, они в настоящее время являются удобными модельными объектами для изучения целого ряда биологических процессов, таких как фотосинтез, азотфиксация, адаптация к изменяющимся условиям окружающей среды.

Разнообразие цианобактерий, приспособленность к различным условиям обитания также отражаются в сложности их сигнальных систем. В передаче сигнала важную роль играет процесс фосфорилирования белков, катализируемый ферментами – протеинкиназами. Кроме гистидиновых киназ (наиболее широко представленных у бактерий), у цианобактерий присутствуют и серин-треониновые протеинкиназы (СТПК).

В геноме цианобактерии Synechocystis sp. PCC 6803 обнаружено 12 генов СТПК эукариотического типа (spkA-L). К настоящему моменту функционально охарактеризованы некоторые из них: протеинкиназы SpkA, SpkB участвуют в регуляции подвижности клеток цианобактерии, протеинкиназа SpkС вероятно вовлечена в регуляцию азотного метаболизма, а SpkD регулирует соотношение метаболитов цикла трикарбоновых кислот в зависимости от количества неорганического углерода в питательной среде.

В настоящей работе изучалась роль СТПК в ответе на тепловой стресс у цианобактерии Synechocystis.

Проведенный на начальном этапе скрининг коллекции мутантов (spkA-L) методом Нозерн блот-гибридизации позволил отобрать двух мутантов по протеинкиназам SpkH и SpkK, у которых в условиях теплового стресса была ослаблена экспрессия ряда стресс-индуцируемых генов (hspA, sodB, slr0967, sll0528) по сравнению с диким типом. Это позволило предположить, что эти протеинкиназы вероятно влияют на экспрессию генов теплового шока. Поэтому в дальнейшем наше внимание было сосредоточено на изучении физиологических характеристик именно этих двух мутантных штаммов.

Анализ ростовых кривых и данных электронно-микроскопического исследования

дикого типа и отобранных мутантных штаммов показал, что в нормальных условиях (32°С)

жизнеспособность этих штаммов не отличается, тогда как в условиях теплового шока (44°С)

выживаемость мутанта ∆spkK выше, чем дикого типа и мутанта ∆spkH. Также можно предположить, что различия, наблюдаемые в накоплении включений на начальных стадиях

теплового шока, вероятно связаны с повышенной выживаемостью мутанта ∆spkK в условиях стресса.

26

Исследование динамики накопления транскриптов генов (groEL2, sodB, sigB, htpG,

clpB1), индуцируемых тепловым стрессом, у мутантов ∆spkН и ∆spkK и дикого типа методом Нозерн блот-гибридизации выявило отличие кинетики и запаздывание во времени максимума

экспрессии активируемых повышенной температурой генов у ∆spkК от кинетики экспрессии этих генов у дикого типа и второго исследуемого мутанта.

Вероятно, протеинкиназа SpkK регулирует продолжительность экспрессии стрессовых генов и, т.о., участвует в ответе цианобактерии Synechocystis на тепловой шок.

Поскольку показанная ранее ослабленная индукция экспрессии некоторых генов теплового шока у обоих мутантов по СТПК SpkK и SpkH может свидетельствовать о непосредственном взаимодействии в процессе передачи стрессового сигнала, то на основании этого предположения был сконструирован рекомбинантный штамм Synechocystis, дефектный по двум генам, кодирующим серин-треониновые протеинкиназы.

Исследование экспрессии индуцируемых тепловым стрессом генов у двойного мутанта выявило значительное сходство динамики накопления транскриптов генов clpB1 и sigB у двойного мутанта и дикого типа, однако при этом наблюдается пониженная интенсивность сигнала у мутантного штамма по сравнению с диким типом. Профиль экспрессии генов

groEL2, groES у двойного мутанта по динамике схож с результатами для мутанта ∆spkH. Возможным объяснением полученных результатов может быть то, что исследуемые протеинкиназы находятся не в начале сигнального пути (т.к. отсутствуют трансмембранные домены), и поэтому сигнал передается также иными регуляторными элементами.

В настоящее время проводится работа по определению вероятного внутриклеточного субстрата исследуемых протеинкиназ.

Полученные данные позволяют заключить, что серин-треониновые протеинкиназы являются сигнальными элементами, играющими важную роль в адаптации цианобактерии Synechocystis sp. PCC6803 к условиям температурного стресса. Однако особенности взаимодействия этих протеинкиназ с другими сигнал трансдуцирующими элементами и непосредственное положение в каскаде реакций требуют дальнейшего изучения.

КООРДИНАЦИОННЫЕ СОЕДИНЕНИЯ CO(II) И NI (II)

КАК РЕГУЛЯТОРЫ АКТИВНОСТИ СУПЕРОКСИДДИСМУТАЗЫ

У ЦИАНОБАКТЕРИИ SPIRULINA PLATENSIS

Л. С. Зосим1, Н. В. Ефремова1

, Д. И. Еленчук2, Ч. М. Бивол1

, Л. М. Батыр2,

С. В. Джур1, О. П. Олан2

1Молдавский государственный университет, Кишинев, Молдова 2Институт Микробиологии и Биотехнологии АН РМ, Кишинев, Молдова

Несмотря на то, что многие живые организмы (облигатные аэробы) не могут

существовать без кислорода, он является агентом, действующим разрушающе на все живое, с чем он соприкасается. Нарушение баланса окислитель/антиокислитель может привести к окислительному стрессу [1]. Передовой линией защиты от токсического действия свободных радикалов являются энзимы: супероксиддисмутаза, каталаза, пероксидаза и др. [2].

27

Супероксиддисмутаза (SOD) осуществляет рекомбинацию радикалов O2– с

образованием перекиси водорода и триплетного кислорода, являясь единственным среди известных антиоксидантных энзимов, непосредственно обеспечивающих обрыв цепей кислородзависимых свободнорадикальных реакций в клетках живых организмов [3]. Биомасса цианобактерии Spirulina platensis может служит источником SOD [4]. Благодаря ярко выраженным антирадикальным свойствам SOD, перспективным является его использование в области медицины и косметологии.

В связи с вышесказанным, целью данного исследования является изучение возможности использования координационных соединений Co(II) и Ni(II) в качестве регуляторов активности SOD в биомассе спирулины.

Объектом исследования являлась цианобактерия Spirulina platensis CNM-CB-02, хранящаяся в Национальной Коллекции Непатогенных Микроорганизмов Института Микробиологии и Биотехнологии АН РМ. В качестве регуляторов активности супероксиддисмутазы в биомассе цианобактерии Spirulina platensis были использованы координационные соединения Co(II) с адипиновой кислотой: [Co(COO(CH2)4COO) • 2H2O] в концентрациях 1, 5, 10, 20 мг/л и Ni(II) с яблочной кислотой в качестве лигандов: [Ni(COO(CHOHCH2)COO) • 2H2O] в пределах концентраций 1-4 мг/л. Определение активности SOD осуществлялось по методу Winterbourn [5].

В ходе исследования было установлено, что влияние тестируемых координационных соединений Co(II) и Ni(II) на активность SOD находится в зависимости от концентрации и природы комплексов. Результаты биохимического анализа показали, что активность супероксиддисмутазы в биомассе спирулины, культивируемой в присутствии координационных соединений Co(II) и Ni(II) во всех используемых концентрациях превышает значения контрольной пробы. Максимальное увеличение активности SOD (1,35 и 1,40 раз по сравнению с контрольной пробой) было достигнуто при внесении в среду культивирования спирулины комплексов [Co(COO(CH2)4COO) • 2H2O] и [Ni(COO(CHOHCH2)COO) • 2H2O] в оптимальной концентрации 3 и 5 мг/л, соответственно. Данный факт может объясняться значительным влиянием металла, входящего в состав координационного соединения. Так как никель и кобальт являются металлами, вызывающими явление окислительного стресса, ответной реакцией на него может служить повышение активности SOD, обладающего антиоксидантными свойствами [6].

Исходя из полученных результатов, можно заключить, что тестируемые координационные соединения никеля и кобальта в пределах исследуемых концентраций могут быть рекоммендованы в качестве стимуляторов активности супероксиддисмутазы в биомассе цианобактерии Spirulina platensis.

1. Flora S. J. Role of free radicals and antioxidants in health and disease. Cell Molecular

Biology. 2007, vol. 53, no. 1, p.1-2. 2. Wolf F. L. The role and evolution SOD in algae. New Jersey, 2006, 132 p. 3. Ruth G., Heath L. Role of superoxiddismutases (SOD) in controlling oxidative stress in

plants. Journal of Experimental Botany. 2002, vol 53, no. 372, p.1331-1341.

28

4. Desai K., Sivakami S. Purification and biochemical characterization of a superoxide dismutase from the soluble fraction of the cyanobcterium Spirulina platensis. World J Microbiol. Biotehnology. 2007, vol. 23, no.11, p. 1661-1666.

5. Winterbourn C. et al. The estimation of red cell superoxide dismutase activity. In: J. Lab. Clin. Med. 1975, vol. 85, no. 2, p. 337-341.

6. Sultan S., Fatma, T. Phytotoxicity of heavy metals on Spirulina platensis. In: Phykos. 1999, vol. 38, no. 1-2, p. 87-92.

Выражаем искреннюю благодарность член-корреспонденту АН РМ, заведующему

кафедрой „Неорганической и физической химии”, профессору Аурелиану Гуля и сотрудникам лаборатории „Координационной химии” Молд. ГУ за предоставленные координационные соединения. Исследования были выполнены в рамках проекта 09.819.18.02A, финансируемого Высшим Советом по Науке и Технологическому Развитию АН РМ.

АНАЛИЗ ПРОТЕОЛИТИЧЕСКОГО ПРОЦЕССИНГА

В ПОПУЛЯЦИИ E. COLI В ТЕЧЕНИЕ ЖИЗНЕННОГО ЦИКЛА

Р. С. Иванов, Т. С. Тропынина

Учреждение Российской академии наук Институт биологии Уфимского научного центра РАН, Уфа, Россия

Бактерии кишечной группы, типичным представителем которой является E. coli,

присутствуют в нормальной микрофлоре кишечника животных и человека. Находясь в постоянном взаимодействии с макроорганизмом, бактериальное сообщество представляет собой динамичную систему, равновесие которой способствует поддержанию здорового метаболизма, иммунитета и адаптационного резерва макроорганизма, поддерживающего баланс с патогенными микроорганизмами. Деление микроорганизмов на патогенные и непатогенные является условным. Роль конкретного микроорганизма определяется его микроокружением и факторами внутренней среды макроорганизма. Изучение биохимических процессов, происходящих на разных фазах роста популяции бактерий, позволяет раскрывать возможные пути регулирования механизмов взаимодействия макро- и микроорганизмов. Целью данной работы был биохимический анализ особенностей Арг-X протеолитического процессинга в супраструктурах популяции прокариотических клеток на разных фазах роста в периодической культуре. При работе с протеомом прокариотической клетки использовался штамм E. coli JC-158 (Hfr PO1, thi, serA6, lacI22, relA1) (любезно предоставленный нашими коллегами И.В. Ступак и Е.Э. Ступак). Клетки E. coli JC-158 выращивали на богатой питательной среде LB (Лурия-Бертани) до полной логарифмической фазы, собирали центрифугированием и промывали трис-буфером. Первая проба была взята через 50 минут после начала инкубирования. Все клетки, собранные в течение от 50 мин до 430 мин с интервалами в 20 мин, были законсервированы в глицерине. Протеом E. coli фракционировали на основе разрыва слабых и сильных взаимодействий надмолекулярных структур с использованием ступенчатого повышения солевого градиента: 0,14 M NaCl;

29

0,35 M NaCl; 2 M NaCl; 6 M гуанидин – гидрохлорида с 0,004 % β – меркаптоэтанолом на 0,01 М трис – HCl буфере при pH 6,8. Количество белка в надмолекулярных структурах определяли методом Бредфорд. Арг–X активность оценивали по расщеплению Арг–X связей в аргининбогатом белке – протамине («Merk») во всех вышеперечисленных фракциях. При переходе клеток в стационарную фазу экспрессия большинства бактериальных генов существенно уменьшается. В этих условиях происходит индукция экспрессии генов, обеспечивающих синтез белков, которые необходимы для устойчивости бактерий к неблагоприятным условиям. В этот период отмечается высокая непрерывная активность Арг–X процессинга на уровне клеточного остатка или «цитоскелета» клетки. Понимание механизмов регуляции экспрессии генов в разных фазах роста в периодической культуре, возможно, позволит найти способы воздействия на бактериальные клетки, которые в свою очередь обеспечат выгодное взаимодействие макроорганизма и микрофлоры.

ЖИЗНЕСПОСОБНОСТЬ ДРОЖЖЕЙ РОДА SACCHAROMYCES

ПОСЛЕ КРИОКОНСЕРВАЦИИ

А. В. Кантерова, Г. И. Новик

Институт микробиологии НАН Беларуси, Минск, Беларусь

Основной задачей коллекций является сохранение культур в жизнеспособном состоянии с присущими им диагностическими и хозяйственно-ценными свойствами. Для этой цели необходима разработка и применение эффективных методов длительного хранения микроорганизмов, таких как криоконсервация.

Дрожжевые грибы в Белорусской коллекции непатогенных микроорганизмов (БКМ) представлены 64-мя видами, относящимися к 32-м родам. Наибольшее количество штаммов (28) относится к роду Saccharomyces. Известно, что в спиртовом и винном производстве используют особые расы дрожжей рода Saccharomyces, которые способны переносить высокое осмотическое давление из-за больших концентраций в сбраживаемом субстрате сахаров, солей, а также спирта, образующегося в процессе ферментации.

Ранее в БКМ были проведены исследования по изучению сбраживающей активности у штаммов дрожжей рода Saccharomyces при ферментации солодового сусла. В результате адаптационной селекции по технологически важным признакам из штамма дрожжей

Saccharomyces cerevisiae Y-717 получен штамм S. cerevisiae Y-717С, который обладал термоустойчивостью и толерантностью к высокому содержанию этанола в сбраживаемом субстрате. Также в наших исследованиях использовались широко применяемые в течение длительного периода времени в промышленности дрожжи Saccharomyces cerevisiae р. ХП (в БКМ этот штамм поддерживается как БИМ Y-177), и БИМ Y-178 - винные дрожжи с высоким уровнем сбраживающей активности.

Культурально-морфологические особенности всех проверенных штаммов практически не отличались. Клетки дрожжей имели, в основном, овальную форму, располагались одиночно или в парах, наблюдалось активное почкование, размер клеток варьировал от 6 × 10 до 7 × 12 мкм. Через трое суток культивирования на сусло-агаре при +25°С колонии

30

дрожжей имели диаметр 5–6 мм, круглую форму с ровными краями, светло-палевый цвет, блестящую поверхность, мажущуюся консистенцию.

Исследуемые штаммы были заложены на хранение при –70°С. Криоконсервации подвергались культуры, находящиеся в стационарной фазе роста (72 часа). Непосредственно перед закладкой культур на хранение, затем через 1 сутки и через 1 год хранения определялось количество живых клеток дрожжей методом предельных разведений. Результаты экспериментов представлены в таблице.

Выживаемость ( КОЕ/мл ) дрожжей рода Saccharomyces

после криоконсервации при –70°С

Штамм Протектор Исходная

культура

Хранение в

течение 1 суток

Хранение

в теч. 1 года

Y- 177 Глицерол, 10% об. 8 × 108 4 × 108 1 × 108

Сахароза, 10% об. 1,8 × 109 1,5 × 109 2 × 108

Y- 178 Глицерол, 10% об. 6 × 108 4 × 108 9 × 107

Сахароза, 10% об. 109 8 × 108 7,5 × 108

Y-717 Глицерол, 10% об. 2,5 × 108 108 8 × 107

Сахароза, 10% об. 2 × 108 9,4 × 107 7 × 107

Y-717 C Глицерол, 10% об. 2 × 108 1,3 × 108 1,1 × 108

Сахароза, 10% об. 3 × 108 7,2 × 107 6,9 × 107

Несмотря на то, что показатели выживаемости дрожжей после 1 года хранения

при –70°С несколько ниже исходных, они были достаточно высокими, в связи с чем метод криоконсервации можно рекомендовать для длительного сохранения жизнеспособности сахаромицетов.

НИТРИЛАЗНАЯ АКТИВНОСТЬ ПОЧВЕННЫХ БАКТЕРИЙ,

ТРАНСФОРМИРУЮЩИХ АЛИФАТИЧЕСКИЕ НИТРИЛЫ

С. В. Козлов, В. А. Демаков

Институт экологии и генетики микроорганизмов УрО РАН, Пермь, Россия

Бактериальная трансформация нитрилов включает два известных метаболических пути: нитрилазный и нитрилгидратазный. Нитрилазы гидролизуют нитрилы до соответствующих кислот без образования амидов и могут быть использованы в процессах биокаталитического синтеза карбоновых кислот. Поиск новых активных продуцентов обусловлен явными преимуществами биоконверсии нитрилов по сравнению с традиционным химическим синтезом [1-2]. В связи с этим актуальным является совершенствование методов выделения микроорганизмов, обладающих нитрилгидролизующими ферментами.

Методами накопительной культуры и прямого высева выделены клоны микроорганизмов, способные утилизировать нитрилы. Отбор штаммов бактерий, проявляющих нитрилгидролизующую активность, проводили по ранее разработанным схемам с применением сред, содержащих ацетонитрил, акрилонитрил или изобутиронитрил

31

в качестве единственного источника азота и энергии. Для обнаружения и дифференцирования системы нитрилазной метаболизма от нитрилгидратазно-амидазной проведен ПЦР-анализ со специфическими праймерами к генам нитрилаз из шести известных бактериальных штаммов-продуцентов.

Наличие у изучаемых штаммов нитрилазной и нитрилгидратазно-амидазной системы метаболизма было подтверждено результатами реакции трансформации нитрилов с последующим газохроматографическим определением соответствующих продуктов трансформации. В результате скрининга образцов 10-ти типов почв, характерныхдля Пермского края, получено 36 штаммов, обладающих детектируемой нитрилазной активностью (более 0,2 мкмоль/мг/мин по отношению какрилонитрилу), в т.ч. 15 высокоактивных штаммов (более 3 мкмоль/мг/мин).

Показана высокая устойчивость нитрилазной активности изолятов к повышенным температурам (максимум активности проявлялся при 50–65°С) и высокая стабильность при хранении, что важно для их использования в биотехнологии.

Работа выполнена при поддержке ФЦП «Научные и научно-педагогические кадры инновационной России на 2009 - 2013 годы» (ГК№ 02.740.11.0078) и программой междисциплинарных исследований, финансируемой УрО РАН.

1. Chauhan S. Purification, cloning, sequencing and over-expression in Escherichia coli a regioselective aliphatic nitrilase from Acidovorax facilis 72W / S. Chauhan, S. Wu, S. Blumerman et al. // Appl. Microbiol. Biotechnol. – 2003. – V. 61. – P. 118-122.

2. Полтавская С.В. Разработка и внедрение биокаталитического способа получения акриловой кислоты. I. Выделение штамма Alcaligenes denitrificans, трансформирующего акрилонитрил в акрилат аммония. Оптимизация среды культивирования / С.В. Полтавская, Т.Н. Козулина, И.Н Сингирцев и др. // Биотехнология. – 2004. – № 1. – С. 62-70.

32

ГРАМПОЛОЖИТЕЛЬНЫЕ БАКТЕРИИ,

ВЫДЕЛЕННЫЕ ИЗ ТЕХНОГЕННОЗАГРЯЗНЕННЫХ ПОЧВ

РАЙОНА СОЛЕРАЗРАБОТОК ПЕРМСКОГО КРАЯ (Г. БЕРЕЗНИКИ)

И. О. Коршунова1, Д. О. Егорова2

, Е. Г. Плотникова1,2

1Пермский государственный университет, Пермь, Россия 2Институт экологии и генетики микроорганизмов УрО РАН, Пермь, Россия

Промышленный регион Пермского края характеризуют уникальные месторождения

калийных солей и нефти, развитие химической, горно-химической, нефтеперерабатывающей и энергетической промышленности. Калийные комбинаты ООО «Уралкалий», расположенные в г. Березники и г. Соликамске, образуют огромное количество отходов, вызывая засоление почвы. Основная химическая нагрузка на окружающую среду г. Березники формируется в результате сбросов и складирования отходов крупнейших химических комбинатов края. Из литературы известно, что в почвах с высоким уровнем засоления и техногенной нагрузки формируется уникальная микрофлора, способная выживать в экстремальных условиях среды. Описано значительное количество бактерий, способных разлагать токсичные поллютанты, в том числе соединения ароматического ряда. Однако наиболее полно процессы деструкции описаны у грамотрицательных бактерий в отношении нафталина и фенантрена. Встречаются единичные работы, посвященные бактериальному разложению бифенила в экстремальных условиях. В связи с этим, особый интерес представляют грамположительные бактерии, адаптированные к выживанию в условиях повышенной минерализации, и способные утилизировать бифенил.

Цель работы – выделение и изучение грамположительных бактерий-деструкторов бифенила из минерализованных техногеннозагрязненных почв.

Методом накопительных культур на минеральной среде Раймонда, содержащих бифенил в качестве ростового субстрата, из образцов почв, отобранных на территории складирования отходов промышленных предприятий г. Березники выделено 42 аэробных грамположительных штамма бактерий. При этом способностью к утилизации бифенила обладали 32 штамма.

На основании морфологических и физиологических признаков, а также профилей ДНК, полученных при проведении REP-ПЦР с тотальной ДНК изолятов, выделенные культуры были объединены в 13 групп. Из них 4 группы составили штаммы, не способные использовать бифенил в качестве ростового субстрата.

Установлено, что 26 штаммов используют бифенил в качестве единственного источника углерода и энергии в присутствии в среде 3% хлорида натрия. Шесть штаммов проявляли деградативные способности при содержании соли в среде не выше 1.5%. 12 бактериальных штаммов способны утилизировать бифенил при минерализации среды хлоридом натрия от 0 до 6%.

Эксперименты по культивированию исследуемых штаммов в полноценной среде Раймонда (минеральная среда с добавлением дрожжевого экстракта 5 г/л и триптона 10 г/л) показали, что все изоляты активно растут в присутствии 3% хлорида натрия. Из них

33

9 штаммов росли при минерализации среды от 0 до 6%, 7 штаммов – от 0 до 9% и 6 штаммов – от 0 до 20%.

Интересным представляется тот факт, что 6 штаммов, демонстрировавших рост в минеральной среде с бифенилом при 6% NaCl, не были способны расти при данном уровне минерализации в полноценной среде.

Таким образом, в ходе проведенных исследований из техногеннозагрязненных почв с повышенной минерализацией выделены аэробные грамположительные галотолерантные бактерии, способные использовать бифенил в качестве единственного источника углерода и энергии.

Работа поддержана грантом РФФИ-Урал №07-04-96078_а, Программой Президиума РАН "Молекулярная и клеточная биология", проект «Исследование метаболизма токсичных органических соединений у аэробных бактерий, анализ генетических и ферментных систем биотрансформации».

ПРОДУКЦИЯ β–ГАЛАКТОЗИДАЗЫ БАКТЕРИЯМИ ARTHROBACTER SP.

В ЗАВИСИМОСТИ ОТ ИСТОЧНИКА АЗОТНОГО ПИТАНИЯ

А. А. Костеневич, Л. И. Сапунова, И. О. Тамкович

ГНУ «Институт микробиологии НАН Беларуси», Минск, Беларусь

β-Галактозидаза (лактаза, β-галактозид-галактогидролаза, КФ 3.2.1.23) катализирует реакции гидролиза и трансгликозилирования β-галактозидов, благодаря чему широко используется в промышленности, сельском хозяйстве, медицине. Из известных продуцентов внутри- и внеклеточных β-галактозидаз для их промышленного производства востребованы лишь отдельные виды родов Aspergillus, Penicillium, Kluyveromyces, Streptococcus и некоторых др. Ранее нами был отобран штамм бактерий Arthrobacter sp. БИМ В-2242, характеризующийся высоким уровнем синтеза β-галактозидазы с исключительно редкой для прокариот внеклеточной локализацией. Цель настоящей работы – оптимизация продукции фермента бактериями в зависимости от утилизируемого источника азота, что представляется необходимым этапом разработки рентабельной технологии получения ферментов на основе нового штамма-продуцента.

Установлено, что из испытанных источников органического азота наиболее подходящими для синтеза β-галактозидазы Arthrobacter sp. является пептон в отдельности или в сочетании с дрожжевым экстрактом. Показано, что концентрация пептона в среде, обеспечивающая максимальный уровень продукции фермента бактериями, составляет 1,0%. В то же время дрожжевой экстракт, который является одновременно источником азотного питания и активирующим рост веществом, в количестве более 0,5% угнетает образование β-галактозидазы Arthrobacter sp. Оптимальная концентрация этого компонента питания для активного синтеза фермента исследуемым штаммом составляет 0,1%. Минимальный уровень продукции фермента бактериями обеспечивают соевый жом, пшеничные отруби, солодовый экстракт и меласса. Полное отсутствие синтеза β-галактозидазы бактериями отмечается при их выращивании в средах с овсяной мукой.

34

Показано, что из дополнительно внесенных в питательную среду минеральных источников азота нитраты, за исключением нитратов магния и аммония, а также многоосновные аммонийные соли неорганических кислот ингибируют образование фермента в 1,2-3,3 раза. В то же время сравнимые с контрольным уровни продукции

β-галактозидазы обнаруживаются у культуры, растущей в средах с одноосновными солями аммония, исключая хлорид аммония, а также с магнием азотнокислым. Последнее обстоятельство позволяет также предположить важную роль катионов магния в процессе биосинтеза каталитически активного ферментного белка бактериями Arthrobacter sp.

МЕТАБОЛИЗМ ГЛИФОСАТА

РИЗОСФЕРНЫМ ШТАММОМ ACINETOBAСTER SP. K7

Е. В. Крючкова, Г. Л. Бурыгин, М. П. Чернышова, Е. Е. Фёдоров, О. В. Турковская

Институт биохимии и физиологии растений и микроорганизмов РАН, Саратов, Россия

Глифосат (N-фосфонометилглицин) – действующее вещество гербицидного препарата «Раундап», широко используемого в мировом сельском хозяйстве. В процессе регулярного применения глифосат неизбежно попадает в почву, что может привести к загрязнению обрабатываемых участков. Одним из условий полной минерализации глифосата в окружающей среде является разрушение С–Р связи, присутствующей в его молекуле. В природе это происходит в основном за счёт ферментных систем микроорганизмов, поэтому поиск бактериальных штаммов, способных деградировать глифосат по пути разрушения С–Р связи является одним из ключевых моментов в создании биотехнологии очистки и восстановления почв от гербицида и его метаболитов.

Данная работа была посвящена изучению способности ризосферного штамма Acinetobacter sp. K7 метаболизировать глифосат, используя его в качестве единственного источника фосфора.

Бактерии выращивали на минимальной синтетической среде (МС), содержащей 5 мМ глифосата в качестве источника фосфора. Рост культуры контролировали спектрофотометрически. Количество глифосата и аминометилфосфоновой кислоты в среде культивирования определяли методом газовой хроматографии. Наличие в культуральной жидкости основных метаболитов глифосата (саркозин и глицин) определяли методом тонкослойной хроматографии (ТСХ).

Исследуемый штамм был выделен с ризоплана топинамбура и сохранял способность к росту на среде с глифосатом в процессе многократных пересевов. Анализ культуральной жидкости методом газовой хроматографии показал значительное уменьшение площади пика глифосата по сравнению с контролем (МС + глифосат без бактерий). Убыль концентрации гербицида в среде после 5 суток культивирования бактерий составила более 50% от первоначальной. Анализ ТСХ культуральной жидкости позволил выявить наличие двух основных меиаболитов: саркозина и глицина, которые образуются в процессе деградации глифосата по С–Р-лиазному пути. В тоже время в культуральной жидкости не удалось обнаружить аминометилфосфоновую кислоту, образующуюся при расщеплении молекулы глифосата по С–N положению.

35

Таким образом, полученные результаты позволяют сделать вывод о способности штамма Acinetobacter sp. K7 деградировать глифосат, используя его в качестве источника фосфора.

Работа проводилась при финансовой поддержки Федерального агентства по науке и инновациям Госконтракт № 02.512.11.2210.

ФИЗИОЛОГО–БИОХИМИЧЕСКАЯ

И МОЛЕКУЛЯРНО–БИОЛОГИЧЕСКАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА ИЗОЛЯТОВ

ERWINIA AMYLOVORA, ВЫДЕЛЕННЫХ НА ТЕРРИТОРИИ БЕЛАРУСИ

И. В. Кудина, А. Л. Лагоненко, А. Н. Евтушенков

Белорусский государственный университет, Биологический факультет, Кафедра молекулярной биологии, Минск, Беларусь

kuddya@gmail.com

Бактериальный ожог плодовых – заболевание растений семейства Розоцветные, приносящее огромный ущерб мировому сельскому хозяйству. Впервые этот бактериоз был обнаружен в 1883 году в Северной Америке. На данный момент заболевание зарегистрировано более чем в 40 странах мира, включая Польшу, Литву и Украину. Плодовый ожог поражает более чем 180 видов растений, особенно представителей подсемейства Maloidae.

Возбудитель заболевания – Erwinia amylovora - фитопатогенная бактерия из семейства Enterobacteriacea. Она является карантинным объектом для Беларуси и стран, входящих в Европейскую организацию защиты растений (EPPO A2 list, EU Annex II/A2). Экономически наиболее важными хозяевами для данного фитопатогена являются Pyrus spp., Malus spp., Cydonia spp., Eriobotrya japonica, Cotoneaster spp., Crataegus spp., Pyracantha spp. и Sorbus spp. Наиболее чувствительны к бактериозу груши и яблони. Молодые деревья при благоприятных для патогена условиях могут погибать при единичном заражении за один сезон. В мире ежегодные убытки от бактериального ожога составляют десятки миллионов долларов. В 2007 году были зафиксированы вспышки бактериального ожога в яблоневых садах Республики Беларусь в Мядельском и Узденском районах Минской области, в 2008 году в Клецком районе Минской области.

В чистую культуру были выделены 11 штаммов бактерий и изучены с помощью ряда микробиологических тестов, бактерии формировали желтые мукоидные колонии на среде MM2Cu, образовывали леваны на питательном агаре с 5% сахарозы, не были способны расти на среде MM1Cu, не образовывали зеленый флюорисциирующий пигмент на среде Кинга Б, заражение незрелых плодов груши вызывало выделение эксудата. Было выяснено, что фитопатогенные штаммы E. amylovora, выделенные на территории Беларуси, представляют собой довольно однородную группу, близкую по своим физиолого-биохимическим характеристикам к типовым штаммам, изолированным на географически удаленных территориях (E. amylovora LMG 2024 и 1/79).

Для характеристики полученных изолятов было использовано несколько методов молекулярной дифференциации: RAPD ПЦР, метод сравнения нуклеотидных

36

последовательностей гена 16S рРНК, сравнение количества восьминуклеотидных повторов в плазмиде pEA29.

С помощью RAPD ПЦР были проверены 16 декамерных праймеров, дававших в ходе амплификации ДНК Erwinia amylovora от 1 до 10 фрагментов ДНК. При использовании праймеров OL9, OL21, OL25, OL42, OL44, C4, C5, C6, C15, C16, D1, D13, D15, D16, D19, RAPD-профили были идентичными для всех штаммов, включая 1/79Sm и LMG 2024. Различия были выявлены только между RAPD паттернами, полученными с праймером С13.

Было осуществлено секвенирование фрагментов генов 16S РНК двух белорусских изолятов Е3 и L3-5. Филогенетический анализ полученных фрагментов и последовательностей из штаммов E. amylovora, взятых из GenBank (всего сравнивалось 14 штаммов), позволил разделить штаммы Erwinia amylovora на две группы. Штаммы, относящиеся к биоварам 1, 2 и 3 были объединены в первую группу, а штаммы, относящиеся к биовару 4 – во вторую. Белорусские изоляты E3 и L3-5, также как и типовые штаммы 1/79 и LMG 2024, попадают в пределы первой группы, однако занимают в ней обособленное положение.

Плазмида pEA29 присуща большинству штаммов Erwinia amylovora. В этой плазмиде есть восьминуклеотидные повторы, количество которых варьирует у штаммов из разных географических точек. Для идентификации количества повторов у белорусских изолятов мы использовали реакцию амплификации с праймерами А (5-CGGTTTTTAACGCTGGG-3) и В (5-GGGCAAATACTCGGATT-3) с последующей рестрикцией полученных продуктов рестриктазой Sau3AI и ПЦР с праймерами RS1 (5-ACCTCAGTGCGATTACAG-3) и RS2с (5-GTCCCATTCTGTGTTAAG-3). Визуализация результата проводилась с использованием электрофореза в 8% полиакриламидном геле. В качестве положительного контроля использовались штаммы E. amylovora 1/79 (6 повторов) и 659 (5 повторов). Таким образом, было выявлено, что белорусские штаммы Erwinia amylovora содержат 5 восьминуклеотидных повторов в плазмиде pEA29, также как польский штамм E. amylovora

659.

37

СУБКЛЕТОЧНАЯ ЛОКАЛИЗАЦИЯ КАРБОАНГИДРАЗЫ БЕТА-ТИП

В КАЛЬЦИФИЦИРУЮЩЕЙ ЦИАНОБАКТЕРИИ

MICROCOLEUS CHTHONOPLASTES

Е. В. Куприянова1, А. Г. Маркелова1

, Л. М. Герасименко2, Д. А. Лось1

, Н. А. Пронина1

1Институт физиологии растений им. К.А. Тимирязева РАН, Москва, Россия 2Институт микробиологии им. С.Н. Виноградского РАН, Москва, Россия

Механизмы минерализации цианобактериального сообщества до сих пор недостаточно

изучены. Нами было выдвинуто предположение, что ключевую роль в биоминерализации может играть фермент карбоангидраза (КА), локализованная в наружных слоях цианобактерий, где ее функция состоит в регуляции равновесия форм неорганического углерода, в том числе и бикарбоната, участвующего в осаждении кальция.

Нами была зарегистрирована активность КА как на интактных клетках, так и во фракции изолированных клеточных оболочек M. chthonoplastes. С помощью вестерн-блот анализа и метода иммуноэлектронной микроскопии показано наличие, по крайней мере, двух КА разных классов (альфа- и бета-) в клеточных оболочках цианобактерии.

Из сконструированной нами на основе фага лямбда геномной библиотеки

M. chthonoplastes клонирован ген бета-КА, названный cahB1. Поиск проводили с помощью гетерологичного зонда, представляющего собой полноразмерный ген периплазматической бета-КА из Synechocystis PCC 6803 (ecaB, slr0051). Для cahB1 определена полная нуклеотидная последовательность, которая депонирована в международную базу данных GeneBank под номером DQ222209.

Для гетерологичной экспрессии белка CahB1 в клетках E. сoli была собрана конструкция на основе вектора pET32b (Novagen), несущая ген cahB1 и позволяющая получить белок, имеющий полигистидиновые последовательности на N- и С-концах для его последующего выделения с помощью аффинной хроматографии на никель-содержащем носителе. Уровень экспрессии CahB1 в штамме E. coli BL21 (DE3) pLysS (Novagen) составлял примерно 200 мг искомого белка на 1 л клеточной суспензии. Причем его накопление в клетках E. сoli происходило в основном в тельцах включения. С помощью электрометрического метода было показало наличие высокой активности фермента КА в общем клеточном гомогенате E. coli, содержащем гетерогенный белок CahB1. Активность фермента полностью ингибировалась специфическим ингибитором КА ацетазоламидом. Очистку белка CahB1 на никелевой колонке (His-Bind columns, Novagen) проводили в денатурирующих условиях.

Выделенный белок СahB1 был использован в качестве антигена для получения специфичных антител. Для установления точной внутриклеточной локализации СahB1 в

M. chthonoplastes нами были выделены различные клеточные фракции цианобактерии (суммарный клеточный гомогенат, фракции растворимых и мембраносвязанных белков, клеточные оболочки). С помощью Вестерн-блот анализа с использованием полученных антител белок CahB1 был локализован в клеточных оболочках M. chthonoplastes.

38

На основе экспериментальных данных предложена схема участия внеклеточных КА

M. chthonoplastes в фотосинтетической ассимиляции углерода и связи этого процесса с отложением CaCO3 при минерализации цианобактерии.

ОБНАРУЖЕНИЕ МЕТАНОВОГО ЦИКЛА

В СИСТЕМЕ АЭРОБНОЙ ОЧИСТКИ ВОДЫ

С ПРИКРЕПЛЕННЫМ АКТИВНЫМ ИЛОМ

Ю. В. Литти, В. К. Некрасова, М. В. Симанькова, А. Н. Ножевникова

Институт микробиологии им. С.Н. Виноградского РАН, Москва, Россия

Станция очистки сточных вод Центра активного отдыха Министерства обороны РФ, реконструированная в начале 2008 г по технологии, разработанной под руководством

Н.И. Куликова, обеспечивает очистку сточных вод в прилегающей части поселка Красной поляна в период строительства олимпийских объектов. В основу примененной на станции технологии положена схема аэробной очистки воды с использованием жесткого носителя, для иммобилизации микробного активного ила. В данном случае применена оригинальная волокнистая насадка «Ерш Куликова» с развитой поверхностью. Различная толщина полимерных волокон «ерша» обеспечивает их гибкость и колыхание при движении воды, как это происходит с водной растительностью. Иммобилизация микроорганизмов позволяет значительно увеличить плотность микробной популяции в очистных сооружениях, вследствие чего увеличивается скорость и глубина очистки воды. Известно, что в биопленках, развивающихся на поверхности твердых носителей, происходит пространственная самоорганизация микробного сообщества, выстраивается сукцессия микроорганизмов по градиенту окислительно-восстановительного потенциала и концентрации субстрата.

Проведенные нами исследования прикрепленного активного ила КОС ЦАО МО РФ показали, что в микробной биопленке на полимерных волокнах ершовой насадки, присутствуют аэробные и анаэробные микроорганизмы, и реализуются соответствующие микробные процессы. В одной и той же пробе активного ила в присутствии кислорода органические вещества окисляются, а после исчерпания кислорода происходит их анаэробная деградация. Более того, в микробной популяции прикрепленного активного ила нами обнаружено полное анаэробное метаногенное микробное сообщество, которое осуществляет деградацию органических загрязнений до метана и диоксида углерода. В активном прикрепленном и свободно плавающем микробном иле обнаружены аэробные метанотрофные бактерии, окисляющие метан и предотвращающие его эмиссию. То есть, исследованном нами активном иле функционирует замкнутый цикл метана. Нами показано также, что летучие жирные кислоты, являющиеся важными промежуточными продуктами деградации органических веществ, разлагаются исследуемым микробным илом как в аэробных, так и анаэробных условиях. Таким образом, в исследованной нами системе очистки воды активный ил является аэробно-анаэробным. Результаты наших исследований позволяют объяснить существенное уменьшение продукции избыточного ила на станции чистки воды по сравнению с традиционной технологией аэробной очистки. Это происходит

39

вследствие увеличения роли анаэробных микроорганизмов в активном иле, образующих гораздо меньше микробной биомассы по сравнению с аэробными микроорганизмами. Качество очищенной воды на КОС ЦАО МО РФ соответствует нормам сброса в водоемы рыбохозяйственного назначения (р. Мзымта), что свидетельствует о высокой эффективности процесса ее очистки.

ВЛИЯНИЕ ЧАСТОТЫ АДАПТИВНОГО МУТАГЕНЕЗА

ПРИРОДНЫХ БИОПЛЕНКООБРАЗУЮЩИХ БАКТЕРИЙ

НА РАЗВИТИЕ УСТОЙЧИВОСТИ К БИОЦИДАМ

Л. А. Магданова

Институт экологии и генетики микроорганизмов УрО РАН, Пермь, Россия

Природные бактериальные штаммы, в отличие от лабораторных, постоянно подвергаются экспозиции с разнообразными стрессорными факторами: бактерицидными веществами, изменениями температуры, влажности, осмолярности и т.д. Одной из стратегий выживания в таких условиях является формирование мутаторного фенотипа, проявляющегося в значительном повышении частоты мутагенеза, что приводит к накоплению мутаций, позволяющих некоторым клеткам популяции приобрести устойчивость к действующим селективным агентам. Адаптивный мутагенез – явление, связанное с возрастанием частоты мутагенеза в клетках культуры стационарной фазы роста. Известно, что большая часть бактерий в природных популяциях образуют биопленки, характеризующиеся высокой устойчивостью входящих в них клеток к условиям среды. Микроорганизмы в составе биопленок стабильно пребывают в состоянии стационарной фазы, что связано с высокой концентрацией сигналов кворум сенсинга, сильными градиентами питательных и минеральных веществ, кислорода и pH. Таким образом, содержание клеток с мутаторным фенотипом в биопленках значительно, и это, вероятно, является одним из главных факторов развития устойчивости биопленкообразующих организмов. В фокусе настоящей работы находится изучение соотношения уровней адаптивного мутагенеза природных биопленкообразующих изолятов с их устойчивостью к биоцидам.

Для выделения этой зависимости в пределах единой системы плавательных бассейнов в течение 6 месяцев собрали библиотеку изолятов биопленкообразующих бактерий. В качестве контрольного использовали коллекционный штамм Pseudomonas aeruginosa ATCC 27853. Уровень адаптивного мутагенеза определяли на питательном агаре с рифампицином

(300 мкг/мл); интенсивность биопленкообразования измеряли методом окраски генцианвиолетом; в качестве теста на чувствительность бактерий к биоцидам (Дезальгин, Биопаг, гипохлорит натрия) использовали метод двукратного разведения на иммунологическом планшете; предварительную идентификацию изолятов микроорганизмов проводили с помощью определителя бактерий Берги.

После первичного скрининга библиотеки (125 изолятов) на предмет интенсивности адаптивного мутагенеза и биопленкообразования отобрали представителей разнообразных морфотипических групп, обладавших радикальными значениями указанных признаков. С

40

помощью предварительной идентификации среди 30 отобранных изолятов были определены такие виды, как P. aeruginosa, Pseudomonas putida, Pseudomonas fluorescense, Pseudomonas

stutzeri, Bacillus subtilis и Escherihia coli. Далее проводили более точное определение частоты адаптивного мутагенеза и биопленкообразования, а так же измерение чувствительности к указанным выше биоцидам. Данные скрининга выявляют значительное понижение чувствительности к Дезальгину и гипохлориту натрия в группе гипермутабельных (104 – 30, с частотой адаптивного мутагенеза более 2 × 10–7) изолятов. Интересно, что менее выражен эффект для препарата Биопаг, не использовавшегося при обработке бассейнов. Эти данные указывают в пользу явления «hitchhiking», обуславливающее закрепление мутаторного фенотипа в геноме за счет приобретения устойчивости данных популяций к селективным факторам, при этом малая засевная доза бактерий (1000 клеток), используемая в тесте на чувствительность к Биопагу, практически не дает микроорганизмам возможность продуцировать устойчивую субпопуляцию в лунке планшета. Таким образом, результаты исследования свидетельствуют в пользу адаптивного значения мутаторного фенотипа в условиях длительного воздействия стрессорных факторов.

104 68

60 149

84

51 12 30105 69 22 40 48 79 108 72 К 33 118 96 15 11941 39 19 16 65

1,0E-09

1,0E-08

1,0E-07

1,0E-06

1,0E-05

1,0E-04

1,0E-03

1,0E-02

1,0E-01

1,0E+00

0 5 10 15 20 25 30

Частота

адаптивного

мутагенеза

Рис. 1. Выстроенные в порядке убывания частоты адаптивного мутагенеза изолятов: ○ – P.

aeruginosa, ◊ - P. fluorescense, ∆ - P. stutzeri, ♦ - P. putida, ■ – E. coli, * - В. subtilis, – в процессе идентификации.

6

11

16

21

104 60 49 51 30 69 40 79 72 33 96 119 39 16Номер изолята

Титр МИК

Рис. 2. Соответствующие указанному выше порядку титры МИК биоцидов: - Дезальгин,

▒ - Биопаг, ■ – Гипохлорит.

41

ИНАКТИВАЦИЯ ГЕНА ФИТАЗЫ В ГЕНОМЕ BACILLUS SUBTILIS

А. Д. Мухаметзянова, А. Р. Каюмов, М. Р. Шарипова

Казанский государственный университет им. В.И.Ульянова-Ленина, Казань, Россия

Микроорганизмы ризосферы высших растений положительно влияют на рост и жизнедеятельность растений. Этому было предложено несколько объяснений, одним из которых является увеличение доступности лимитированных, но важных для растений питательных веществ, таких как азот, фосфор, витамины группы B и аминокислоты. Так, улучшение фосфорного питания достигается путем мобилизации фосфора из нерастворимых неорганических полифосфатов и фитатов.

Фитаты составляют почти 50% от общего органического фосфора почвы и более 80% от общего фосфора в кормах растительного происхождения. Из-за отсутствия внеклеточной фитазной активности, растения не могут самостоятельно гидролизовать фитаты почвы. Однако внеклеточные фитазы микроорганизмов способны их расщеплять и переводить фосфор в доступное для растений состояние.

Фитазы бактерий рода Bacillus существенно отличаются от других фитаз. Такие их свойства, как рН-оптимум, термостабильности и устойчивость к протеолитическим ферментам делает их особо привлекательными для использования в биотехнологии. Они могут входить в состав органических удобрений и служить кормовой добавкой для промышленных животных.

Проведенный нами геноинформационный анализ показал высокую степень гомологии генов фитаз у бацилл. Большинство фитаз принадлежат к классу гистидиновых кислых фосфатаз, но гены, кодирующие фитазы бацилл, не имеют гомологии с гистидиновыми кислыми или другими фосфатазами.

Несмотря на многие преимущества перед фитазами других микроорганизмов, слабо изучены механизмы регуляции биосинтеза внеклеточных бациллярных фитаз и их вклад в преодоление стрессовых условий. Для ответа на эти вопросы необходимо получить штамм с инактивированным геном фитазы.

Целью работы явилась инактивация гена фитазы в геноме Bacillus subtilis 168 и изучение особенностей мутантного штамма.

Для нокаутирования гена фитазы необходимо создать конструкцию, состоящую из маркерного гена (в нашем случае – ген устойчивости к эритромицину), фланкированного 5’ и 3’ областями гена фитазы. По участкам гомологии происходит рекомбинация, и ген устойчивости к антибиотику встраивается в открытую рамку считывания гена фермента в хромосомной ДНК, нарушая его экспрессию.

Для инактивации гена фитазы, нами были последовательно сконструированы две плазмиды. На первом этапе ген фитазы, амплифицированный с геномной ДНК

Bacillus subtilis, был клонирован в вектор pUC19 по сайтам PstI и KpnI для образования плазмиды phy21.

Следующим этапом было конструирование плазмиды, несущей ген устойчивости к эритромицину внутри открытой рамки считывания гена фитазы. Для этого клонировали ген устойчивости к антибиотику в плазмиду phy21 по сайту EcoRV, который находится в

42

клонированном фрагменте гена фитазы и отсутствует на исходном векторе. После трансформации лигазной смеси в штамм E.coli было отобрано 20 клонов, 6 из

которых несли плазмиду с большей молекулярной массой, чем phy21. ПЦР с праймеров, комплементарных к гену устойчивости к эритромицину дал

положительный результат во всех случаях. Таким образом, была получена плазмид phy21EM, несущая ген устойчивости к

эритромицину внутри открытой рамки считывания гена фитазы. Фрагмент рестрикции по сайтам KpnI и PstI был использован в качестве нокаутирующей последовательности ДНК.

Этой ДНК трансформировали клетки B. subtilis 168 и высевали на среду с эритромицином. Клоны, растущие на среде с антибиотиком, анализировали с помощью ПЦР. Анализ показал, что в геномной ДНК всех штаммов присутствует ген устойчивости к эритромицину. ПЦР с праймеров, комплиментарных к гену фитазы с клона №1 дала продукт большей молекулярной массы, чем с геномной ДНК исходного штамма.

Эти данные подтверждают, что произошла гомологичная рекомбинация и ген устойчивости к эритромицину встроился в открытую рамку считывания гена фитазы. Полученный мутантный штамм был обозначен как Bacillus subtilis dPHY.

Штамм Bacillus subtilis dPHY не проявляет активности по отношению к специфическому субстрату, в отличие от контрольного штамма. Это является биохимическим доказательством отсутствия активного гена фитазы в клетках B. subtilis dPHY.

Как показали результаты микрокопирования (36-часовой культуры), полученный штамм с нокаутированным геном фитазы не имеет существенных морфологических отличий по сравнению с исходным.

‘MOORELLA QUINOLICA’ SP. NOV. – НОВАЯ ТЕРМОФИЛЬНАЯ

АНАЭРОБНАЯ БАКТЕРИЯ ИЗ НАЗЕМНЫХ ГИДРОТЕРМ КАМЧАТКИ

Я. Н. Непомнящая1, Г. Б. Слободкина2

, Т. В.Колганова3, Е. А. Бонч-Осмоловская2

,

А. И. Нетрусов1, А. И. Слободкин2

1Московский государственный университет им. М.В. Ломоносова, Биологический факультет, Москва, Россия

2Институт микробиологии им. С.Н. Виноградского РАН, Москва, Россия 3Центр биоинженерии РАН, Москва, Россия

На сегодняшний день известно несколько представителей термофильных анаэробных бактерий рода Мoorella. Большинство из них имеет гомоацетатный тип метаболизма и отличается способностью использовать широкий ряд органических и неорганических соединений в том числе токсичных.

Из пробы осадка и воды наземной пресной гидротермы Долины гейзеров была выделена анаэробная термофильная бактерия. Штамм SQL был выделен на базовой анаэробной среде с лактатом в качестве потенциального донора электронов, ферригидритом (70мМ), заключенным в гранулы альгината (1,5%) и 9,10-антрахинондисульфонатом (АХДС) (0,1мМ). Выделение штамма и все эксперименты проводились с газовой фазой 100% СО2.

Клетки изолята представляют собой подвижные прямые палочками с латеральным

43

жгутикованием. Размер клеток при росте на большинстве исследуемых субстратах составляет 0,3–0,4мкм в диаметре и 1,3–4,8 мкм в длину. Развитие терминальных спор происходит в поздней экспоненциальной фазе роста. Размножение клеток происходит бинарным делением.

Штамм SQL способен расти в диапазоне температур 46–70°С, с оптимумом при 65°С. При росте на АХДС (20 мМ), в качестве акцептора электронов, спектр субстратов включал лактат, пируват, сукцинат. Рост отсутствовал на ацетате, пропионате, бутирате, формиате, глицерине, метаноле, этаноле, бутаноле, оксолате и бензоате. В отсутствие акцепторов электронов наблюдалось сбраживание следующих органических субстратов (20мМ): фруктоза, галактоза, мальтоза, сахароза, арабиноза, ксилоза, дрожжевой экстракт (0,2 г/л) и пептон (13 г/л). Рост отсутствовал на глюкозе, маннозе, целлобиозе и альгинате. Кроме АХДС в качестве акцептора электронов выступали нитрат (10мМ), тиосульфат (20мМ) и перхлорат (10мМ). Сульфат (20мМ), сульфит (20мМ), фумарат (10мМ), цитрат Fe(III) (10мМ), Fe(III)-ЭДТА (10мМ) и ферригидрит (80 мМ) не поддерживали роста штамма SQL.

Анализ последовательности гена 16S рРНК показал, что штамм SQL филогенетически близок к представителям спорообразующих грамположительных бактерий рода Moorella (Thermoanaerobacteraceae, Firmicutes); наиболее близкий организм – Мoorella glycerini (96% гомологии).

Сравнение морфологических, физиолого-биохимических и филогенетических характеристик штамма SQL с известными на сегодняшний день термофильными бактериями рода Мoorella показало, что они отличаются по фенотипическим признакам, спектру утилизируемых субстратов, используемым акцепторам электронов и последовательности гена 16S рРНК. Обнаруженные особенности позволяют отнести выделенный штамм SQL к новому виду бактерий рода Moorella – ‘Morella quinolica’ sp.nov.

44

СРАВНЕНИЕ ПРОФИЛЕЙ АНТИБИОТИКОРЕЗИСТЕНТНОСТИ

PSEUDOMONAS AERUGINOSA И ACINETOBACTER BAUMANNII,

ЦИРКУЛИРУЮЩИХ В МНОГОПРОФИЛЬНОМ СТАЦИОНАРЕ

Н. В. Николаева1, М. В. Кузнецова1,2

1ГОУ ВПО ПГМА им. ак. Е.А. Вагнера Росздрава, Пермь, Россия 2Институт экологии и генетики микроорганизмов УрО РАН, Пермь, Россия

Грамотрицательные неферментирующие бактерии, в том числе P. aeruginosa и

A. baumannii, обладают различными механизмами устойчивости к антибактериальным препаратам (В.А. Руднов, 2002; М.Н. Зубков, 2003; Г.К. Решедько и соавт., 2006). Однако, учитывая широкое распространение как внутри-, так и межвидовой передачи детерминант резистентности, в конкретном стационаре у представителей близкородственных родов могут формироваться и одинаковые фенотипы антибиотикочувствительности, а у отдельных штаммов соименных видов, циркулирующих в разнопрофильных отделениях, – разные (С.В. Сидоренко, В.Е. Колупаев, 2004).

Цель исследования: сравнительный анализ спектров устойчивости к антибактериальным препаратам штаммов P. aeruginosa и A. baumannii, изолированных в крупном ЛПУ, в зависимости от профиля отделения.

Изучено 62 штамма P. аeruginosa и 40 – A. baumannii из многопрофильного ЛПУ г. Перми. Определение антибактериальной активности цефазолина, цефтазидима, цефепима, имипенема, амикацина, ципрофлоксацина, гентамицина и левомицетина проводили диско-диффузионным методом (МУК, 2004). Исследуемые штаммы были выделены в следующих отделениях: экстренной хирургии (ЭХО), торакальной хирургии (ТХО), реанимации и интенсивной терапии (ОРИТ), сердечно-сосудистой хирургии (ОССХ).

Установлен высокий процент полирезистентных штаммов как P. аeruginosa (94%), так и A. baumannii (90%). Практически все изоляты обоих видов характеризовались устойчивостью к цефазолину и левомицетину (рис. 1). В отношении других препаратов прослежены некоторые особенности. Все культуры A. baumannii отличала наибольшая резистентность к взятому спектру, за исключением имипенема, к которому штаммы синегнойной палочки были достоверно более устойчивы. Это связано, в частности, с выработкой различных карбопенемаз P. аeruginosа и нарушением транспорта антибиотика через специфические пориновые каналы, что не типично для ацинетобактера.

Культуры неферментирующих бактерий, изолированные в различных отделениях, обладали разной устойчивостью к антибактериальным препаратам. Например, доля резистентных штаммов P. аeruginosa к амикацину составила от 33,3% (ТХО) до 100% (ОССХ), процент устойчивых культур к цефепиму – 60%, 88,9% и 100% в ЭХО, ТХО и ОССХ, соответственно. Имипенемрезистентных изолятов A. baumannii выявлено от 20% (ОРИТ) до 63,6% (ЭХО). По-видимому в разных отделениях с учетом их специфики, используются «свои» схемы антибиотикотерапии, что способствует формированию различных профилей у одного вида бактерий.

45

0 10 20 30 40 50 60 70 80 90 100

цефазолин

цефтазидим

цефепим

имипенем

гентамицин

амикацин

левомицетин

ципрофлоксацин

%

P.aeruginosa

A.baumannii

Рис. 1. Профили антибиотикорезистентентности P. аeruginosa и A. baumannii.

Установлено, что в отдельных подразделениях стационара фенотипы резистентности

представителей двух исследуемых родов неферментирующих бактерий не совпадают. Вместе с тем, идентичные уровни чувствительности к 2–3 препаратам выявлены во всех отделениях. Штаммы P. аeruginosa более резистентны в ОРИТ, ОССХ, а A. baumannii – в ЭХО. Возможно, это связано с длительной циркуляцией синегнойной палочки, обладающей высокой пластичностью и разнообразными механизмами устойчивости, в высокоспециализированных отделениях, тогда как ацинетобакторы в этих условиях быстро элиминируются.

Отмечен высокий уровень устойчивости P. аeruginosa и A. baumannii к основным группам антибактериальных препаратов. В тенденциях формирования спектров резистентности у бактерий родственных и соименных видов, циркулирующих в одних условиях, прослеживается сходство, тогда как штаммы одного вида, изолированные в разных отделениях, могут существенно различаться вследствие специфики последних.

ПОЛИАМИНЫ СПОСОБСТВУЮТ ФОРМИРОВАНИЮ

НИЗКОУРОВНЕВОЙ УСТОЙЧИВОСТИ ESCHERICHIA COLI

К ФТОРХИНОЛОНАМ

Л. Ю. Нестерова

Институт экологии и генетики микроорганизмов УрО РАН, Пермь, Россия.

Формирование резистентности бактерий к антибиотикам - неизбежное следствие широкого применения антимикробных препаратов. Фторхинолоны – это класс антибиотиков, наиболее часто используемых для лечения бактериальных инфекций. Его широкое использование привело к быстрому возрастанию фторхинолоновой резистентности. Устойчивость к хинолонам наиболее часто формируется в результате специфических

46

мутаций в генах, кодирующих белки-мишени (ДНК-гираза, топоизомераза IV). Однако, наряду с этим, обнаружены неспецифические мутации, которые обусловливают низкоуровневую антибиотикорезистентность и возникают при низких концентрациях антибиотика, что создает условия для формирования устойчивости высокого уровня. Примером таких мутаций являются те, которые приводят к конститутивной сверхэкспрессии регулона множественной лекарственной устойчивости marA, а также регулона антиоксидантной защиты soxS. Продукты этих генов участвуют в адаптации Escherichia coli к различным неблагоприятным факторам среды. Известно, что в адаптации ко многим стрессовым факторам принимает участие также σS субъединица РНК-полимеразы и низкомолекулярные клеточные поликатионы полиамины. Ранее было показано возрастание уровня этих соединений в клетках Escherichia coli при культивировании в присутствии сублетальных концентраций фторхинолонов. Исходя из этого, целью настоящей работы является оценка уровня экспрессии гена rpoS, кодирующего σS субъединицу РНК-полимеразы, и активности полиаминсинтезирующей системы у мутантов, устойчивых к различным концентрациям фторхинолона 3 поколения левофлоксацина, которые были селекционированы в лабораторных условиях.

Селекционированные мутанты были производными родительского штамма, несущего генное слияние rpoS::lacZ, и обладали β-галактозидазной активностью. Среди них частота встречаемости клонов, у которых активность полиаминсинтезирующей системы отличалась от родительского штамма, составляла около 67%. Минимальные ингибиторные концентрации этих штаммов значительно варьировали и превышали МИК исходного штамма в 5–300 раз. По этому признаку все исследуемые мутанты были условно подразделены на 3 группы: чувствительные (до 2мкг/мл), переходные (2-8 мкг/мл) и устойчивые (более 8 мкг/мл).

У 33% исследованных клонов базовый уровень путресцина, который является модулятором экспрессии адаптивных генов, превышал его содержание в клетках родительского штамма. По уровню антибиотикоустойчивости большинство клонов относились к переходной группе. Содержание полиамина кадаверина, регулятора проницаемости пориновых каналов, через которые в клетку поступают фторхинолоны, было повышено у 50% мутантов. Наибольшие значения по этому показателю наблюдались у клонов, относящихся к группам чувствительных и переходных. Причиной возрастания содержания кадаверина в мутантных штаммах явилась повышенная активность ферментов его синтеза, двух изоформ лизиндекарбоксилазы, LdcC и CadA. Мы обнаружили, что базовый уровень активности CadA превышал уровень родительского штамма у 39% клонов, и большинство из них относились к группе чувствительных. В то же время большая часть клонов с переходной устойчивостью обладала повышенной активностью LdcC лизиндекарбоксилазы. Известно, что активность этой изоформы фермента находится под контролем σS субъединицы РНК-полимеразы. Повышенным уровнем базовой активности rpoS по сравнению с исходным штаммом обладали более 80% исследованных клонов. У мутантов из чувствительной группы данный показатель в среднем в два раза превышал исходный. Еще выше активность rpoS была у большинства переходных и устойчивых штаммов. Известной функцией RpoS является его участие в регуляции количества

47

пориновых каналов, что может оказывать влияние на антибиотикочувствительность посредством изменения проницаемости клеток.

Таким образом, большая часть полученных мутантов с повышенной устойчивостью к левофлоксацину, обладающих высоким базовым содержанием полиаминов, относятся к группам чувствительных и переходных. Повышенный уровень кадаверина в этих клонах обусловлен высокой активностью фермента его синтеза. Причем у чувствительных штаммов преобладала повышенная активность лизиндекарбоксилазы СadA, тогда как у переходных – лизиндекарбоксилазы LdcC, как следствие высокого содержания у них траскрипционного регулятора RpoS. В свою очередь, на синтез RpoS положительное влияние может оказывать высокое содержание путресцина, характерное для клонов, относящихся к данной группе. Исходя из полученных данных, обоснованным кажется предположение о существовании механизма формирования антибиотикорезистентности к фторхинолонам при участии полиаминов, что, наряду с селекционированными клонами, по-видимому, может наблюдаться и в природных популяциях микроорганизмов. Проверка данного предположения является предметом дальнейших исследований.

Работа выполнена по программе МКБ Президиума РАН и поддержана грантом РФФИ (09-04-99006-р-офи).

АМИДАЗЫ НИТРИЛТРАНСФОРМИРУЮЩИХ ПОЧВЕННЫХ БАКТЕРИЙ

Ю. А. Павлова1,2, А. Ю. Максимов1,2

1Пермский государственный университет, Пермь, Россия 2Институт экологии и генетики микроорганизмов УрО РАН, Пермь, Россия

Амидазы – ферменты, катализирующие гидролиз амидов с образованием

соответствующих карбоновых кислот и аммония. [1]. Известно, что у ряда бактерий амидазы вовлечены в метаболизм нитрилов.

У бактерий известны гидролитические пути метаболизма нитрилов: двустадийный гидролиз, в котором участвуют два фермента – нитрилгидратаза (КФ 4.2.1.84) и амидаза (КФ 3.5.1.4) и одностадийный гидролиз, осуществляемый нитрилазой (КФ 3.5.5.1).

R N R NH2

O

R OH

OOH

2 OH2

NH3

R N R OH

O

OH2 NH

3

НитрилгидратазаКФ 4.2.1.84

АмидазаКФ 3.5.1.4

+ -

Нитрилаза КФ 3.5.5.1

+2 -

Нитрилгидратазный путь

Нитрилазный путь

+

Бактерии, обладающие высокой амидазной активностью, могут быть использованы как биокатализаторы синтеза акриловой, никотиновой и других карбоновых кислот.

48

Успешное применение микроорганизмов в промышленном синтезе зависит от свойств биокатализатора: скорости гидролиза нитрила, pH- и термостабильности фермента.

Цель настоящей работы: изучение бактерий, метаболизирующих амиды карбоновых кислот, выявление и секвенирование генов амидазы.

В результате селекции из образцов почв нами выделены 32 культуры грамположительных бактерий, активно метаболизирующие амиды и нитрилы, обладающие амидазной активностью (более 5 мкмоль/мг/мин), значительно превышавшей нитрилгидратазную в широком интервале температур. Методами полифазной таксономии, а также путем анализа генов 16S рРНК изоляты идентифицированы как R. erythropolis,

R. rhodochrous, R. ruber, Arthrobacter sp. Установлено, что наилучшими субстратами для ферментов большинства изолятов

являются ацетамид и пропионамид. Никотинамид и бензамид гидролизовались с меньшей скоростью. Показано, что большинство амидаз Rhodococcus термостабильны и обладают повышенной активностью при температуре 50°С.

Проведен ПЦР-анализ генов ферментов гидролиза нитрилов с применением набора праймеров, специфичных к известным в настоящее время видам амидаз [2], нитрилгидратаз и нитрилаз. Выявлены фрагменты ДНК штаммов Rhodococcus, гомологичные генам амидаз трех типов: R. erythropolis (AY026386, GenBank), R. erythropolis (M88614, Genbank), Rhodococcus sp. N-771. Показано, что геномы изолятов Rhodococcus содержат преимущественно две группы последовательностей, родственные ранее известным генам амидаз R. erythropolis, GenBank (I группа), E12517 и R. erythropolis, GenBank, M88614

(II группа). Гены амидаз других видов встречались со значительно меньшей частотой. Проведено секвенирование полученных ПЦР-фрагментов с помощью системы

MegaBase1000. Установлено, что гомология ПЦР-фрагментов первой группы к известной последовательности E12517 составляет от 94 до 99%. У некоторых штаммов обнаружен ряд замен и коротких делеций, что, вероятно, обуславливает наблюдаемые различия в субстратной специфичности.

Большинство штаммов также содержали последовательности, родственные генам α- и β- субъединиц Fe-содержащей нитрилгидратазы.

Работа поддержана ФЦП «Научные и научно-педагогические кадры инновационной России на 2009 - 2013 годы» (ГК№ 02.740.11.0078) и грантом РФФИ №07-04-96071.

1. Fournand D., Arnaud A. Aliphatic and enantioselective amidases: from hydrolysis to acyl

transfer activity // J. Appl. Microbiol. – 2001. – V. 91. – P. 381-393. 2. Перцович С.И., Гуранда Д.Т., Подчерняев Д.А., Яненко А.С., Швядас В.К. // Биохимия. –

2005. – Т.70. – С.1556-1565.

49

УГЛЕВОДОРОДОКИСЛЯЮЩИЕ БАКТЕРИИ ТРОПИЧЕСКОГО ВЬЕТНАМА

А. В. Прохоров1, А. Е. Иванова1

, И. А. Борзенков1, В. А. Карпов2

1 Институт микробиологии им С.Н. Виноградского РАН, Москва, Россия 2 Институт проблем экологии и эволюции им. А.Н. Северцова РАН, Москва, Россия

Сырая нефть, нефтепродукты и многие их производные занимают особое положение в

хозяйственной деятельности человека и проблеме сохранения их качества, с одной стороны, и защите окружающей среды от загрязнения подобными ксенобиотиками, с другой, во всем мире уделяется большое внимание. В условиях влажных тропиков многие аспекты жизнедеятельности углеводородокисляющих бактерий, ответственных за самоочищение загрязненных экотопов и порчу углеводородсодержащих материалов, остаются малоисследованными вследствие отсутствия в коллекциях соответствующих культур микроорганизмов. Тропический Вьетнам представляет уникальную возможность для заполнения этого пробела в знаниях. В фокусе этой проблемы интерес представляют как микроорганизмы малонарушенных ладштафтов (для изучения самоочищающей способности, присущей природным популяциям), так и специфическая микрофлора техногенных объектов и загрязненных территорий.

Основным природным резервуаром, из которого происходит пополнение микроорганизмами наземных объектов, является почва. Поэтому мы исследовали углеводородокисляющие бактерии в составе почвенной микрофлоры образцов, отобранных на климатических испытательных станциях Хоа Лак (Северный Вьетнам) и Дам Бай (Центральный Вьетнам). Кроме того, изучали технофильную микрофлору, населяющую объекты авиационной техники, находящиеся в условиях консервации в условиях гумидного климата Вьетнама. Всего было выделено 45 чистых культур аэробных микроорганизмов, доминирующих в составе сообщества. Для обеих станций на фоне высокой общей численности органотрофных бактерий (107–1011 КОЕ/г почвы) характерен ограниченный спектр доминирующих видов и значительное преобладание грамположительных микроорганизмов.

По результатам анализа последовательности генов 16S рРНК бактерии принадлежали к трем основным крупным филогенетическим филам: Firmicutes (Bacillus, Brevibacillus,

Staphylococcus), Actinobacteria (Micrococcus, Brevibacterium, Gordonia, Dietzia,

Mycobacterium, Rhodococcus, Microbacterium, Arthrobacter) и Proteobacteria –

α-(Ochrobactrum), β-(Achromobacter, Chromobacterium, Cupriavidus) и γ-подкласса (Pseudomonas, Pseudoxanthomonas, Acinetobacter), с огромным преобладанием первых двух групп. Уровень сходства нуклеотидных последовательностей генов 16S рРНК и выявленные нами существенные фенотипические отличия между новыми изолятами и ближайшими известными родственными организмами позволяет предположить, что по крайней мере часть выделенных штаммов принадлежит к новым таксонам.

Многие представители этих филумов известны как технофильные микроорганизмы и активные деструкторы приоритетных экотоксикантов. Согласно результатам настоящей работы, большинство выделенных нами бактериальных штаммов способно использовать сырую нефть и соединения углеводородной природы в качестве единственного источника

50

углерода и энергии. Исследуемая микрофлора имеет высокий деструкционный потенциал в отношении изопреноидов (терпенов и терпеноидов), нефтяных углеводородов (алканов, аренов, полициклических ароматических соединений) и их производных, таких как фенолы, крезолы, карбоновые кислоты, органические спирты и др.

Исследованные нами почвенные местообитания можно отнести к категории «условно чистых». Населяющая их микрофлора, в целом, типична для муссонного тропического климата, специфических ферраллитных почв Вьетнама и имеет ряд адаптивных черт для существования в условиях повышенной солнечной инсоляции, выраженного сухого и избыточно влажного периодов, низкого содержания доступной почвенной органики, резких перепадов температур. К числу подобных особенностей выделенных мезофильных органотрофных бактерий следует отнести способность активно функционировать при повышенных температурах (45-55°С), рост на голодном агаре, образование пигментов и спор.

Высокая биологическая валентность исследуемой микрофлоры и ее катаболический потенциал представляют несомненный интерес, как для работ прикладного характера (биодеструкция и биоремедиация), так и с точки зрения фундаментальной науки, в плане расширения наших знаний о многообразии микробного мира малоисследованных тропических местообитаний.

Работа проводится в рамках совместной Программы исследований ИНМИ РАН и ИПЭЭ РАН по изучению тропикостойкости материалов в условиях тропического климата (тема «Эколан Т-1.5») и международного гранта РФФИ № 08-04-90305.

ПРОТЕОЛИТИЧЕСКАЯ АКТИВНОСТЬ

В ЩЕЛОЧНЫХ ГИДРОТЕРМАХ ПРИБАЙКАЛЬЯ

А. А. Раднагуруева, Е. В. Лаврентьева

Институт общей и экспериментальной биологии СО РАН, Улан-Удэ, Россия

Важную роль в природных экосистемах играют внеклеточные гидролитические ферменты, выделяемые в среду, в основном микроорганизмами, обеспечивая высокие скорости деструкции органических веществ и их перераспределение между компонентами природных экосистем. Ведущую роль в процессе деструкции играют внеклеточные протеолитические ферменты, которые осуществляют гидролиз ряда пептидных связей в молекулах белков.

Цель исследования – определение активности внеклеточных протеаз в нативных образцах термальных источников Прибайкалья.

Исследуемые источники (Умхей, Гарга, Сеюя, Алла, Гусихинский) характеризуются широкими значениями температур по изливу от 30 до 74°С и рН от 8,2 до 10,6. Вода источников является сульфатно-гидрокарбонатной натриевой. Были исследованы пробы воды, донных отложений и цианобактериальных матов

Численность протеолитических бактерий в донных осадках и микробных матах варьировала в пределах от 10 до 105 клеток/см3. Наибольшее число микроорганизмов

51

обнаружено в поверхностном микробном мате источника Сеюя (105) и в донных осадках источника Алла (105).

Изучение протеазной активности на различных синтетических субстратах показало, что максимальная активность по субстрату ВАРА обнаружена в источнике Алла – 0,646 ед. Также отмечена высокая активность, по данному субстрату, в пробах донных осадков источников Сеюя и Умхей, и составила 0,556 и 0,587 ед., соответственно. В образцах источников Гусихинский и Гарга протеолитическая активность по ВАРА была низкой. Активность по субтилизинподобному субстрату GlpAALpNA была низкой во всех исследуемых источниках, за исключением источника Сеюя. Максимальное значение активности обнаружено в образце поверхностного цианобактериального мата – 0,437 ед.

Рис. 1. Общая протеолитическая активность по субстрату желатина

Определение общей протеолитичекой

активности по белковому субстрату (1%-ный желатин) показало, что наиболее активное разложение субстрата выявлено в источнике Сеюя, максимальная активность которого составила 1,085 ед. и проявилась в

поверхностном цианобактериальном мате. Пробы из других источников характеризовались более низкими активностями, и доходили до 0,508 ед.

Полученные результаты показывают, что в изученных гидротермах характерна сравнительно невысокая численность протеолитиков, но секретируемые ими внеклеточные протеазы характеризуются различным спектром. Выявлено, что на протеазную активность оказывают существенное влияние тип субстрата.

ВЛИЯНИЕ ФИЗИОЛОГИЧЕСКОГО СОСТОЯНИЯ

PSEUDOMONAS FLUORESCENS БИМ B–86

НА ИНФИЦИРОВАНИЕ КЛЕТОК ФАГОМ BV–1

Д. В. Рахуба, Г. И. Новик

ГНУ «Институт микробиологии НАН Беларуси», Минск, Беларусь

Изучение фаговой инфекции в различных условиях культивирования бактерий представляет значительный интерес для понимания закономерностей распространения бактериофагов и их хозяев, а также путей эволюции и быстрой изменчивости вирусов в природной среде. Кроме того, интерес к изучению бактериофагов связан с возможностью использования их как средства биологического контроля для борьбы с возбудителями болезней растений, животных и человека. Бактериофаг BV-1 является одним из фагов, составляющих основу препарата «Пентафаг», разработанного для борьбы с фитопатогенными бактериями Pseudomonas fluorescens, которые поражают овощные, бобовые, зерновые, плодовые и другие сельскохозяйственные растения. Целью работы

Сеюя

(ил)

Сею

я(пов.

мат

)

Гусиха

(ил)

Гарга

(ил)

Алла

(ил)

Умхей

(ил)

Р10

0,2

0,4

0,6

0,8

1

1,2

ед.

52

явилось изучение влияния ряда физиологических состояний клетки-хозяина, при различных условиях культивирования, на протекание вирусной инфекции фага BV-1.

Изучено влияние возраста культуры бактерий Pseudomonas fluorescens БИМ В-86, на скорость лизиса клеток бактериофагом BV-1. Установлено, что с увеличением возраста культуры, увеличивается время необходимое для лизиса. Бактерии, выращиваемые в течении 48 часов были устойчивы к инфицированию бактериофагом. Также отмечено различие титра фага в конечном фаголизате. Так, с увеличением возраста культуры, титр фага достоверно снижался. Также было изучено влияние множественности заражения на скорость протекания вирусной инфекции. Установлено, что при соотношении хозяин/фаг 1:1 скорость лизиса была максимальной. При увеличении данного соотношения до 1:0.1 и 1:0,01 скорость лизиза снижалась. Однако, самый высокий титр фага в конечном лизате был обнаружен при соотношении хозяин/фаг 1 : 0,01. При исследовании влияния температуры культивирования бактерий на их инфицирование фагом BV-1, наиболее быстрый лизис а также самый высокий титр фага в конечном лизате наблюдался у культуры, выращенной при 27°С. При снижении температуры скорость лизиса и конечный титр фага также снижались. При повышении температуры до 30 и 32°С бактерии были устойчивы к фагу и лизис не наблюдался.

Таким образом, полученные данные свидетельствуют о том, что механизмы устойчивости бактерий Pseudomonas fluorescens к инфицированию фагом связаны с температурой культивирования бактерий, а также с возрастными изменениями клеток. Множественность инфекции также оказывает влияние на протекание вирусной инфекции.

ИЗМЕНЕНИЕ УЛЬТРАСТРУКТУРЫ КЛЕТОК

ЭКСТРЕМАЛЬНО НАТРОНОФИЛЬНОЙ ЦИАНОБАКТЕРИИ

‘EUHALOTHECE NATRONOPHILA’ ПРИ СНИЖЕНИИ КОНЦЕНТРАЦИИ

CO32–

+ HCO3– В СРЕДЕ КУЛЬТИВИРОВАНИЯ

О. С. Самылина1, А. Г. Маркелова2

, М. П. Синетова2, Л. М. Герасименко1

1Институт микробиологии им. С.Н. Виноградского РАН, Москва, Россия 2Институт физиологии растений им. К.А. Тимирязева РАН, Москва, Россия

‘Euhalothece natronophila’ – экстремально натронофильная одноклеточная

цианобактерия, выделенная из рапы содового озера Магади. Организм облигатно нуждается в высоких концентрациях растворённых карбонатов: максимально высокий урожай биомассы был получен при 1.7 М CO3

2- + HCO3- (что соответствует 180 г/л Na2CO3) и рН

10-10.5. Клетки ‘E. natronophila’, выращенные на средах с концентрацией карбонатов 1 М и

более, круглые, диаметром 2.7–4 мкм. Ранее нами было показано (Миходюк и др., 2008; Самылина и др., 2009), что при снижении концентрации карбонатов в среде клетки ‘E. natronophila’ преобразуются в инволюционные формы: утолщённые неровные палочки размерами до 10–17–(23) × 3.5–4 мкм при 0.2 М CO3

2- + HCO3- в среде. Эти клетки бледные и

менее жизнеспособные, о чём свидетельствует возрастающее содержание каротиноидов и уменьшение содержания хлорофилла а в таких условиях. По нашим данным подобные

53

преобразования происходят при концентрации CO32- + HCO3

- в среде менее 0.8 М (рН 10) даже при условии сохранения оптимальной молярности среды по Na+.

В данной работе мы рассматриваем изменение ультраструктуры клеток ‘E. natronophila’ при снижении концентрации CO3

2- + HCO3- до 0.5 М в среде с общей минерализацией 1.8 М.

В качестве контроля использовали клетки, выращенные при 1 М CO32-+HCO3

- в среде с тем же общим содержанием солей.

Контрольные клетки ‘E. natronophila’, которые использовались в качестве посевного материала на обоих вариантах сред, имеют овальную форму. Слои оболочки хорошо выражены, с внешней стороны видны тяжи слизи, перпендикулярные поверхности клетки. Тилакоиды расположены параллельно оболочке, но часто виден также пучок тилакоидов, пересекающий центр клетки. Нуклеоид расположен в центре клетки. Из включений хорошо видны цианофициновые гранулы, иногда встречаются карбоксисомы (1–2 на срез). Некоторые клетки содержат углеводы, а также другие включения различной электронной плотности. Кроме того, в клетках довольно часто встречаются полимембранные структуры – так называемые, ламелласомы (Громов, 1976) – в виде лабиринтиков, располагающихся среди тяжей тилакоидов недалеко от плазматической мембраны.

Уже на первые сутки инкубирования при 0.5 М CO32- + HCO3

- наблюдаются изменения ультраструктуры клеток ‘E. natronophila’. Эти изменения в дальнейшем прогрессируют, что позволяет выделить несколько линий (типов) клеток, различающихся по особенностям ультраструктуры.

Тип 1. Клетки почти прозрачные, с рыхлыми тилакоидами и большим количеством карбоксисом (до 12 на срез). Клетки явно крупнее контрольных, часто уже не сохраняют овальную форму, а вытягиваются. Слизи вокруг клеток практически нет.

Тип 2. Клетки с сильно раздувшимися тилакоидами, содержащие много ламелласом, часто с неструктурированным содержимым. Слизи или нет совсем, или очень мало. Постепенно клетки этого типа деградируют – практически всё содержимое собирается в сгустки, примыкающие к оставшимся тилакоидам и окружающие конгломераты карбоксисом.

Тип 3. Эти клетки представляются наиболее жизнеспособными, поскольку в целом сохраняют исходную ультраструктуру. Тилакоиды не расширенные, с характерным расположением по периферии. Клеточная стенка кажется утолщенной, есть тяжи слизи. Карбоксисом меньше, чем в типах 1 и 2.

Важной особенностью опытных клеток является образующийся дополнительный внешний слой, либо сплошной и плотный, либо в виде отдельных чешуек, которые выглядят на срезах спирально закрученными. Такую оболочку имеют все клетки, сохранившие видимую жизнеспособность до конца опыта. Клетки, создавшие такую дополнительную защиту в первые дни воздействия неблагоприятных условий, но впоследствии утратившие ее – погибают.

Морфология контрольных клеток в процессе роста не изменяется, но по своей ультраструктуре клетки делятся примерно на те же три типа, что и в опытных вариантах: 1) клетки невысокой электронной плотности (часто имеющие повреждения клеточной стенки и, видимо, погибшие); 2) клетки с вздувшимися в различной степени тилакоидами; 3) клетки, которые не изменяют значительно свою структуру, по сравнению с началом роста.

54

Таким образом, показано, что расхождения в судьбе клеток при выращивании на пониженной концентрации CO3

2- + HCO3- сходны с таковыми при росте культуры в

стандартных условиях, но на неоптимальной среде изменения в ультраструктуре происходят более резко и сопровождаются изменениями морфологии клеток.

Работа выполнена при финансовой поддержке гранта Президиума РАН «Происхождение и эволюция биосферы», госконтракта с Роснаукой № 02.512.12.0027 (руководитель Г.А. Заварзин) и гранта РФФИ № 08-04-00804-а. 1. Громов Б.В., 1976. Ультраструктура синезелёных водорослей. Л., «Наука», 91 с. 2. Миходюк О.С., Герасименко Л.М., Акимов В.Н., Ивановский Р.Н., Заварзин Г.А., 2008.

Экофизиология и полиморфизм одноклеточной экстремально натронофильной одноклеточной цианобактерии Euhalothece sp. Z-M001 из озера Магади. Микробиология, 77, №6, 805-813.

3. Самылина О.С., Герасименко Л.М., Ивановский Р.Н., 2009. Морфологическая изменчивость экстремально натронофильной цианобактерии ‘Euhalothece natronophila’ в зависимости от условий культивирования. Бюллетень Московского общества испытателей природы. Отдел биологический, 114, вып. 2, приложение 1 «Физиология и генетика микроорганизмов в природных и экспериментальных системах», 186-189.

УЧАСТИЕ СВЕРХСПИРАЛИЗАЦИИ ДНК

В РЕГУЛЯЦИИ ЭКСПРЕССИИ СТРЕСС–ИНДУЦИРУЕМЫХ ГЕНОВ

ЦИАНОБАКТЕРИИ SYNECHOCYSTIS SP. PCC 6803

М. П. Синетова, А. А. Зорина, Д. А. Лось

Институт физиологии растений им. К. А. Тимирязева РАН, Москва, Россия Уровень отрицательной сверхспирализации ДНК в бактериальных клетках

контролируют две топоизомеразы: ДНК-гираза увеличивает его, а ДНК-топоизомераза I снижает. Мы изучали экспрессию стресс-индуцируемых генов цианобактерии Synechocystis sp. PCC 6803 в условиях холодового (20°С, 30 мин), солевого (0,5 М NaCl, 30 мин) и теплового стресса (44°С, 30 мин) в присутствии ингибитора ДНК-гиразы новобиоцина (50 мкг/мл) и в его отсутствии с использованием ДНК-микрочипов. Данные для ряда стресс-индуцируемых генов, полученные с использованием ДНК-микрочипов, были подтверждены методом Нозерн-гибридизации. Средние данные из всех вариантов анализа на микрочипах (контроль: 34°С, 50мкг/мл новобиоцина; солевой, холодовой и тепловой стрессы с новобиоцином и без новобиоцина) были логарифмированы и подвергнуты иерархическому кластерному анализу с помощью программы Cluster 3.0.

Кластерный анализ показал, что существует три больших группы генов, экспрессия которых меняется по-разному в ответ на стрессовые воздействия и добавление новобиоцина. В первую группу (540 генов) входят гены, индукция которых уменьшается при добавлении новобиоцина в различных стрессовых условиях. В основном это гены, отвечающие за синтез

55

пигментов, формирование и работу фотосинтетического аппарата, фиксацию CO2, синтез ферментов пентозо-фосфатного цикла, синтез нуклеотидов, аминокислот, полисахаридов, синтез клеточных покровов. Эта группа содержит также один нетипичный кластер генов, индуцируемых холодом и ингибируемых добавлением новобиоцина. Сюда входят в том числе хорошо изученные гены десатураз и гены, участвующие в синтезе клеточной стенки.

Во вторую группу (361 ген) входят гены, которые различным образом регулируются новобиоцином при разных стрессовых условиях. В эту группу входит кластер, состоящий в основном из генов рибосомальных белков и тРНК и генов, отвечающих за синтез аминокислот и нуклеотидов. Экспрессия этих генов несколько увеличивается при солевом шоке, и снижается при добавлении новобиоцина. Холодовой шок вызывает индукцию этих генов, при добавлении новобиоцина их индуцибильность снижается. Индукция холодовым стрессом генов, необходимых для процесса трансляции, наблюдалась также у дрожжей. В нашей работе было показано, что у Synechocystis индукция этой группы генов зависит от изменения уровня негативной сверхспирализации ДНК, вызванного снижением температуры.

В третью группу (259 генов) входят гены, которые в основном индуцируются в присутствии новобиоцина. Эта группа состоит из трех подгрупп, различающихся по степени своей индуцибельности. В первую подгруппу объединяются гены, слабо индуцируемые солевым и/или холодовым стрессами, но индукция которых резко возрастает в присутствии новобиоцина. Это гены различных транспортеров, хемотаксиса; гены, участвующие в репликации, транскрипции и в регуляции этих процессов. Во вторую подгруппу входят гены, экспрессия которых значительно увеличивается в условиях солевого и/или холодового стрессов, в присутствии новобиоцина их индуцибельность уменьшается. Типичный представитель этой подгруппы кластер 24. Сюда входят хорошо известные индуцируемые холодовым и/или солевым шоком гены hliA, hliB, hliC, feoB,ndhD2, crhR, sigD и др. Интересно отметить, что в этом кластере находятся 8 из 10 генов, индукция которых при солевом стрессе регулируется двухкомпонентной системой Hik33-Rre31. Гистидин-киназа Hik33 является также сенсором холодового стресса. Третья подгруппа состоит из одного кластера генов, экспрессия которых не меняется при холодовом стрессе и увеличивается при солевом и тепловом стрессах. Добавление новобиоцина снижает индуцибельность этих генов в условиях солевого стресса, но не оказывает большого влияния при тепловом стрессе. Это гены шаперонов, протеаз, супероксиддисмутазы, сигма-фактора B, гистидин-киназы Hik34 и другие. В этот кластер входят 16 из 25 генов, индукция которых при солевом стрессе регулируется двухкомпонентной системой Hik34-Rre1. Гистидин-киназа Hik34 участвует также в регуляции экспрессии генов при тепловом стрессе.

Таким образом, анализ экспрессии генов с использованием ДНК-микрочипов показал, что новобиоцин, ингибирующий вызванные различными стрессовыми условиями изменения отрицательной сверхспирализации ДНК, участвует в регуляции транскрипции многих стресс-индуцируемых генов, включая гены, необходимые для адаптации к изменившимся условиям окружающей среды. Функционирование двухкомпонентных систем, участвующих в регуляции ответов на солевой, холодовой и тепловой стрессы (особенно гистидин-киназ Hik33 и Hik34) также зависит от уровня сверхспирализации ДНК.

56

ГЛЮКОЗНЫЙ МЕТАБОЛИЗМ

В КУЛЬТУРЕ LACTOCOCCUS LACTIS SSP. LACTIS BV. DIACETYLACTIS:

ВЛИЯНИЕ ДРОЖЖЕВОГО ЭКСТРАКТА НА РАСПРЕДЕЛЕНИЕ

ПОТОКА ПИРУВАТА ПО КОНЕЧНЫМ ПРОДУКТАМ БРОЖЕНИЯ

В. М. Серебренников, Л. Н. Анорова, А. В. Глазунов

ФГУП ГосНИИгенетика, Москва, Россия

В Lactococcus lactis гликолиз протекает по пути Эмбдена-Мейергофа-Парнаса с образованием пирувата, центрального ключевого соединения в метаболической сети МКБ. Его образование и дальнейшие превращения в конечные продукты находятся под строгим клеточным контролем, механизм которого, несмотря на множество публикаций, остается все еще не вполне ясным. В L. lactis в случае гомоферментативного типа конверсии углерода глюкозы практически весь пируват (до 95%) переводится при участии лактатдегидрогеназы (ЛДГ) в лактат с минимумом образования побочных продуктов. Помимо ЛДГ, еще три фермента участвуют в превращении пирувата: 1) пируватформиатлиаза (ПФЛ) с образованием смеси формиата, этанола и ацетата; 2) пируватдегидрогеназный комплекс (ПДГ), продукты - ацетат и/или этанол;. 3) α-ацетолактатсинтаза (α-АЛС). Трансформация пирувата по последнему пути имеет определяющее значение в формировании вкусовых качеств молочных продуктов. α-Ацетолактат (α-АЛ), образующийся в результате третьей реакции, при участии фермента α-ацетолактатдекарбоксилазы (α-АЛД) превращается в ацетоин (Ац) и в небольших количествах в диацетил (Дц), который придает продуктам характерный масляный аромат. Эта особенность объясняет интерес к культурам, способным к активному синтезу α-АЛ. Некоторые представители L. lactis способны ассимилировать цитрат. Среди них крайне редко встречаются особые культуры, природные мутанты, лишенные α-АЛД. По этой причине они способны накапливать в среде высокие концентрации α-АЛ. [1]

В результате поисковой работы культура такого типа была найдена в коллекции ВКПМ и идентифицирована как мутант по α-АЛД. Цель работы – оценка потенциальных возможностей культуры по образованию α-АЛ в разных физиологических условиях. В настоящем сообщении представлены результаты по изучению распределения пирувата по конечным продуктам в зависимости от состава среды и поступления О2 в среду. Для каждого варианта скорость переноса О2 в среду оценивали по сульфитному числу и на основании этого рассчитывали величину объемного коэффициента массопередачи по кислороду КLa: 9, 15, 25, 37, 60 и 90 ч –1. Также этот ряд был дополнен вариантом в анаэробных условиях. Культивирование проводили на традиционной среде (ТДЭС), содержащей, помимо глюкозы, триптон и дрожжевой экстракт (ДЭ), и на среде ТС того же состава, но без ДЭ.

Исследования позволили установить следующие особенности изучаемой культуры. 1. Во всем диапазоне КLa культура не снижала выхода биомассы, проявляя

толерантность к присутствию О2. Только при 90 ч –1 наблюдалось минимальное образование токсичной перекиси, появление которой – результат защитной реакции L.lactis на присутствие О2. Защита связана с активацией в МКБ при аэробиозе НАДН-оксидазной

57

0

20

40

60

80

100

120

Лактат АЛ Лактат АЛ

концентр

ация, мМ

1 2 3

системы, окисляющей НАДН кислородом с образованием Н2О и Н2О2. По-видимому, в системе защиты преобладает нетоксичный для культуры вариант окисления до Н2О.

2. В анаэробных условиях культура проявила классический тип гомоферментативного брожения с выходом из глюкозы (по сумме конечных продуктов) 97% и выше на обеих средах. Однако в условиях аэрации выход был заметно ниже, около 70% на ТС и 80% на ТДЭС, вероятно, из-за образования каких-то дополнительных продуктов брожения (помимо α-АЛ, ацетата, лактата, формиата, этанола и СО2).

3. ДЭ оказывает сильное влияние на активность действия ПФЛ: концентрация побочных продуктов этого пути была вдвое ниже на ТС, чем на ТДЭС.

4. Обнаружена высокая устойчивость ПФЛ к инактивации О2, обычно нехарактерная для МКБ. Формиат, побочный продукт при строго анаэробных условиях, все еще

присутствовал в среде при ее высокой насыщенности О2 в вариантах 9–25 ч –1.

5. Показано, что выход α-АЛ зависит от состава среды. На ТДЭС выход α-АЛ не превышал 9–18%, что согласуется с данными литературы. На ТС при всех КLa уровень α-АЛ был выше, чем на ТДЭС, но при 37 ч –1 и особенно при 60–90 ч –1 наблюдалось перераспределение потока пирувата от ЛДГ-пути на АЛС-путь (рис.1) без изменения активности ПДГ-пути. В этих условиях максимальный выход α-АЛ составил 40%.

T.M. Cogan (1995) Flavour production by dairy starter cultures. – J. Appl. Bacteriol. Simp. Suppl., 79, 49S – 64S.

- ДЭ

Рис.1. Содержание лактата и α-АЛ в среде с ДЭ и без него 1 – анаэробные условия; 2 – 9 ч –1; 3 – 90 ч –1

+ ДЭ

58

ВЛИЯНИЕ ПОВЫШЕННОГО ТЕМПЕРАТУРНОГО РЕЖИМА

НА СПЕКТР ГИДРОФИЛЬНЫХ МИЦЕЛИАЛЬНЫХ БЕЛКОВ

GRIFOLA FRONDOSA 0917 И LENTINUS EDODES F–249

Л. В. Степанова, Е. П. Ветчинкина, В. Е. Никитина

Институт биохимии и физиологии растений и микроорганизмов РАН, Саратов, Россия

В настоящее время есть все основания полагать, что ценные биологически активные вещества, содержащиеся в высших грибах, представляют собой биохимический материал, обеспечивающий адаптационный потенциал собственно грибного организма. Как известно, грибы демонстрируют уникальные адаптационные возможности с помощью фенотипических модификаций, как правило, не закрепляющихся генетически. Биохимические механизмы, столь быстро срабатывающие в стрессовых условиях роста грибов, пока остаются малоизученными. Особенно это актуально в плане изменений и регуляции белкового состава.

Известно, что при температуре существенно выше или ниже оптимальной, у базидиомицетов меняется состав растворимых углеводов и сахароспиртов [1]. В белковом спектре некоторых изученных базидиомицетов при их культивировании в неблагоприятных условиях обнаружены белки теплового шока, описанные у многих организмов и в настоящий момент относимые к универсальной группе шаперонов.

Настоящее исследование представляет собой первый этап работы по изучению роли и функционирования биологически активных метаболитов базидиальных ксилотрофов в неблагоприятных условиях, а также выявлению их возможной взаиморегуляции. Так, с использованием методов гель-фильтрации и ДДС-Na-электрофореза в ПААГ с последующей специфической окраской, мы отметили, что при культивировании ксилотрофных базидиомицетов Grifola frondosa 0917 и Lentinus edodes F-249 при температуре 37°С, что на 11°С выше оптимальной, в течение 1-х, 2-х и 3-х суток, существенно меняется спектр водорастворимых мицелиальных белков, по сравнению с белковым спектром мицелия грибов, выращенных при нормальном для них температурном режиме. Контрольные культуры имеют гораздо большее разнообразие по белкам и гликопротеинам, чем мицелиальная биомасса, полученная при культивировании с повышенной температурой. При этом наблюдаемые изменения происходят в течение первых суток, в дальнейшем спектр белков меняется незначительно.

Для G. frondosa с первых суток характерно появление четких единичных полос на уровне приблизительно 14, 24 и 27 кДа, при этом основная масса полипептидов, характерных для контроля (15–22 кДа и 28–35 кДа), отсутствует.

В случае L. edodes F-249 отмечено большое разнообразие полипептидов имеющих молекулярную массу ниже 14 кДа, однако их количество в процессе роста культуры в стрессовом температурном режиме уменьшается. Напротив, полипептиды молекулярной массой от 16 до 25 кДа и 31 кДа, присутствующие также и в контроле, сохраняются.

Ранее было установлено, что при культивировании с повышенной температурой в мицелиальных экстрактах L. edodes F-249 в несколько раз увеличивалась лектиновая активность [2]. Было также показано, что молекулы мицелиальных лектинов данного

59

штамма L. edodes содержат субъединицы молекулярной массой 16–30 кДа и данные белки не теряли своей активности при повышенной температуре [3]. Вполне возможно, что неизменные четкие полипептиды на этом уровне в белковом спектре экстрактов мицелия шиитаке являются субъединицами термостабильных лектинов.

Характерное изменение белкового состава мицелия в стрессовых условиях является следствием функционирования регуляторных систем грибного организма и, несомненно, свидетельствует об определенном функциональном значении данных белков. Выяснение принципов их биологического действия, позволит наметить пути адаптационной регуляции высших базидиомицетов.

1. Feofilova E.P., Tereshina V.M., Khokhlova N.S., Memorskaya A.S. Different mechanisms of

the biochemical adaptation of mycelial fungi to temperature stress: changes in the cytosol carbohydrate composition // Microbiology. – 2000. – Vol. 69, No. 5. – Р. 504–508.

2. Цивилева О.М., Никитина В.Е., Гарибова Л.В., Завьялова Л.А., Игнатов В.В. Геммаглютинирующая активность Lentinus edodes (Berk.) Sing [Lentinula edodes (Berk.) Pegler] // Микробиология. – 2000. – Т. 69, № 1. – С. 38–44.

3. Ветчинкина Е.П., Соколов О.И., Никитина В.Е. Выделение и очистка внутриклеточных лектинов Lentinus edodes на разных стадиях развития гриба // Микробиология. – 2008. – Т. 77, № 4. – С. 496–501.

ВЛИЯНИЕ АЦЕТАТА СВИНЦА

НА СТРУКТУРНЫЕ И МОРФОФИЗИОЛОГИЧЕСКИЕ ПОКАЗАТЕЛИ

АЛЬГО–ЦИАНОБАКТЕРИАЛЬНЫХ СООБЩЕСТВ СЕРОЙ ЛЕСНОЙ ПОЧВЫ

А. Д. Темралеева

Институт физико-химических и биологических проблем почвоведения РАН, Пущино, Россия

Исследовали влияние ацетата свинца на структурные и морфофизиологические

показатели альго-цианобактериальных сообществ (АЦС) серой лесной почвы в условиях лабораторного эксперимента. Культивирование проводили в системе «почва-вода» (1 : 3). Свинец вносили в ацетатной форме однократно в концентрациях: 300, 750, 1500 мг/кг серой лесной почвы (в пересчете на катион), что соответствует среднему, высокому и очень высокому уровню загрязнению для почв со слабокислой и кислой реакцией. Контроль оставался чистым (без внесения соли).

Анализ видового состава и структуры АЦС в контроле и опытах выявил уменьшение количества видов АЦС при увеличении концентрации металла от 300 до 1500 мг/кг. Одновременно снижалось общее обилие видов при загрязнении среды ацетатом свинца. Вместе с этим при внесении 300 и 750 мг/кг свинца отмечалось увеличение доли зеленых водорослей и уменьшение доли цианобактерий (цианопрокариот) по сравнению с другими опытами (Таблица).

60

Структурные и морфофизиологические показатели альго-цианобактериальных

сообществ серой лесной почвы

Опыт Количество видов Обилие, баллы

Содержание общего

хлорофилла, мкг/л

( Chl ± σ)

Контроль 9(Сyan6Chloro3) 32(Сyan19Chloro13) 2,25±0,32 300 Pb(Ac)2 9(Сyan5Chloro4) 26(Сyan16Chloro10) 7,97±2,80 750 Pb(Ac)2 8(Cyan4Chloro3Xant1) 24(Cyan10Chloro11Xant3) 0,61±0,35

1500 Pb(Ac)2

6(Сyan4Chloro2) 18(Сyan14Chloro4) 1,21±0,71

Примечание. Сyan – Cyanoprokaryota, Сhloro – Chlorophyta, Хant – Xanthophyta.

Chl – среднее содержание общего хлорофилла, σ – стандартное отклонение.

По данным световой микроскопии виды АЦС в опыте с добавлением 1500 мг/кг свинца визуально отличались от контроля появлением обильной слизи и увеличением слизистого чехла. Кроме того, при микроскопировании этого АЦС были отмечены осветление окраски организмов и наличие большого количества отмирающих клеток. Подобные морфологические изменения, очевидно, вызваны влиянием токсиканта, т.к. в присутствии свинца хлоропласты развиваются слабо, преимущественно у стенок клетки, а ингибирование синтеза хлорофилла визуально выражается в виде хлороза или осветления клеток до бледно-зеленого или желтоватого цвета.

Эти наблюдения были подтверждены данными о содержании общего хлорофилла. При внесении 300 мг/кг свинца содержание общего хлорофилла превысило соответствующий показатель в контрольном опыте. Внесение ацетата свинца в концентрации 750 и 1500 мг/кг вызывало уменьшение содержания общего хлорофилла.

Сделано предположение, что внесение 300 мг/кг свинца не оказывало токсического воздействия на АЦС в первую очередь за счет связывания металла компонентами почвы, а также экзометаболитами, слизистыми чехлами, мертвыми клетками организмов. Кроме того, возможен и стимулирующий эффект анионной части соли. Известно, что ацетат может использоваться в качестве питательного субстрата как непосредственно водорослями и цианобактериями (цианопрокариотами), так и опосредованно бактериями с последующим выделением углекислого газа, стимулирующего фотосинтез. При высоких дозах свинца 750 и 1500 мг/кг происходит угнетение развития и функционирования АЦС: изменение видовой структуры АЦС, уменьшение видового разнообразия и обилия сообщества, снижение содержания общего хлорофилла, а также морфологические изменения видов при максимальной дозе тяжелого металла.

Автор выражает признательность д.б.н. Пинскому Д.Л. за содействие в обсуждении результатов, к.б.н. Патовой Е.Н. и к.б.н. Новаковской И.В. за помощь в определении видов. Работа поддержана проектом Министерства образования и науки Российской Федерации № 2.1.1/3819 и грантом РФФИ №09-04-00652.

61

БИОСИНТЕЗ ИНДОЛИЛ–3–УКСУСНОЙ КИСЛОТЫ

АЭРОБНЫМИ МЕТИЛОТРОФНЫМИ БАКТЕРИЯМИ–ФИТОСИМБИОНТАМИ

Д. Н. Федоров

Институт биохимии и физиологии микроорганизмов им. Г.К. Скрябина РАН, Пущино, Россия

Ауксины – основные фитогормоны растений, среди них наиболее активным является

индолил-3-уксусная кислота (ИУК). Растения и бактерии синтезируют ИУК посредством различных путей, как зависимых от триптофана, так и независимых. Фитопатогенные бактерии образуют ИУК посредством индолил-3-ацетамидного пути

(L-триптофан→индолил-3-ацетамид→ИУК). У большинства непатогенных бактерий реализуется индолил-3-пируватный (ИПвК) путь биосинтеза ИУК

(L-триптофан→индолил-3-пировиноградная кислота→индолил-3-ацетальдегид→ИУК). Первая реакция является неспецифической, поскольку катализируется трансаминазами ароматических аминокислот, которые обнаружены у всех бактерий, использующих аминокислоты в качестве источника углерода и энергии. Ключевым ферментом ИПвК-пути является индолилпируватдекарбоксилаза (IPDC), катализирующая вторую реакцию этого пути.

Предварительный анализ генома модельного метилотрофа Methylobacterium extorquens AM1 выявил ген RMQ09094, кодирующий тиаминпирофосфат-зависимую декарбоксилазу, имеющую наибольшую гомологию с бактериальными бензилформиатдекарбоксилазами. Последние могут использовать в качестве субстрата индолил-3-пируват, поэтому вполне ожидаемо, что белок, кодируемый RMQ09094, может декарбоксилировать ИПвК. Кроме того, в культуральной жидкости нами обнаружены интермедиаты этого пути: индолил-3-пируват, индолил-3-молочная кислота, индолил-3-ацетальдегид, что подразумевает функционирование ИПвК-пути биосинтеза ИУК у метилотрофов. Среди представленных в базе данных GenBank геномов Methylobacterium имеются два штамма M. nodulans ORS2060 и Methylobacterium sp. 4-46, которые лишены генов ipdC. С другой стороны, данные штаммы обладают генами, кодирующими декарбоксилазы ароматических аминокислот, что указывает на вероятность наличия триптаминового пути биосинтеза ИУК у бактерий

(L-триптофан→триптамин→индолил-3-ацетальдегид→ИУК), функционирование которого у метилобактерий ранее показано не было. Цель данной работы – изучение и характеристика генов метилотрофов, кодирующих ключевые ферменты биосинтеза ИУК.

Ген RMQ09094 M. extorquens AM1, названный ipdC (indolepyruvate decarboxylase), был амплифицирован и клонирован в плазмиде pET-22b(+) (Novagen). На основе штамма Escherichia coli BL21(DE3, pT-GroE) получен суперпродуцент IpdC. Методом Ni2+-NTA хроматографии выделен электрофоретически гомогенный рекомбинантный белок IpdC из M. extorquens AM1 с молекулярной массой мономера 60 кДа. Методом гель-фильтрации установлено, что IpdC является гомотетрамером с молекулярной массой 245 кДа. Определены основные кинетические константы (Km, kcat) и показано, что фермент проявляет наибольшее сродство к индолилпирувату, однако максимальная скорость реакции наблюдается с бензоилформиатом.

62

Методом гомологичной рекомбинации получен штамм M. extorquens с делетированным геном ipdC, который при росте на минеральной среде с триптофаном синтезировал в 3 раза меньше индольных соединений, чем исходный штамм. Напротив, комплементированный штамм синтезировал втрое больше индольных соединений, нежели штамм дикого типа. Эти данные указывают на то, что белок IpdC осуществляет ключевую реакцию в биосинтезе ИУК – декарбоксилирование индолил-3-пирувата.

Аналогичным образом ген aodA из M. nodulans, кодирующий декарбоксилазу ароматических аминокислот, был клонирован, получен суперпродуцент и препарат рекомбинантного белка. Оказалось, что фермент AodA, вместо ожидаемого декарбоксилирования ароматических аминокислот, катализирует окислительное дезаминирование (ароматическая аминокислота + O2+ H2O→ароматический альдегид + CO2 + NH3+ H2O2), что указывает на уникальность данного фермента у бактерий. Фермент использует в качестве субстратов L-триптофан, L-3,4-дигидроксифенилаланин (ДОФА) и

L-фенилаланин. Определены основные кинетические константы (Km, kcat) и показано, что фермент проявляет наибольшее сродство к триптофану, однако максимальная скорость реакции наблюдается с ДОФА. При помощи нативного электрофореза в полиакриламидном геле установлено, что фермент является гомодимером с молекулярной массой 115 кДа.

Таким образом, нами впервые доказано наличие нескольких ключевых ферментов биосинтеза ауксинов у метилобактерий. У M. extorquens ИУК образуется индолилпируватным путем, в то время как у M. nodulans – в результате окислительного декарбоксилирвания триптофана за счет активности фермента AodA. Кроме того, делеция ipdC у M. extorquens не привела к полному нарушению биосинтеза ИУК, что указывает на большое разнообразие путей биосинтеза ауксинов у метилобактерий-фитосимбионтов.

Работа проводилась в рамках проекта Минобрнауки РФ РНП 2.1.1/605.

ВЛИЯНИЕ СВЕТА,

ТРАНСФОРМИРОВАННОГО СВЕТОКОРРЕКТИРУЮЩЕЙ ПЛЕНКОЙ

НА АКТИВНОСТЬ УГЛЕВОДОРОДОКИСЛЯЮЩИХ МИКРООРГАНИЗМОВ

В ЖИДКОЙ СРЕДЕ

Д. А. Филатов, Л. К. Алтунина, Л. И. Сваровская

Институт химии нефти СО РАН, Томск, Россия

Проблема светочувствительности микроорганизмов привлекает все большее внимание исследователей. В настоящее время достигнуты значительные успехи в изучении механизмов ряда фотобиологических процессов. Установлено также, что все растения и водоросли характеризуются наличием специальных фоторегуляторных систем, эффективно контролирующих их рост и развитие. Однако в литературе имеется очень мало данных об эффектах и механизмах действия света на метаболизм гетеротрофных микроорганизмов. Сам факт существования фоторегуляторных систем у высших растений позволяет сделать вывод о том, что такого рода системы и механизмы должны существовать и у более древних в эволюционном отношении микроорганизмов.

63

В последние годы особое внимание привлекают светокорректирующие полимерные пленки, которые применяются для повышения урожайности сельскохозяйственных культур. Влияние пленок на развитие растений связывается с закономерным изменением количественного и качественного состава проходящего через них электромагнитного излучения солнца. При прохождении света через данные пленки, содержащие люминофоры, наблюдается появление новой области спектра с длиной волны с максимумом 615 нм, возникающей за счет люминесценции соединений европия, т. е. пленки, преобразуют ультрафеолетовое излучение в красное.

Ранее нами было показано, что прошедший через светокорректирующую пленку солнечный свет и трансформированный фотолюминофорами пленок, стимулирует процессы роста и ферментативную активность аборигенной микрофлоры чистых и нефтезагрязненных почв.

Целью следующего эксперимента было исследовать влияние света, трансформированного светокорректирующей пленкой на активность углеводородокисляющих микроорганизмов в жидкой среде.

Для опыта, проведенного в жидкой среде, использовали эксикаторы со средой Раймонда. В каждый эксикатор помещали по 300 мл среды и вносили нефть в концентрации 2 мл на 100 мл среды. В жидкую среду вносили 2 штамма углеводородокисляющих микроорганизмов: Pseudomonas stutzeri и Pseudomonas putida, выделенных из пластовой воды Усинского месторождения. Эксикаторы закрывали светокорректирующей пленкой ФЕ. В качестве контроля использовали эксикаторы закрытые обычной пленкой ПЭВД и закрытые стеклянной крышкой, помещенные в темное место, без освещения. Источниками освещения служили люминесцентная лампа ЛБ-40 (спектр лампы 380-710 нм), интенсивность облучения 29 Вт/м2 и УФ лампа «PHILIPS BLACK LIGHT», моделирующая УФ часть солнечного спектра с максимумом излучения 365 нм, мощностью 9 Вт, интенсивность облучения 4 Вт/м2. Режим облучения – 6 часов в сутки. Продолжительность эксперимента 15 суток при температуре 18–20°С.

Результаты опыта показали, что свет, трансформированный люминофорами полимерной пленки марки ФЕ, стимулирует рост численности микроорганизмов в жидкой среде. Численность увеличивается до 2300 млн кл/мл в контроле численность не превышает 80–90 млн кл/мл.

С увеличением численности микроорганизмов возрастает и ферментативная активность, а, следовательно, и уровень биодеградации углеводородов нефти.

В опытном варианте, т.е. с применением фотолюминесцентной пленки, активность каталазы возрастает от 0.21 до 4.3 мл/мл, в контрольных вариантах не превышает 1.8–2 мл/мл. Активность дегидрогеназы возрастает до 1.25 мг/мл, в контрольных вариантах не превышает 0.56–0.63 мг/мл. При использовании светокорректирующей пленки в 2.5 раза увеличивается динамика накопления альдегидов, как промежуточных продуктов метаболизма при микробном окислении нефти.

Процессы биодеструкции в опытном варианте подтверждаются данными ЯМР, ИК-спектроскопии, элементного анализа, а так же газожидкостной хроматографией. Полностью элиминировали н-алканы от С9 до С15, на 80–90% уменьшилось содержание углеводородов с молекулярной массой С16–С30. Коэффициент биодеградации для исходного загрязнения

64

составляет 0.6, в образце остаточной нефти без пленки 1.1, с пленкой ПЭВД-1.2. При использовании пленки ФЕ коэффициент биодеструкции увеличивается до 4.9, что указывает на глубокие процессы микробного окисления углеводородов нефти.

Таким образом, показано, что свет, трансформированный люминофорами светокорректирующей пленки, стимулирует процессы роста и биохимической активности микроорганизмов в жидкой среде. И как следствие, процессы биодеградации нефтяного загрязнения в опытном варианте протекают значительно интенсивнее.

Вероятно, здесь имеют место фотохимические процессы. Возможно, красный свет выполняет триггерную функцию, запуская определенную систему последовательных реакций, приводящих к биологическому эффекту, в данном случае ускоряются процессы роста и оксигеназная активность микроорганизмов.

ХАРАКТЕРИСТИКА СУЛЬФАТВОССТАНАВЛИВАЮЩИХ БАКТЕРИЙ

КАЛЬДЕРЫ УЗОН, КАМЧАТКА

К. С. Фишман1,2

1Пущинский государственный университет, Пущино, Россия 2Институт биохимии и физиологии микроорганизмов РАН, Пущино, Россия

Сульфатвосстанавливающие микроорганизмы – это широко распространенная, филогенетически гетерогенная группа, включающая в себя представителей двух высших таксонов – бактерии и археи, которые способны получать энергию за счет анаэробного сульфатного дыхания или диссимиляторной редукции сульфатов. Физиологические особенности СВБ позволяют им занимать ареалы с экстремальными условиями обитания. Температурный диапазон толерантности СВБ очень широк – от –5°С и ниже до 104°С. На данный момент известны представители как мезофильных, так и термофильных сульфатвосстанавливающих бактерий. В последние два десятилетия описано большое количество новых видов сульфатвосстанавливающих бактерий, выделенных из различных мест обитания, в том числе и экстремальных.

Объектом исследования являлись образцы микробных обрастаний и осадков из гидротермальных источников кальдеры вулкана Узон (Камчатка), был исследован ряд проб из источников Капля, Термофильный и Красный. Изучение микробных сообществ мы проводили, используя шесть пар специфичных для групп СВБ праймеров: DFM140 – DFM842; DBB121 – DBB1237; DBM169 – DBM1006; DSB127 – DSB1273; DCC305 – DCC1165; DSV230 – DSV838. Также для анализа использовали универсальные эубактериальные праймеры 27f и 1392r, и специфичные архейные праймеры – A8F и A1041R.

Результаты анализа показали, что представители СВБ присутствуют преимущественно в пробах матов источника Термофильного, также СВБ были обнаружены в пробах мата источника Красного. В пробах источника Капля представителей СВБ с помощью данных таксон-специфичных праймеров обнаружено не было. Большинство обнаруженных специфичными праймерами СВБ источника Термофильного относятся к родам: Desulfovibrio, Desulfomicrobium, Desulfonema, Desulfosarcina, Desulfococcus. Также при

65

анализе были обнаружены представители родов Desulfobulbus и Desulfobacter. Выявленные представители СВБ в пробах источника Красного относятся к тем же родам, что и в пробах Термофильного, по частоте встречаемости также доминируют роды Desulfovibrio,

Desulfomicrobium. Проведенный анализ ни в одной из проб исследованных источников не выявил представителей родов Desulfotomaculum и Desulfobacter, также не было выявлено присутствие архей.

Были получены накопительные культуры на среде с ацетатом, лактатом, малатом, пропионатом. Выделение чистых культур СВБ проводили методом разведений на жидких и твердых средах в пробирках Хангейта и в запаянных трубках с агаром. В результате пересевов нами было отобраны культуры: У6, У7, У8/12, ТУ7.

Исследование температурных пределов роста показало, что выделенные культуры У6 и У7 являются мезофилами и способны расти в диапазоне температур от 18 до 37°С. Температурные пределы роста культуры У8/12 отличались от вышеописанных. Хотя оптимальный рост культуры У8/12 на лактате наблюдался при температуре 37°С, при 45°С интенсивность сульфидогенеза не отличалась от оптимума, но при 55°С культура У8/12 не росла, что позволяет отнести ее к мезофилам. Вероятно, данная культура является термоустойчивой, что дает ей возможность нормально расти при температурах несколько превышающих оптимальные для мезофильных культур. Температурный оптимум для роста культуры ТУ7 наблюдался при температуре 55°С, культура не растет при температурах ниже 45°С, что позволяет отнести ее к термофилам. Исследование влияния рН на сульфидогенез выделенных бактерий показал, что культура У6 растет в диапазоне рН от 5,1 до 7,4, с оптимумом при рН 6,8, для культуры У7 оптимум роста наблюдали при рН 6,5–6,8, при рН выше 8,0 и ниже 5,0 культуры не растут. Культура ТУ7 хорошо росла при рН 6,6–7,6, однако максимальный рост наблюдался при рН 8,0, что дает основания отнести культуру к алкалофилам. Культуры проверяли также на использование субстратов, каждый из которых добавляли в среду до конечной концентрации 20 мМ. Культуры У6, У7, У8/12 сходны по субстратной специфичности и способны утилизировать лактат, пируват, формиат; на этаноле, ацетате и глюкозе рост культур был хуже; на цистеине – отсутствие роста. Культура ТУ7 показала максимальный рост на лактате. Невысокие показатели роста были отмечены при использовании культурой глюкозы и пирувата, также отмечено отсутствие роста на цистеине.

Было проведено частичное секвенирование гена 16S рРНК с целью определения филогенетического положения выделенных культур. Результаты секвенирования фрагмента гена 16S рРНК длиной 560 нуклеотидов у культуры У8/12 показали, что этот представитель СВБ имеет 99% сходства по нуклеотидной последовательности гена 16S рРНК с Desulfovibrio vulgaris. Однако, как было показано при исследовании физиологических параметров роста, культура У8/12 в отличие от других представителей этого вида, обладает более широким температурным оптимумом.

66

ЭКОФИЗИОЛОГИЧЕСКИЕ ОСОБЕННОСТИ КУЛЬТУР ЦИАНОБАКТЕРИЙ,

ВЫДЕЛЕННЫХ ИЗ СОЛЕНЫХ ОЗЕР ЮЖНОГО ЗАБАЙКАЛЬЯ

Д. Д. Цыренова, Б. Б. Намсараев

Институт общей и экспериментальной биологии СО РАН, Улан-Удэ, Россия

Целью настоящей работы было изучение влияния физико-химических факторов на рост и развитие культур цианобактерий.

Из донных осадков и микробных матов озер Южного Забайкалья было выделено шесть монокультур цианобактерий (таблица). Три культуры (Cya 1, 2, 10) отнесены к роду Phormidium, две культуры (Cya 5, 6) – к роду Nodularia, одна культура (Cya 4) – к Pseudanabaena.

Культуры цианобактерий, выделенные из исследованных озер

Культура Озеро Классификация по

Еленкину (1949),

Голлербах и др. (1953)

Классификация по

Komárek&Anagnostidis

(1999, 2007)

На основе

сиквенса 16S

РНК

Cya 1 Сульфатное Oscillatoria brevis (Kűtz.) Gom.

Phormidium breve (Kűtz. et Gom.)

Phormidium sp.

Cya 2 Ехэ Тором Oscillatoria brevis (Kűtz.) Gom.

Phormidium breve (Kűtz. et Gom.)

Phormidium sp.

Cya 4 Сульфатное Phormidium frigidum Fritsch.

Pseudanabaena frigida

(Fritsch) Anagnost. -

Cya 5 Хилганта Anabaena sibirica (Pop. et Degt.) Elenk.

Nodularia sp. Nodularia sp.

Cya 6 Горбунка Anabaena sibirica (Pop. et Degt.) Elenk.

Nodularia sp. Nodularia sp.

Cya 10 Хилганта Phormidium sp. Phormidium sp. Phormidium sp.

Культуры Cya 1 и Cya 2 были выделены из цианобактериальных матов озер Сульфатное и Ехэ Тором соотвественно, но по морфологическим характеристикам, лишь с некоторыми вариациями в размерах, являлись идентичными Oscillatoria brevis (Еленкин, 1949) или Phormidium breve (Komárek & Anagnostidis, 2007). Рестрикционные профили генов 16S рРНК показали сходство культур Cya 1 и Cya 2 на видовом уровне. В результате анализа генов 16S рРНК было установлено, что данные культуры имели 99,2% сходства с Phormidium sp. NIVA-CYA 202.

Культура Cya 4, выделенная из цианобактериального мата озера Сульфатное, по морфологии была идентифицирована как Phormidium frigidum (Еленкин, 1949) или как Pseudanabaena frigida (Komárek & Anagnostidis, 1998).

Культуры Cya 5 и Cya 6 были выделены из сухой корки озера Хилганта и ила озера Горбунка, соответственно и определены как Anabaena sibirica (Голлербах и др., 1953) или Nodularia sp. (Намсараев З.Б., неопубликованные данные).

Культура Суа 10 была выделена из сухого мата озера Хилганта и была идентифицирована как Phormidium sp. (Komárek & Anagnostidis, 2007). Наиболее близкими

67

организмами к культуре Cya 10 оказались Oscillatoria cf. laetevirens Baja-Osc-1 (99,0%) и Phormidium sp. UTCC 487 (98,9%). Оба близкородственных к Cya 10 штамма выделены из минерализованных местообитаний и принадлежат к кластеру, близкородственному Phormidium. На основе полученных данных культура Cya 10 отнесена к роду Phormidium.

Исследование экофизиологических особенностей культур показало, что культуры Cya 1 и Cya 2 имели оптимумы роста при рН 9,5 минерализации 1–5 г/л, с диапазоном роста до 100 г/л, что соответствовало природным условиям мест обнаружения.

Идентичные по морфологическим признакам культуры Cya 5 и Cya 6 проявили себя сходным образом как алкалофильные (диапазон развития при рН 8,5–9,5, оптимум

при рН 9,5) и галотолерантные (диапазон роста 0–100 г/л NaCl, оптимум роста при 1–20 г/л) организмы. Показано развитие Nodularia при содержании NaCl в среде до 100 г/л, что является интересным, поскольку известные в литературе культуры Nodularia способны развиваться при соленостях не выше морской.

Культура Cya 10 имела способность к росту при минерализации от 0 до 50 г/л с оптимумом при 5 г/л; при увеличении минерализации рост угнетался. Наибольший выход биомассы зафиксирован при рН 8,5, при рН 7,5 и 9,5 рост был замедленным.

В результате проведенных экспериментов было показано, что все изученные культуры являлись умеренными алкалофилами, имеющими оптимум развития при рН 8,5–9,5 и способными развиваться при содержании NaCl до 100 г/л.

Работа выполнена при поддержке грантов: Программа Минобразования и науки РФ № РНП 2.1.1/2165, НОЦ «Байкал», Президиума СО РАН № 38 и 95.

МУТАНТ (ГАЛО)АЛКАЛОФИЛЬНОГО МЕТАНОТРОФА

METHYLOMICROBIUM ALCALIPHILUM 20Z, ДЕФЕКТНЫЙ ПО СИНТЕЗУ

ПОВЕРХНОСТНОГО Н2О2–РАЗЛАГАЮЩЕГО БЕЛКА

В. Н. Щукин1,2, Б. Ц. Ешинимаев2

1Пущинский государственный университет, Пущино, Россия 2Институт биохимии и физиологии микроорганизмов РАН, Пущино, Россия

Поверхностные S-слои, сравнительно недавно обнаруженные у большинства грамположительных и грамотрицательных эубактерий, являются частью сложной организации их клеточных конвертов. Эти регулярные паракристаллические гликопротеиновые структуры, покрывающие клетки, нековалентно связаны с липополисахаридами, тейхоевыми кислотами, пептидогликанами или другими интегральными поверхностными компонентами бактерий.

Ранее у (гало)алкалофильного метанотрофа Methylomicrobium alcaliphilum 20Z были выявлены гликопротеновые S-слои, однако их роль не ясна. Нами у обнаружены 3 белка: Omp (45 кДа), CorA (27кДа) и Н2О2-разлагающий белок Mca (87 кДа). Впервые Mca был найден у Methylococcus capsulatus Bath. Оказалось, что данный белок относится к новой группе бактериальных цитохром с пероксидаз, однако функциональное назначение этого фермента у метанотрофов не ясно. Цель работы - скрининг метанотрофов на наличие Mca, получение мутанта с инактивированным геном mca и изучение его свойств.

68

Рис. 1. Электрофореграмма ПЦР-продуктов, амплифицированных парой праймеров mcaF1/mcaR1 в ДНК метанотрофов I и II типов. 1 – Methylomicrobium alcaliphilum 20Z; 2 – Methylomicrobium alcaliphilum 3S; 3 – Methylomicrobium buryatense 5G; 4 – Methylocaldum

szegediense O-12; 5 – Methylobacter marinus 7C; 6 – Methylomonas scandinavica SR5; 7 – Methylococcus capsulatus Bath; 8 – Methylosinus trichosporium OB3b; 9 – Methylocystis parva Se48; 10 – ‘Methylocystis minimus 72; 11 – Methylobacter chroococcum 41; 12 – Methylocystis sp.MF5; 13 – Methylocystis heyerii SAK1; 14 – Methylocystis heyerii SAK2.

Скрининг метанотрофов на наличие гена mca выявил таковой в ДНК метанотрофов I типа родов Methylomicrobium, Methylobacter и Methylococcus. У метанотрофов II типа, представителей родов Methylocystis и Methylosinus, ген mca не обнаружен, что может быть связано с различными путями С1-метаболизма. Для выяснения локализации белка Mca клетки Mm. alcaliphilum 20Z обрабатывали очищенными специфичными поликлональными антителами и белком А, меченным коллоидным золотом. Электронно-микроскопические исследования показали, что белок Mca связывается со стенками чашевидных структур S-слоев.

Рис. 2. Гибридизация первичных антител Mca и белка А, меченных коллоидным золотом (8.3 нм) с клетками Mm. alcaliphilum 20Z.

коллоидное золото

Methylomicrobium alcaliphilum 20Z

100 нм

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14

69

Анализ скорости роста Mm. alcaliphilum 20Z и мутанта, делетированного по гену mca, на среде П с различным содержанием NaCl и разными значениями рН показал, что при рН 11 мутант растёт лучше, чем исходный штамм. Также наблюдали закисление культуральной жидкости с начального рН 11 до рН 8, что, возможно, связано с повышенной активностью (40x) формиатдегидрогеназы у мутантного штамма.

0

0,5

1

1,5

2

2,5

0 20 40 60 80 100 120 140

0

2

4

6

8

10

12

мутант контроль

Рис. 3. Кривая роста Mm. alcaliphilum 20Z и мутанта по гену mca при рН 11.

Работа проводилась в рамках проекта РФФИ 08-04-01732а.

ФЕНОТИПИЧЕСКИЕ СВОЙСТВА ШТАММОВ СМ-9 И СМ-10,

ВЫДЕЛЕННЫХ ИЗ КРИСТАЛЛИЧЕСКИХ ПОРОД

ГЛУБОКИХ ПЛАСТОВ ЗЕМНОЙ КОРЫ

А. Ю. Ягушкина, М. Ю. Яковлев, Н. В. Шеховцова

Ярославский государственный университет им. П.Г. Демидова, Ярославль, Россия

Оценка биоразнообразия микроорганизмов, выделенных из глубоких горизонтов земной коры, является непростой, но актуальной проблемой. Объектами нашего исследования являются штаммы СМ-9 и СМ-10, выделенные из гнейсов, вскрытых Воротиловской научной скважиной в интервале глубин 1935 – 3570 м. Анализ липидных профилей чистых культур не позволил идентифицировать эти штаммы даже до рода. На основании сиквенса 16S рДНК штамм СМ-9 был отнесен к роду Planomicrobium, а СМ-10 – к роду Leifsonia, поэтому задачей настоящего исследования является изучение фенотипических свойств выделенных бактерий в сравнении с известными представителями соответствующих родов Planomicrobium и Leifsonia.

Выявлено, что бактерии штамма СМ-9 в суточной культуре представлены короткими палочками и кокками. В трехдневных культурах появляются длинные, нитевидные клетки. Грамположительны, неподвижны и не образуют эндоспоры. Аэробы. Образуют круглые гладкие кратерообразные с ровными краями колонии розового или коралло-красного цвета маслянистой консистенции. Утилизируют L-аланин, лизин, сорбозу; слабый рост обнаруживают на утилизируют L-серин, L-глицин и ацетат натрия. Хорошо растут на метаноле. Каталазоположительные. Не обладают уреазной и оксидазной активностями.

70

Нитрат не восстанавливают. Утилизируют серосодержащие аминокислоты с образованием сероводорода. Не сбраживают глюкозу до кислот. Гидролитические ферменты отсутствуют. Растут в среде только с 1% NaCl. Очень чувствительны к антибиотикам.

Бактерии штамма СМ-10 представляют собой палочки различной длины с закругленными концами, расположенными попарно или палисадно. Грамположительные, неводвижные, неспорообразующие. Аэробы. Образуют колонии бледно-желтого цвета с влажным блеском и маслянистой консистенцией, плоские полупрозрачные с шероховатой поверхностью. Утилизируют L-серин, L-аланин, метионин, глицерин, L- фенилаланин, L-триптофан, лизин, L-глицин, сорбозу, D-галактозу, ацетат натрия. Очень медленно растут на богатых питательных средах. Хорошо используют метанол. Каталазо- и оксидазоположительные. Не обладают уреазной активностью. Нитрат не восстанавливают. Утилизируют серосодержащие аминокислоты с образованием сероводорода. Не сбраживают глюкозу до кислот. Разжижают желатин и гидролизуют крахмал. Не растет на среде с высокой концентрацией NaCl (7%). Чувствителен к действию антибиотиков. Выделены из кристаллических пород.

Сравнение бактерий штамма СМ-9 с четырьмя известными видами рода Planomicrobiu:

P. citreus, P. kocurii, P.mcmeekinii, P. okeanokoites, выделенными из морских местообитаний, показывает их родственность как по морфологическим, так и по физиолого-биохимическим признакам. Кроме того, принимая во внимание, что породы, вскрытые Воротиловской научной скважиной омываются высокоминерализованными водами Московской синеклизы, можно утверждать, что и экология этих видов не имеет принципиальных различий. Однако, бактерии штамма СМ-9 не имеют полного совпадения по физиолого-биохимическим признакам ни с одним из описанных видов.

Микроорганизмы рода Leifsonia характеризуются самой различной экологией. Они выделены из цианобактерий, из растительных тканей, из почвы и даже дистиллированной воды. Таким образом, бактерии штамма СМ-10 принципиально отличаются от известных семи видов местом выделения. Однако по изученным физиолого-биохимическим свойствам они практически полностью совпадают с видом Leifsonia shinshuensis, выделенным из почвы. Таким образом, результаты исследования фенотипичеких свойств штаммов СМ-9 и СМ-10 согласуются с результатами генетического анализа этих культур и подтверждают их принадлежность к роду Planomicrobium и Leifsonia, соостветственно.

71

СЕКЦИЯ II

МОЛЕКУЛЯРНАЯ ЭКОЛОГИЯ

И ГЕОХИМИЧЕСКАЯ ДЕЯТЕЛЬНОСТЬ МИКРООРГАНИЗМОВ

СТРУКТУРА И ФУНКЦИОНАЛЬНАЯ РОЛЬ ЦИАНОБАКТЕРИЙ

И ФОТОТРОФНЫХ НЕСЕРНЫХ ПУРПУРНЫХ БАКТЕРИЙ

ПЕРИФИТОННЫХ СООБЩЕСТВ ПРИРОДНЫХ И ТЕХНОГЕННЫХ ВОД

КАМСКОГО БАССЕЙНА

П. Г. Беляева, В. В. Галямина, А. И. Саралов

Институт экологии и генетики микроорганизмов УрО РАН, Пермь, Россия

Фототрофные аноксигенные пурпурные несерные бактерии (ПНБ), обладающие способностью к азотфиксации (АФ) и денитрификации (ДЕН), широко распространены в биообрастаниях гидрофильной растительности и каменистых субстратов ряда природных и техногенных экосистем Камского бассейна (Галямина, 2004). Возможности распространения ПНБ в перифитонных сообществах водотоков, их участие в процессах ДЕН и АФ до сих пор остаются малоизученными.

Цель работы – изучение видового состава цианобактерий (ЦБ) и ПНБ, количественное определение интенсивности микробиологических процессов АФ и ДЕН газохроматографическим методом в перифитоне Воткинского и Нытвенского водохранилищ, реках Кама, Вишера, Сылва, Нытва и Глотиха ряда районов Пермского края.

При изучении ЦБ перифитона в водотоках бассейна р. Кама к настоящему времени выявлено 72 разновидности и формы. Доминируют представители родов Anabaena, Oscillatoria, Aphanizomenon и Microcystis. Разнообразие и численность ЦБ обычно повышается вниз по течению и от весны к осени.

В перифитоне проточных бессульфидных водотоков Западного Предуралья фотоорганотрофные ПНБ не испытывают конкуренцию со стороны зелёных и пурпурных серных бактерий и поучают широкое распространение. Здесь они довольно многочисленны и представлены в осоновном родами Rhodobacter (R. capsulatus, R. blasticus), Rhodopseudomonas (R. palustris), Rhodocyclus (R. purpureus, R. tenuis).

Наиболее активные светозависимые процессы и АФ и ДЕН зарегистрированы в воде низовьев р. Глотиха, принимающей стоки очистных сооружений Соликамского целлюлозно-бумажного комбината. В низовьях реки при определенных окислительно-восстановительных условиях (Eh~175 мВ), неблагоприятном кислородном режиме преобладают разнообразные ПНБ морфотипа Rhodobacter, Rhodopseudomonas, Rhodocyclus и ряд других сопутствующих видов. Альгоценозы реки характеризуется отсутствием нитчатых ЦБ.

АФ в верховьях среднего течения р. Сылва, где в водном балансе важную роль играют холодные подземные воды, очень низка в планктоне, но увеличивалась в эпифитоне при появлении немногочисленных ЦБ (Anabaena affinis, A. minima, A. aequalis), содержащих сравнительно мало гетероцист (0.6–1.2 % Nцб). Численность ЦБ и гетероцист возрастало к

72

концу лета и вниз по течению реки (особенно после наиболее крупных притоков – рек Барда, Ирень, Шаква) за счет появления Anabaena contorta, A. variabilis и массового распространения Aphanizomenon flos-aquae (69–81 % Nцб), соответственно повышалась интенсивность фиксации N2. Повышенная активность потенциальной ДЕН в планктонных и перифитонных сообществах р. Сылва отмечена лишь в местах обильного излива подземных вод, после крупных населённых пунктов на загрязненных участках реки при заметном подъёме численности ПНБ (R. palustris и R. capsulatus).

Довольно высокий уровень потенциальной ДЕН и массовое распространение ПНБ

(R. capsulatus, R. palustris, R. tenuis и некоторых других пока не идентифицированных видов) отмечен в августе–сентябре в обрастаниях камней вдоль побережья р. Кама напротив буферных прудов биологических очистных сооружений (БОС) ниже г. Перми.

Активность микробиологических процессов цикла азота в р. Кама и ее притоках усиливалась в направлении от северных районов (р. Вишера на Северном Урале) к южным (Воткинское водохранилище ниже Пермского промузла). При этом одновременно повышалась как численность гетероцистных ЦБ, так и интенсивность АФ. Для планктона и перифитона выявлена достоверная корреляция между интенсивностью фиксации N2 и численностью Anabaena spp., Aphanizomenon spp.: r=0.89 в эпифитоне, r=0.97–0.99 в эпилитоне. Причем в эпилитоне и АФ, и ДЕН одинаково тесно коррелировали с частотой встречаемости ПНБ морфотипа Rhodopseudomonas, Rhodobacter, Rhodocyclus (r=0.99).

В целом по перифитону водоемов и водотоков бассейна р. Кама (за 122 дня вегетационного сезона с июня по сентябрь) потери соединений азота при биологической ДЕН составили 15 г N/м2 или 150 кг N/га в год: 5 % – в эпифитоне и 95 % – в эпилитоне. Причем интенсивность и масштабы АФ и ДЕН фототрофными перифитонными сообществами ЦБ и ПНБ изученных водотоков Камского бассейна на Западном Предуралье сопоставимы с таковыми в водных массах и донных отложениях загрязненных участков продуктивных озер и водохранилищ.

Таким образом, впервые установлено, что в активных процессах ДЕН (в условиях проточных бессульфидных вод) на биологических очистных сооружениях г. Перми, в эпилитоне и альго-бактериальных матах р. Кама и её притоков существенная роль принадлежит фототрофным аноксигенным ПНБ, в частности, родов Rhodobacter, Rhodopseudomonas и Rhodocyclus. Тогда как в активной фиксации N2 в планктоне и перифитоне низовьев рек более важную роль обычно играют гетероцистные ЦБ родов Anabaena и Aphanizomenon.

Работа выполнена при финансовой поддержке по программе Президиума РАН «Молекулярная и клеточная биология».

73

ОБРАЗОВАНИЕ СУЛЬФИДОВ МЕТАЛЛОВ ЧИСТЫМИ КУЛЬТУРАМИ

СУЛЬФАТРЕДУЦИРУЮЩИХ БАКТЕРИЙ, УСТОЙЧИВЫХ К ИОНАМ МЕДИ

О. П. Буторова1, А. Л. Герасимчук1

, А. В. Козлова2, О. В. Забудченко2

, Л. Н. Еренко1,

И. П. Мишин2, А. А. Миллер3

, О. В. Карначук1

1Кафедра физиологии растений и биотехнологии, Томский государственный университет, Томск, Россия

2Материаловедческий центр Томского государственного университета, Томск, Россия 3НПО «Вирион», Томск, Россия

Способность сульфатредуцирующих бактерий (СРБ) осуществлять восстановление

серы с образованием сероводорода делает эту группу микроорганизмов перспективной для применения в технологиях биоремедиации загрязненных тяжелыми металлами экосистем, таких как сточные воды металлургических предприятий, кислые шахтные дренажи и др. Образующийся в ходе сульфатного дыхания сероводород осаждает растворенные ионы металлов в виде практически нерастворимых и соответственно, менее токсичных сульфидов. Детальная характеристика сульфидов меди, образуемых чистыми культурами СРБ, до сих пор отсутствовала, так как проведение подобных экспериментов затрудняло ингибирование клеток высокими концентрациями Cu(II). В нашем исследовании использовали чистые культуры СРБ, выделенные из местообитаний, загрязненных металлами и характеризующиеся высокой устойчивостью к ионам Cu(II). Были выбраны два наиболее перспективных штамма, относящиеся к разным филогенетическим группам – спорообразующий Desulfosporosinus sp. DB (Карначук и др., 2009) и Deltaproteobacteria Desulfovibrio sp. R2 (Karnachuk et al., 2003).

Культуры СРБ выращивали анаэробно в пенициллиновых флаконах и 500 мл сывороточных бутылях на пресноводной среде Видделя (Widdel, Back, 1992) с добавлением ионов двухвалентной меди в концентрации 200 и 250 мг/л. Бактериальные клетки для микроскопирования осаждали центрифугированием, предварительно отфильтровав через бумажный фильтр, чтобы избавится от крупных частиц сульфида. Ультратонкие срезы готовили по методике Уикли (Уикли, 1975). Изучение ультраструктуры бактериальных клеток проводили методом трансмиссионной электронной микроскопии с использованием электронного просвечивающего микроскопа “JEM-100 CXII” (“JEOL”, Япония).

Образование сульфидов изучали после кратковременной (3 суток) и более длительной инкубации (54 суток). После окончания роста культуры сульфиды осаждали центрифугированием. Анализ осадков сульфида проводили с помощью сканирующей электронной микроскопии, микроскопе Philips SEM515 с анализатором EDAX ECON IV и методом рентгено-фазового анализа на дифрактометре Shimadzu XRD 6000.

Микроанализ (EDAX) показал, что основными элементами, содержащимися в осадке, были Cu, Fe, S, а также в некоторых вариантах опытов P, O и C. Соотношение атомного веса обнаруженных элементов позволяет предположить присутствие в осадке сульфидов меди состава CuS, фосфатов железа и возможно, карбонатов железа.

Рентгено-фазовый анализ показал, что в процессе роста штаммов происходит образование кристаллических сульфидов меди. Основными фазами, обнаруженными в

74

осадках, были халькопирит (CuFeS2) и ковеллит (CuS). Было обнаружено и несколько других фаз, процентное содержание которых было очень мало: путоранит, CuFeS2, (кубическая решетка молекулы), гирит, Cu8S5, борнит, Cu5FeS4, ярровит, Cu9S8.В контрольном осадке, полученным при культивировании штаммов без добавления ионов меди, основной кристаллической фазой были сульфиды железа. Сульфиды меди также не были обнаружены в химическом контроле без клеток, куда вносили Na2S, до 100 мгS/л – средней концентрации сероводорода, типичной для активно растущих культур СРБ. Основной кристаллической фазой в контроле были оксид меди (CuО) и элементная медь.

Изучение с помощью трансмиссионной электронной микроскопии ультратонких срезов клеток штаммов DB и R2, культивированных на среде с 200 мг/л Cu(II), позволило обнаружить не только макросульфиды, образуемые в процессе роста, но также электронплотные микрокристаллы, находящиеся во внеклеточном пространстве, а также накапливающиеся на поверхности клеток. Обнаруженные микрокристаллы могли быть сульфидами меди, так как микроскопирование контрольных срезов клеток, выращенных без добавления ионов меди, не обнаружило на поверхности клеток никаких микрочастиц.

Накопление халькопирита в процессе роста штаммов в присутствии ионов меди делает их перспективными не только для биоремедиации, но и для повторного извлечения металлов из руд, так как CuFeS2 может быть использован в традиционных пирометаллургических схемах, применяемых при получении меди из сульфидных руд.

Исследованные штаммы СРБ могут быть рекомендованы для тестирования в in situ и ex

situ технологиях очистки сточных вод от металлов, рециклирования меди из различных видов отходов горно-добывающей и металлургической промышленности, а также для возможного получения наночастиц сульфидов меди.

Работа финансировалась грантами РФФИ 09-04-99138-р_офи, 09-04-90734моб_ст и фондом УМНИК (договор № 6362р/8761).

РАЗВИТИЕ И ФУНКЦИОНИРОВАНИЕ БАКТЕРИЙ ОБОРОТНОЙ ВОДЫ

В ЦИКЛЕ ОБОГАЩЕНИЯ АПАТИТ–НЕФЕЛИНОВЫХ РУД

Н. В. Воронина

Институт проблем промышленной экологии Севера Кольского научного центра РАН, Апатиты, Россия

На примере горно-обогатительного предприятия ОАО «Апатит», являющегося

крупнейшим в России по переработке апатит-нефелиновых руд с получением апатитовых концентратов, было проведено исследование значимости микробиологических процессов при обогащении несульфидных руд с использованием оборотного водоснабжения. Роль бактерий может быть двоякой – стимулирующей технологический процесс или ингибирующей его. Основные направления биологической деятельности микроорганизмов связаны с трансформацией металлов и органических веществ, в результате часть химических элементов переходит в растворимое состояние. В других случаях металлы взаимодействуют с метаболитами микроорганизмов, образуя нерастворимые комплексные соединения. Все эти

75

процессы могут происходить на поверхности минералов, трансформируя её, делая труднодоступной для других сорбционных процессов.

Изучение процессов влияния микроорганизмов на обогащение апатит-нефелиновой руды проводили непосредственно на обогатительных фабриках АНОФ-2 и АНОФ-3 ОАО «Апатит» в непрерывном цикле переработки минерального сырья. Для определения численности и разнообразия микробиоты использовали стандартные микробиологические методы. Технологические испытания выполнены на лабораторных установках в открытом и замкнутом циклах с ведением согласованных химических анализов.

Установлено, что основная масса микроорганизмов поступает в обогатительный процесс из оборотной воды и руды. В этих образцах численность бактерий незначительна из-за недостатка питательных веществ. В пенном продукте происходит значительный рост численности микроорганизмов, что связано с улучшением условий среды их обитания за счет аэрации пульпы и дополнительного внесения органических веществ. Высокое количество микроорганизмов сохраняется в хвостах флотации и в фильтрате.

Численность бактерий в оборотной воде фабрики АНОФ-2 значительно превышает их численность в оборотной воде АНОФ-3, что коррелирует с уровнем минерализации оборотных вод и согласуется с различиями в производственных показателях фабрик. Наибольшая численность микроорганизмов в оборотной воде фабрик отмечена осенью, что связано с поступлением в хвостохранилища дополнительного экзогенного органического вещества.

Определены виды бактерий, доминирующих в оборотной воде и продуктах технологического процесса. Это бактерии родов Pseudomonas, Stenotrophomonas и Acinetobacter, идентифицированные методом молекулярной биологии по определению последовательностей генов 16S рРНК.

В ходе работы обнаружено, что все исследованные виды бактерий ухудшают флотируемость апатита и кальцита, и апатита из апатит-нефелиновой руды за счет взаимодействия с активными центрами кальцийсодержащих минералов и интенсивной флокуляции, приводящей к снижению селективности процесса флотации и ухудшению качества концентрата. Особенно это выражено при флотации в замкнутом цикле, который характерен для процесса флотации, осуществляемого на фабриках АНОФ-2 и АНОФ-3. По степени отрицательного воздействия на флотируемость чистых разностей апатита и кальцита бактерии можно расположить в ряд: Stenotrophomonas rhizophila > Pseudomonas alcaliphila = Acinetobacter sp. > Pseudomonas plecoglossicida. Наиболее сильное негативное влияние на процесс флотации апатита из апатит-нефелиновой руды оказывает консорциум бактерий Stenotrophomonas rhizophila, Pseudomonas alcaliphila и Pseudomonas plecoglossicida, снижая содержание Р2О5 в апатитовом концентрате на 3%.

Для разработки способов снижения численности бактерий в оборотной воде были исследованы перекись водорода, гипохлорит натрия и перманганат калия.

Опыты по влиянию бактерицидных соединений на жизнеспособность бактерий показали, что наиболее эффективен в качестве антисептика гипохлорит натрия. Он практически полностью стерилизует бактериальную суспензию в течение 5 мин при концентрации 2–5 мг/л и не снижает технологических показателей процесса флотации.

76

Разработана технология получения апатитового концентрата с учетом бактериального фактора, которая заключается в использовании малых концентраций гипохлорита натрия, ингибирующего развитие бактерий при флотации апатит-нефелиновых руд, не снижая технологических показателей процесса флотации. Предложенный способ позволяет на 20% сократить расход собирателей, что снизит негативное воздействие на окружающую среду. Экономическая эффективность этого способа по предварительным расчетам

составляет ∼ 5 млн. руб. в год.

ПРОДУКЦИЯ И ДЕСТРУКЦИЯ

В ЗАЛИВЕ ПОСОЛЬСКИЙ СОР ОЗЕРА БАЙКАЛ

В. П. Гаранкина, О. П. Дагурова

Институт общей и экспериментальной биологии СО РАН, Улан-Удэ, Россия

Посольский Сор – мелководный залив озера Байкал, с преобладающей глубиной около 3 м, расположенный южнее дельты реки Селенга. Залив относится к экотонной зоне между озером и прибрежьем. Постоянный приток воды, взвесей, органических и неорганических веществ осуществляют такие реки, как Большая Речка, Абрамиха, Большая Култушная и Толбазиха (Атлас Байкала, 1993).

Целью исследования было оценить процессы продукции и деструкции органического вещества в прибрежной зоне залива и сравнить с прибрежьем открытого Байкала.

Отбор проб воды и прибрежных осадков производился летом и осенью 2008 г. Пробы отбирались в двух точках: первая у уреза воды, вторая – на расстоянии 2 м от берега на глубине 0,7 м. Температура воды при отборе в осенний период была 13°С, летом – 24°С. Осадки у уреза представлены мелкозернистым песком, в двух метрах от берега –заиленным песком. Среднее значение минерализации воды составляло 60 мг/л. Значения рН воды варьировали от 7,8 до 8,4. Содержание гидрокарбонатов не превышало 48,8 мг/л. Содержание кислорода в воде варьировало от 5,4 до 10 мг/л. Общая численность микроорганизмов (ОЧМ) у уреза воды составила 1,1 млн. клеток/мл в воде и 5,5 млрд. клеток/мл в осадках, в двух метрах от берега- – 1,3 млн. клеток/мл и 4,3 млрд. клеток/мл в осадках. Скорость разложения целлюлозы в осадках составила 1,91% в сутки, скорость разложения белка – 2% в сутки.

Наибольшая величина валовой продукции была отмечена в осенний период у уреза воды и составила 0,166 мг С/л в сутки, при значениях деструкции 0,029 мг С/л в сутки. Летом продукция и деструкция характеризовались меньшими значениями – 0,008 и 0,006 мг С/л в сутки соответственно. В осадках аэробная деструкция протекала со скоростью 63,4 мг С/м2 в сутки в осенний период, 60 мг С/м2 в сутки – летом. Деструкция в анаэробных условиях составляла 10,5 мг С/м2 в сутки осенью, 48 мг С/м2 в сутки - летом. Для прибрежья открытого Байкала величина продукции в воде осенью составила 0,024 мг С/л в сутки, летом – 0,004 мг С/л в сутки; величина деструкции – 0,016 мг С/л в сутки и 0,02 мг С/л в сутки соответственно.

77

Таким образом, для прибрежья залива Посольский Сор показана большая интенсивность процессов продукции и деструкции, чем в прибрежных участках открытого Байкала, причем процессы деструкции происходят с меньшей интенсивностью, чем продукции. В осадках деструкция в основном протекает в аэробных условиях. Это объясняется мелководностью, обусловленным хорошим освещением, насыщением кислородом, прогревом воды и донных осадков.

Работа выполнена при финансовой поддержке гранта РФФИ № 08-04-98018р_сибирь_а.

БАКТЕРИИ–ДИССИПОТРОФЫ,

РАЗВИВАЮЩИЕСЯ В СООБЩЕСТВЕ С ГРИБАМИ–КСИЛОЛИТИКАМИ

В УЛЬТРАПРЕСНЫХ УСЛОВИЯХ

М. В. Зайчикова, Ю. Ю. Берестовская, Л. В. Васильева

Институт микробиологии им. С.Н. Виноградского РАН, Москва, Россия marinaz15@yandex.ru

Разложение древесины – один из масштабных процессов в круговороте углерода в

бореальной зоне России. Общий ежегодный отпад на покрытых лесом землях оценивается в 254Мт Сорг в пересчете на углерод, что согласуется по балансу углерода с ежегодным приростом леса (1). Основными деструкторами древесины являются ксилотрофные грибы, деятельность которых приводит к образованию дистрофных вод в лесо-болотных экосистемах. Бактерии не способны к разрушению химически инертного полимерного лигнина, но способны использовать низкомолекулярные продукты его гидролиза грибами, формируя в процессе жизнедеятельности мико-бактериальное сообщество, отличающееся тесной взаимосвязью компонентов.

На начальной стадии разложения древесины формируются кислые дистрофные воды, изучение бактериального сообщества которых имеет важное значение для водопользования (3).

Целью настоящей работы было изучение видового разнообразия бактерий, развивающихся в дистрофных ультрапресных кислых водах, сформированных ксилотрофными грибами в процессе разложения древесины в условиях лабораторной модели (микролизиметра), и установление их функциональной роли. В исследуемом сообществе были выявлены ксилотрофные грибы: Aspergillus ustus, Penicillium decumbens Penicillium sp., Paecilomyces sp., Trichoderma harzianum, Cladosporium sp. (по данным Семеновой Т.А.).

В промывных водах микролизиметра при рН 4.3 и электропроводности 140µS, были обнаружены олиготрофные бактерии с характерной морфологией - представители родов: Caulobacter sp., Prosthecobacter sp., Hyphomicrobium sp. Из группы простекобактерий обнаружен Labrys sp. Бактерии родов Stella sp., Prosthecomicrobium sp., Ancalomicrobium sp. не были выявлены.

Выделен ряд чистых культур ацидотолерантных диссипотрофных (2) бактерий, которые являются индикаторными формами для данной стадии разложения древесины.

78

На основании филогенетического анализа последовательности гена 16S pPHK и фенотипических признаков выделенные культуры отнесены к родам: Xanthobacter

(штамм Z-0055, описан в качестве нового вида рода X. xylophilus), Methylobacterium sp. (штамм Z-0033), Hyphomicrobium sp. (штамм Z-0045), Microccocus sp. (штамм Z-0066), Afipia sp. (штамм Z-0043), Spirosoma sp. (штамм Z-0088), а также штамм Z-0056, относящийся к новому виду рода Ancylobacter. Выделено 2 представителя ацидотолерантных планктомицетов (штамм Z-0078, штамм Z-0077).

Исследуемая группа бактерий характеризуется следующими эко-физиологическими особенностями: ацидотолерантностью (оптимальный рН для роста в пределах 5.0–6.5); способность к росту при низких концентрациях NaCl в среде (не выше 0.25%, за исключением Z-0088) и низкой электропроводности среды от 44 µS (Z-0056, Z-0055) до 0.8 mS (Z-0033, Z-0044, Z-0066, Z-0077, Z-0078).

Выделенные бактерии устойчивы к антибиотикам пенициллинового ряда и группы цефалоспоринов, продуцентами которых являются преимущественно грибы.

Выделенные организмы по пищевым потребностям условно можно разделить на следующие группы: сахаролитики, преимущественно использующие углеводы

(штаммы Z-0033, Z-0066, Z-0077, Z-0078, Z-0088); ацидотрофы, использующие органические кислоты (Z-0055, Z-0056); метилотрофы (Hyphomicrobium sp.). Оптимальная концентрация субстрата для представителей ацидотрофной группировки – 0,2 г/л. Концентрация субстрата выше 10 г/л оказывает ингибирующее воздействие.

Таким образом выделенные микроорганизмы являются представителями диссипотрофной группировки олиготрофных ацидофильных бактерий, использующих в качестве источника углерода и энергии вещества, образующиеся в процессе разложения древесины ксилотрофными грибами. Все исследованные бактериальные компоненты сообщества адаптированы к существованию в ультрапресных кислых условиях в тесной взаимосвязи с грибами.

1. Замолодчиков Д.Г. Кислород – основа жизни// 2006, Вестник Российской академии

наук, том 76, № 3, 209-218 с. 2. Васильева Л.В., Заварзин Г.А. Диссипотрофы в микробном сообществе// 1995,

Микробиология, том 64, № 2, 239-244 с. 3. Заварзин Г.А., Заварзина А.Г. Ксилотрофы и микофильные бактерии при образовании

дистрофных вод// 2009, Микробиология (в печати).

4. М.В. Зайчикова, Ю.Ю. Берестовская, В.Н. Акимов, А.К. Кизилова, Л.В. Васильева. Xanthobacter xylophilus sp. nov. – представитель ксилотрофного микобактериального сообщества ультрапресных вод.// 2010, Микробиология, том 1 (в печати).

79

ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНЫЕ

ЦИАНОБАКТЕРИАЛЬНО–АКТИНОМИЦЕТНЫЕ АССОЦИАЦИИ

И ИХ РОЛЬ В ПРЕОБРАЗОВАНИИ

КРИСТАЛЛИЧЕСКОЙ РЕШЕТКИ ГЛИНИСТЫХ МИНЕРАЛОВ

Е. А. Иванова1, Е. О. Омарова1

, Г. М. Зенова1

, Н. П. Чижикова2

1Московский государственный университет имени М.В. Ломоносова, Москва, Россия 2Почвенный институт имени В.В. Докучаева, Москва, Россия

Сообщества с участием цианобактерий и мицелиальных бактерий (актиномицетов)

широко распространены в природе: циано-бактериальные маты гидротерм и лагун; синцианозы саговниковых растений, где актиномицеты являются ассоциативными микросимбионтами наряду с доминантными микросимбионтами – цианобактериями; циано-бактериальные сообщества формирующиеся при “цветении” почвы; альго-бактериальные ассоциации с лишайникоподобным талломом в местах первичного почвообразования на осадочных карбонатных породах. Цианобактерии наряду с актиномицетами являются значимым компонентом сообщества почвенных микроорганизмов и активно принимают участие в таких биохимических процессах, как накопление органического вещества, распределение и аккумуляция различных элементов, разрушение минеральных субстратов. С целью выявления взаимодействия цианобактерий и актиномицетов в природных сообществах необходимо исследование функционирования компонентов в экспериментально сформированных ассоциациях.

Объектами исследования служили экспериментальные цианобактериально-актиномицетные ассоциации, одним из компонентов которых являлась аксеничная культура цианобактерии Anabaena variabilis Kutz. АТСС, полученная из музея кафедры физиологии микроорганизмов биологического факультета МГУ имени М.В. Ломоносова. В качестве партнеров выступали культуры актиномицетов Streptomyces pluricolorescens и S.

cyaneofuscatus, выделенные из природного синцианоза саговникового растения Stangeria

eriopus. Филогенетическое положение актиномицетов установлено на основании проведенного BLAST-анализа секвенированного фрагмента гена 16S рРНК.

Отмечено наличие тесного физического контакта компонентов ассоциации друг c другом, что проявляется в образовании коагрегатов из клеток водоросли и гиф актиномицета при росте ассоциации в жидкой среде. Выявлены морфологические изменения цианобактерий, не наблюдаемые в монокультуре – увеличение размеров клеток, присутствие форм несбалансированного роста цианобактерии в виде гигантских, дисковидных, изогнутых и ромбовидных клеток, наблюдается усиление антагонистической активности в ассоциации по сравнению с монокультурами цианобактери и актиномицета. Исследованиями, проведенными методом ЯМР – спиновое эхо, установлено присутствие определенного количества связанной воды в лиофильно высушенном образце ассоциации, что диагностировано по наличию фракции подвижных протонов (2,7% от веса образца), которая сохраняется при низких температурах. Отмечено изменение кристаллохимического состояния слоистых силикатов (каолинита, монтмориллонита, вермикулита, биотита и мусковита) под влиянием роста экспериментальных ассоциаций и монокультур

80

цианобактерии и актиномицета. Наиболее сильные изменения в минеральном субстрате рентгенографически зафиксированы при выращивании цианобактериально-актиномицетной ассоциации. В первую очередь происходит деструкция вермикулита, диагностируемая по троекратному уменьшению интенсивности рефлексов минерала, отмечается преобразование биотита в смешаннослойное слюда-смектитовое образование, о чем свидетельствует наличие характерных рефлексов (12,7 Å и 24,4 Å). На примере мелкопесчаной фракции породы вермикулита показано физическое дробление минерала до фракции тонкой пыли под влиянием жизнедеятельности экспериментальной ассоциации.

Проведенное исследование показывает возможность создания экспериментальных цианобактериально-актиномицетных ассоциаций c симбиотическим характером взаимодействия партнеров. Изменение морфолого-физиологической активности компонентов, а также наличие связанной воды в ассоциации может служить механизмами, обеспечивающими устойчивость и сохранение жизнеспособности исследуемых ассоциаций в неблагоприятных условиях окружающей среды.

МЕТАНОТРОФНОЕ СООБЩЕСТВО

ТЕРМАЛЬНЫХ ИСТОЧНИКОВ КАЛЬДЕРЫ УЗОН, КАМЧАТКА

Т. Н. Игумнова1,2, К. А. Медведкова1

1Институт Биохимии и Физиологии Микроорганизмов им. Г.К. Скрябина РАН, Пущино, Россия

1,2 Пущинский Государственный Университет, Пущино, Россия Интерес к термофильным прокариотам связан с наличием у них уникальных по

стабильности биополимеров и низкомолекулярных соединений, обуславливающих адаптацию к повышенным температурам. Гидротермы Камчатского полуострова являются специфическими местообитаниями для микробных сообществ, поскольку характеризуются высокой температурой и различными значениями рН. Присутствие метана геохимического или микробиологического происхождения в этих биотопах предполагает возможность существования адаптированных метанотрофных бактерий. Недавно из кислого термального источника вблизи кальдеры Узон Камчатки выделен и описан термоацидофильный метанотроф “Methyloacida kamchatkensis” Kam1, растущий в интервале температур 37-60°C и рН 2–5. Однако разнообразие метанотрофов в гидротермах Камчатского полуострова не изучалось. Цели данной работы выделение накопительных культур метанотрофных бактерий и оценка их филогенетического разнообразия метанотрофов в термальных источниках кальдеры Узон Камчатского полуострова.

Из образцов донных осадков термальных источников кальдеры Узон, характеризующихся различными рН (от рН 3.0 до рН 7.0) и температурами воды от 37

до 55-70°С, выделены 9 накопительных культур метанотрофных бактерий, растущих при различных рН (рН 3.5 или рН 6.8) и температурах 37 или 60°С. В первичных накопительных культурах оценивали активность метанотрофов радиоизотопным методом. Из образцов кислых термальных источников с рН 3.0 выделены активно потребляющие С14-метан накопительные культуры №101, 152, 91, 132, 145, 127 и 107.

81

Из ДНК накопительной культуры 101 с использованием ПЦР, клонированием и рестрикционным анализом полученных ампликонов выявлен один тип клонов, в которых последовательности генов 16S рРНК и pmoA имели 99% сходства с термоацидофильным метанотрофом “Acidimethylosilex fumariolicum” SoIV. Транслированные аминокислотные последовательности фрагмента гена pmoA из ДНК накопительных культур №152, 91, 107, 127, 132 имели 99% сходства с PmoA термоацидофильного метанотрофа “Methyloacida

kamchatkensis”. В накопительной культуре, выделенной из донных осадков карбонатного термального

источника при 37°С и рН 5.0 и характеризующейся высокой скоростью окисления метана, с помощью библиотеки клонов гена pmoA, амплифицированного с применением системы праймеров 189f и 682r, выявлены 9 групп клонов. Рестрикционный анализ ампликонов показал присутствие ранее не описанных филогенетических единиц метанотрофов, имеющих наибольшее сходство с известным термотолерантным Methylococcus capsulatus (88% идентичности транслированных аминокислотных последовательностей), а также близких мезофильным метанотрофам I морфотипа Methylomonas methanica (95–98%) и II морфотипа Methylosinus trichosporium (97%) и Methylocystis parvus (96%).

Полученные результаты свидетельствуют о разнообразии метанотрофов в геотермальных источниках Камчатки, а также высокой адаптабельности к повышенным температурам бактерий, представленных в культурах мезофильными штаммами метанотрофов.

Работа поддержана грантами РФФИ 09-04-90450-Укр_ф_а и Министерства образования и науки РФ (РНП 2.1.1/605).

ИНСТРУМЕНТАЛЬНАЯ ОЦЕНКА БИОРАЗНООБРАЗИЯ ЛАКТОБАЦИЛЛ

ВЛАГАЛИЩА ЧЕЛОВЕКА

А. С. Исаева1, В. В. Муравьева2

, А. Д. Боровская3, Е. Н. Ильина3

, А. В. Летаров1

1Институт микробиологии им. С.Н. Виноградского РАН, Москва, Россия 2ФГУ "Научный центр акушерства, гинекологии и перинатологии

имени академика В.И. Кулакова", Москва, Россия 3Научно-исследовательский институт физико-химической медицины, Москва, Россия

Лактобациллы занимают значительную часть вагинального биотопа, играя важную

роль в поддержании в физиологической норме репродуктивных путей. Лактобациллы продуцируют молочную кислоту и перекись водорода, которые создают во влагалище кислую среду с pH 4,4–4,6, эффективно подавляя рост таких бактерий, как E. coli,

Gardnerella vaginalis, Chlamidia trachomatis, Neisseria gonorrhoeae и других условно-патогенных микроорганизмов. При бактериальном вагинозе число пероксид-продуцирующих лактобактрий снижается значительно, а численность анаэробов возрастает, что приводит к изменению физико-химических условий среды. Среди различных факторов, способных in situ отрицательно влиять на лактобацилл, одним из наименее изученных остается фаговая инфекция. Для исследования этого явления необходимо определить степень

82

гетерогенности индивидуальных популяций лактобацилл на штаммовом уровне и изменение их состава во времени. Задачей нашего исследования была оценка возможности применения прямого белкового профилирования с помощью MALDI–TOF масс-спектрометрии для быстрой идентификации и типирования клинических изолятов лактобацилл.

Из 295 отобранных изолятов, 189 были идентифицированы как разные виды, входящие в род Lactobacillus, (с точностью log(score) ≥ 2.0) – L. jensenii (n=35), L. crispatus (n=85), L. gasseri (n=61), L. sp 105932T CIP (n=4), L. johnsonii (n=1), L. salivarius (n=3). 98 изолятов были идентифицированы как L. jensenii (n=75), L. crispatus (n=16), L. gasseri (n=6), L. salivarius (n=1) с вероятностным определением до рода (log(score) < 2.0)

Полученные нами данные свидетельствуют о том, что метод MALDI–TOF масс-спектрометрии выгодно отличается от других методов молекулярной идентификации лактобацилл. Основными преимуществами метода являются высокая чувствительность, простая пробоподготовка (10–15 мин/образец), высокая скорость измерения, возможность автоматизации и роботизации всех стадий исследования, сравнительно низкая стоимость используемых реактивов и материалов. Таким образом, этот метод может найти широкое применение в клинической и прикладной микробиологии. Мы планируем его дальнейшее использование в наших исследованиях в качестве системы штаммовой дифференциации лактобацилл.

МОЛЕКУЛЯРНЫЙ АНАЛИЗ

НАКОПИТЕЛЬНЫХ МЕТАНОКИСЛЯЮЩИХ КУЛЬТУР,

ВЫДЕЛЕННЫХ ИЗ ЛЕСНОЙ И СЕЛЬСКОХОЗЯЙСТВЕННЫХ ПОЧВ

А. К. Кизилова, Е. В. Менько, И. К. Кравченко

Институт микробиологии им. С.Н. Виноградского РАН, Москва, Россия

Окисление метана микроорганизмами аэробных почв является единственным известным биологическим процессом регуляции содержания этого важнейшего парникового газа в атмосфере. В последние годы для оценки разнообразия метанотрофов в различных природных объектах широко и успешно применяется анализ фрагмента гена pmoA, кодирующего ключевой фермент первого этапа метаболизма метана у всех известных метанотрофов кроме Methylocella. Филогенетические построения, основанные на анализе последовательностей pmoA, практически совпадают с таковыми на основе 16S рРНК, что позволяет определить таксономическое положение метанокисляющих организмов до рода, а иногда и до вида.

Стабильные метанокисляющие накопительные культуры были выделены из почвы лесного биоценоза (FS) и пашни (AS) Московской области и почвы агроценоза Бельгии (BS). Методами газовой хроматографии и радиоактивных изотопов было установлено, что культуры способны окислять метан при низкой (2–10 ppm) концентрации, причем, включение метки 14СН4 наблюдается как в СО2, так и в биомассу и экзометаболиты. Константы Михаэлиса для накопительных культур составляли от 54,2 до 176,8 нМ СН4, что сопоставимо с величинами, полученными для аэробных почв. Микроскопический анализ накопительных культур методом флуоресцентной in situ гибридизации (FISH) показал, что

83

доля метанотрофов II типа (зонд М-450) от метаболически активных бактерий

(зонд EUB 338 mix) составляла 87,3%, 80,9% и 99,5% в культурах FS, AS и BS соответственно.

Для оценки разнообразия метанокисляющих бактерий был применен метод молекулярного клонирования фрагмента pmoA с помощью коммерческого набора реактивов pGEM-T Easy Vector System I (Promega, США) и разделение ампликонов методом ДГГЭ. Установлено, что основная часть клонов (94%) в клонотеке, полученной для накопительной культуры из лесной почвы (FS), имела вставки, нуклеотидные последовательности которых продемонстрировали наибольшую степень сходства с фрагментами гена pmoA (98%) и pmoA2 (100%) Methylocystis sp. SC2. Именно для этой культуры, выделенной их загрязненного водоносного слоя, впервые было показано присутствие двух значительно отличающихся между собой генов pmoA (pmoA1 и pmoA2) [1] и установлено, что именно pmoA2 отвечает за синтез активного центра фермента с высоким сродством к метану [2]. Минорную часть составляли последовательности, выявившие сходство с Methylosinus

trichosporium (92%). В накопительных культурах из обеих пахотных почв (AS и BS) в качестве доминирующих были идентифицированы метанотрофы наиболее близкие к представителям рода Methylosinus, однако, сходство нуклеотидных последовательностей pmoA и pmoA2 с известными организмами было низким (92% и 96%).

Проведенные исследования показали, что в состав накопительных культур, выделенных из аэробных почв и обладающих высоким сродством к метану, входили бактерии рода Methylocystis (почва смешанного леса) и Methylosinus (почвы агроценозов), обладающие генами, кодирующими синтез активного центра двух метанмонооксигеназ. Наличие двух ферментов с различным сродством к метану объясняет возможность адаптации этих микроорганизмов к разным концентрациям метана. Ранее с помощью иммунных методов нами было выявлено доминирование бактерий рода Methylocystis в микробных сообществах лесных почв, обладающих высокой метанокисляющей активностью, что позволяет предположить ведущую роль в этом процессе метанотрофов, входящих в состав изученных накопительных культур. 1. Dunfield P.F., Tchawa Yimga M., Dedysh S.N., Berger U., Liesack W., Heyer J. Isolation of a

Methylocystis strain containing a novel pmoA-like gene// FEMS Microbiol. Ecol. 2002. V. 41. P. 17-26.

2. Baani M., Liesack W. Two isozymes of particulate methane monooxygenase with different methane oxidation kinetics are found in Methylocystis sp. strain SC2 // Proc Natl. Acad. Sci. USA. 2008. V. 105. № 29. P. 10203-10208.

84

ГЕНЕТИЧЕСКАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА ШТАММОВ

CLAVIBACTER MICHIGANENSIS SUBSP. MICHIGANENSIS,

ВЫДЕЛЕННЫХ НА ТЕРРИТОРИИ БЕЛАРУСИ В 2007–2008 ГОДАХ

A. В. Клемантович1, В. Е. Мямин1

, А. Г. Песнякевич1

1Белорусский государственный университет, Минск, Беларусь

Тепличная культура томата подвержена широкому кругу бактериальных заболеваний, приносящих значительный экономический урон. На протяжении 2007 и 2008 годов нами были проведены исследования видового разнообразия бактериальных возбудителей заболеваний томата в тепличных хозяйствах республики Беларусь.

Установление видовой принадлежности микроорганизмов, выделенных из пораженных растений, осуществлялось посредством ПЦР диагностики со специфическими праймерами, рекомендуемыми в литературе, а так же путем определения нуклеотидной последовательности гена 16S РНК и сравнения с известными последовательностями в базах данных.

В результате было установлено, что преобладающим заболеванием томатов за исследованный промежуток времени являлся бактериальный рак томата, возбудителем которого является Clavibacter michiganensis subsp. michiganensis (C.m.m.). Высокая вирулентность 6 штаммов C.m.m, выделенных в 2007 году, и 10 штаммов, выделенных

в 2008 году, в различных тепличных хозяйствах, была подтверждена путем заражения ими растений томата сорта Раиса и последующего выделения возбудителя из тканей растений.

В дальнейшем проводилась генетическая характеристика полученных изолятов. Штаммы C.m.m. были проверены на наличие плазмидных генов celA и pat-1 расположенных на плазмидах pCM1 и pCM2 соответственно (Рис. 1).

А.

1000 п.н. 750 п.н. 500 п.н.

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 к

Б.

1000 п.н. 750 п.н. 500 п.н.

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 к

Рис. 1. Результат ПЦР с праймерами к celA (А) и pat-1 (Б). 1 – маркер молекулярной массы; 2–7 – штаммы, изолированные в 2007 году; 8–17 – штаммы, изолированные в 2007 году; к – негативный контроль

Из литературных источников следует, что плазмидные гены celA и pat-1 необходимы для развития симптомов бактериального рака. Как видно из данных, приведенных на рисунке 1, некоторые из выделенных штаммов не дают в результате ПЦР продукта ожидаемой длины

85

(для celA – 580 п.н., для pat1 – 614 п.н.), из чего можно заключить, что эти штаммы не несут соответствующих плазмид. Однако все штаммы имеют хотя бы одну плазмиду, а значит, не утрачивают вирулентность полностью, что коррелирует с результатами экспериментов по заражению томатов.

Далее определялось наличие у исследуемых штаммов генов ppaA и chpC, принадлежащих к хромосомному островку патогенности chp/tomA (Рис.2).

А.

750 п.н. 500 п.н.

250 п.н.

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 к

Б.

750 п.н. 750 п.н.

500 п.н.

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 к

Рис. 2. Результат ПЦР с праймерами к ppaA (А); chpC (Б). 1 – маркер молекулярной массы; 2–7 – штаммы, изолированные в 2007 году; 8–17 – штаммы, изолированные в 2007 году; к – негативный контроль

Исходя из данных, представленных на рисунке 2 видно, что все штаммы в результате ПЦР реакции с праймерами к гену chpC дали ожидаемый фрагмент размером 638п.н. Можно заключить, что генетический материал всех исследованных штаммов имеет в своем составе ген chpC. В тоже время, 1 из штаммов, выделенных в 2007 году., и 1 из выделенных

в 2008 году не дали фрагменты нужной длинны (587 п.н.) и, соответственно, не имеют гена ppaA.

Таким образом, можно сделать вывод о генетической гетерогенности популяции C.m.m. циркулирующей в тепличных хозяйствах Беларуси, и предположить, в связи с этим, существования различных источников поступления инфекции на территорию республики.

86

ИСПОЛЬЗОВАНИЕ РИБОСОМНЫХ И ФУНКЦИОНАЛЬНЫХ ГЕНОВ

В ИССЛЕДОВАНИИ МИКРОБНЫХ СООБЩЕСТВ

ВЫСОКОТЕМПЕРАТУРНЫХ НЕФТЯНЫХ ПЛАСТОВ

А. В. Коршунова1, Е. М. Михайлова2

, Н. М. Шестакова2, Д. Ш. Соколова2

,

Т. П. Турова2, А. Б. Полтараус3

, Т. Н. Назина2

1Факультет биоинженерии и биоинформатики, МГУ им. М.В. Ломоносова, Москва 2Институт микробиологии им. С.Н. Виноградского РАН, Москва

3Институт молекулярной биологии им. В.А. Энгельгардта РАН, Москва

В настоящее время для изучения биоразнообразия и функциональных особенностей

природных сообществ используется сравнительный анализ рибосомных и функциональных генов. Целью настоящей работы было изучение разнообразия микроорганизмов высокотемпературного нефтяного пласта путем анализа генов 16S рРНК и генов биодеградации н-алканов (alkB), полученных на основе ДНК и РНК пластовой воды, исследование ДНК топоизомераз типа II (gyrB и parE) у представителей рода Geobacillus и оценка возможности использования этих генов для изучения природных сообществ.

Ранее нами был проведен поиск генов системы биодеградации н-алканов у представителей бактерий рода Geobacillus. Процесс окисления н-алканов осуществляется системой алкан-гидроксилаз (alk-оперон), которая детально описана только для мезофильных бактерий. При изучении 11 штаммов термофильных аэробных бактерий рода Geobacillus были обнаружены 8 гомологов гена alkB. Сравнительный филогенетический анализ нуклеотидных последовательностей и транслированных аминокислотных последовательностей выявил близкое сходство шести полученных гомологов с alkB4, alkB3,

и alkB2 гомологами, обнаруженными ранее у штаммов Rhodococcus erythropolis NRRL

B-16531 и Q15. Два оставшихся гомолога оказались уникальными для геобацилл. Показано, что по ГЦ составу гены alkB геобацилл имели большую степень сходства с хромосомной ДНК родококков, чем с хромосомной ДНК геобацилл. Анализ использования кодонов для генов alkB выявил, что пул этих генов был общим для большинства грамположительных и некоторых грамотрицательных бактерий. Отсутствие видовой специфичности обнаруженных у гебацилл генов alkB, не позволяет использовать их для таксономических целей. Тем не менее, они могут быть использованы для оценки разнообразия геобацилл в термальных природных экосистемах, где отсутствуют мезофильные микроорганизмы (в основном, родококки), обладающие близкими последовательностями alkB генов.

Методом анализа генов 16S рРНК и alkB в библиотеках клонов, полученных на основе ДНК пластовой воды, были обнаружены филотипы аэробных и анаэробных микроорганизмов, термофильных бактерий и архей с бродильным типом метаболизма, сульфатредуцирующих, метанобразующих и синтрофных микроорганизмов. Создание кДНК библиотек клонов гена 16S рРНК из накопительных культур углеводородокисляющих бактерий и пластовой воды нефтяного месторождения Даган позволило выявить метаболически активные группы в составе микробного сообщества. Впервые было показано, что филотипы бактерий рода Geobacillus доминируют в составе кДНК библиотеки клонов гена 16S рРНК, что свидетельствует о присутствии метаболически активных геобацилл в

87

нефтяном пласте. Ранее с использованием микробиологических методов было установлено широкое распространение геобацилл, использующих углеводороды нефти, в заводняемых нефтяных пластах.

Таким образом, изучение биоразнообразия микроорганизмов методом анализа генов 16S рРНК, полученных на основе тотальной ДНК и РНК микробного сообщества, дает наиболее полное представление о составе микробного сообщества и позволяет выявить метаболически активные группы микроорганизмов.

Кроме того, у 15 штаммов геобацилл были определены последовательности генов β-субъединицы гиразы и топоизомеразы топоизомераз II типа, gyrB и parE. Впервые показана возможность использования этих генов для дифференциации видов рода Geobacillus в качестве филогенетических маркеров, альтернативных генам 16S рРНК. Использование последовательностей генов топоизомераз II типа позволяет достоверно различать меж- и внутривидовой уровни родства геобацилл.

Таким образом, применение рибосомных генов в сочетании с генами алкан-гидроксилаз позволяет описать разнообразие микроорганизмов в микробном сообществе, выявить генетические детерминанты биодеградации н-алканов, тогда как гены топоизомераз II типа могут претендовать на роль филогенетических маркеров, имеющих наиболее высокую разрешающую способность.

Работа поддержана РФФИ (гранты № 06-04-49128 и № 05-04-39029), Министерством науки и образования РФ (НШ 4174.2008.4) и Президиумом РАН (Программы "Молекулярная и клеточная биология" и "Научные основы эффективного природопользования, развития минерально-сырьевых ресурсов, освоения новых источников природного и техногенного сырья").

ПЦР–АНАЛИЗ ГЕНОВ АЛЬДОКСИМДЕГИДРАТАЗ

У НИТРИЛТРАНСФОРМИРУЮЩИХ ПОЧВЕННЫХ БАКТЕРИЙ

А. В. Максимова1, М. В. Кузнецова2

1Пермский государственный университет, Пермь, Россия, 2Институт экологии и генетики микроорганизмов УрО РАН, Пермь, Россия

Одной из причин распространения у бактерий ферментов метаболизма нитрилов,

вероятно, является наличие пути их эндогенного синтеза из аминокислот с образованием интермедиатов – альдоксимов. У бактерий конверсия альдоксимов в нитрилы, а затем в соответствующие карбоновые кислоты происходит путем сочетания работы ферментов альдоксимдегидратазы и нитрилутилизирующих ферментов – нитрилгидратазы и амидазы и/или нитрилазы [1].

Целью работы является детекция генов альдоксимдегидратаз у бактерий, способных утилизировать нитрилы карбоновых кислот.

Объектами исследования являлись бактериальные культуры, утилизирующие нитрилы карбоновых кислот, полученные ранее в результате селекции на ацето- или

88

изобутиронитриле из образцов почв и вод естественной среды, а также почвы промышленных предприятий (ФГУП "ПЗ им. С.М. Кирова" и ОАО "Бератон").

Проанализировано 59 штаммов грамположительных (роды Rhodococcus, Arthrobacter, Miсrobacterium, Citreobacterium, Nocardia, Gordonia, Aureobacterium) и 32 штамма грамотрицательных (роды Pseudomonas, Azomonas, Azotobacter и Acidovorax) бактерий. Препараты хромосомной ДНК грамположительных микроорганизмов получали фенольным методом, модифицированным для выделения ДНК из актиномицетов (Гловер Д., 1988). Выделение тотальной ДНК грамотрицательных бактерий проводили по методике, описанной G.G. Stone [2].

Детекцию генов альдоксимдегидратаз осуществляли посредством ПЦР с праймерами к генам, кодирующим известные альдоксимдегидратазы грамотрицательных и грамположительных микроорганизмов.

Для ПЦР с праймерами RhOxd F1/R1, выявляющими гены альдоксимдегидратазы, характерные для грамположительных бактерий, использовали следующий режим амплификации: 94°С – 20 с; 64°С – 30 с; 72°С – 60 с (35 циклов). Для праймеров PsOxd F1/R1, выявляющих гены ферментов грамотрицательных микроорганизмов, подобных альдоксимдегидратазе Pseudomonas chlororaphis B23, режим амплификации включал: 94°С – 20 с; 54°С – 70 с; 72°С – 60 с (35 циклов).

Установлено, что у 12 штаммов (20,3%) грамположительных нитрилутилизирующих бактерий присутствовали фрагменты ДНК, соответствующие гену альдоксимдегидратазы. Все штаммы принадлежали к роду Rhodococcus (из них 11 – R. erythropolis, 1 – R. rhodochrous). На матрице ДНК штамма Pseudomonas fluorescens 3220 амплифицирована последовательность, гомологичная альдоксимдегидратазе P. chlororaphis

B23 [3]. Таким образом, показано, что только 14,3% нитрилутилизирующих бактерий изолятов содержат гены альдоксимдегидратаз.

Распределение нитрилгидролизующих ферментов в группах микроорганизмов и их физиологическая роль определена не в полной мере, поэтому изучение альдоксимдегидратаз, генетической регуляции альдоксим-нитрильного пути позволит понять механизмы работы этих ферментов и их место в метаболизме бактерий.

Работа выполнена при поддержке программы Президиума РАН «Биологическое разнообразие», ФЦП «Научные и научно-педагогические кадры инновационной России на 2009–2013 годы» (ГК№ 02.740.11.0078).

1. Kato Y. et al. Isolation and characterization of a bacterium possessing a novel aldoxime-

dehydration activity and nitrile-degrading enzymes // Arch. Microbiol. – 1998. – V. 170. – P. 85-90.

2. Stone G.G. et al. Detection of Salmonella serovars from clinical samples by enrichment broth cultivation-PCR procedure // J. Clin. Microbiol. – 1994. – V. 32. – P. 1742-1749.

3. Oinuma K. et al. Novel aldoxime dehydratase involved in carbon-nitrogen triple bond synthesis of Pseudomonas chlororaphis B23 // J. Biol. Chem. – 2003. – V. 278. – P. 29600-29608.

89

ВЫДЕЛЕНИЕ И ХАРАКТЕРИСТИКА

НАКОПИТЕЛЬНЫХ КУЛЬТУР МЕТАНОТРОФОВ

ИЗ ГОРЯЧИХ ИСТОЧНИКОВ КАЛЬДЕРЫ ВУЛКАНА УЗОН, КАМЧАТКА

Е. В. Менько, А. К. Кизилова, И. К. Кравченко, В. Ф. Гальченко

Институт микробиологии им. С.Н. Виноградского РАН, Москва, Россия Метанотрофные бактерии представляют собой уникальную группу микроорганизмов,

активно участвующих в биогеохимическом цикле углерода и других биогенных элементов, а также контролирующих потоки метана из мест его образования или захоронения в атмосферу.

В ходе экспедиционных исследований из образцов ила и циано-бактериальных матов термальных источников кальдеры вулкана Узон на низкоминерализованной среде с метаном (60°С, рН 6,8) было получено 18 накопительных культур. С помощью праймерной системы A189–A682 [1] в первичных накопительных культурах фрагмент гена pmoA, кодирующий субъединицу А метанмонооксигеназы, был амплифицирован лишь в культуре «14», полученной из образца ила источника Культурный на берегу оз.Фумарольное. После трехкратных пересевов в лабораторных условиях фрагменты гена pmoA были амплифицированы еще для четырех накопительных культур, полученных из образцов ила из жерла («7») источника Глаз дракона и вытекающего из него ручья («8»), (63°С, рН 6,0), а также из нижней поверхности циано-бактериальных мата («11») и ила со дна («12») источника Строма (51,2°С, рН 6,3).

Молекулярное клонирование и рестрикционный анализ полученных фрагментов показал наличие только одного типа клонов, что свидетельствует о присутствии одной метанотрофной культуры во всех культурах. Секвенирование фрагментов генов и сравнение с последовательностями базы данных GenBank продемонстрировало высокую степень сходства (92–96% по нуклеотидным последовательностям) с фрагментом гена pmoA некультивируемого термофильного метанотрофа «Methylothermus HB». На филогенетическом дереве, построенном на основании PmoA, метанотрофы из всех пяти накопительных культур образуют компактную отдельную группу, которая кластируется также с Methylothermus thermalis и Methylohalobius crimeensis.

Анализ накопительных культур после пересевов методом FISH (зонд М 84+705) выявил присутствие метанотрофов, относящихся к γ-Proteobacteria (I группа метанотрофов). Доля метанотрофов среди метаболически активных бактерий (зонд EUB 338 mix) достигала 70–90%. Рост культуры (снижение содержания метана, увеличение количества клеток) наблюдали при инкубации в диапазоне от 55 до 60°С, при 50°С рост прекращался. В процессе роста образуются конгломераты, устойчивые к механической, ультразвуковой и химической (пирофосфат натрия) дезинтеграции. Исследования разнообразия микробного населения культуры с помощью метода ДГГЭ (денатурирующего градиентного гель-электрофореза) гена 16S рРНК выявили присутствие в культуре «14» некультивируемых представителей рода Chlorobium.

Камчатский регион – уникальное место для изучения выделения и сохранения в коллекциях культур термофильных микроорганизмов, которые являются перспективным

90

объектом для биотехнологии. В настоящее время род Methylothermus представлен лишь одним валидно описанным видом M. thermalis. Полученные нами пять высокообогащенных монокультур метанотрофов, проявившие высокую степень сходства с утраченным штаммом «Methylothermus HB», позволяют надеяться на выделение чистой культуры и описание нового вида термофильных метанотрофов. 1. Holmes, A. J., Costello, A. M., Lidstrom, M. E., and Murrell, J. C. (1995). Evidence that

particulate methane monooxygenase and ammonia monooxygenase may be evolutionarily related. FEMS Microbiol. Lett. 132, 203–208.

НИТРИФИЦИРУЮЩИЕ МИКРООРГАНИЗМЫ

В ПОЧВАХ ЕВРОПЕЙСКОЙ ЧАСТИ РОССИИ

А. С. Черобаева1, А. Л. Степанов1

, И. К. Кравченко2

1Московский Государственный Университет им. М.В. Ломоносова, Факультет почвоведения, Москва, Россия

2Институт микробиологии им. С.Н. Виноградского РАН, Москва, Россия Закись азота рассматривается как один из трех компонентов атмосферы, увеличение

концентрации которого определяет формирование парникового эффекта. Основным источником закиси азота в природе является почва, и наибольший вклад в процессы образования и поглощения закиси азота в почве вносят сообщества нитрифицирующих и денитрифицирующих микроорганизмов. Целью настоящей работы было оцеить разнообразие нитрифицирующих микроорганизмов в почвах зонально-генетического ряда экосистем европейской части России. Для этого были поставлены следующие задачи: отработка методов молекулярной детекции ключевых функциональных генов нитрификаторов и сравнительный анализ результатов амплификации фрагментов этих генов из ДНК, выделенной из почвенных образцов разных экосистем.

В качестве основного объекта молекулярных исследований были выбраны гены amoA, кодирующие синтез одной из субъединиц фермента аммоний монооксигеназы (АМО), который являются функционально-специфическими и широко используются для выявления автотрофных окисляющих аммоний микроорганизмов. Для амплификации фрагмента гена β-протеобактерий использовали праймеры amoA – 1F и amoA – 2R (Rotthauwe et al., 1997). ПЦР анализ фрагмента гена амоА архей был проведен при помощи праймерной системы crenAmo – 1F и crenAmo – 1R (Konneke et al., 2005).

Для оптимизации условий экстракции ДНК из разных зональных почв были проверены 4 метода, основанные на применении прямого лизиса. Методы основывались на первоначальной механической обработке почвы, применении экстракционных буферов, детергентов, разного температурного и временного режима инкубации образцов. По результатам исследований был выбран метод с использованием коммерческого набора реактивов Power Soil DNA Kit (MO BIO) с незначительными модификациями, с помощью которого препарат ДНК, пригодный для амплификации фрагментов рибосомальных

91

(16S rRNA) и функциональных (амоА) генов, получали стабильно и воспроизводимо в течение 2 часов.

Препараты ДНК из почв природных экоценозов и агрофитоценозов были проанализированы на наличие нитрифицирующих бактерий. ПЦР-анализ показал присутствие в дерново-подзолистой почве Московской обл. (лес, пашня), серой лесной почве Тульской обл. (лес), а также в почвах, сформировавшихся под степной растительностью – черноземе Воронежской обл. и каштановой Волгоградской обл. Для оценки разнообразия нитрификаторов полученные PCR продукты разделяли методом молекулярного клонирования, с последующим сиквенсным и филогенетическим анализом. Сравнительный анализ библиотек клонов почвенных образцов и обогащенных накопительных культур показал, что в дерново-подзолистой почве выявлены представители рода Nitrosospira, в то время как в накопительной культуре из этой почвы – Nitrosospira, Nitrosolobus. В каштановой почве обнаружены Nitrosospira и Nitrosolobus, в накопительной культуре – Nitrosospira, Nitrosolobus и Nitrosovibrio.

Разработан протокол амплификации, позволяющий получать стабильный продукт фрагмента гена амоА архей из почвенных образцов. Данный протокол является модификацией ранее опубликованных (Konneke et al., 2005, Dorador et al., 2008) с изменением времени элонгации, температуры отжига и количества матрицы. Получены продукты амплификации для ДНК, выделенной из дерново-подзолистой почвы леса и пашни на разной глубине забора проб: 5–10 см и 40–50 см.

Таким образом, отработаны праймерные системы и условия амплификации для детекции фрагмента функционального гена amoA β-протеобактерий и кренархеот из почвенных образцов. Сравнительный анализ показал, что выявляемое разнообразие нитрификаторов в в накопительных культурах больше, чем в соответствующих почвенных образцах.

3. Rotthauwe JH, Witzel KP, Liesack W. 1997. Appl Environ Microbiol. 63(12):4704-12. 4. Könneke M, Bernhard AE, de la Torre JR, Walker CB, Waterbury JB, Stahl DA. 2005.

Nature. 22;437(7058):543-6. 5. Dorador C, Busekow A, Vila I, Imhoff JF, Witzel KP. 2008. Extremophiles. 12(3):405-14.

92

ИЗУЧЕНИЕ ГЕНЕТИЧЕСКОГО РАЗНООБРАЗИЯ

БАКТЕРИЙ РОДА RHODOCOCCUS,

ВЫДЕЛЕННЫХ ИЗ РАЙОНА СОЛЕРАЗРАБОТОК

О. В. Ястребова, Л. Н. Ананьина, Е. Г. Плотникова

Институт экологии и генетики микроорганизмов УрО РАН, Пермь, Россия

Эубактерии рода Rhodococcus представляют отдельную группу в эволюционной ветви актиномицет, содержащих миколовые кислоты в клеточной стенке. Бактерии этого рода встречаются в различных биотопах эколого-географических регионов планеты, это обусловлено их устойчивостью к действию неблагоприятных факторов среды и наличием у них катаболических путей разложения органических соединений разных классов, в том числе полициклических ароматических углеводородов (ПАУ).

Целью работы являлось изучение генетического разнообразия бактерий-деструкторов ПАУ рода Rhodococcus, выделенных из района солеразработок.

В работе проведен анализ 8 галотолерантных штаммов-деструкторов нафталина рода Rhodococccus, изолированных из почвы и донных осадков сточных вод солеразрабатывающего предприятия БКРУ-1 г. Березники Пермского края. Типирование выделенных штаммов с помощью REP-ПЦР позволило разделить их на 4 геномогруппы. Скрининг нуклеотидных последовательностей фрагмента гена 16S рРНК изолятов по базе данных GenBank выявил, что представители I геномогруппы (штаммы SN31 и DB11) имеют высокий уровень сходства с типовым штаммом вида R. ruber, а изоляты II геномогруппы (B13 и B14) с R. wratislaviensis, наиболее близкородственным видом для представителей

III геномогруппы (штаммы B1-4, B2-1 и SMB37) является вид R. pyridinovorans, а штамм SMB38 наиболее близок к R. marinonascens. Этот факт свидетельствует о видовом разнообразии родококков-деструкторов ПАУ в засоленной экосистеме.

Помимо этого был исследован полиморфизм генов, кодирующих каталитический компонент ключевого фермента деструкции нафталина – большую и малую субъединицы нафталин 1,2-диоксигеназы (НДО). Филогенетический анализ нуклеотидных последовательностей показал, что уровень гомологии анализируемых фрагментов у штаммов-представителей разных геномогрупп друг с другом находится ниже 100%, а на дендрограмме они располагаются в разных подкластерах. Таким образом, выявлено разнообразие генов НДО у исследованных родококков.

Работа поддержана грантом РФФИ-Урал №07-04-96078-а и Программой фундаментальных исследований Президиума РАН "Молекулярная и клеточная биология".

93

СЕКЦИЯ III

ПЕРСПЕКТИВНЫЕ НАПРАВЛЕНИЯ

МИКРОБНОЙ БИОТЕХНОЛОГИИ

УГЛЕВОДНЫЙ СОСТАВ МИЦЕЛИЯ И СПОР ПРЕДСТАВИТЕЛЕЙ

ВЫСШИХ И НИЗШИХ МИЦЕЛИАЛЬНЫХ ГРИБОВ

Д. А. Андриянова1, А. И. Усов2

, Н. Р. Мейчик3, Е. П. Феофилова1

1 Институт микробиологии РАН, Россия, Москва 2 Институт органической химии РАН, Россия, Москва

3 Московский Государственный Университет, Россия, Москва

Грибы достаточно долго относили к растениям, и относительно недавно – к началу 70-х годов прошлого столетия – эти организмы выделили в особое царство (Fungi, Mycota,

Mycetalia). Наиболее значимым по числу видов в этом царстве является раздел, относимый по системе Олайва (Olive, 1975) к отделу Eumycota, включающему 5 классов.

Анализируя существующие системы грибов можно видеть, что они создавались с учетом данных, полученных с использованием наиболее современных методов исследования. Например, для построения систем грибов использовались данные электронной и сканирующей микроскопии, в более поздних системах изучали морфологию отдельных стадий онтогенеза, а в последних системах преобладали данные молекулярной биологии и геносистематики, секвенирования ДНК и РНК, электрофорез определенных белков, методы реассоциации и др. Одновременно с этими данными используется и углеводный состав грибов, но основным систематическим маркером служит преобладающий углевод, в частности, наличие хитина, глюканов и хитозана.

В наших исследованиях мы попытались, исследуя углеводный состав на разных стадиях онтогенеза грибов, в частности вегетативную и покоящуюся стадии, найти химические критерии, позволяющие отличать такие большие систематические группы, как грибы аскомицетного аффинитета и мукоровые. Полученные данные представляют интерес и с позиции морфогенных изменений грибов в процессе онтогенеза и связи этого процесса с химическим составом клеток.

Работу проводили с мукоровым грибом Cunninghamella japonica (класс Phycomycetes, порядок Mucorales, семейство Choanephoraceae) BKM FW-1204 (-) и Penicillium roquforti (класс Ascomycetes, порядок Eurotiales, род Penicillium ) BKM FW-3072.

Грибы выращивали на среде (Сергеева с соавторами,2008) , в колбах объемом 2 л, куда помещали 300мл среды, на качалках, в термостатной комнате при температуре 27–28°С в течение 2 и 3 суток. Полученную биомассу отделяли от культуральной жидкости и обезжиривали (хлороформом со этанолом в соотношении 2 : 1 и далее подсушивали серным эфиром). Споры двух видов грибов получали на твердой сусло-агаровой среде, в матрацах, при температуре 27–28° в течение 12–14 дней. Споры собирали водным способом, смыв проводили водой, охлажденной до +4°С, отделение спор от спороносцев проводили на

94

шейкере, а далее споры отделяли на капроновом фильтре, центрифугировали и обезжиривали.

Полученные данные показывают, что моносахаридный состав мицелия представителей высших и низших грибов достаточно близок и содержит: рамнозу, ксилозу, маннозу, глюкозу, галактозу и уроновые кислоты. Единственным отличием в моносахаридном составе является наличие у мукорового гриба арабинозы (или фукозы), содержание которой составляет, однако, около 1,0%. Отличия между двумя видами грибов отмечаются в количественном содержании моносахаридов, особенно заметные в отношении глюкозы, которая, однако, является преобладающим сахаром как у мукорового гриба, так и у пеницилла. При этом содержание глюкозы значительно выше у грибов аскомицетного аффинитета.

Впервые показано, что моносахаридный состав спор аналогичен таковому мицелия изучаемых грибов, однако, имеются различия в содержании отдельных углеводов, например, глюкозы и особенно маннозы, которое несколько выше в спорах C. japonica, по сравнению с мицелием. В тоже время у P. roqueforti в отношении глюкозы отмечается обратная закономерность, и содержание этого моносахарида выше, чем у мукорового гриба. Эти данные интересно сопоставить с содержанием аминосахаров. Количество D-глюкозамина и хитина выше в мицелии и спорах мукорового гриба, чем у пеницилла, что может быть связано с тем, что у представителей эуротиалес содержится больше глюкана, чем хитина. Так, нами ранее было показано, что у грибов аскомицетного аффинитета в мицелии в хитин-глюкановом комплексе содержится больше глюкана, чем хитина (Феофилова с соавторами, 2008).

Резюмируя сказанное, новизну представляют данные о сходстве в составе основных моносахаридов высших и низших грибов, которое сохраняется в процессе онтогенеза, что может свидетельствовать о монолитности царства Fungi. В то же время по составу моносахаридов высшие грибы, в частности P. roqueforti, отличаются от растений, в состав структурных полимеров которых входят арабиноза и фукоза. В связи с этим интерес представляют данные о наличии у C. japonica следовых количеств этих моносахаридов, содержание которых выше в мицелии, чем в спорах, и может быть связано с присутствием специфического гетерополисахарида – мукорана.

Работа поддержана грантом РФФИ № 09-04-00430

95

ВЛИЯНИЕ КООРДИНАЦИОННЫХ СОЕДИНЕНИЙ CU(II)

НА ПРОДУКТИВНОСТЬ И НАКОПЛЕНИЯ МЕДИ

В БИОМАССЕ ЦИАНОБАКТЕРИЙ SPIRULINA PLATENSIS CNM–CB–02

Л. М. Батыр

Институт Микробиологии и Биотехнологии, Академия Наук Молдовы, Кишинев, Молдова batludmila@mail.ru

Благодаря ценному биохимическому составу биомассы и отсутствию в ней токсинов

цианобактерия Spirulina platensis считается одним из главных объектов биотехнологических исследований XXI века. В последние десятилетия координационным соединениям переходных металлов принадлежит важная роль в регуляции процессов синтеза биоактивных веществ цианобактерий и микроводорослей. Принимая во внимание тот факт, что медь входит в составе белков и некоторых ферментов, участвует в метаболизме углеводов и синтезе витаминов комплекса А и В, а также обладает бактерицидными, противогрибковыми и антиканцерогеными свойствами [1, 2], культивирование спирулины в присутствии некоторых координационных соединений меди позволит получить биомассу, обогащенную медью, с повышенной противоопухолевой активностью. Биомасса спирулины с высоким содержанием биоактивных веществ и меди может быть использована для получения новых медьсодержащих препаратов с широким спектром действия.

Таким образом, целью исследования явилось изучение влияния координационных соединений CU(II) на продуктивность цианобактерии Spirulina platensis CNM-CB-02 и накопление меди в биомассе.

Объектом исследования послужила цианобактерия Spirulina platensis CNM-CB-02, хранящаяся в Национальной Коллекции Непатогенных Микроорганизмов Института Микробиологии и Биотехнологии АН РМ [3, 4]. В качестве стимуляторов продуктивности спирулины и содержания меди в биомассе были использованы координационные соединения Cu(II), добавляемые в среде культивирования в концентрации 2,0 4,0 и 6,0 мг/л. Продуктивность определяли на 6-ой день культивирования по методу Рудика [5]. Определение содержания меди в биомассе спирулины была выполнено по фотоколориметрическому методу с диетилдитиокарбаматом натрия [4].

Результаты проведенных исследований по изучению влияния координационных соединений Cu(II) на продуктивность спирулины и накопление меди в биомассе показали, что токсичность тестируемых соединений может быть определена как влиянием центрального атома Cu, так и природой лигандов. Полученные результаты свидетельствуют о том, что с ростом концентрации комплекса происходит снижение продуктивности и увеличение содержания меди в биомассе. Комплексные соединения [Cu(L1-H)H2O(NO3)],

[CuL(NO3)2,] и [CuL32(NO3)2], добавляемые в концентрации 2,0 мг/л способствуют увеличению

продуктивности спирулины на 17,64–22,35% по сравнению с контролем, а с увеличением концентрации данных соединений наблюдается снижение продуктивности (рисунок 1).

96

0

0,2

0,4

0,6

0,8

1

1,2

0

2m

g/l

4m

g/l

6m

g/l 0

2m

g/l

4m

g/l

6m

g/l 0

2m

g/l

4m

g/l

6m

g/l 0

2m

g/l

4m

g/l

6m

g/l 0

2m

g/l

4m

g/l

6m

g/l 0

2m

g/l

4m

g/l

6m

g/l

1 2 3 4 5 6

АСБ

г/л

0,00

2,00

4,00

6,00

8,00

10,00

12,00

мг/

% АСБ

Продуктивность Cu, мг/%

1 – [Cu (L-H)H2O(NO3)] 3 – CuL2(NO3)2 5 – CuL

2(Sfz)⋅3H2O

2 – CuL1(NO3)2 4 – CuL1(Sfz)⋅H2O 6 – Cu(L-2H)

Рис. 1. Продуктивность и содержание меди в биомассы цианобактерии Spirulina platensis CNM -CB-02

культивируемой в присутствии координационных соединений Cu(II)

Координационные соединения [CuL1(Sfz)⋅H2O], [CuL2(Sfz)⋅3H2O] и [Cu(L-2H)]

проявляют негативное воздействие на⋅продуктивность спирулины (снижение на 24,71-

22,36% по сравнению с контролем). Однако, соединения [CuL2(Sfz)⋅3H2O] и [Cu(L-2H)] способствуют максимальному накоплению меди в биомассе, превышающему в 2,95 – 3,25 раз контрольную пробу. В случае других комплексов, содержание меди в биомассе спирулины превышает контроль на 27,85–76,31% при концентрации 2 мг/л

и на 45,38–129,92% при максимальной используемой концентрации 6 мг/л.

Исследования проводились при финансовой поддержке World Federation of Scientists (WFS).

1. Abdel-Monem M. M., Anderson M. D. Copper complexes of alfa-amino acids that contain

terminal amino groups, and their use as nutritional supplements. 1990. US Patent № 4948594.

2. Marzano Cristina, Pellei Maura, Tisato Francesco, Santini Carlo. Copper Complexes as Anticancer Agents. Anti-Cancer Agents in Medicinal Chemistry. Vol. 9, N. 2, 2009, p. 185-211.

3. Rudic V. Noi aspecte ale biotehnologiei moderne. – Chişinău, 1993, p. 25-26. 4. Практикум по технологии косметических средств „биологически активные вещества в

косметике” под редакцией Т.В. Пучковой и В.Е. Кима, издательство «Школа косметических химиков» Москва, 2004, стр.119.

ФУНГИСТАТИЧЕСКАЯ АКТИВНОСТЬ

97

БАКТЕРИАЛЬНОГО СООБЩЕСТВА БИОГУМУСА

А. Б. Бубина1, 2, Н. Н. Терещенко2

1Томский государственный педагогический университет, Томск, Россия 2ГНУ Сибирский НИИ сельского хозяйства и торфа, Томск, Россия

К настоящему времени установлено и экспериментально доказано, что вермикомпост

обладает ярко выраженной фунгистатической активностью. Предварительные исследования динамики фунгистатической активности отдельных бактериальных изолятов, предположительно относящихся к роду Pseudomonas, выделяемых из органического субстрата в процессе его переработки дождевыми червями, показали, что фунгистатическая активность бактерий увеличивается к 10–20 суткам культивирования и снижается к 30. В связи с этим возникло предположение о том, что биогумус к моменту его созревания, возможно, будет обладать низким уровнем фунгистатической активности. Для того чтобы проверить это предположение, было проведено исследование динамики фунгистатической активности бактериального сообщества органического субстрата, перерабатываемого червями на протяжении более длительного срока – 2 месяцев.

Кроме того, в связи с тем, что помимо псевдомонад в биогумусе содержится довольно широкий в систематическом отношении спектр бактерий, также способных оказывать влияние на его фунгистатические свойства, возникла необходимость отработки новой методики, позволяющей проследить динамику суммарной фунгистатической активности всего сообщества бактериальных культур по отношению к фитопатогенным грибам.

Все уже известные методики, к сожалению, не обеспечивали совместного культивирования грибов и бактерий, при котором отсутствовало бы экранирование питательной среды для гриба колониями бактерий. Суть разработанной методики состоит в следующем. На агаризованную питательную среду (мясо-пептонный агар + картофельно-глюкозный агар), содержащую для прочности пластинки не менее 4% агар-агара, с интервалом 5 суток производится посев из серии последовательных разведений водной вытяжки из органического субстрата, перерабатываемого червями. На 5–6-е сутки на поверхности питательной среды в зависимости от разведения вырастает определенное количество колоний бактерий, принадлежащих к разным систематическим группам.

Перед проведением биотеста, бактериальный консорциум необходимо выдержать на твердой питательной среде еще 3–4 суток, в течение которых происходит диффузия веществ, выделяемых бактериями, в питательную среду. На 4–5 сутки, для повышения прочности агаровую пластинку поверх бактериальных колоний накрывают стерильным бумажным фильтром и прикатывают стерильным шпателем. Далее, с помощью пинцета пластинку в этой же чашке Петри нужно аккуратно перевернуть фильтровальной бумагой вниз. После этого на чистую поверхность перевернутой среды раскладывают по три блока фитопатогенного гриба на одинаковом расстоянии друг от друга и далее замеряют диаметры колоний гриба по мере их роста. Контролем служили диаметры колоний гриба, выросшего на твердой питательной среде без бактериального сообщества.

Результаты экспериментальных исследований позволили сделать вывод о том, что новая методика обеспечивает изоляцию бактериальных колоний от колоний

98

фитопатогенного гриба, но при этом фунгистатические свойства бактерий сохраняются, что связано с диффузией, вырабатываемых ими веществ, в слой питательной среды.

Разработанная методика была использована при последующем изучении характера динамики фунгистатической активности бактериального сообщества биогумуса в процессе его созревания на протяжении 2-х месяцев вермикультивирования. Фунгистатические свойства биогумуса исследовали в биотестах с чистой культурой Fusarium oxysporum. На основании данных о скорости роста гриба в контроле и в присутствии сообщества бактерий, высеваемого на чашки Петри в разные сроки культивирования червей, были рассчитаны показатели подавления скорости роста гриба для каждого конкретного срока анализа.

Результаты свидетельствуют о том, что кривая динамики фунгистатической активности бактериального сообщества биогумуса на протяжении проанализированного периода времени имеет вид, близкий к синусоиде. Следовательно, предположение о возможном снижении уровня фунгистатической активности биогумуса к моменту его созревания является необоснованным, поскольку изменение фунгистатической активности имело достоверный колебательный характер (P<0,05).

Работа выполнена при поддержке гранта Президента (НШ 3938.2008.5) и грантов РФФИ (№№ 09-05-00235, 09-05-99007).

ЗНАЧЕНИЕ ЭКЗОГЕННЫХ ЛИПИДОВ

В ЛИКОПИНОГЕНЕЗЕ МИЦЕЛИАЛЬНОГО ГРИБА BLAKESLEA TRISPORA

О. А. Верещагина, А. С. Меморская, В. М. Терёшина

Институт микробиологии имени С. Н. Виноградского РАН, Москва, Россия

Между синтезом каротиноидов и липогенезом существует тесная взаимосвязь. Во-первых, гриб может использовать экзогенные липиды в качестве единственного источника для синтеза каротиноидов. Во-вторых, каротиноиды являются липофильными соединениями и депонируются в клетке в липидных глобулах. В-третьих, присутствие липидов в среде выращивания необходимо для полового взаимодействия (+) и (-) штаммов, так как установлено, что действие полового гормона, триспоровых кислот, и стимулятора каротиногенеза β-ионона проявляется только на фоне масел.

Целью настоящей работы было изучение влияния экзогенных липидов на ликопиногенез у B. trispora. Для этого было изучено влияние экзогенных липидов на рост, образование липидов и ликопина; методом ТСХ был исследован фракционный состав липидов мицелия гриба, выращенного в присутствии экзогенных масел; с помощью ГЖХ был определён состав жирных кислот экзогенных масел и основных фракций нейтральных и мембранных липидов. В качестве экзогенных липидов были использованы оливковое, льняное, подсолнечное, хлопковое, горчичное и касторовое масла.

Установлено, что все исследованные экзогенные масла стимулируют рост и накопление липидов в мицелии гриба. При этом наибольший стимулирующий эффект оказывают масла (оливковое и горчичное) с преобладанием моноеновых жирных кислот в их составе.

99

Действие масел на ликопиногенез специфично. Масла с высокой долей моноеновых жирных кислот не изменяют содержания ликопина в мицелии, тогда как масла с преобладанием диеновой линолевой и особенно триеновой линоленовой жирных кислот значительно стимулируют ликопиногенез. Наибольшим стимулирующим эффектом обладает льняное масло с преобладанием линоленовой кислоты.

В присутствии экзогенных масел наблюдается небольшое повышение (на 20%) количества фракции триацилглицеринов, но существенное изменение состава их жирных кислот. Установлено, что в составе триацилглицеринов гриба накапливаются доминирующие в маслах жирные кислоты, например, в случае льняного масла значительно (до 44% от суммы) увеличивается доля линоленовой кислоты, отсутствующей в контрольном варианте.

В отличие от действия на трииацилглицерины, экзогенные масла существенно

(в 2–8 раз) увеличивают количество мембранных липидов, но слабо влияют на состав их жирных кислот. При этом в составе фосфолипидов увеличивается доля «небислойного» фосфатидилэтаноламина.

Обнаруженное влияние экзогенных масел на состав жирных кислот триацилглицеринов, но не фосфолипидов, позволяет высказать предположение о том, что основным механизмом стимулирующего действия масел является повышение ёмкости липидных глобул, вследствие увеличения растворимости ликопина в триацилглицеринах с высокой долей ненасыщенных жирных кислот.

Основным критерием для отбора масел предлагается считать высокое содержание в их составе линолевой и особенно линоленовой кислоты, которая является незаменимой для (-) штамма гриба, имеющего ключевое значение в синтезе каротиноидов.

АНАЛИЗ БЕЛКОВОГО СОСТАВА, ЛЕКТИНОВ И ФЕНОЛОКСИДАЗ

В ПРОЦЕССЕ МОРФООБРАЗОВАНИЯ

КСИЛОТРОФНОГО БАЗИДИОМИЦЕТА LENTINUS EDODES (BERK.) SING

Е. П. Ветчинкина, В. Е. Никитина

Институт биохимии и физиологии растений и микроорганизмов РАН, Саратов, Россия Интерес человека к ксилотрофным базидиомицетам, ярким представителем которых

является Lentinus edodes (шиитаке), обусловлен как большой пищевой ценностью, вкусовыми качествами плодовых тел, так и наличием уникального комплекса биологически активных и лекарственных веществ. Вопрос о возможной оптимизации искусственного выращивания ценных съедобных ксилотрофов до настоящего времени не решен. Одна из главных причин этого заключается в особенности жизненного цикла базидиомицетов, кардинально отличающегося от биологии растений и животных. Исследование белков в связи с регуляцией роста и морфообразования грибов, выявление специфичных белков, сопутствующих морфогенетическим процессам, представляют большой интерес, как для развития фундаментальной науки, так и в плане прикладных аспектов. Ксилотрофные базидиомицеты благодаря широкому набору ферментов являются важным звеном в цепи биологического разрушения органического вещества в природе. Одними из ключевых ферментных систем для истинно дереворазрушающих базидиомицетов являются фенолоксидазы. Есть мнение

100

относительно участия данных оксидаз в процессе морфобразования грибов. С другой стороны, присутствие лектинов практически во всех живых организмах, стоящих на самых разных уровнях эволюционного развития, свидетельствует о важной физиологической роли этих биологически активных соединений в процессах жизнедеятельности. Кроме того, ряд исследований говорит о том, что лектины играют важную роль в регуляции деятельности ферментных систем. Все это обусловливает необходимость изучения данных соединений в связи с процессами морфообразования, выявления их участия в особенностях цитодифференцировки грибов.

На основании выше изложенного, была сформулирована цель исследования – сравнительная характеристика белкового состава, внутриклеточных лектинов и фенолоксидаз в процессе морфообразования ксилотрофного базидиомицета Lentinus edodes.

В процессе своего развития шиитаке образует следующие, характерные для данного гриба и хорошо дифференцированные, морфоструктуры: вегетативные – непигментированный мицелий (НМ), пигментированный мицелий (ПМ), коричневую мицелиальную пленку (КМП); генеративные – примордии (ПР) и плодовые тела (ПТ). Сравнительный анализ белковых спектров показал характер их изменения в процессе формирования плодового тела, был выявлен как ряд общих, так и характерных для отдельных морфоструктур компонентов. Значительное отличие в полипептидном составе имело место при переходе от вегетативных стадий развития к генеративным. Для стадии НМ специфическими являются полипептиды с молекулярной массой 42 и 45 кДа. Стадия ПМ, также как и стадия КМП, характеризуется полипептидами массой

от 23 до 33 кДа. У ПР и ПТ главное отличие заключается в появлении легкорастворимых полипептидов молекулярной массой от 50 кДа и выше, которые не наблюдались на предыдущих стадиях морфогенеза. Изменение белкового состава, появление полипептидов, характерных для конкретной морфологической структуры, является следствием функционирования и перестройки регуляторных систем в процессе развития грибного организма и, несомненно, свидетельствует об определенном функциональном значении данных белков.

Нами впервые, как из вегетативных, так и генеративных морфоструктур L. edodes выделен ряд лектинов, обладающих различной молекулярной массой, субъединичным составом, активностью и небольшими различиями в углеводной специфичности. В НМ содержится три лектина: два димера и тетрамер; на стадии КМП лектиновую активность проявляли белки, в состав которых входили полипептиды массой 24, 30 и 38 кДа. В ПТ гриба обнаружено два лектина 43 и 55 кДа. Все выделенные лектины относятся к группе галактозоспецифичных. Установлено, что внутриклеточные лектины КМП ускоряют процесс перехода от вегетативных к генеративным стадиям развития L. edodes, что свидетельствует о возможном участии данных белков в морфообразовании.

Обнаружено, что L. edodes продуцирует фенолоксидазы, включая лакказу, Mn-пероксидазу и тирозиназу. Состав молекулярных форм оксидаз меняется в процессе жизненного цикла базидиомицета и содержит от одной до четырех форм каждого фермента. Активность ферментов также менялась в зависимости от стадии развития. Показано, что активация лакказ, в результате воздействия субстратов фенолоксидаз на растущий мицелий, приводит к ускорению процесса морфообразования. Впервые установлена способность внутриклеточных лектинов разных морфологических структур L. edodes влиять на активность собственных лакказ, лектины НМ и ПТ ее стабилизируют, лектин КМП – активирует. С большей долей вероятности можно говорить

101

о том, что функционирование ферментных систем, в частности фенолоксидаз, может находиться под контролем лектинов и является одной из их функций в процессе морфообразования.

Таким образом, результаты проведенных экспериментов позволяют говорить о многоплановой роли белков с фенолоксидазной и лектиновой активностью в процессе развития ксилотрофного базидиомицета L. еdodes, что дает основание предполагать регуляторную деятельность этих соединений в процессе развития грибного организма.

ХИМИКО–ФЕРМЕНТАТИВНЫЙ СИНТЕЗ ФРАГМЕНТОВ

О–АНТИГЕННЫХ ПОЛИСАХАРИДОВ ГРАМ–ОТРИЦАТЕЛЬНЫХ БАКТЕРИЙ

С ИСПОЛЬЗОВАНИЕМ СИНТЕТИЧЕСКИХ ЛИПИДНЫХ АКЦЕПТОРОВ

А. Н. Винникова, Т. Н. Дружинина, Л. Л. Данилов, В. В. Веселовский

Институт органической химии им. Н. Д. Зелинского РАН, Москва, Россия

Среди грам-отрицательных микроорганизмов группа энтеробактерий выделяется обилием и разнообразие патогенных видов. Это – возбудители тифов, дизентерии, чумы, а также выходящие последние десятилетия на передний план условно-патогенные бактерии. Специфическими компонентами клеточной оболочки грам-отрицательных бактерий являются липополисахариды (ЛПС). Эти полимеры располагаются на внешней поверхности бактериальной клетки и принимают непосредственное участие во взаимодействии бактерий с окружающей средой. Наиболее специфической частью ЛПС являются О-специфические полисахариды (О-антигены).Их тонкая структура определяет специфичность иммунного ответа высших животных и человека на инфекцию, в том числе образование защитных О-антител. Непременными участниками биосинтеза О-антигенов являются полипренилфосфаты, выполняющие роль акцепторов при сборке полисахаридных цепей. Долгое время химические и биохимические исследования этих соединений тормозились из-за их труднодоступности и высокой лабильности. Целенаправленное исследование связи структуры и функции этого класса соединений стало возможным только после обнаружения возможности замены бактериальных полипренолов в биохимических реакциях близкими по структуре растительными аналогами и разработки эффективных методов их фосфорилирования [1].

В настоящей работе для этой цели представлен синтез ω-феноксиморапренил фосфата 1 из морапренола (2), включающий в себя восемь стадий (см. схему). Морапренол является растительным полипренолом, полученным из листьев шелковицы. От бактериального полипренола морапренол отличается тем, что в его цепи на одно транс-звено больше. Наличие УФ-поглощающей фенокси-группы в производном морапренил фосфата 1 позволяет вести наблюдение за ходом биохимических реакций даже без использования радиоактивного субстрата. Строение соединения 1 было доказано спектрами ЯМР 1Н,

ЯМР 31Р и масс-спектром ESI. Синтезированный ω-феноксиморапренил фосфат 1 вводили в реакцию инициации сборки повторяющегося звена О-антигенного полисахарида, катализируемую UDP-GlcNAc: полипренилфосфат- GlcNAc-фосфотрансферазой из Salmonella arizona O:59 .

102

Схема

5-73

i.Ac2O, DMAP, Py; ii. NBS, aq. THF; iii. K2CO3, PhH/MeOH; iv. HIO4 H2O, THF/Et2O; v. NaBH4, DME; vi. PhOH, Ph3P, DEAD, THF; vii. K2CO3, PhH/MeOH; viii. Bu4NH2PO4, CCl3CN.

i-viii

(1)(2)

OP O 32 -

PhO

5-73

OH

Данная работа поддержана РФФИ, проект № 08-04-00556а. 1. Danilov L.L., Druzhinina T.N., Kalinchuk N.A., Maltsev S.D., Shibaev V.N. // Chem. Phys.

Lipids. 1991. V.59 P. 191-203.

ИССЛЕДОВАНИЕ ФЕРМЕНТАТИВНЫХ СПОСОБОВ ПОЛУЧЕНИЯ

НИЗКОМОЛЕКУЛЯРНЫХ ПЕПТИДОВ

И. М.Данилов1, Л. А.Забодалова1

, Н. Н.Скворцова1, Г. А. Панкова2

1ГОУ ВПО Санкт-Петербургский государственный университет низкотемпературных и пищевых технологий, Санкт-Петербург, Россия

2Институт высокомолекулярных соединений РАН, Санкт-Петербург, Россия

Низкомолекулярные вещества пептидной природы 600–7000 Да, образующиеся в некоторых кисломолочных напитках в результате частичного протеолиза белков молока обладают физиологической активностью. Нами исследована возможность получения пептидов с заданной молекулярной массой путем воздействия на белки молока различных протеолитических агентов. Молекулярно-массовое распределение пептидных фракций оценивалось методом эксклюзионной гель-хроматографии на Sephadex G-75

На начальном этапе молоко ферментировалось изолированным препаратом «Панкреатин», при 50±2°С, в течение 24 ч без использования рН-статирования. Для дальнейшего анализа отбиралась надосадочная жидкость, получаемая в результате центрифугирования сгустка. Результаты хроматографического анализа показывают наличие двух фракций. Первая фракция представляет собой высокомолекулярные белки ~95 кДа, не подвергшиеся гидролизу, количественное содержание составляет 3%. Вторая фракция имеет молекулярную массу ~4,5 кДа, количественное содержание 97%.

Затем исследовалось изменение температуры и продолжительности гидролиза «Панкреатином» на молекулярно-массовое распределение гидролизатов белков молока. В результате проведенных исследований установлено, что для получения низкомолекулярных пептидов (НМП) рациональнее проводить ферментацию при данных условиях: температура и продолжительность термостатирования 45±2°С и 4 ч соответственно. Далее фракция НМП подвергалась очистке от высокомолекулярных пептидов на методом гель-хроматографии на аналитической колонке, и лиофильно высушивалась. Полученное вещество представляет собой бесцветный кристаллический порошок без запаха.

103

Проведены исследования готовых кисломолочных напитков смешанного брожения: кефира, кумыса и курунги на предмет наличия НМП. В качестве образцов использовалась сыворотка, получаемая после центрифугирования сгустка. Хроматограмма кефирной сыворотки свидетельствует о присутствие фракции высокомолекулярных белков ~95 кДа, количественное содержание 8%. Остальное количество приходится на пептиды, имеющие большой разброс по молекулярным массам, области пиков выделения сильно перекрываются в основании.

На хроматограммах сыворотки кумыса и курунги наблюдается единственный пик пептидов, имеющих молекулярную массу 6,5 кДа, причем фракция не гидролизовавшихся белков присутствует лишь в следовых количествах, что говорит о более полном протеолизе. Таким образом, имеет практический интерес дальнейшее исследование данных образцов.

БИОТРАНСФОРМАЦИЯ АРОМАТИЧЕСКИХ НИТРИЛОВ И АМИДОВ

БАКТЕРИЯМИ ПОЧВЕННОЙ СРЕДЫ

Н. П. Долгих1,2, А. Ю. Максимов1,2

1Пермский государственный университет, Пермь, Россия, 2Институт экологии и генетики микроорганизмов УрО РАН, Пермь, Россия

Известна способность многих микроорганизмов к гидролизу алифатических амидов и

нитрилов с образованием соответствующих карбоновых кислот. Более труднометаболизируемыми субстратами являются ароматические производные. В то же время микроорганизмы, способные к биотрансформации этих соединений, могут быть использованы для биокаталитического синтеза ценных фармацевтических препаратов, а также представляют интерес для экологической биотехнологии.

Цель настоящей работы – выделение и идентификация почвенных бактерий, разлагающих ароматические нитрилы и амиды, а также анализ промежуточных продуктов их метаболизма.

В качестве субстратов были использованы никотинамид, 3-цианопиридин, бензамид и бензонитрил, фенилацетонитрил, нитрил и амид миндальной кислоты.

Выделены и идентифицированы 15 штаммов бактерий, активно использующих ароматические нитрилы и амиды в качестве источника углерода и азота и дибензотиофен в качестве источника углерода и серы.

По совокупности культурально-морфологических, хемотаксономических и биохимических свойств, а также структуры 16S рДНК новые культуры идентифицированы как Rhodococcus erythropolis, R. rhodochrous, Pseudomonas fluorescens, P. putida и

Dietzia maris.

Исследован рост бактерий на средах с ароматическими нитрилами и амидами, а также состав продуктов биотрансформации, накапливающихся в среде. Показано, что селекционированные бактерии наиболее активно используют в качестве ростового субстрата бензамид. При его утилизации в среде накапливалась бензойная кислота. Обнаружено, что промежуточным продуктом трансформации бензонитрила у ряда штаммов является 1,2-бензодикарбоновая кислота.

104

Наиболее устойчивым к биодеградации субстратом оказались 3-цианопиридин и нитрил миндальной кислоты. Показано, что клетки R. Erythropolis 6РИ в течение 120 часов утилизируют ок. 50% 3-цианопиридина при начальной концентрации его в среде 100 мкг/мл.

Таким образом, выделены штаммы бактерий, трансформирующие ароматические нитрилы и амиды, перспективные для использования в биотехнологии.

Работа поддержана ФЦП «Научные и научно-педагогические кадры инновационной России на 2009 – 2013 годы» (ГК№ 02.740.11.0078) и ВЦП «Развитие научного потенциала высшей школы (2009–2010 годы)».

ШТАММ RHODOCOCCUS SP. G12А – ДЕСТРУКТОР

ХЛОРИРОВАННЫХ БИФЕНИЛОВ

Д. О. Егорова, Е. С. Шумкова, Е. Г. Плотникова

Институт экологии и генетики микроорганизмов УрО РАН, Пермь, Россия

Полихлорированные бифенилы (ПХБ) принадлежат к числу наиболее распространенных и экологически значимых загрязнителей биосферы. По химическому строению ПХБ представляют два бензольных кольца объединенных С-С связью и присоединенных к ним от 1 до 10 атомов хлора. Всего семейство ПХБ содержит 209 соединений. В промышленных масштабах использовали смеси хлорированных бифенилов. Следует отметить, что ПХБ слабо подвергаются абиотическому разложению и прочно адсорбируются почвенными частицами и осадочными материалами. Аккумуляция их в организме животных и человека приводит к развитию онкологических и других заболеваний. Основная роль в разложении хлорированных бифенилов в окружающей среде принадлежит микроорганизмам, в частности бактериям.

Способность к утилизации или частичной трансформации ПХБ обнаружена у штаммов различных родов. Однако особый интерес представляют бактерии рода Rhodococcus, так как представители данного рода нередко обладают способностью разлагать широкий спектр ароматических соединений.

Методом накопительных культур из образцов почв, отобранных на территориях с высокой техногенной нагрузкой, выделена бактериальная культура, способная использовать бифенил в качестве единственного источника углерода и энергии. На основании проведенных морфологических, хемотаксономических и генетических исследований на данном этапе работы штамм идентифицирован как Rhodococcus sp. Выявлена филогенетическая близость исследуемого штамма Rhodococcus sp. G12а с типовым штаммом Rhodococcus erythropolis DSM 43066T (GenBank X79289). Уровень сходства составил 98%.

Установлено, что штамм Rhodococcus sp. G12а утилизирует нафталин и ряд органических кислот: салициловую, гентизиновую, орто-фталевую, пара-гидроксибензойную и протокатеховую. Штамм проявляет деструктивную активность к ди- и три-хлорированным бифенилам, несущим заместителей в обоих кольцах в орто- и/или пара-положении. Эксперименты по «острой деструкции» показали, что штамм Rhodococcus sp. G12а предпочтительнее атакует моно-орто-замещенное кольцо молекулы

105

ди- и/или три-ХБ. В течение 24 часов штамм разлагает 100% 1мМ 2,2’-ХБ, 99.7% 1мМ 2,4’-ХБ, 69.12% 1мМ 4,4’-ХБ и 48.6% 1мМ 2,4,2’-ХБ. Следует отметить, что штамм способен атаковать и ди-замещенное кольцо молекулы 2,4,2’-ХБ. При этом одним из основных промежуточных продуктов разложения является 2-хлорбензойная кислота. Для большинства бактерий-деструкторов ПХБ хлорбензойные кислоты являются конечным продуктом трансформации хлорированных бифенилов. Полученные нами данные свидетельствуют о том, что штамм Rhodococcus sp. G12а разлагает 2-хлорбензойную кислоту.

Таким образом, выделенный и исследованный в данной работе штамм является активным деструктором хлорированных бифенилов, перспективным для использования в технологиях биоремедиации загрязненных территорий.

Работа поддержана грантом РФФИ-Урал №07-04-96078_а, Программой Президиума РАН "Молекулярная и клеточная биология", проект «Исследование метаболизма токсичных органических соединений у аэробных бактерий, анализ генетических и ферментных систем биотрансформации».

НОВЫЕ СПОСОБЫ ПОЛУЧЕНИЯ БИОМАССЫ СПИРУЛИНЫ

С ПОВЫШЕННЫМ СОДЕРЖАНИЕМ ЖЕЛЕЗА И ХРОМА

Д. И. Еленчук1, Л.С. Зосим2

1Институт Микробиологии и Биотехнологии Академия Наук Молдовы, Кишинев, Молдова ciumac@yahoo.com

2Молдавский Государственный Университет, Кишинев, Молдова zosim_liliana@yahoo.fr

Влияние неблагоприятных факторов, сопутствующих современному образу жизни,

таких как стресс, неправильное питание, воздействие негативных экзо - и эндогенных факторов способствует нарушению деятельности иммунной системы, процессов метаболизма, а также образованию и накоплению в организме человека различных дисфункций систем жизнеобеспечения, вызывающих впоследствии тяжелые заболевания [5].

Одним из способов предотвращения возникновения данных нарушений является применение пищевых добавок на основе биомассы спирулины. Цианобактерия Spirulina

platensis является общепризнанным источником биоактивных веществ: фикобилипротеинов, незаменимых аминокислот, сульфатированных полисахаридов, полиненасыщенных жирных кислот, каротиноидов, витаминов, ферментов, микроэлементов, обладающих широким иммуномодуляторным, противовоспалительным, антиоксидантным действием [1].

Цель исследования: разработка способов получения новых пищевых добавок на основе биомассы спирулины с высоким содержанием биоактивных веществ и биоэлементов (железа и хрома).

Объект исследования - штамм цианобактерии Spirulina platensis CNM-CB-02, хранящийся в Национальной Коллекции Непатогенных Микроорганизмов Института Микробиологии и Биотехнологии АН РМ [2]. В качестве регуляторов роста были

106

использованы координационные соединения Fe(III) – [Fe2MnO(αfur)6(THF)3] и Cr(III) – [Cr(HSSA)]2Cl • H2O. Определение железа и хрома в биомассе спирулины была выполнено колориметрическими методами [3, 4].

Накопление железа в биомассе Spirulina platensis при культивировании в присутствии соединений Fe (III) возрастает с увеличением концентрации, достигая максимального значения при концентрации 50 мг/л. Максимальное содержание железа в биомассе спирулины составляет 1,08% при ее культивировании в присутствии

[Fe2MnO(α-fur)6(THF)3]. Максимальное накопление хрома (29,68% из АСБ) отмечено при добавлении в среду культивирования спирулины комплекса [Cr(HSSA)]Cl2 • H2O в концентрации 30 мг/л.

Использования разработанного спосооба способствует повышению содержания железа в 3,5 и хрома 2,6 раза по сравнению с биомассой, выращеной без внесения координационных соединений.

Полученная таким образом биомасса может быть использована, как для получения биодобавок, содержащих железо и хром, так и антианемичекских и антидиабетических биопрепаратов.

1. Rudic V., Cojocari A., Cepoi L., Chiriac T., Rudi L. ş.a.. Ficobiotehnologia – cercetări

fundamentale şi realizări practice. Chişinău, 2007 (Tipogr. „Elena V. I.” SRL).-365p. 2. Rudic V., Şalaru V., Obuh P. Tulpina Spirulina platensis (Nordst) Geitl.CALU - producător

de biomasă. Brevet de invenţie 169 MD, BOPI Nr. 3, 1995, p.140. 3. Rudic, V., Gudumac, V, Bulimaga, V., Dencicov, D, Ghelbet, V, Chiriac, T. Metode de

investigaţii în ficobiotehnologie. Chişinău, 2002, 61 p 4. Ермаков, А., Арасимович, В., Ярош, Н., Перуанский, Г., Луковникова, Г., Иконникова, М.

Методы биохимического исследования растений. Агропромиздат, 1987, 430 с. 5. Мазо, В., Скальный, А., Гмошинский, И. Эссенциальные микроэлементы в питании.

Врач. 2003, № 5, c.34–36.

Исследование было проведено в рамках проекта 08.819.0803F финансируемая Высшим Советом по Науке и Технологическому Развитию АН РМ.

107

ОКИСЛИТЕЛЬНАЯ БИОТРАНСФОРМАЦИЯ ТИОАНИЗОЛА

АКТИНОБАКТЕРИЯМИ РОДА RHODOCOCCUS

А. А. Елькин1, В. В. Гришко2

, В. И. Лозинский3, И. Б. Ившина1

1Институт экологии и генетики микроорганизмов УрО РАН, Пермь, Россия 2Институт технической химии УрО РАН, Пермь, Россия

3Институт элементоорганических соединений им. А.Н. Несмеянова РАН, Москва, Россия

Оптически активные органические сульфоксиды распространены в природе и находят широкое применение в химической и фармацевтической практике. В ассиметрическом синтезе сульфоксидная группа используется в качестве активного центра, контролирующего реакции циклоприсоединения, альдольной конденсации, присоединения по Михаэлю. Среди лекарственных средств, принадлежащих к таким терапевтическим группам, как нейролептики, нестероидные противовоспалительные средства, α-адреноблокаторы, блокаторы Н1-гистаминовых рецепторов, ингибиторы протонной помпы, диуретики, немало препаратов, действующим началом которых являются соединения сульфоксидной структуры или продукты более глубокого окисления – сульфоны [1]. Целью настоящих исследований явилась оценка возможности использования актинобактерий рода Rhodococcus для осуществления биотрансформации тиоанизола в оптическиактивный сульфоксид.

В работе использовали 146 штаммов родококков, принадлежащих к видам R. fascians

(20), R. erythropolis (43), R. opacus (15), R. rhodochrous (14), R. ruber (47), "R. longus" (7) и поддерживаемых в Региональной профилированной коллекции алканотрофных микроорганизмов ИЭГМ (www.iegm.ru/iegmcol/index.html). Биотрансформацию проводили в соокислительных условиях в присутствии глицерина, н-гексадекана, глюкозы или ацетата аммония [2, 3]. Культуры выращивали на орбитальном шейкере Certomat®S, Германия. Продолжительность процесса биотрансформации тиоанизола составляла 2–5 сут. В качестве носителя для иммобилизации клеток родококков использовали макропористый гетерофазный криогель на основе поливинилового спирта (производства ПО «Азот», Невинномысск), применение которого обеспечивает проведение иммобилизации бактериальных клеток при физиологических значениях pH, без применения токсичных химических веществ [4]. Иммобилизацию родококков осуществляли согласно методике, описанной ранее в работе [5]. Анализ продуктов биотрансформации проводили методом хромато-масс-спектрометрии с помощью газового хроматографа Agilent 6890N, США. Каталитическую активность свободных (суспензионных) и иммобилизованных на гелевом носителе клеток родококков оценивали с помощью респирометра «Micro-Oxymax Respirometer», США.

В связи с тем, что активность родококков ингибируется при использовании тиоанизола в качестве единственного источника питания, трансформация сульфида свободными клетками осуществлялась в условиях соокисления. Установлено, что оптимальным косубстратом являются глицерин и н-гексадекан, в присутствии которых 48 исследуемых штаммов катализируют (от 36 до 100%) процесс образования сульфоксида тиоанизола. При этом показано, что наибольшую сульфоксидирующую активность проявляют представители R. rhodochrous, поэтому в дальнейших экспериментах использовали штамм R. rhodochrous

108

ИЭГМ 66. Выбор данного штамма обусловлен наиболее оптимальным соотношением между химическим выходом (более 90%) и оптической чистотой (81,4%) сульфоксида тиоанизола, которая достигается в течении 5 сут при условии добавления тиоанизола (0,5 г/л) на 2-е сут инкубации родококков. Определены оптимальные условия (время внесения субстрата в среду, pH среды, концентрация вносимого тиоанизола, продолжительность трансформации, температурный режим, величина аэрации, концентрация ко-субстрата) для трансформации тиоанизола свободными клетками родококков, позволяющие сократить время трансформации тиоанизола на 24 ч.

Существенное ускорение процесса трансформации тиоанизола достигается за счет использования иммобилизованных клеток родококков, индуцированных в присутствии

н-гексадекана. Использование приема иммобилизации позволило сократить процесс окисления тиоанизола родококками в три раза и получить целевой сульфоксид (≥ 92%) на 2-е сут при условии внесения тиоанизола в реакционную среду в начале эксперимента.

Работа поддержана грантом программы фундаментальных исследований президиума РАН «Биологическое разнообразие».

1. Толстиков А.Г., Гришко В.В., Ившина И.Б. Энантиоселективное биокаталитическое

окисление органических сульфидов в хиральные сульфоксиды // Современные проблемы асимметрического синтеза: УрО РАН. Екатеринбург. – 2003. С. 165–205.

2. Каталог штаммов Региональной профилированной коллекции алканотрофных микроорганизмов / Под ред. И.Б. Ившиной. – М.: Наука, 1994. – 163 С.

3. Sojo M., Bru R., Lopez-Molina D., Garcia–Carmona F., Arguelles J.-C. Cell–linked and extracellular cholesterol oxidase activities from Rhodococcus erythropolis. Isolation and physiological characterization // Appl. Microbiol. Biotechnol. – 1997. – V. 47. – P. 542–589.

4. Лозинский В.И. Криотропное гелеобразование растворов поливинилового спирта // Успехи химии. – 1998. – Т. 67, N. 7. – С. 641–652.

5. Kuyukina M.S., Ivshina I.B., Gavrin A.Yu., Podorozhko E.A., Lozinsky V.I., Jeffree C.E., Philp

J.C. Immobilization of hydrocarbon-oxidizing bacteria in poly(vinyl alchohol) cryogels hydrophobized using a biosurfactant // J. Microbiol. Methods. – 2006. – V. 65. – P. 596–603.

109

ВЛИЯНИЕ ПРЕПАРАТОВ КЛЕТОЧНЫХ СТЕНОК

ПРОБИОТИЧЕСКИХ МИКРООРГАНИЗМОВ НА АКТИВНОСТЬ РОСТА

БАКТЕРИАЛЬНЫХ КУЛЬТУР ПОСЛЕ ЛИОФИЛИЗАЦИИ

И НИЗКОТЕМПЕРАТУРНОЙ КОНСЕРВАЦИИ

А. В. Ижик1, Г. И. Новик1

, Е. П. Киселёва2

1Институт микробиологии НАН Беларуси, Минск, Беларусь 2Институт биоорганической химии НАН Беларуси, Минск, Беларусь

В настоящее время наиболее часто используемыми методами долгосрочного хранения

бактериальных культур в коллекциях являются лиофилизация и низкотемпературная консервация. Известно, что жизнеспособность бактерий при этом снижается и требуется время для восстановления активности роста культуры после выведения её из состояния анабиоза. В связи с этим актуален поиск биологически активных субстанций, способных оказывать ростстимулирующее влияние на культуры бактерий, подверженные лиофилизации и низкотемпературной консервации.

В эксперименте были использованы 4 культуры пробиотических бактерий из Белорусской коллекции непатогенных микроорганизмов, каждая в вариантах, соответствующих способам хранения (анабиотические культуры после лиофилизации, низкотемпературной консервации при –70°С, физиологически активные культуры III генерации − контроль): Bifidobacterium longum B379M, Bifidobacterium adolescentis 94 БИМ, Bifidobacterium bifidum 791, Lactobacillus plantarum B-495-Д. Для получения препаратов клеточных стенок (КС) бифидобактерий и молочнокислых бактерий (МКБ) были использованы культуры III генерации, полученные при культивировании бактерий на питательной среде МРС. Клетки осаждали центрифугированием при 5000 g в течение 20 мин и после удаления культуральной среды промывали трижды по 30 мл 0,02 М натрий-фосфатным буфером, рН 7,5, содержащим 0,2 М NaCl, суспендируя клетки и осаждая их центрифугированием в указанных выше условиях. Клетки каждого штамма гомогенизировали вручную гомогенизатором («Wheaton», США) в 20 мл натрий-фосфатного буфера и обрабатывали ультразвуком с использованием диспергатора УЗДН-2Т (п/я В-2613, СССР) порциями по 50 мл 6 раз по 30 сек при частоте 22 кГц. Фракцию КС осаждали центрифугированием при 31000 g в течение 30 мин.

В среду культивирования (МРС) вносили препарат КС, а затем – бактериальную культуру. После 12 часов культивирования при 37°С проводили измерение оптической плотности (ОП) относительно стерильной среды культивирования при длине волны 590 нм («Фотометр КФК-3», СССР) и активной кислотности среды − рН (HANNA, Румыния). По результатам следили за изменением активности роста и кислотообразования бактериальной культуры в присутствии препаратов КС пробиотических бактерий. В качестве контроля использовалась культура III генерации без внесения препарата.

Во всех вариантах опытов в присутствии препаратов КС активность роста бактерий была выше, чем в контроле. Компонент КС Bifidobacterium longum B379M можно назвать наиболее перспективным для восстановления культур пробиотических микроорганизмов после лиофилизации и низкотемпературной консервации − показатели ОП культуральной

110

жидкости в присутствии препарата превышали контроль в 1,2~1,4 раза, а активная кислотность среды была ниже на 0,5–0,9 единиц. Препараты КС бифидобактерий обладают перекрёстной ростстимулирующей активностью, в то время как препарат из Lactobacillus

plantarum B-495-Д отличается аутостимулирующей активностью (табл.). Примечательно, что на лиофилизированную культуру данного штамма как активаторы роста действуют все исследованные препараты.

Культура Вариант опыта Препарат КС с максимальной

ростстимулирующей активностью

Bifidobacterium longum

B379M

лиофилизация Bifidobacterium longum B379M

–70°С Bifidobacterium bifidum 791

III генерация Препараты КС бифидобактерий

Bifidobacterium adolescentis 94 БИМ

лиофилизация Bifidobacterium adolescentis

94 БИМ

–70°С Bifidobacterium longum B379M

III генерация Bifidobacterium adolescentis 94 БИМ

Bifidobacterium bifidum 791 лиофилизация Bifidobacterium longum B379M

–70°С Bifidobacterium longum B379M

III генерация Bifidobacterium longum B379M

Lactobacillus plantarum

B-495-Д

лиофилизация Препараты КС бифидобактерий и МКБ

–70°С Lactobacillus plantarum B-495-Д

III генерация Bifidobacterium bifidum 791

Таким образом, препараты клеточных стенок бифидобактерий и МКБ можно рекомендовать

в качестве ростстимулирующих факторов для репарации лиофилизированных и консервированных при –70°С культур.

АЛКИЛРЕЗОРЦИНЫ РЕГУЛИРУЮТ РОСТ,

ПОДВИЖНОСТЬ И ФИЗИОЛОГИЧЕСКОЕ СОСТОЯНИЕ

AZOSPIRILLUM BRASILENSE И AZOSPIRILLUM LIPOFERUM

А. В. Ильчукова1, А. В. Тугарова1

, А. В. Шелудько1, Г. И. Эль-Регистан2

,

Л. П. Антонюк1

1Институт биохимии и физиологии растений и микроорганизмов РАН, Саратов, Россия 2Институт микробиологии им. С.Н. Виноградского РАН, Москва, Россия

Азоспириллы колонизируют корневую систему многих пищевых и кормовых культур; они помогают растению-хозяину адаптироваться к стрессам, улучшают за счет азотфиксации его азотное питание, синтезируют фитогормоны и реализуют другие программы, способствующие росту и развитию растения. Считается, что формирование симбиоза азоспириллы с растением регулируется молекулярными сигналами, бόльшая часть которых

111

еще не изучена. Мы предприняли исследование взаимодействия экзогенных алкилрезорцинов с Azospirillum brasilense и Azospirillum lipoferum, так как (i) азоспириллы в естественных условиях находятся в зоне действия этих соединений и, кроме того, (ii) алкилрезорцины и некоторые другие алкилоксибензолы известны как биоэффекторы с широким спектром адаптогенных и регуляторных функций [1]. Эффекты этого класса регуляторов для азоспирилл еще не охарактеризованы, и сведения относительно их роли в формировании и функционировании растительно-микробных симбиозов пока отсутствуют. Все вышесказанное побудило нас исследовать жидкие культуры A. brasilense и A. lipoferum, в среду роста которых был добавлен гексилрезорцин или метилрезорцин.

Эксперименты показали, что рост A. brasilense на среде с гексилрезорцином приводит к угнетению размножения и плавания бактерий, удлинению лаг-фазы и ряду изменений в физиологическом состоянии азоспириллы. Действие биоэффектора было строго дозозависимо. Так, присутствие 4 × 10-5–8 × 10-5 М гексилрезорцина в среде приводило к снижению оптической плотности аэрируемых жидких культур A. brasilense Sp245, причем чем выше была концентрация биорегулятора, тем бόльшим было снижение плотности (D590). Незначительные концентрационные сдвиги от вышеупомянутого диапазона существенно видоизменяли ответ A. brasilense Sp245 на гексилрезорцин: уменьшение его концентрации до 1 × 10-5 элиминировало ингибирующий эффект, а увеличение до 5 × 10-4 М вызывало полное подавление роста по крайней мере в течение 36 час культивирования. В микроаэробных условиях роста гексилрезорцин также подавлял размножение A. brasilense

Sp245, однако его ингибирующее действие было более мягким по сравнению с аэробными условиями.

Подобно гексилрезорцину, ингибирующий концентрационный диапазон метил-резорцина был узким: 4 × 10-3–8 × 10-3 М; однако биологическая активность была ниже, чем у его более высокомолекулярного гомолога (действующие концентрации метилрезорцина для Sp245 были на 2 порядка выше). Хотя A. brasilense реагировала на присутствие алкилрезорцинов в среде аналогично другим эубактериям, было обнаружено несколько особенностей. Так, азоспириллам удавалось преодолевать ингибирующее действие определенных концентраций гексилрезорцина (в течение 7–17 час, в зависимости от штамма). Развитие в культурах окраски, обусловленной, вероятно, появлением окисленных «красных» форм алкилрезорцинов [2], дало нам возможность предположить, что алкилрезорцины индуцируют у азоспириллы синтез фенолоксидазы, которая вызывает их окислительную модификацию и нейтрализует негативное действие эффектора. Проверка данного предположения привела к обнаружению у A. brasilense Sp245 лакказоподобной оксидазы, индуцируемой гексилрезорцином; фермент представлен двумя изоформами (по результатам анализа зимограмм) и имеет предположительно внутриклеточную локализацию. Выявлены межштаммовые (A. brasilense Sp245 и SR75) и межвидовые (A. brasilense Sp245, SR75 и A. lipoferum 59b) особенности рост-ингибирующего действия гексилрезорцина.

Установлено, что гексилрезорцин начинает оказывать негативное воздействие на бактерию непосредственно после контакта с клетками. В частности, уже через 1 мин удавалось зарегистрировать снижение средней скорости плавания у A. brasilense Sp245 при 4 × 10-3–8 × 10-3 М; при 1.2 × 10-3 М подвижность азоспириллы блокировалась полностью. С использованием фазово-контрастного микроскопа Leica DM2500 и программного

112

обеспечения для обработки изображений установлено, что гексилрезорцин влияет на морфологию и размеры клеток A . brasilense Sp245: при 4 × 10-3–8 × 10-3 М клетки становятся мельче и округляются. Это, в свою очередь, хорошо объясняет тот факт, что в ряде случаев жизнеспособность стрессированных гексилрезорцином азоспирилл не отличалась от контрольной, в то время как их оптическая плотность (D590) была сниженной.

Ряд интересных эффектов наблюдали в 18-часовых культурах A. brasilense Sp245, растущих при 4 × 10-3 М гексилрезорцина: (i) средний размер клеток (рассчитанный из 300 изображений) увеличивался, (ii) 3-кратно возрастала доля клеток, устойчивых к термообработке при 60°С, (iii) формировалась минорная субпопуляция клеток с высокой термоустойчивостью (80°С, 15 мин).

Таким образом, азоспириллы чувствительны к действию метил- и гексилрезорцина; тем не менее они способны преодолевать их ингибирующее действие. Предполагается, что эта особенность реализуется в естественных условиях и обеспечивает азоспириллам селективное преимущество при колонизации растения-хозяина.

1. Эль-Регистан Г.И. и др. // Микробиология, 2006, Т. 75, № 4. С. 446-456. 2. Ревина А.А. и др. // Изв. Академии наук. Сер. хим. 2003, Т. 11, С. 2257-2263.

ТРАНСФОРМАЦИЯ ПЕСТИЦИДОВ ПОЧВЕННОЙ МИКРОФЛОРОЙ

А. В. Колупаев, А. А. Широких, И. Г. Широких

Лаборатория биомониторинга Коми НЦ УрО РАН и ВятГГУ, Киров, Россия

Важным компонентом биогеоценозов, который с успехом можно использовать для биоиндикации загрязнения почв, является микробная система почвы и, в частности, почвенные микроскопические грибы (Терехова, 2007). Целью нашей работы являлось изучение реакции Trichoderma viridе на различные концентрации симазина в жидких средах. Объектом исследования служили природные изолят T. viridе дерново-подзолитых почв (гумус 1,5–2,3%, рНKCl 4,1-5,9) Кильмезкого захоронения пестицидов.

Для постановки модельных экспериментов использовали изолят с максимальной скоростью роста (Kr=1,6±1,15 мм/ч) T. viride S11. Наблюдали за накоплением грибной биомассы и изменениями в морфобиологической структуре T. viride S11 при росте в жидкой питательной среде Чапека с добавлением 0,1; 0,2, 0,4, 1 и 2 мкг/мл симазина, что соответствует 0,5; 1; 2, 5, 10 ПДК для почвы. Биомассу определяли на седьмые сутки инкубации гравиметрически после фильтрования через бумажный фильтр и высушивания до воздушно-сухого состояния. Остаточную концентрацию симазина в аликвоте культуральной жидкости каждого из вариантов опыта определяли методом хроматомасс-cпектрометрии (Shimadzu GCMS-QP2010 Plus EI, Япония). В результате было установлено, что в вариантах с различным содержанием симазина снижение в накоплении грибом биомассы (3,4–4,3 г/л) по сравнению с контролем (4,5 г/л) находится в пределах статистической ошибки (Таблица). Степень разложения пестицида составила 100; 60,7; 70,0; 82,9 и 86,3% соответственно в вариантах 0,5; 1; 2, 5, 10 ПДК. Погрешность измерения не превышала 2,0%. Методом прямого счета определяли плотность мицелия и спор в единице объёма жидкости. Для

113

каждого варианта готовили по 3 препарата для микроскопии. На каждом просматривали не менее 30 полей зрения.

Метод микроскопии позволил выявить характерную морфобиологическую реакцию гриба на возрастание в среде концентрации симазина, заключающуюся в формировании мицелиальных конгломератов различной плотности. С увеличением степени коагрегации мицелия доля не ассоциированного мицелия соответственно снижалась, а скорость биотрансформации симазина T. viride, наоборот, возрастала от 0,59 до 10,27 × 10-3 мкг/час. Это говорит о существенной роли процессов агрегации гиф в увеличении устойчивости популяции микромицета к загрязнителю, а также косвенно свидетельствует о повышении экзогидролазной активности T. viride в результате формирования мицелиальных конгломератов.

Биомасса и показатели биоморфологической структуры T.viride S11

в зависимости от концентрации симазина в среде

Вариант Биомасса,

г/л

Средняя длина

не ассоциированного

мицелия, мм/мл

Концентрация спор,

× 103 шт/мл

Удельная

продукция

спор, шт/мм

Контроль 4,5±0,55 58.6±29.0 3252±1061 55,1

0,5 ПДК 3,4±0,72 52.3±25.9 5685±1417 108,7

1 ПДК 3,4±0,85 66.9±33.9 2321±569 34,7

2 ПДК 4,2±0,83 35.5±20.1 12405±2801 351,4

5 ПДК 4,3±0,93 46.8±18.6 1759±562 37,6

10 ПДК 3,8±0,83 24.8±17.6 1174±313 47,3

Из представленных в таблице данных видно, что существенная перестройка в

биоморфологической структуре T. viride, заключающаяся в четырёхкратном увеличении концентрации спор при одновременном снижении длины мицелия в 1,6 раза, выявлена в варианте 2 ПДК. Это повлекло за собой существенное возрастание удельной продукции спор, что можно рассматривать как попытку гриба сохранить популяционную плотность в условиях резко неблагоприятных условий среды. При дальнейшем увеличении исходной концентрации симазина в среде (вариант 5 ПДК) удельная продукция спор резко снижается, а затем (при 10 ПДК) происходит и существенное по сравнению с контролем снижение в плотности неассоциированного мицелия (в 2,4 раза) и концентрации спор (в 2,8 раза), что может свидетельствовать об истощении адаптационного потенциала популяции.

В результате исследования можно сделать следующие выводы: 1. В модельном опыте показана способность изолята T. viride S11 к разложению

симазина. При этом скорость разложения данного вещества прямо пропорциональна степени коагрегированности мицелия. Варианты с различным содержанием симазина существенно не различались по накоплению биомассы микромицета, что свидетельствует об устойчивости штамма T. viride S11 к данному ксенобиотику.

2. В зависимости от исходной концентрации пестицида наблюдаются изменения в биоморфологической структуре T.viride. При этом в варианте с максимальной исходной концентрацией симазина плотность неассоциированного мицелия и концентрация спор более

114

чем в 2 раза меньше, по сравнению с контрольным вариантом. Возможным объяснением тому является усиленное формирование мицелиальных агрегатов, как способ адаптации гриба к присутствию ксенобиотика.

3. Полученные данные дают основание считать, что штамм T. viride S11 обладает биодиагностическим потенциалом в отношении выявления пестицидного загрязнения.

ИДЕНТИФИКАЦИЯ ВОЗБУДИТЕЛЕЙ БОЛЕЗНЕЙ ФАСОЛИ

И ИХ ВЗАИМОДЕЙСТВИЕ С БИОПРЕПАРАТАМИ

НА ОСНОВЕ АНТАГОНИСТОВ

А. С. Коробейников

Новосибирский государственный аграрный университет, Новосибирск, Россия

В последние годы зерновая и овощная фасоль занимает все большее место в питании жителей Западной Сибири. Фасоль широко используются во многих отраслях промышленности: пищевой, комбикормовой и др. Кроме того, ее значение в растениеводстве определяется тем, что фасоль обогащает почву азотом и повышает урожайность следующих за ней в севообороте культур.

Известно, что посевы фасоли поражаются болезнями, вызывающими потери урожая и снижающими качество зерна. Наиболее вредоносны фузариозная и ризоктониозная корневые гнили, пустульный бактериоз листьев, черная бактериальная пятнистость (Заостровных, Дубовицкая, 2003). Выявление и идентификация возбудителей болезней фасоли имеет решающее значение для разработки защитных мероприятий при ее выращивании. При этом для фасоли, поступающей в пищу в свежем виде неприемлемо использование химических средств защиты растений, целесообразно заменять их биологическими препаратами на основе микроорганизмов-антагонистов. Для отбора перспективных биопрепаратов необходим первоначальный скрининг в лабораторных условиях в отношении выделенных возбудителей болезни.

Целью настоящей работы было выделение возбудителей болезней фасоли из пораженных корней растений и их идентификация, а также проведение лабораторного скрининга новых биологических препаратов в отношении этих фитопатогенов.

Опыты проводили в лаборатории биотехнологии кафедры биологической защиты растений Новосибирского государственного аграрного университета в 2008–2009 гг. В качестве объектов исследования использовались возбудители корневых гнилей фасоли и биологические препараты на основе грибов рода Penicillium Link. (Веррукозин, Фуникулозум) и бактерий родов Bacillus Cohn. (D7-1) и Pseudomonas M. (OIF-2-1), разработанные во ВНИИ Масличных культур РАСХН и предоставленные нам д.б.н. Л. В. Маслиенко. Фитопатогены выделялись из пораженной корневой системы фасоли. Участки пораженной ткани вырезались и помещались во влажную камеру. Инкубировали материал при температуре 24°С. Отдельные участки пораженной ткани высевались на картофельно-глюкозный агар с последующим культивированием при температуре 24°С.

В результате исследования были выделены фитопатогены грибной природы. Определение осуществлялось по общепринятой методике с использованием микроскопии в

115

проходящем свете и определителя (Билай, 1977). Все выявленные возбудители оказались грибами рода Fusarium: Fusarium oxysporum Schltdl., Fusarium oxysporum Schlecht. f.sp. orthoceras (Appel & Wollenw.), Fusarium solani var. coeruleum (Sacc.) Booth.

Лабораторный скрининг биопрепаратов на основе антагонистов проводился с использованием метода агаровых блоков (Соколова, 1975). Суспензия исследуемого биопрепарата в определенной концентрации добавлялась к предварительно разогретой питательной среде для выращивания фитопатогенных грибов при перемешивании. Из чистой культуры фитопатогена пробоотборником вырезались блоки диаметром 10 мм и помещались на поверхность среды с препаратом. Опыт ставился в четырехкратной повторности. Препараты использовались в концентрациях 0,5 и 0,25%. По окончании опыта рассчитывался индекс антагонистической активности биопрепарата по соотношению диаметров колоний в контрольном и опытном вариантах в % (Рудаков, 1981).

По результатам лабораторного скрининга наиболее высокую антагонистическую активность проявили биопрепараты на основе Bacillus subtilis Cohn. штамм D7-1 (D7-1) в концентрациях 0,5 и 0,25% (индекс антагонистической активности 82,4 и 82,1% соответственно) и на основе Penicillium funiculosum Thom. (Фуникулозум) в концентрации 0,5% (индекс составил 83,7%). Наиболее низкая активность наблюдалась для препарата на основe Pseudomonas spp. (OIF-2-1) в концентрации 0,5% (индекс 34,7%).

По результатам работы можно сделать следующие выводы: 5. Основное место среди почвенных инфекций фасоли в Новосибирской области

занимают фузариозы; 6. Наиболее высокая антагонистическая активность в лабораторных условиях

наблюдалась у биопрепаратов на основе Bacillus subtilis Cohn. и Penicillium funiculosum Thom., что позволяет сделать предварительный вывод о перспективности получения и использования этих препаратов для подавления возбудителей корневых гнилей фасоли.

116

ВЛИЯНИЕ RHODOCOCCUS–БИОСУРФАКТАНТОВ

НА ПРОЦЕСС МОБИЛИЗАЦИИ И ДЕСОРБЦИИ

НЕФТЯНЫХ УГЛЕВОДОРОДОВ ИЗ ПОЧВЫ

Л. В. Костина1, А. В. Криворучко1

, М. С. Куюкина1, Т. А. Пешкур2

, П. Андерсон2,

К. Д. Каннингхем2, И. Б. Ившина1

1Институт экологии и генетики микроорганизмов УрО РАН, Пермь, Россия 2Исследовательский центр оценки загрязненных земель и ремедиации, Эдинбург,

Великобритания

Цель настоящего исследования – изучение процесса мобилизации и десорбции нефти из почвы под воздействием Rhodococcus-биосурфактантов в условиях модельного эксперимента.

В работе использовали модельную почву (об. %): песок – 50, глина – 30, грунтосмесь – 20. В почву вносили смесь углеводородов: н-алканы (декан, ундекан, додекан, тетрадекан, гексадекан, гептадекан, нонадекан, каждый в концентрации – 11.90 вес. %), разветвленный изоалкан (пристан – 3.96 вес. %), а также полициклические ароматические углеводороды (нафталин, фенантрен, антрацен и аценафтен, каждый в концентрации – 2.68 вес. %) в концентрации 5 об. %. Содержание углеводородов, входящих в состав модельной нефти, соответствуют таковым в составе сырых нефтей. Отмывание углеводородов проводили параллельно с помощью неочищенного Rhodococcus-биосурфактанта (1500 мг/л), его экстракта (519 мг/л) или синтетического сурфактанта Твина 60 (99 мг/л) при температуре 24°С. Неочищенные Rhodococcus-биосурфактанты, продуцируемые R. ruber ИЭГМ 231 в среде с н-додеканом (3 об. %), получали методом [2], а их экстракты с использованием метил-трет-бутилового эфира [3]. В качестве контроля использовали дистиллированную воду. Эксперименты по десорбции нефтяных углеводородов из почвы проводили в стеклянных колонках длиной 57 и диаметром 3 см. Структурный анализ углеводородов осуществляли с помощью газового хроматографа Agilent 6890N с квадрупольным масс-спектрометрическим детектором Agilent MSD 5973N, Agilent Technologies, США.

Как видно из рисунка, интенсивность процесса десорбции нефтяных углеводородов из почвы под воздействием Rhodococcus-биосурфактантов составляет до 33.0 %, тогда как под воздействием Твина 60 не превышает 18.5 %. При этом наиболее эффективное извлечение нефтяных углеводородов наблюдается в случае прямоцепочечных и разветвленных алканов с длиной цепи 16–19 атомов углерода. В экспериментах с использованием экстракта Rhodococcus-биосурфактанта в качестве отмывающего агента показаны практически аналогичные результаты по нефтеотмыванию по сравнению с неочищенным биосурфактантом. В связи с этим целесообразно использование более дешевого и экологически безопасного неочищенного Rhodococcus-биосурфактанта для очистки почв, загрязненных нефтяными углеводородами.

117

0

200

400

600

800

1000

1200

1400

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12

Нефтяные углеводороды

Сод

ержан

ие в кол

онке,

мг

Исходное загрязнение

Вода

Твин 60

Б/нт 1

Б/нт 2

Рис. 1. Остаточное содержание нефтяных углеводородов в модельной почве.

Углеводороды: 1 – антрацен; 2 – аценафтен; 3 – нафталин; 4 – фенантрен; 5 – пристан; 6 – н-декан; 7 – н-ундекан; 8 – н-додекан; 9 – н-тетрадекан; 10 – н-гексадекан; 11 – н-гептадекан; 12 – н-нонадекан. Б/нт 1 –

неочищенный Rhodococcus-биосурфактант; Б/нт 2 – экстракт Rhodococcus-биосурфактанта.

Работа поддержана грантами Программы фундаментальных исследований РАН “Биологическое разнообразие” и НАТО (ESP.NR.NRCLG 982051).

1. Ivshina I.B. et al. Oil desorption from mineral and organic materials using biosurfactant

complexes produced by Rhodococcus species // W. J. Microbiol. Biotechnol. – 1998. – V. 14. – P. 711-717.

2. Kuyukina M.S. Recovery of Rhodococcus biosurfactants using methyl-tertiary butyl ether extraction / M. S. Kuyukina, I.B. Ivshina, J.C. Philp et al. // J. Microbiol. Methods. – 2001. – V. 46. – P. 149-156.

118

ВЛИЯНИЕ ГЕРБИЦИДА «ТОПИК»

НА РОСТ И РАЗВИТИЕ ШТАММА БАКТЕРИИ BACILUS MEGATERIUM

К. К. Кунанбаев1, А. П. Науанова2

1Научно-производственный центр зернового хозяйства им. А.И. Бараева, Казахстан 2Казахский агротехнический университет им. С. Сейфулина, Казахстан

На территории Акмолинской области получил широкое распространение гербицид

«Топик», рекомендованный для борьбы с однолетними злаковыми сорняками в посевах яровой пшеницы. Применяется по всходам культуры при норме расхода 0,4 – 0,75 л/га. Действующим веществом препарата является хлодинафоп – пропаргил 80 г/л +антидот 20 г/л.

о

F

Cl

N

O CCH3

HC O CH2 C CH

Нами было проведено исследование по изучение потенциальной активности штамма Baccilus megaterium разлагать данный гербицид; для этого со стационаров Института, где проводятся гербицидные обработки, был выделен штамм данной бактерии. В чистую культуру вносился препарат в 6 дозах, в том числе и рекомендованной фирмой-производителем 0,7 л/га с пересчетом концентрации на чашки Петри. Для повышенных доз перерасчет производился в процентах от рекомендованной. Повторность лабораторных опытов – четырехкратная. Коэффициент торможения высчитывался по формуле Эббота:

Т= Дк – До / Дк × 100,

где Т – торможение роста; Дк – диаметр колоний в контроле; До – диаметр колоний в опыте.

Полученные данные по влиянию гербицида «Топик» на штамм Baccilus megaterium в зависимости от дозы препарата показал, что в повышенных дозах (от 40 до 100% или двойная доза от рекомендованной) коэффициент торможения в среднем составил 20,0%, что может говорить о том, что препарат оказывает незначительный токсический эффект на данный микроорганизм. В рекомендованной дозе идет стимуляция бактерий; здесь коэффициент торможения отрицательный.

119

Влияние гербицида «Топик» на Baccilus megaterium

Доза гербицида, % Диаметр колоний, см Коэффициент торможения, %

100 1,78 ± 0,20 20,89

80 1,78 ± 0,15 20,89

60 1,80 ± 0,16 25,64

40 1,80 ± 0,16 20,00

20 2,18 ± 0,23 3,11

Рекомендованная доза 2,40 ± 0,27 –6,67

К 2,25 ± 0,20

НСР 0,402

Для выявления деструкции пестицидов были внесения штамм деструктор в жидкую

среду голодный агар, содержащий 100 мкг/мл пестицида. В качестве источника углерода использовали пестицид «Топик». Контролем служила среда с пестицидом без микроорганизма. Динамику роста микроорганизмов изучали после центрифугирования путем разбавления осадка физиологическим раствором и измерением оптической плотности на спектрофотометре Varian Cary 50, предварительно сняв спектр поглощения в диапазоне длин волн 190–1100 нм. Спектрофотометрнческий анализ проводили в супернатанте после центрифугирования среды с микроорганизмами.

Результаты исследований показали, что данный штамм обладает способностью разлагать пестицид в лабораторных условиях, однако для полного исследования необходимо провести испытания в полевых условиях. Не вызывает сомнения, что использование микроорганизмов деструкторов пестицидов, для проведения направленной детоксикации, является одним из перспективных направлений в области экологической микробиологии и биотехнологии.

ПРОТЕОЛИТИЧЕСКАЯ АКТИВНОСТЬ БАКТЕРИАЛЬНОГО ШТАММА

BREVIBACILLUS BREVIS B–398

Е. И. Ладутько, Г. И. Новик

ГНУ «Институт микробиологии НАН Беларуси», Минск, Беларусь Ladutko_elena@mail.ru

Применение микроорганизмов для подавления или контроля роста получило достаточно широкое распространение как альтернатива использования химических бактериоцинов и фунгицидов и вошло в практику в качестве средств биологического контроля патогенных микроорганизмов. Потенциал регулирования численности патогенных микроорганизмов огромен, поскольку механизмы действия «биологических агентов» разнообразны. В частности синтез сидерофоров и продукция антибиотических метаболитов псевдомонадами, а также синтез ферментов, участвующих в лизисе клеточной стенки патогенов, бациллами позволяют широко использовать данные микроорганизмы в борьбе с грибковыми заболеваниями растений. В Белорусской коллекции непатогенных

120

микроорганизмов (БКМ) поддерживаются штаммы бактерий рода Brevibacillus, антагонистически активные по отношению к фитопатогенным микромицетам – Fuzarium

oxysporum, Rhizoctonia solani, Rhizoctonia arealis. Скрининговые исследования коллекционных бактерий рода Brevibacillus, позволили отобрать штамм бактерий Brevibacillus brevis B-398, обладающий достаточно высокой антагонистической активностью. Наличие в литературе сведений, о возможной роли протеолитических ферментов в механизмах действия биопрепаратов на основе спорообразующих бактерий при грибковых заболеваниях растений, позволило нам предположить, что антагонистическая активность штамма B. brevis B-398 может быть связана с продукцией протеиназ. Нами изучены закономерности образования протеолитических ферментов штамма B. brevis БИМ В-398 в процессе роста. B. brevis БИМ В-398 был восстановлен из замороженного состояния (–70°С), в экспериментах использовалась физиологически активная культура 3-й генерации. Культивирование бактерий осуществляли при 28°С на мясопептонном бульоне (МПБ). Активность роста и продукцию протеиназ B. brevis БИМ В-398 в динамике развития популяции определяли в процессе отбора проб через каждые 2–4 часа в течение 5 суток. Рост бактерий оценивали по показателям КОЕ/мл и спектрофотометрически ОП600. Определение активности протеолитических ферментов проводили по модифицированному методу Ансона, используя в качестве субстрата казеин (рН 4,4; 6,8; 8,6 ).

Кривая роста, выполненная на основе анализа данных оптической плотности суспензии бактерий, характеризовалась непродолжительной логарифмической фазой роста (8 ч). Затем наблюдалась фаза замедления длительная стационарная фаза роста бактерий

B. brevis БИМ В-398.

0

100

200

300

400

500

0 8 16 26 48 68 100время, ч

Е, усл

.ед

/мл

0

0,05

0,1

0,15ОП 600

1 2 3 4

Рис 1. Динамика роста (4) и изменения протеолитической активности (Е, усл.ед/мл)

бактериального штамма Brevibacillus brevis B–398 при проведении реакции при различных значениях рН (1 – рН 4,4; 2 – рН 6,8; 3 – рН 8,6).

Сохранение способности к росту отмечено в течение 5 суток культивирования бактерий (~106 КОЕ/мл). Протеолитические ферменты, образующиеся в процессе роста бактериальной культуры, активны при кислых, нейтральных и щелочных условиях реакции гидролиза белка. Максимальный уровень активности фермента (~ 432 усл.ед./мл) при рН 6,8 реакции гидролиза белка зафиксирован к 12 часам культивирования, что соответствует фазе замедления роста бактерий. По-видимому, секреция данного фермента на этом этапе необходима бактериям для обеспечения вегетативного роста. Пик активности протеолитических ферментов (~ 312 усл.ед./мл) при рН 8,6 реакции гидролиза белка отмечен

121

через 48 ч культивирования B. brevis БИМ В-398. Возможно, увеличение продукции данного фермента на поздних стадиях роста бактерий связано с началом процесса спорообразования. Таким образом, высокий уровень антагонистической активности штамма B. brevis БИМ В-398, а также синтез протеолитических ферментов активных в широком диапазоне рН, позволил сделать вывод о перспективности использования данного штамма микроорганизмов в качестве основы средств биологического контроля грибковых заболеваний растений. Известно, что многие микроорганизмы проявляют антагонистическую активность благодаря синтезу антибиотических веществ. Вместе с тем, роль внеклеточных протеолитических ферментов в механизме антагонистической активности бактерий также достаточно высока. Эффективность биологического контроля фитопатогенов, как правило, опосредована комплексным действием различных факторов.

НАКОПЛЕНИЕ ОЛИГОСАХАРИДОВ

ПРИ КУЛЬТИВИРОВАНИИ БИФИДОБАКТЕРИЙ НА СРЕДАХ С ЛАКТОЗОЙ

А. Н. Морозова, Н. А. Головнева, Н. Е. Рябая

Институт микробиологии НАН Беларуси, Минск, Республика Беларусь

Одним из наиболее физиологичных путей активизации роста и биологической активности норморофлоры пищеварительного тракта человека и животных является использование пребиотиков. К пребиотикам относят некоторые углеводы, такие как лактулоза, инулин и ряд олигосахаридов – селективных пищевых субстратов, стимулирующих пролиферацию и активность индигенных анаэробных бифидо- и лактобактерий в экосистеме кишечника. Способность к утилизации олигосахаридов-пребиотиков обеспечивает бифидобактериям конкурентное преимущество перед другими представителями микробиоценоза кишечника. Широкий спектр положительного влияния олигосахаридов на развитие бифидобактерий является основой для создания препаратов-синбиотиков, сочетающих в себе свойства про- и пребиотиков.

β-Галактозидаза является ключевым ферментом углеводного обмена бифидобактерий, способных к росту на молоке и средах, содержащих лактозу или её производные. Первоначально исследование активности β-галактозидазы было сфокусировано на гидролитических свойствах фермента. В настоящее время все больше внимания уделяется трансгликозилирующему действию β-галактозидаз и возможности получения галактоолигосахаридов. Благодаря реакциям трансгликозилирования происходит формирование олигосахаридов, которые составляют основу пребиотиков. Существует предположение, что такие олигосахариды могут воздействовать на состав микрофлоры дистальных отделов кишечника. Имеются сведения о том, что некоторые штаммы бифидобактерий обладают наиболее высокой скоростью роста на смеси галактоолигосахаридов (ГОС), синтезируемых собственными β-галактозидазами. Предполагается, что реакции гидролиза и синтеза олигосахаридов взаимосвязаны, осуществляются одними и теми же активными центрами ферментов с различной скоростью, в зависимости от конфигурации связей олигосахаридов в следующем порядке: 1→6; 1→4;

122

1→3. Количество и спектр ГОСов, продуктов реакции трансгликозилирования, определяется, прежде всего, свойствами ферментов, а также составом среды культивирования.

Целью данной работы было определение гидролитической и трансгликозилирующей активности β-галактозидазы у исследуемых штаммов бифидобактерий.

В качестве объектов исследования были выбраны четыре штамма бифидобактерий: Bifidobacterium adolescentis МС-42, B. adolescentis ГО-13, B. bifidum 791, B. longum.

Гидролитическую активность β-галактозидазы определяли колориметрически по количеству освободившегося о-нитрофенола из о-нитрофенил-β-D-галактопиранозида (о-НФГ) и выражали в единицах Миллера. Реакционная смесь для определения трансгликозилирующего действия β-галактозидазы содержала 0,5 мл раствора лактозы в концентрации от 5 до 30% в 0,05М Na-фосфатном буфере рН 7,5 и 0,5 мл клеточной суспензии. Наличие олигосахаридов в культуральной среде определяли методом тонкослойной хроматографии (ТСХ).

Для определения β-галактозидазной активности бифидобактерии культивировали на среде с лактозой. Наиболее высокий уровень продукции фермента в данных условиях отмечен у B. bifidum 791 и B. longum. Трансгликозилирующее действие β-галактозидаз оценивали по хроматографической подвижности и интенсивности окрашивания продуктов реакции. Методом ТСХ установлено наличие в реакционной смеси глюкозы, галактозы, лактозы и олигосахаридов, хроматографическая подвижность которых составляет от 0,08 до 0,18 (лактоза – 0,26; глюкоза – 0,48; галактоза – 0,38). Из полученных данных следует, что исследуемые штаммы бифидобактерий продуцируют ферменты, которые наряду с гидролизом лактозы способны осуществлять реакцию трансгликозилирования. Эффективность трансгликозилирующего действия определяется уровнем продукции

β-галактозидазы различными штаммами бактерий. Наиболее активное накопление олигосахаридов – продуктов реакции трансгликозилирования, отмечено у штамма B. longum.

Анализ показал, что с увеличением концентрации лактозы в реакционной смеси накопление олигосахаридов более выражено.

НАПРАВЛЕННАЯ БИОТРАНСФОРМАЦИЯ β-СИТОСТЕРОЛА

В ФАРМАКОЛОГИЧЕСКИ АКТИВНЫЙ СТИГМАСТ–4–ЕН–3–ОН

Е. М. Ноговицина1, В. В. Гришко2

, Е. В. Тарасова3, И. Б. Ившина1

1Институт экологии и генетики микроорганизмов УрО РАН, Пермь, Россия 2Институт технической химии, Пермь, Россия

3Пермский государственный университет, Пермь, Россия

Стигмаст-4-ен-3-он (CAS No: 1058-61-3, C29H48O, М.В. 412,69) – продукт окислительной трансформации β-ситостерола перспективен в качестве фармакологического препарата для лечения эндокринных заболеваний, в частности гиперплазии простаты [1]. Известно, что образование стигмаст-4-ен-3-она из β-ситостерола катализируется бифункциональным ферментом холестеролоксидазой, однако литературные данные по селективной биотрансформации стерола в стигмаст-4-ен-3-он весьма ограничены. Ранее нами было показано [2], что актинобактерии рода Rhodococcus способны трансформировать

123

β-ситостерол с образованием стигмаст-4-ен-3-она. Установлено, что направленное биокаталическое окисление β-ситостерола до стигмаст-4-ен-3-она достигается при использовании изопропанола в качестве растворителя стерола, ростового субстрата н-гексадекана и представителей R. ruber, катализирующих в данных условиях образование до 98% стигмаст-4-ен-3-она. Однако эффективное получение стигмаст-4-ен-3-она при использовании штаммов R. ruber возможно только в условиях добавления β-ситостерола в концентрации 0,5 г/л через 2 сут суток роста бактериальных клеток. В настоящей работе исследована возможность сокращения продолжительности процесса биотрансформации β-ситостерола и проведен поиск оптимальных условий получения стигмаст-4-ен-3-она в присутствии более высоких концентраций исходного субстрата.

В работе использовали штаммы R. erythropolis ИЭГМ 487 и R. ruber ИЭГМ 233 из Региональной профилированной коллекции алканотрофных микроорганизмов (акроним ИЭГМ, номер во Всемирной федерации коллекций культур 768, www.iegm.ru/iegmcol). Родококки выращивали в жидкой минеральной среде, содержащей н-гексадекан (от 0,05 до 0,2 %) и пальмитиновую кислоту (от 0,005 до 0,05%). β-Ситостерол (0,5; 1,0; 1,5 или 2,0 г/л) в виде раствора в изопропаноле добавляли в среду культивирования одновременно с инокулятом или через 2-е сут роста бактериальных клеток. В отдельных экспериментах в качестве эмульгаторов стерола использовали синтетические сурфактанты полипропиленгликоль и твин-40, 60, 80. В результате поиска эффективных активаторов процесса биотрансформации β-ситостерола подобраны условия, позволяющие проводить направленное получение стигмаст-4-ен-3-она при добавлении субстрата одновременно с инокулятом. Оказалось, что при использовании в качестве индуктора холестеролоксидазы пальмитиновой кислоты стеролтрансформирующая активность клеток R. erythropolis ИЭГМ 487, характеризующейся низким (26,3%) уровнем конверсии стерола в стигмаст-4-ен-3-он в присутствии н-гексадекана, не зависит от времени внесения β-ситостерола. При этом максимальная (84,8%) степень образования стигмаст-4-ен-3-она достигается в присутствии 0,015 % пальмитиновой кислоты и 0,25% н-гексадекана. Следует отметить, что клетки

R. ruber ИЭГМ 233, эффективно трансформирующие β-ситостерол в присутствии

н-гексадекана при добавлении стерола через 2 сут роста клеток родококков, в данных условиях катализируют образование лишь 10,8% стигмаст-4-ен-3-она. В результате исследования влияния повышенных концентраций β-ситостерола на процесс получения стигмаст-4-ен-3-она установлено, что в присутствии н-гексадекана, пальмитиновой кислоты и синтетических сурфактантов эффективная трансформация β-ситостерола в стигмаст-4-ен-3-он достигается только при использовании культуры R. erythropolis ИЭГМ 487. При этом максимальная (39,4%) степень образования стигмаст-4-ен-3-она регистрируется в присутствии твина-80 при добавлении 1,5 г/л стерола. В присутствии 2 г/л исследуемого субстрата стеролтрансформирующая активность культуры снижается на 2,5%.

Таким образом, в результате проведенных исследований установлено, что для получения целевого продукта биотрансформации β-ситостерола (стигмаст-4-ен-3-она) наиболее перспективно использование R. erythropolis ИЭГМ 487.

124

Работа поддержана программой государственной поддержки ведущих научных школ Российской Федерации (НШ-4112.2008.4) и грантом в рамках междисциплинарного проекта фундаментальных исследований, выполняемых в учреждениях УрО РАН.

1. Patent 5264428 USA. Use stigmasta-4-en-3-on in the treatment of androgen dependent

disease. /S. Streber. 3.11.1993. 2. Гришко В.В., Ноговицина Е.М., Ившина И.Б. Биокаталитическое получение

физиологически активных соединений на основе растительного β-ситостерола // Катализ в промышленности. 2009. № 1. С. 67-74.

ОПТИМИЗАЦИЯ ЭКСПРЕССИИ РЕКОМБИНАНТНОЙ L-АСПАРАГИНАЗЫ

YERSINIA PSEUDOTUBERCULOSIS

В. С. Покровский1, К. В. Сидорук2

, В. Г. Богуш2, Н. М. Омельянюк1

,

М. В. Покровская1, С. С. Александрова1

, А. А. Борисова1, Ю. А. Гладилина1

,

Н. Н. Соколов1

1НИИ Биомедицинской химии им. В.Н. Ореховича РАМН, Москва, Россия 2НИИ Генетики и селекции промышленных микроорганизмов, Москва, Россия

Введение

Широко применяемая в химиотерапии острых лимфобластных лейкозов L-аспарагиназа (КФ 3.5.1.1) Е. сoli обладает рядом недостатков, связанных с иммуногенностью и быстрой наработкой резистентности, что определяет актуальность поиска ее аналогов, не имеющих этих побочных эффектов. Ранее нами была выделена рекомбинантная L-аспарагиназа Y. pseudotuberculosis (YpA) и показана ее высокая противоопухолевая активность на культурах клеток Molt4, Jurkat и др.

Цель исследования

Определить оптимальные условия экспрессии YpA для получения максимального количества микробной массы с высокой удельной аспарагиназной активностью.

Материалы и методы

В качестве продуцентов YpA использовали штаммы E. coli BL-21(DE3), BL-21(plysS), BL-21(JM83), BL-21(TOP10), трансформированные плазмидами pBad24 или pET23a, несущими ген YpA. Продуценты выращивали на среде LB при рН 7,2±0,1 в колбах объемом 0,2 л и 1,0 л на качалке со скоростью перемешивания 180 об/мин.

Аспарагиназную активность определяли по стандартной методике с использованием реактива Несслера. За единицу активности L-аспарагиназы (МЕ) принимали такое количество фермента, которое катализирует высвобождение 1 мкмоль аммиака за 1 мин при 37°С.

Оптическую плотность культуры измеряли фотометрически при длине волны 600 нм и выражали в оптических единицах (ОЕ). Продуктивность культуры выражали в МЕ/ОЕ.

Определяли оптимальную концентрацию индуктора (арабиноза) и время его добавления в среду, температуру культивирования, а также длительность инкубации.

125

Конечная концентрация индуктора составляла 0,02–0,50%. В процессе культивирования проводили раннюю, позднюю индукцию, а также индукцию в середине логарифмической фазы (лог-фазы) роста при Т=28–37°С.

Для оценки зависимости продуктивности клеток от времени инкубации пробы отбирали каждые 40 мин в течение 13 ч после индукции. Основными критериями оптимизации являлись выход биомассы и продуктивность клеток.

Результаты В качестве оптимального продуцента YpA был выбран штамм BL-21 (DE3), для

которого характерно наиболее высокое накопление биомассы и стабильный высокий уровень экспрессии при длительном пассировании.

Максимальная активность и продуктивность штамма отмечались при внесении индуктора в середине лог-фазы роста. Активность через 17 ч после внесения индуктора составила 16–21 МЕ/мл; продуктивность 3,2–3,9 МЕ/ОЕ. Различия в концентрации индуктора в пределах 0,1–0,5% существенно не влияли на продуктивность. Снижение температуры культивирования до 28°С приводило к увеличению продуктивности клеток, но замедляло клеточный рост, поэтому суммарная активность снижалась.

При изучении зависимости продуктивности от времени инкубации было показано, что максимальная продуктивность штамма на уровне 3,1 МЕ/ОЕ достигалась через 6,5 ч. Максимальная активность, равная 18,4 МЕ/мл, наблюдалась через 7–11 ч после индукции.

Выводы

1. Оптимальным продуцентом из изученных является E. coli/BL-21(DE3)/pBad/YERS. 2. При добавлении индуктора в середине логарифмической фазы роста клеток

уровень экспрессии YpA выше, чем при более ранней индукции. 3. Различия в концентрации индуктора в пределах 0,1–0,5% существенно не влияют

на продуктивность. 4. Оптимальная продолжительность наработки биомассы – 7–11 ч после индукции.

126

ФЕРМЕНТНЫЙ ПРЕПАРАТ ДЛЯ БИОКОНВЕРСИИ СЫРЬЯ

В КОРМОПРОИЗВОДСТВЕ

Э. А. Рафаилова1, А. В. Шишкин1

, Ю. А. Морозова1, Ф.К. Алимова1

, Е. В. Скворцов2

1Казанский государственный университет им. В.И. Ульянова-Ленина, Казань, Россия 2 Институт органической и физической химии Казанского научного центра

Российской академии наук, Казань, Россия

Ключевым компонентом агробизнеса неизменно является эффективное кормопроизводство, обеспечивающее сбалансированные и высококачественные корма при минимальных затратах на их производство. Известно, что порядка 90% всех производимых кормов составляют корма для птицеводства, свиноводства и крупного рогатого скота. Качество и стоимость животноводческой продукции зависит от качества и стоимости кормов. Не для всех хозяйств доступны комбикорма из-за их высокой стоимости, кроме того, фураж также дорожает, что увеличивает себестоимость животноводческой продукции. А используемые дешевые корма имеют низкую пищевую ценность. С развитием биотехнологии в кормопроизводстве для улучшения пищевой ценности корма используют ферменты. Они позволяют изъять из кормов непищевые факторы (фитаты) и разрушить трудногидролизуемые компоненты зерна (пентозаны, β-глюканы).

Одним из известных промышленных продуцентов гидролаз являются грибы рода Trichoderma [1]. Ранее нами была показана способность грибов этого рода синтезировать активный комплекс карбогидраз [2, 3]. Целью данной работы явился поиск высокопродуктивного штамма-продуцента ксиланаз. Исходя из цели работы, поставлены следующие задачи:

1. Скрининг штаммов-продуцентов с высокой ксиланазной активностью. 2. Изучить стабильность фермента в условиях желудочно-кишечного тракта

моногастричных животных. В работе были использованы штаммы Trichoderma из музея лаборатории

сельскохозяйственной биохимии и биотехнологии Казанского Государственного Университета.

Для получения инокулята чистой культуры Trichoderma использовалась среда Чапека (гр/л): NaNO3 – 2; KH2PO4 – 1; MgSO4X7H2O – 0.5; KCl – 0.5; FeSO4 – 0.01; Сахароза – 30; Агар – 20. Посевы грибов Trichoderma выращивали на агаризованной среде Чапека при температуре 28°С, в течение 5 суток. Определение ксиланазной активности ферментных препаратов проводили согласно методике [4]. Абсорбцию измеряли при 530 нм, используя двулучевой спектрофотометр Lambda 35 Perkin Elmer Ins. Одна единица активности энзима (IU) соответствует количеству фермента, вызывающего выход одного мкМоля восстанавливающих сахаров в минуту при гидролизе соответствующего субстрата.

В результате скрининга грибов рода Trichoderma найден штамм с активностью синтеза ксиланаз на 70% выше, чем у промышленного аналога. Ксиланазы найденного штамма высоко стабильны в среде, соответствующей физиологическим условиям желудочно-кишечного тракта моногастричных животных. Ферменты Trichoderma высокоэффективны в верхних зонах двенадцатиперстной кишки. Большая часть корма через 5 часов из желудка

127

переходит в кишечник. Согласно полученным данным, за 5 часов при физиологических условиях желудка ксиланазная активность уменьшается всего на 40%, с сохранением 60% исходной активности для работы в кишечном тракте. Ксиланазный комплекс Trichoderma также обладает повышенной способностью снижать вязкость раствора некрахмалистых полисахаридов в пищеварительном тракте животных и птиц. Благодаря этому улучшается перевариваемость корма - на 40% по сравнению со стандартным ферментным препаратом. А также помогает избежать отрицательных последствий - жидкий и клейкий помет, в котором распространяется инфекция.

Таким образом, использование предлагаемого фермента ксиланазы позволит снизить себестоимость животноводческой продукции в результате увеличения эффективности корма (прирост массы животных) и снижения стоимости самого корма за счет использования более дешевого зернового сырья.

Работа выполнена при поддержке гранта фонда содействия развитию малых форм предприятий в научно-технической сфере по программе «Участник молодежного научно-инновационного конкурса» («У.М.Н.И.К.»).

1. Алимова Ф.К. Промышленное применение грибов рода Trichoderma.- Казань, Изд-во

Унипресс ДАС, 2006. - 268 С. 2. Скворцов Е.В. Исследование ферментных препаратов грибов р. Trichoderma,

гидролизующие пентозаны ржи / Скворцов, Е.В., Алимова Ф.К., Абузярова Д.М. // Вестник Татарстанского отделения Российской Экологической Академии, 2 (20), 2004, с.14-18

3. Скворцов Е.В. Биосинтез ксиланаз аборигенными изолятами Trichoderma / Скворцов Е.В., Алимова Ф.К., Абузярова Д.М. // Вестник Казанского технологического университета, - 2005, №1, С.251-255

4. König J. Determination of xylanase, glucanase, and cellulase activity / König J , Grasser R., Pikor H., Vogel K. // Anal Bioanal Chem.-2002.- 374.-P.80–87.

ИССЛЕДОВАНИЕ АНТИОКСИДАНТНОЙ АКТИВНОСТИ

ЭКСТРАКТОВ ИЗ ЛИСТЬЕВ ДЕРЕВЬЕВ ЗАПАДНОЙ СИБИРИ

З. Ю. Самойлова1, Г. В. Смирнова1

, Г. И. Высочина2, О. Н. Октябрьский1

1Институт экологии и генетики микроорганизмов УрО РАН, Пермь, Россия 2Центральный сибирский ботанический сад СО РАН, Новосибирск, Россия

В настоящее время в мировой практике принят комплексный подход к изучению

антиоксидантной активности (АОА) химических веществ, их смесей, а также экстрактов, полученных из биосубстратов. При таком подходе исследования АОА с применением биологических тест-систем: культуры клеток эукариот, микроорганизмов и живых организмов (мыши, крысы и т.д.) обязательно дополняются экспериментами in vitro, проводимыми с помощью физико-химических методов. Этот подход, используемый и в нашей работе, позволяет дать более полную характеристику антиоксидантных свойств

128

испытуемых субстратов. Бактерии Escherichia coli хорошо изучены в биохимическом и генетическом плане, могут быть использованы как относительно простые тест-системы для оценки АОА in vivo экстрактов растений.

В работе исследовали АОА 15 экстрактов из листьев деревьев Западной Сибири. Предполагается, что одним из основных механизмов АОА биосубстратов является их

способность к прямой нейтрализации свободных радикалов. Радикал-связывающую активность (РСА) экстрактов оценивали с использованием 2,2-дифенилпикрилгидразила (DPPH). РСА экстрактов варьировала 2.2 до 56.0%.

Накапливаются также данные о том, что АОА биосубстратов связана со способностью хелатировать ионы металлов и, прежде всего, ионов железа. В наших опытах с феррозином хелатирующая активность экстрактов в тесте изменялась в пределах от 5.8 до 54.6%.

В тестах с E. coli определяли способность экстрактов снижать бактериостатическое и бактерицидное действие Н2О2, а также металл-хелатирующей способностью in vivo.

Коэффициенты корреляции определяемых параметров при исследовании свойств экстрактов из листьев деревьев находились в диапазоне от +0.40 до +0.85.

Выявлена связь между способностью экстрактов снижать бактерицидное действие Н2О2 и РСА, а также металл-хелатирующей способностью экстрактов in vitro (r = + 0.67, p > 0.01и r = + 0.55, p > 0.01, соответственно).

Особый интерес представляет обнаруженное прооксидантное действие экстрактов, которое выражалось в стимулирующем эффекте на экспрессию антиоксидантного гена katG, кодирующего каталазу, в отсутствие оксиданта. Примечательно, что этот эффект

коррелировал со способностью экстрактов снижать бактерицидное действие Н2О2 (r = + 0.80, p > 0.01), а также с РСА in vitro (r = + 0.59, p > 0.01).

Все изученные параметры у экстрактов из листьев деревьев были связаны с содержанием в них полифенолов (коэффициенты корреляции варьировали от + 0.60 до + 0.85).

Учитывая все исследованные показатели наибольшую АОА проявили экстракты из листьев деревьев кизильника, клена, ирги и миндаля. Средний уровень АОА отмечен у экстрактов спиреи, бузины, барбариса, сибирки, сирени и ивы. Слабым антиоксидантным действием обладали экстракты калины, жимолости, яблони, ракитника и караганы.

Работа выполнена при поддержке гранта РФФИ-Урал № 07-04-960030, гранта Президиума УрО РАН по программе интеграционных исследований с СО РАН и гранта Президиума УрО РАН для молодых ученых (2009 г.).

129

РОЛЬ ЛИПИДОВ В АНТИСТРЕССОВОЙ ЗАЩИТЕ МИЦЕЛИАЛЬНЫХ ГРИБОВ

Я. Э. Сергеева1, И. В. Конова1

, Л. А. Галанина1, , Г. А. Кочкина2

, Н. Е. Иванушкина2

, С. М. Озерская2, Е. П. Феофилова1

1Институт микробиологии им. С. Н. Виноградского РАН, Москва, Россия 2Институт биохимии и физиологии микроорганизмов им. Г. К. Скрябина РАН,

Пущино, Россия

Процессы адаптации включают генетические механизмы, синтез специфических белков, вариабельность энзимов, накопление в клетках микроорганизмов протекторных углеводов (в основном трегалозы и полиолов), а также таких известных осмопротекторов как пролин, бетаин и некоторые аминокислоты. В адаптационных процессах важная роль принадлежит и липидам, особенно локализованным в клеточных мембранах. Существенную адаптационную роль играет изменение жидкостности биомембран за счёт изменения адекватно внешнему сигналу молекулярной структуры жирных кислот, входящих в состав клеточных липидов. Согласно литературным данным, состав и соотношение индивидуальных фракций жирных кислот, особенно полиеновых, имеет широкое адаптационное значение в системной реакции клеток как прокариотных, так и эукариотных микроорганизмов на стрессовое воздействие среды обитания. Кроме того, в ходе адаптационных процессов к неблагоприятным условиям происходят изменения в относительном содержании отдельных фракций как нейтральных липидов (триглицеридов, стеринов, свободных жирных кислот), так и полярных липидов (фосфо- и гликолипидов).

На примере двух штаммов грибов Geomyces pannorum, выделенных из средней полосы РФ (штамм ВКМ F-3808) и из линзы криопэга Арктики (штамм ВКМ FW-2241) исследованы липогенная активность и состав жирных кислот в процессе роста культур как в нормальных условиях, так и в условиях стресса: гипотермии и гиперсолености, а также при совместном действии двух стрессовых факторов. В отсутствии стрессовых воздействий у штамма ВКМ FW-2241 по сравнению со штаммом ВКМ F-3808 наблюдали замедленный рост и мéньшую липогенную активность, различий в жирнокислотном профиле не отмечено. В условиях гипотермии в грибных липидах обоих штаммов в сумме жирных кислот почти вдвое снижается уровень короткоцепочечных (С12–С16) преимущественно насыщенных жирных кислот и адаптивной реакцией культур обоих штаммов на понижение температуры является усиление процессов десатурации. Выявлено, что повышение ненасыщенности происходит за счет увеличения содержания α-линоленовой кислоты (α-С18:3), в особенности у штамма ВКМ FW-2241. В условиях гиперсолености культуры вели себя по-разному: у штамма ВКМ F-3808 активизировались процессы элонгации жирных кислот первого этапа биогенеза (С16) в длинноцепочечные молекулы С18, снижалось содержание полиеновых кислот и увеличивался уровень насыщенной и моноеновой кислот С18 (в сумме составлявший 50.3%). В липидах же биомассы штамма ВКМ FW-2241 возрастало содержание ненасыщенных и полиненасыщенных жирных кислот, причем, этот рост обусловлен в основном содержанием линолевой кислоты (С18:2), возрастание количества которой является специфической реакцией изученной культуры на солевой стресс. При совместном воздействии гиперсолености и гипотермии соотношение кислот С18:2 и α-С18:3 занимает промежуточное

130

положение, что указывает на участие в этом случае двух механизмов адаптации, связанных с участием обеих кислот.

Таким образом, исследование показателей липогенеза сравниваемых штаммов, выделенных из различных экотопов и культивируемых в условиях воздействия стрессовых значений гипотермии, гиперсолености и совместного воздействия этих стрессорных факторов выявило, что тенденции адаптивных реакций клеток изучаемых штаммов G.

pannorum однотипны, однако степень толерантности их к стрессорному воздействию различна.

При изучении механизма действия консерванта пищевых изделий – сорбата калия (СК) на состав липидов основного контаминанта сыров гриба аскомицетного аффинитета Penicillium roqueforti установлено, что ингибирование роста гриба под действием СК сопряжено с изменением состава фосфолипидов (снижением содержания фосфатидилхолина и увеличением фосфатидилэтаноламина и фосфатидной кислоты) и нейтральных липидов (снижением содержания триглицеридов и стеринов и повышением количества свободных жирных кислот). Отмечено и изменения жирнокислотного состава липидов гриба: как в суммарных липидах, так и в их отдельных фракциях (триглицеридах и суммарных фосфолипидах) отмечено резко снижение уровня линолевой кислоты (С18:2) на фоне увеличения содержания олеиновой кислоты (С18:1). Это позволяет предположить, что СК влияет на активность ∆12 десатуразы, контролирующей у мицелиальных грибов основные реакции адаптации липидного бислоя к неблагоприятным воздействиям окружающей среды.

Работа выполнена при финансовой поддержке грантов РФФИ № 06-04-49229 и № 07-04-12005 офи.

БИОЛОГИЧЕСКИЕ СВОЙСТВА КОЛЛЕКЦИОННЫХ

И ВЫДЕЛЕННЫХ ИЗ ПРОБИОТИЧЕСКХ ПРОДУКТОВ

ШТАММОВ БИФИДОБАКТЕРИЙ

А. В. Сидоренко1, Г. И. Новик1

, Е. Ю. Эпова2, С. П. Синеокий2

ГНУ «Институт микробиологии НАН Беларуси», Минск, Беларусь ФГУП «Государственный научно-исследовательский институт генетики и селекции

промышленных микроорганизмов», Москва, Россия

Изучение биологических свойств бифидобактерий с целью отбора биотехнологически перспективных штаммов имеет большое практическое значение.

Изучены биологические свойства 14 коллекционных и 5 выделенных из пробиотических продуктов штаммов бифидобактерий. Из них 5 штаммов B. adolescentis, 2 – B. angulatum, 3 – B. animalis ssp. lactis, 3 – B. longum ssp. infantis, 6 – B. bifidum. Для селективного выделения бифидобактерий использовали среду МРС с добавлением

L-цистеина (0.5 г/л), хлорида лития (2 г/л) и пропионата натрия (3 г/л). Идентификацию культур проводили по совокупности морфологических, культуральных и физиолого-биохимических признаков, а также на основании данных определения нуклеотидной последовательности гена 16S рРНК. Из выделенных 20 штаммов только 5 культур принадлежало к роду Bifidobacterium, из них 2 штамма идентифицировано как B. animalis

131

ssp. lactis (N-5 и N-6), по 1 штамму B. angulatum (N-10), B. bifidum (N-20), B. longum ssp. infantis (N-1). Все бифидобактерии, за исключением B. angulatum AC 1714 и N-10, сквашивали стерильное обезжиренное молоко через 10–20 часов культивирования, в зависимости от штамма, с образованием однородного сгустка без отделения сыворотки. Максимальные показатели титра клеток (4–8 × 109 КОЕ/мл) и активной кислотности (рН 3.8–4.2) на момент образования сгустка отмечались для штаммов B. animalis ssp. lactis, для штаммов других видов варьировали в пределах 1–9 × 108 КОЕ/мл и рН 4.1–4.9. Штаммы

B. angulatum не сквашивали стерильное молоко, титр клеток и показатель активной кислотности через 28 часов культивирования составляли 6–7 × 106 КОЕ/мл и рН 6.1–6.7. Штаммы бифидобактерий существенно различались по активности ассоциированной с клеткой β-галактозидазы. При использовании в качестве источника углерода глюкозы наибольшие показатели активности фермента регистрировались для 2 штаммов B. adolescentis (0.270 и 0.296 ед/мл), 1 – B. longum ssp. infantis (0.347 ед/мл), 2 – B. bifidum (0.266 и 0.305 ед/мл), наименьшие – 1 штамма B. bifidum и B. angulatum (0.011 и 0.015 ед/мл, соответственно), для остальных культур варьировали в пределах 0.036–0.094 ед/мл. При использовании в качестве источника углерода лактозы максимальная активность β-галактозидазы отмечалась для 3 штаммов B. adolescentis (0.417, 0.438 и 0.476 ед/мл), наименьшая – для штаммов B. angulatum (0.085 и 0.161 ед/мл), для остальных штаммов варьировала в пределах 0.214–0.356 ед/мл. Все штаммы продуцировали внеклеточные протеолитические ферменты. Наиболее высокий уровень продукции протеиназ отмечался у штамма B. bifidum N-20 (355.6±8.6 ед/мл), для остальных культур варьировал в пределах

15–109 ед/мл. Следует отметить, что активность β-галактозидазы и внеклеточных протеиназ не зависела от видовой принадлежности культур, а являлась характеристикой конкретного штамма. Бифидобактерии существенно различались по способности к росту в присутствие высоких концентраций кислорода. Максимальные показатели накопления биомассы

(ОП600 1.244–1.840) отмечались для штаммов B. animalis ssp. lactis, для остальных культур варьировали в пределах ОП600 0.020–0.800, в зависимости от штамма. Все бифидобактерии характеризовались чувствительностью к хлориду натрия. Присутствие в среде культивирования 2% NaCl приводило к снижению показателя накопления биомассы бифидобактерий на 41–80%, в зависимости от штаммовой принадлежности. Наиболее устойчивыми к кислотному стрессу оказались штаммы B. animalis ssp. lactis, титр клеток которых через 180 минут инкубации при рН 2.0 снижался на 2 порядка, в то время как количество жизнеспособных клеток других бифидобактерий снижалось на 3–5 порядков, в зависимости от штаммовой принадлежности. При хранении бифидобактерий в сквашенном молоке (28 суток) и питательной среде без нейтрализации (70 суток) при +4°С титр клеток 3 штаммов B. animalis ssp. lactis и B. bifidum N-20 снижался менее чем на порядок, для других культур количество жизнеспособных клеток уменьшалось на 3–6 порядков, в зависимости от штамма. Коэффициент гидрофобности поверхности клетки не зависел от видовой принадлежности бифидобактерий, являлся характеристикой конкретного штамма и варьировал в пределах 0–44.7%. Исключение составили штаммы B. animalis ssp. lactis, для которых регистрировались более высокие (52.2–56.8%) показатели гидрофобности. Коэффициент аутоаггрегации у разных штаммов бифидобактерий варьировал в пределах

4.4–19.5%. Бифидобактерии существенно различались уровнем антагонизма по отношению к

132

тест-культурам Bacillus cereus БИМ В-108, В-169, B. subtilis БИМ В-25, В-276, Escherichia

coli БИМ В-238, В-379, Pseudomonas aeruginosa БИМ В-153, 155. Все штаммы проявляли высокую антагонистическую активность в отношении P. aeruginosa БИМ В-153 и В-155. Штамм B. bifidum N-20 характеризовался наиболее высоким уровнем антагонизма по отношению ко всем исследуемым тест-культурам.

Таким образом, биологические свойства бифидобактерий, важные для их использования в составе пробиотических продуктов, являются характеристикой конкретных штаммов и практически не зависят от их видовой принадлежности. Штаммы бифидобактерий, выделенные из пробиотических препаратов и кисломолочных продуктов, были более устойчивы к стрессовым воздействиям по сравнению с коллекционными культурами.

ИСПОЛЬЗОВАНИЕ НОВОГО КОМПЛЕКСА БИОПЕСТИЦИД–ГИДРОГУМАТ

ДЛЯ ЗАЩИТЫ РАСТЕНИЙ ОТ ФИТОПАТОГЕННЫХ МИКРООРГАНИЗМОВ

Т. Л. Скакун, Д. В. Маслак, В. А. Смирнова, Н. П. Максимова

Белорусский государственный университет, Минск, Беларусь В настоящее время актуальной задачей является создание эффективных и безвредных

биологических средств защиты и стимуляции роста сельскохозяйственных культур в процессе возделывания. Наиболее перспективными средствами защиты растений являются полифункциональные биопрепараты, главная роль среди которых принадлежит препаратам микробного происхождения на основе живых культур микроорганизмов. Существенным преимуществом технологий, основанных на использовании бактериальных и гуминовых препаратов, является снижение затрат на химические средства защиты растений. Немаловажно, что при этом решается комплекс экологических проблем, обусловленных ведением интенсивного земледелия. Однако, одним из основных недостатков применяемых в настоящее время биопрепаратов является малый срок хранения (2–3 месяца), что ограничивает объем производства и сроки реализации продукции.

В настоящее время разрабатывается новый высокоэффективный полифункциональный комплексный препарат на основе продуктов переработки торфа и культуры ризосферных бактерий для стимуляции роста растений, улучшения их минерального питания и защиты от болезней различной этиологии, пригодный для длительного хранения (до 12–18 месяцев).

Эксперименты по оценке способности нового комплексного биопрепарата подавлять развитие заболеваний овощных культур проводились в лабораторных условиях – в светотеплице при температуре 22°С и 10-ти часовом фотопериоде. Инфекционный фон создавался искусственно, путем внесения в почвогрунт суспензии фитопатогена (10% от объема почвы). Для приготовления суспензии фитопатогенные грибы (Alternaria spp.,

Botritis spp., Fusarium spp.) культивировали при 21°С с аэрацией в жидкой картофельной среде в течение 10 суток, Pseudomonas corrugata – в течение 48 ч.

Семена овощных культур – капусты белокочанной сорта «Июньская», огурцов сорта «Парижский корнишон» и томатов сорта «Ляна» замачивали в течение 1 ч в рабочем растворе препарата (разведение 1 : 100 водой), а затем 48 ч выдерживали при 21°С для

133

прорастания семян. Проросшие семена высаживали в инфицированную фитопатогенами почву. Обработка опытных растений биопрепаратом проводилась трехкратно – полив рассады под корень рабочим раствором на стадии двух настоящих листьев (разведение 1 : 1000 водой), двукратное опрыскивание растений рабочим раствором препарата с интервалом в две недели (разведение 1 : 1000 водой). В контрольных вариантах аналогичная обработка проводилась водой.

Результаты проведенных экспериментов продемонстрировали высокую фитозащитную активность разрабатываемого комплексного биопестицида, созданного на основе гидрогумата торфа и бактерий Pseudomonas aureofaciens. Максимальный биологический эффект препарат проявил по отношению к Botritis spp. У растений томатов обработанных препаратом биомасса корневой системы в 13,07, а стеблей в 6,99 раз превышала таковую контрольных вариантов. Для растений огурцов данные показатели составляли 3,3 и 3,19 раза, а для капусты – 2,0 и 1,33 раза соответственно. Кроме того, разрабатываемый комплексный препарат эффективно подавлял развитие Fusarium spp. и P. corrugata на томатах. Сухая биомасса корней возрастала в опыте по сравнению с контролем в 1,85 и 5,9, а биомасса стеблей – в 4,2 и 4,6 раз соответственно. У растений огурцов, пораженных Alternaria spp. обработка биопрепаратом позволила на 37% увеличить сухую биомассу корневой системы и на 30% – стеблей. Необходимо отметить, что обработка растений овощных культур комплексом биопестицид-гидрогумат не только уменьшало признаки поражения растений фитопатогенами, но и снижало гибель растений (максимально значение – снижение гибели растений капусты на 57%).

Таким образом, разрабатываемый комплексный биопестицид на основе гидрогумата торфа и бактерий P. aureofaciens продемонстрировал высокую способность подавлять развитие заболеваний основных овощных культу, что делает его перспективным для внедрения в сельскохозяйственную практику.

134

ВЛИЯНИЕ СОВМЕСТНОЙ ПРЕДПОСЕВНОЙ ОБРАБОТКИ СЕМЯН

АССОЦИАТИВНЫМИ АЗОТФИКСИРУЮЩИМИ

И ФОСФАТМОБИЛИЗУЮЩИМИ БАКТЕРИЯМИ

НА РОСТ И РАЗВИТИЕ ТРИТИКАЛЕ

Е. А. Соловьёва, Л. Е. Картыжова, З. М. Алещенкова

ГНУ «Институт микробиологии НАН Беларуси», Минск, Беларусь

Создание и применение комплексных микробных препаратов, основу которых составляют штаммы ризобактерий с несколькими хозяйственно-ценными свойствами, – приоритетное направление новых биотехнологий в сельском хозяйстве. Одной из важнейших зерновых культур, успешно возделываемых в Беларуси, является тритикале. В настоящее время наметилась тенденция снижения доз применяемых минеральных удобрений и возросла роль технологий, направленных на поддержание естественного плодородия почв и увеличение биоразнообразия почвенной микрофлоры. Интродукция полезных микроорганизмов при возделывании зерновых культур способствует пополнению микробоценоза и активизации жизнедеятельности его основных эколого-трофических групп. Хорошо изучено влияние совместной инокуляции семян различными микроорганизмами на продуктивность бобовых культур. Известно, что при использовании консорциума полезных микроорганизмов, состоящего из азотфиксирующих и фосфатмобилизующих бактерий, за счет дополнительных источников азота и фосфора происходит стимуляция роста и развития растений.

Ранее нами было установлено эффективное действие моноинокуляции выделенными местными штаммами ассоциативных диазотрофов (Pseudomonas sp. 10, Agrobacterium sp. 17) и фосфатмобилизующих бактерий (Bacillus sp. 7) на рост и развитие тритикале. Целью настоящих исследований было изучение и оценка эффективности применения совместной предпосевной обработки семян тритикале ассоциативными азотфиксаторами и фосфатмобилизующими бактериями по сравнению с моноинокуляцией.

Исследования проводились в микровегетационном опыте с яровым тритикале сорта Лана в сосудах, содержащих 0,4 кг стерильной почвенно-торфяной смеси (3:1). Норма высева семян – 40 шт./сосуд. Обработку семян осуществляли водной бактериальной суспензией ассоциативных диазотрофов (Pseudomonas sp. 10, Agrobacterium sp. 17), выделенных из ризопланы тритикале, и фосфатмобилизующего штамма (Bacillus sp. 7), выделенного из дерново-подзолистой почвы. Титр клеток составлял не менее 108 КОЕ/мл.

Влияние предпосевной обработки семян исследуемыми штаммами на рост и развитие тритикале оценивали в течение 3 месяцев по следующим показателям: высота растений, вес зеленой массы (сух. в-во). Нитрогеназную активность определяли ацетиленовым методом.

В лабораторных условиях установлено, что применение моноинокуляции семян тритикале ассоциативными азотфиксаторами стимулирует рост и развитие растений. Контрольные растения отстают по высоте на 2–10,5% от растений тритикале в варианте с моноинокуляцией. Максимальный ростстимулирующий эффект отмечен при инокуляции семян асооциативным диазотрофом Pseudomonas sp. 10.

135

К концу 3 месяца роста тритикале установлено, что совместная инокуляция семян ассоциативными азотфиксаторами совместно с фосфатмобилизующими бактериями оказывала стимулирующее действие на рост растений в высоту. По сравнению с контрольным вариантом (без инокуляции) высота инокулированных растений увеличилась на 6,5% (Pseudomonas sp.10 + Bacillus sp.7) и 12,7% (Agrobacterium sp. 17 + Bacillus sp. 7), а фитомасса – на 5,9% и 28,5%, соответственно.

Показатели азотфиксирующей активности растений и почвы за счет совместной обработки семян тритикале азотфиксирующими и фосфатмобилизующими бактериями увеличиваются по сравнению с контрольными (без инокуляции) и коррелируют с биометрическими показателями растений. Максимальная азотфиксирующая активность установлена при обработке семян тритикале ассоциативным диазотрофом Pseudomonas sp.10 и фосфатмобилизующим штаммом Bacillus sp. 7. Необходимо отметить, что биологическая фиксация азота при использовании совместной обработки семян тритикале ассоциативным диазотрофом Agrobacterium sp. 17 и фосфатмобилизующим штаммом Bacillus sp. 7 ниже по сравнению с применением диазотрофа Pseudomonas sp. 10 и фосфатмобилизующего штамма Bacillus sp. 7.

Установлено, что при совместной обработки семян тритикале диазотрофными и фосфатмобилизующими бактериями биометрические показатели растений, азотфиксирующая способность исследуемых штаммов в ассоциации с растением и в почве незначительно снижаются по сравнению с моноинокуляцией, однако заметно превышают контрольные показатели (без инокуляции).

Полученные результаты показывают, что предпосевная обработка семян тритикале ассоциативными диазотрофами и фосфатмобилизующими бактериями, увеличивая обеспеченность растений азотом и фосфором, благоприятно влияет на их рост.

ВЗАИМОДЕЙСТВИЕ НЕФТЕОКИСЛИТЕЛЯ DIETSIA SP.

С ГАЛОФИЛЬНЫМИ СПУТНИКАМИ В СОСТАВЕ

БИНАРНЫХ БИОПЛЕНОК

Е. А. Стрелкова, М. В. Журина, В. К. Плакунов

Институт микробиологии им. С.Н. Виноградского РАН, Москва, Россия

Ранее нами были разработаны методы частичной реконструкции из пластовых вод нефтяных месторождений микробных биопленок, включающих, наиболее тесно взаимодействующие микроорганизмы [1]. Из реконструированных биопленок изолированы входящие в одни и те же ассоциации чистые культуры нефтеокисляющих бактерий и их спутников, неспособных к окислению парафинов. Определена родовая принадлежность некоторых нефтеокислителей (Dietzia, Rhodococcus) и их спутников (Chromohalobacter,

Brevundimonas) [1,2]. Впервые продемонстрирована защитная роль галофильного спутника (Chromohalobacter sp.) (пределы роста 5–25% NaCl) в сообществе с галотолерантным нефтеокисляющим микроорганизмом (Dietzia sp.) (пределы роста 0–10% NaCl) в условиях гиперосмотического шока и, таким образом, выявлен механизм, обусловливающий существование устойчивой ассоциации спутника (способного к синтезу и экскреции

136

осмопротекторного вещества) и нефтеокислителя (поглощающего это вещество из внешней среды). Идентифицированы главные осмопротекторные соединения, образуемые галотолерантным нефтеокислителем Dietzia sp. (глицинбетаин), а также его галофильными спутниками Chromohalobacter sp. и штаммом 8214 (эктоин).

Одним из последствий формирования структурированных микробных сообществ (биопленок) является изменение пула экспрессируемых генов или масштаба их экспресии (возникновение «биопленочного» фенотипа). Обычно в биопленке между ее микробными компонентами устанавливаются протокооперативные взаимоотношения, которые, например, проявляются в стимуляции спутником (Brevundimonas sp.) парафинокисляющей активности Dietzia sp. в ответ на снабжение спутника продуктами окисления нефти [2]. Поскольку галофильный спутник Chromohalobacter sp. оказывает в условиях гиперосмотического (для нефтеокислителя Dietzia sp.) шока защитное действие, которое, как можно полагать, обусловлено образованием осмопротектора эктоина, поглощаемого нефтеокислителем, следует ожидать, что в этих условиях у спутника (Chromohalobacter sp.) экспрессируемость генов, определяющих биосинтез эктоина, будет увеличиваться. Поэтому содержание осмопротектора в бинарной биопленке должно быть выше, чем в биопленке, формируемой одним галофилом. Необходимо иметь в виду, что количественная оценка накопления эктоина – более показательный метод для определения активности биосинтетических генов, чем детекция их транскрипции или трансляции молекулярно-биологическими методами в связи с многоступенчатостью пути биосинтеза эктоина. При этом из-за множественной регуляции на разных этапах данного пути, синтез и/или активность отдельных ферментов может ограничиваться или блокироваться. Уровень накопления эктоина дает более корректную количественную оценку функционирования всего пути биосинтеза в конкретных физиологических условиях.

Как показал сравнительный хроматографический анализ экстрактов биопленок, сформированных из одного спутника (Chromohalobacter sp.) или из смеси спутника с нефтеокислителем (Dietzia sp.) на среде LB содержащей 10% NaCl, в присутствии нефтеокислителя содержание эктоина увеличивается в 1.3–1.6 раза. Механизм этого эффекта связан с тем, что часть эктоина, образуемого галофилом Chromohalobacter sp., поглощается галотолерантным нефтеокислителем Dietzia sp., поскольку глицинбетаин и эктоин имеют общую транспортную систему [3]. Это приводит к снижению внеклеточного уровня эктоина в биопленке, что, в свою очередь, дерепрессирует систему биосинтеза эктоина, как показано ранее для Chromohalobacter salexigens [4]. Ограничение масштаба повышения уровня эктоина в бинарной биопленке определяется тем количеством эктоина, которое должно накопиться в клетках галотолеранта для осуществления осмопротекции, после чего избыток эктоина вновь блокирует собственный биосинтез путем включения регуляторных механизмов.

Аналогичное возрастание биосинтеза эктоина (и возможно, гидроксиэктоина) в бинарных биопленках, включающих нефтеокислитель Dietzia sp., обнаружено для другого галофильного спутника (штамм 8214), изолированного из того же экотопа.

Таким образом, раскрыта одна из возможных причин существования распространенных в природных условиях ассоциаций галофильных (способных к синтезу и экскреции

137

осмопротекторных веществ) и галотолерантных микроорганизмов, поглощающих эти вещества из внешней среды. 1. В.К. Плакунов, М.В. Журина, С.С. Беляев. Устойчивость нефтеокисляющего

микроорганизма Dietzia sp. к гиперосмотическому шоку в реконструированных биопленках // Микробиология. 2008. Т.77. № 5. С. 581-589.

2. М.В. Журина, Е.А. Стрелкова, В.К. Плакунов, С.С. Беляев. Влияние состава реконструированных биопленок на активность парафинокисляющих бактерий // Микробиология.2008. Т. 77. № 5. С. 701-703.

3. A. Onraedt, M. De May, B. Walcarius, W. Soetaert, Transport kinetics of ectoine, an osmolite produced by Brevibacterium epidermis // Biotechnology Lett. 2006. V. 28. P. 1741-1747.

4. M.I. Calderon, et al., Complex regulation of the synthesis of the compatible solute ectoine in the halophilic bacterium Chromohalobacter salexigens DSM 3043 // Microbiology. 2004. V. 150. P. 3051-3063.

СТИМУЛЯЦИЯ РОСТА ОВОЩНЫХ КУЛЬТУР

КОМПЛЕКСОМ БИОПЕСТИЦИД–ЛИГНОГУМАТ

И. Н. Феклистова, И. В. Можарова, Л. Е. Садовская

Белорусский государственный университет, Минск, Беларусь В настоящее время регуляторы роста растений входят в комплекс обязательных

мероприятий по возделыванию различных культур. Чаще всего фитогормоны применяются для стимулирования прорастания семян и клубней, ускорения корнеобразования и созревания, управления процессами цветения, формирования плодов, повышения урожайности, морозо- и солеустойчивости, регулирования состояния покоя и т.д. Сфера использования регуляторов роста постоянно расширяется, что определяет потребность в разработке новых высокоактивных соединений. Большинство регуляторов роста растений – синтетические соединения, однако все большее внимание привлекают микробные метаболиты, обладающие ростостимулирующей активностью. Недавно на основе живых бактерий рода Pseudomonas aurantiaca был разработан новый биопестицидный препарат «Аурин» (ТУ BY 300042160.012-2009), предназначенный как для защиты сельскохозяйственных культур от фитопатогенов, так и для стимуляции роста растений [1]. Также был разработан новый способ увеличения сроков хранения этого биопрепарата с использованием гуминового удобрения Лигногумат марок Б натриевый и БМ калийный (0,5 %) [2].

Целью настоящей работы являлось изучение ростостимулирующей активности комплекса биопестицид «Аурин»–Лигногумат в отношении ряда овощных культур. Обработку семян растений (капуста «Дитморская ранняя», огурцы «Свитанок», томаты «Ляна», салат «Королева лета») 1 %-ным раствором комплекса биопестицид–Лигногумат проводили согласно [1], массу растений определяли на стадии 2-х настоящих листьев. В качестве контроля при обработке растений вместо препарат использовали питательную

138

среду для выращивания бактерий P. aurantiaca в соответствующем разведении. Также вариантами опыта являлась обработка семян биопестицидом «Аурин» и Лигногуматом, взятыми по отдельности в той же концентрации.

Результаты экспериментов показали, что комплекс «Аурин»–Лигногумат обладает стимулирующей активностью в отношении как корней, так и проростков растений. Установлено, что масса проростков растений при обработке комплексом препаратов увеличивалась на 19–20% у огурцов и капусты и на 27–29% у салата и томатов. В то же время наблюдалось увеличение массы корней на 26–27% у капусты и огурцов, на 53% у томатов и 74% у салата. Такое существенное изменение массы корневой системы растений (особенно на ранних этапах развития) имеет огромное значение для его питания и дальнейшего роста. Следует отметить, что масса проростков и корней растений, семена которых были обработаны только «Аурином» или Лигногуматом, была меньше таковой растений, обработанных комплексом препаратов, что свидетельствует об усилении их полезных свойств при совместном применении.

Ранее нами было установлено, что стимуляция роста растений биопестицидом «Аурин» возможны благодаря синтезу бактериями, входящими в его состав, гиббереллинов, ауксинов и цитокининов [3]. Лигногумат же является гуминовым удобрением с микроэлементами в хелатной форме со свойствами регулятора роста и антистрессанта [4].

Таким образом, установлено, что обработка семян овощных культур комплексом биопестицид «Аурин»–Лигногумат приводит к достоверному увеличению массы корней и проростков растений.

1. Феклистова И.Н., Максимова Н.П. Бактерии P. aurantiaca B-162 как основа

биопрепарата для защиты растений // Земляробства i ахова раслiн.–2006.–№ 2.–С. 42–44.

2. Feklistova I.N., Maslak D.V., Maksimova N.P. New method of extending the expiry date of biopesticides „nemacide“ and „aurine“ by using lignohumate // World of Lignohumate. – 2009.– May-June. P. 7-10.

3. Феклистова И.Н., Максимова Н.П. Характеристика гиббереллинов, синтезируемых бактериями P. aurantiaca B-162 // Бюллетень Московского общества испытателей природы. Отд. биол.–2009.–Т. 114, Вып. 2.–С. 110-112.

4. http://www.humate.spb.ru

139

ВЛИЯНИЕ ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОЙ АДАПТАЦИИ

СООБЩЕСТВ ХЕМОЛИТОТРОФНЫХ МИКРООРГАНИЗМОВ

К ПЛОТНОСТИ ПУЛЬПЫ НА ИХ ОКИСЛИТЕЛЬНУЮ АКТИВНОСТЬ

Т. С. Хайнасова, О. О. Левенец

Научно-исследовательский геотехнологический центр ДВО РАН, Россия

Получение высокоактивных штаммов бактерий в отношении окисления двухвалентного железа, восстановленных соединений серы и сульфидных минералов является одной из важнейших задач в интенсификации бактериально-химических процессов переработки минерального сырья. Выявление периода естественной адаптации микроорганизмов к необходимым промышленным условиям позволяет сократить срок подготовки культуры к бактериальному окислению выщелачиваемого субстрата.

На сегодняшний день одним из способов, интенсифицирующих процесс выщелачивания целевых компонентов из руд, является использование автохтонных сообществ. Нами была исследована адаптация автохтонных сообществ, выделенных из сульфидной руды кобальт-медно-никелевого месторождения Шануч (Западная Камчатка), к последовательному увеличению плотности пульпы и бактериально-химическое выщелачивание (БХВ) руды адаптированными сообществами. Цель проведенной работы заключалась в выяснении сроков адаптации и определении плотности пульпы, при которой адаптация еще необходима. В работе использовали два сообщества ацидофильных хемолитотрофных микроорганизмов, выделенных из окисленной руды (ОК) и из неокисленной руды, измельченной до 44 мкм (М-44).

Адаптацию проводили в реакторе с механическим перемешиванием в жидкой питательной среде 9К без железа с добавлением сульфидной руды кобальт-медно-никелевого месторождения Шануч (степень измельчения руды 95% ± 100 мкм). Процесс включал три последовательных этапа: 1) адаптация к плотности пульпы т : ж = 1 : 50 (1,96%); 2) адаптация к т : ж = 1 : 20 (4,76%); 3) адаптация к т:ж = 1:10 (9,09%). Соотношение микробной культуры к используемой питательной среде составляло 1:2. Температура = 28–30°С. Начальное значение рН жидкой фазы пульпы доводили до 1,8–1,9 при помощи 10N H2SO4. В ходе эксперимента пульпу не подкисляли. В ходе процесса контролировали следующие параметры: рН, Eh, численность микроорганизмов, Fe2+/Fe3+, Ni2+, Cu2+, Co2+. О завершении адаптации сообществ судили по стабилизации рН, Eh, численности микроорганизмов, соотношения Fe2+/Fe3+. Культуры, адаптированные к плотности пульпы т : ж = 1 : 10 (9,09%), далее были направлены на бактериально-химическое выщелачивание при той же плотности пульпы и в тех же условиях.

Предварительная адаптация к плотности пульпы позволила повысить активность сероокисляющих микроорганизмов обоих сообществ, что отразилось в ускорении снижения рН пульпы. Адаптация положительно повлияла и на активность железоокисляющей компоненты микробного сообщества М-44: активный прирост Fe3+ при БХВ начался гораздо раньше (3 сут.), по сравнению с адаптацией к т : ж = 1 : 10 (14 сут.). После адаптации к плотности пульпы т : ж = 1 : 50 выход Ni2+ в процессе выращивания микробных культур при

140

т : ж = 1 : 20 увеличился, в среднем, на 25–30%. При переходе к плотности т : ж = 1 : 10 выход Ni2+ изменился незначительно.

Время адаптации сообщества ОК к каждой плотности пульпы составило 9–14 суток. Выход Ni2+ в процессе БХВ после адаптации сообщества ОК к т : ж = 1 : 10 уменьшился на 10%. По-видимому, данное сообщество целесообразно использовать в БХВ при плотности пульпы т : ж = 1 : 10 сразу после адаптации к т : ж = 1 : 20. Адаптация М-44 занимала более длительное время (17–18 суток). Однако выход Ni2+ в процессе БХВ после адаптации сообщества М-44 к т : ж = 1 : 10 увеличился на 12%.

Таким образом, данный эксперимент позволил выяснить время адаптационного периода использованных сообществ. Ключевым моментом в адаптации микробных культур являлся переход от плотности пульпы т : ж = 1 : 50 к т : ж = 1 : 20, когда наблюдали максимальное увеличение выхода Ni2+. Сообщество ОК было готово к использованию в процессах БХВ при т : ж = 1 : 10 сразу после адаптации к т : ж = 1 : 20. Сообществу М-44 для большей эффективности в БХВ при т : ж = 1 : 10 была необходима предварительная адаптация к данной плотности пульпы.

ИССЛЕДОВАНИЕ ЖИЗНЕСПОСОБНОСТИ

ШТАММА BACILLUS SUBTILIS 26 Д

В БАКОВЫХ СМЕСЯХ С ПЕСТИЦИДАМИ

А. В. Широков1, Е. Ю. Лобастова1

, Л. И. Пусенкова1, Т. С. Тропынина2

1ГНУ Башкирский НИИ Сельского хозяйства Россельхозакадемии, Уфа, Россия 2Учреждение Российской академии наук

Институт биологии Уфимского научного центра РАН, Уфа, Россия

Одним из перспективных направлений в современном сельскохозяйственном производстве является использование биологических препаратов различных классов. Биопрепараты используются для стимуляции иммунной системы растений, повышения урожайности с/х культур и борьбы с патогенными микроорганизмами. Особое значение биопрепараты приобретают при хранении продукции и сырья, так как применение химических средств в этих условиях сильно ограничено.

Главной проблемой применения биопрепаратов является отсутствие детально разработанной технологии их применения. Ограниченные возможности производителей с/х продукции заставляют приспосабливать (встраивать) биопрепараты в уже существующие технологические схемы выращивания культурных растений. Поэтому биопрепараты используются как компонент баковых смесей при обработке вегетирующих растений пестицидами. Это является вынужденной мерой, однако с этим приходится мириться.

Задача нашего исследования - определение жизнеспособности штамма Bacillus subtilis 26Д, который является основой биопрепарата «Фитоспорин» в составе модельной баковой смеси с некоторыми пестицидами, применяемыми в республике Башкортостан. Биопрепарат «Фитоспорин» предназначен для увеличения урожайности и защиты от патогенов сахарной свеклы и картофеля, как во время вегетации, так и при хранении.

141

Таблица 1. Список пестицидов, которые были использованы в эксперименте

№ Коммерческое

название

Действующее

вещество

Назначение Норма расхода препарата

(рабочей жидкости)

1 Клео Клопиралид Гербицид 120 г/га (200–300 л/га) 2 Лонтрел Клопиралид Гербицид 0,3–0,5 л/га (200–300 л/га) 3 Клетодим+Микс Клетодим Гербицид 0,2–1,0 л/га (200–300 л/га) 4 Агритокс МЦПА Гербицид 1,2 л/га (200–300 л/га) 5 Зенкор Метрибузин Гербицид 0,7–1,4 кг/га (200–300 л/га) 6 Регент Фипронил Инсектицид 0,02–0,025 кг/га (10л/100м2)

7 Актара Тиаметоксам Инсектицид 0,06–0.08 кг/га (200–400 л/га) 8 Круйзер Тиаметоксам Инсектицид 8,0–12,0 л/т (до 20л/т) 9 Барьер Колор Тебуконазол Фунгицид 0,4–0,5 л/т (10 л/т)

10 ТМТД-Плюс Тирам Фунгицид 2,5 л/т (10 л/т) 11 Максим Флудиоксонил Фунгицид 10 л/т

Модельную баковую смесь готовили следующим образом. В колбу объемом 250 мл со

стерильным физраствором (100 мл) вносили 1 мл концентрированного биопрепарата «Фитоспорин», затем добавляли пестициды в зависимости от рекомендованной концентрации для сахарной свеклы. Далее производили посевы (в 3-х кратной повторности) на картофельно-глюкозную агаризованную питательную среду и определяли титр жизнеспособных клеток и спор штамма B. subtilis 26Д, время экспозиции 1 ч, 4 ч, 24 ч, 72 ч, усредненные экспериментальные данные представлены в Таблице 2.

Таблица 2. Количество (титр) жизнеспособных клеток и спор штамма B. subtilis 26Д

при взаимодействии с различными пестицидами в составе модельной баковой смеси.

№ Коммерческое

название

1ч. 4ч. 24ч. 72ч.

КОЕ/мл % КОЕ/мл % КОЕ/мл % КОЕ/мл %

1 Контроль 2,5*108 100 Не изменился в течение всего эксперимента 2 Клео* 1,5*108 60 1*108 40 4,2*107 17 2,5*107 10

3 Лонтрел* 1,45*108 58 9*107 36 4*107 16 2,3*107 9

4 Клетодим+Микс 9*107 40 6,5*107 25 3,5*107 14 2,7*107 11

5 Агритокс 1,2*108 45 2,5*107 10 1,4*107 5,5 1,2*107 4

6 Зенкор 6*107 24 3,6*107 15 3*107 12 2,5*107 10

7 Регент 1*108 40 3*107 12 1,5*107 6 1,2*107 ~5

8 Актара** 1,8*108 72 7,5*107 30 4*107 16 3*107 12

9 Круйзер** 1,5*108 60 6*107 25 3,5*107 14 2,5*107 10

10 Барьер Колор 2*108 80 7*107 28 3*107 12 2*107 8

11 ТМТД-Плюс 2,3*108 90 2,1*108 84 2*108 80 1,9*108 76

12 Максим 1*108 40 6*107 24 2,5*107 10 8*106 ~3

Примечание: Пестициды, имеющие одно и то же действующее вещество, были включены в эксперимент для сравнения их препаративных форм (жидкость или порошок).

142

Таким образом, биопрепарат «Фитоспорин» (за исключением варианта с ТМТД) не совместим с указанными пестицидами (такое предположение можно сделать и относительно других биопрепаратов на основе живых клеток и спор), и при внесении его в баковые смеси происходит значительная инактивация клеток штамма B. subtilis 26Д, которая напрямую связана со временем экспозиции. Поверхностное внесение препарата приводит к его нерациональному распылению, а из анализа отечественных и иностранных литературных источников следует, что наиболее эффективным способом применения биопрепаратов является замачивание семян и интродукция в ризосферу растения.

Следовательно, для повышения эффективности использования биопрепаратов необходимо осуществить корректировку способов их внесения, и по возможности минимизировать время контакта с пестицидами при невозможности изменения технологической схемы выращивания с/х культур. Это можно осуществить при непосредственном внесении препарата в баковую смесь перед ее распылением на растения, в этом случае время контакта должно быть ограничено в пределах 0,5–1,5 часа.

ОПТИМИЗАЦИЯ УСЛОВИЙ НИЗКОТЕМПЕРАТУРНОГО ХРАНЕНИЯ

ДРОЖЖЕЙ ВИДА DEBARYOMYCES HANSENII

И. И. Шуниборова, Г. И. Новик, Д. В.Рахуба

Институт микробиологии НАН Беларуси, Минск, Беларусь В последнее время широкое применение получили культуры дрожжей молочнокислого

брожения, используемые в пищевой промышленности, в различных отраслях сельского хозяйства и медицине, поэтому возникает необходимость эффективного хранения производственных и коллекционных штаммов [2, 3]. Криоконсервация является наиболее надежным и перспективным способом хранения микроорганизмов, обеспечивающим генетическую стабильность, сохранность жизнеспособности, морфологических и функциональных свойств культур в течение длительного времени [1, 4, 5]. Одним из важнейших факторов, определяющих успешность криоконсервации биологических объектов, является выбор режима замораживания и подбор криопротекторных сред.

Объектом исследований служили штаммы дрожжей вида Debaryomyces hansenii, выделенные из кислого молока и депонированные в фонде Научной коллекции типовых и промышленно-ценных непатогенных микроорганизмов Института микробиологии НАН Беларуси. Исследования проводили с использованием трех режимов замораживания: охлаждение до –20°С, –70°С, –196°С. В качестве защитных составов консервирования дрожжевых клеток использовали стерильную среду культивирования (жидкое пивное сусло) и 10% растворы сахарозы и глицерола. Установлено, что сахароза оказывает выраженное защитное действие при всех режимах замораживания. Показатели накопления биомассы в вариантах опытов соответствовали контролю. При замораживании клеток дрожжей в присутствии глицерола и среды культивирования уровень выживаемости клеток был ниже.

Анализ криоповреждений клеток с использованием метода электронной микроскопии показал, что под влиянием кратковременного замораживания, морфология молочных дрожжей претерпевает определенные изменения. В ряде случаев при криоконсервации

143

наблюдалось отслоение цитоплазматической мембраны от клеточной стенки, разрыхление или частичная деструкция клеточных стенок, сопровождающаяся изменением формы клеток. При наличии деструктивных изменений клеточной стенки дрожжей цитоплазматическая мембрана, сохраняя видимую целостность, становилась неровной, образуя впячивания и инвагинации, вследствие уменьшения объема содержимого клетки. Также в криоконсервированных препаратах дрожжей D. hansenii возрастало количество разрушенных клеток, присутствовали клетки со значительными разрывами клеточной стенки, утратившие внутреннее содержимое.

Таким образом, при хранении микроорганизмов с использованием низкотемпературного консервирования для обеспечения высокого уровня сохранения жизнеспособности клеток необходим подбор оптимальных протекторных сред. При получении высокоэффективных стартовых культур для использования в биотехнологии метод криоконсервации дрожжей является более предпочтительным, поскольку замороженные клетки могут использоваться в качестве инокулятов сразу после отогрева без предварительной репарации.

1. Бронштейн В.Л., Иткин Ю.А., Шурда Г.Г., Исерович П.Г. // Криобиология и

криомедицина. – 1983. – Вып.12. – с.35-38. 2. Голубева Л.В. Современные технологии и оборудование для производства питьевого

молока / Голубева Л.В. – М.: ДеЛи ООО, 2004. – 178с. 3. Кородева Н.С. Основы микробиологии и гигиены молока и молочных продуктов. – М.:

Легкая и пищевая промышленность, 1984. – 168с. 4. Сидякина Т.М. Криоконсервация микроорганизмов / Сидякина Т.М. – Пущино, 1985. –

63с. 5. Цуцаева А.А. Криобиология и биотехнология / А.А. Цуцаева, Т.С. Сафронова, К.М.

Сытник [и др.]. – Киев: Наук. Думка,1987. – 200с.

АНТИМИКРОБНЫЕ ПЕПТИДЫ БИФИДОБАКТЕРИЙ,

ПРИМЕНЕНИЕ И СВОЙСТВА

В. А. Щетко, Н. А. Головнева

Институт микробиологии НАН Беларуси, Минск, Беларусь

Антагонистические взаимоотношения облигатных представителей микробиоценоза желудочно-кишечного тракта (бифидобактерий, лактобацилл, кишечной палочки, энтерококков) с патогенными микроорганизмами осуществляются в процессе конкуренции за питательные вещества, сайты адгезии и продукции ингибирующих веществ. Установлено, что многие микроорганизмы нормофлоры способны продуцировать бактериоцины – вещества пептидно-белковой природы, обладающие антибиотическим действием, прежде всего на близкородственные штаммы, а также микроорганизмы других групп, в том числе патогенные и условнопатогенные. К настоящему времени накоплен фактический материал, касающийся характеристики бактериоцин-продуцирующих культур грамположительных

144

бактерий, свойств бактериоцинов, их генетической детерминации, практического использования штаммов-продуцентов и бактериоцинов.

В связи с широким применением бифидобактерий для бактериотерапии и профилактики различных заболеваний человека и животных, использованием их в пищевой, фармацевтической промышленности, необходим скрининг и изучение штаммов бифидобактерий, обладающих способностью к бактериоциногении, детальное исследование физиолого-биохимических особенностей их продукции и биологической активности бактериоцинподобных соединений белково-пептидной природы. Особое внимание заслуживает изучение спектра антимикробной активности бактериоцинов, установление механизма их действия, путей биосинтеза.

Несомненный интерес представляют исследования, направленные на практическое использование бактериоцинов бифидобактерий. Обоснование возможностей и перспектив использования биологически активных экзометаболитов в биотехнологии послужит основой для создания новых поликомпонентных микробных биопрепаратов для использования их в сельском хозяйстве, медицине и пищевой промышленности. Бактериоцинпродуцирующие штаммы микроорганизмов, в частности, бифидо- и молочнокислые бактерии, или сами бактериоцины могут быть использованы как природные консерванты в пищевой промышленности для предохранения от порчи мясных и молочных продуктов. Продуценты бактериоцинов также могут использоваться в качестве заквасочных культур в различных пищевых производствах. Изучение этих природных антибиотических соединений приобретает чрезвычайную актуальность также в связи с быстрым снижением чувствительности патогенных бактерий к вводимым в клиническую практику новым антибиотикам, которое сопровождается стремительным распространением антибиотикорезистентных штаммов.

Нами впервые у бифидобактерий B. adolescentis и B. bifidum установлена продукция бактериоцинов. Показано, что накопление бактериоцинов в среде роста бактерий зависит от физико-химических факторов: рН, температуры, состава среды культивирования.

Бактериоцины, продуцируемые бифидобактериями, характеризуются термостабильностью, сохраняют активность в широком диапазоне рН от 2 до 9, полностью инактивируются трипсином, но устойчивы к действию пепсина, протосубтилина, кислой протеиназы Aspergillus foetidus, протеиназы Staphylococcus aureus. Молекулярная масса бактериоцинов B. adolescentis составляет ~12 kDa. В составе бактериоцина B. adolescentis обнаружено 16 аминокислот. Около половины (48%) приходится на долю гидрофобных аминокислот аланина, лейцина, изолейцина, пролина, метионина, фенилаланина.

Показано, что высокоочищенные бактериоцины B. adolescentis ингибируют рост патогенных микроорганизмов родов Salmonella, Staphylococcus, Proteus, Klebsiella, что позволяет рассматривать их в качестве перспективных антимикробных соединений.

Впервые установлено, что продукция бактериоцинов у B. adolescentis и B. bifidum кодируется генами, локализованными на хромосомной ДНК. Выделен локус хромосомной ДНК бифидобактерий, содержащий гены, кодирующие синтез бактериоцинов. Составлена рестрикционная карта локуса хромосомной ДНК B. bifidum, отвечающего за продукцию бактериоцинов.

145

Полученные результаты являются научной основой для создания новых биологических препаратов – биоконсервантов, заквасок в пищевой промышленности, а также лечебно-профилактических препаратов-пробиотиков направленного действия, в состав которых будут входить штаммы бифидобактерий, характеризующиеся продукцией бактериоцинов.

В настоящее создана промышленная технология получения препарата пробиотического действия на основе биологически активных метаболитов бифидо- и молочнокислых бактерий для профилактики и лечения желудочно-кишечных заболеваний телят и освоению ее в производстве.

О МИКРОБИОЛОГИЧЕСКОЙ ХАРАКТЕРИСТИКЕ ВЕРМИКОМПОСТОВ

А. В. Якушев

Кафедра биологии почв факультета почвоведения МГУ имени М.В. Ломоносова, Москва, Россия

Вермикомпост – это продукт физической и биохимической трансформации

органических субстратов, образующийся при взаимодействии дождевых червей и микроорганизмов. Биологии вермикомпостирования посвящено много исследований. Часть из них направлены на характеристику состава микробного сообщества при вермикомпостировании (Терещенко, 2003; Кузьмина, 2005; Кубарев Верховцева, Кузьмина, 2005; Anastasi et al., 2005; Aira et al., 2006; другие). Другие работы характеризуют микробную активность (Жигжитова, 1998; Lazcano et al., 2008; Sen, Chandra, 2009; Vivas et al., 2009), функциональные особенности (Терещенко, Бубина, 2007; Vaz-Moreira et al., 2008; Yasir et al, 2009), свойства ферментов (Masciandaro et a.l, 2000) или физиологическое состояние микроорганизмов в вермикомпостах (Aira et al., 2006; Pramanik et al., 2008). Несмотря на противоречия в данных, связанные с разнообразием субстратов и условий вермикомпостирования, имеющаяся научная база свидетельствует о том, что вермикомпостирование – особый процесс, отличающийся от обычного компостирования. Таким образом, можно искать специфические свойства вермикомпостов, связанные с активностью червей. Однако микробиологические стандарты качества (за исключением санитарных) и готовности вермикомпостов до сих пор не разработаны.

Работа касается и проблемы источников плодородия вермикомпостов, которыми могут быть только свойства, характерные для разных по происхождению вермикомпостов. Экофизиологические параметры, характеризующие активность микроорганизмов, кинетику роста, потребность в факторах роста и т. д., дополнят имеющиеся санитарные нормативы.

Цель: установить отличия вермикомпостов от компостов по экофизиологическим, биохимическим параметрам и обилию микроорганизмов.

Задачи: 1. Исследовать влияние червей Eisenia fоetida andrei, Aporrectodea caliginosa,

A. rosea и природы сырья для изготовления вермикомпостов на таксономическую структуру бактерий по анализу разнообразия ДНК денатурирующим градиентным гель-электрофорезом (ДГГЭ) и микромицетов (метод посева). 2. Исследовать изменение обилия отдельных групп микроорганизмов в процессе вермикомпостирования: длина мицелия грибов и актиномицетов, обилие бактерий, и учитываемой прямым счётом микрофауны (нематод,

146

инфузорий, коловраток). 3. Охарактеризовать функциональные (трофические) особенности и физиологическое состояние (активность микроорганизмов) в вермикомпостах. 4. Исследовать по кинетике ферментативных реакций изменение сродства эстераз к сложным эфирам и оксидо-редуктаз к глюкозе под действием червей в вермикомпостах. 5. Установить изменения стратегий роста микробных сообществ при вермикомпостировании по сравнению с компостированием. 6. Определить время вермикомпостирования, достаточное для формирования отличительных признаков микробного сообщества вермикомпоста.

Методы: 1. метод Райта-Хобби для оценки параметров минерализационной активности и экофизиологической характеристики сообщества, 2. кинетический метод определения биомассы микроорганизмов. 3. определение гидролазной активности, 4. определение спектра ассимиляции органических субстратов микробным сообществом, 5. изучение микробного роста в вермикомпостах методом стекол обрастания Росси-Холодного, 6. учет беспозвоночных (нематоды, коловратки, инфузории).

Объекты: Модельные вермикомпосты: 1. перепревший навоз крупного рогатого скота (КРС), 2. смесь опавших листьев, 3. низинный торф. Изучение проводили на протяжение всего лабораторного вермикомпостирования. Промышленные вермикомпосты («Русский Биогумус»)-4 партии отобранных в 2006-2009 г. Три партии на основе навоза КРС различались процедурой подготовки корма для червей. И одна партия на основе конского навоза. Черви: Eisenia foetida andrei, Aporrectodea caliginosa и A. rosea.

Выводы: 1. Основные отличия микробных сообществ вермикомпостов от компостов установлены по следующим параметрам: константа полунасыщения ферментов субстратом реакции (Кm), длина грибных гиф, спектр ассимиляции органических соединений микробным сообществом. Эти параметры могут быть использованы для разработки микробиологических стандартов качества и готовности вермикомпоста. 2. Спектр ассимиляции субстратов позволяет говорить о функциональной (трофической) обособленности вермикомпостов от компостов. 3. Обнаружена активизация микроорганизмов (коэффициент r0, отражающий активность микроорганизмов в риродной среде обитания возрастает) в вермикомпостах по сравнению с аналогичными компостами. 4. В вермикомпостах подтверждено усиление накопления нитратов и активизация минерализации (для вермикомпоста из листьев). 5. Установлено снижение эффективности работы эстераз и окислительно-востановительных ферментов под действием червей по значению константы Михаэлиса-Ментен, что наряду с

параметром µm/Ks (максимальная удельная скорость роста микробного сообщества на глюкозе поделить на константу полунасышения ферментов для глюкозы) свидетельствует об увеличении в микробном блоке вермикомпостов доли r-стратегов с неэффективной ферментной системой. 6. В вермикомпостах снижается длина грибного мицелия, обилие бактерий и актиномицетов не изменяется; снижается численность нематод. 7. Таксономическая структура бактериального сообщества (ДГГЭ) вермикомпостов определяется в существенно большей степени природой сырья, а не деятельностью дождевых червей. 8. Микробиологические свойства, по которым вермикомпосты отличаются

от компостов, достигают максимальных значений за 1,5–2 месяца вермикомпостирования.

Работа выполнена при финансовой поддержке РФФИ грант № 08-04-00786-а.

147

STENOTROPHOMONAS SP. 33T – ДЕСТРУКТОР ПЕСТИЦИДА 2,4,5–Т

Т. Р. Ясаков, Л. Г. Анисимова, Н. В. Жарикова, В. В. Коробов, Е. Ю. Журенко,

Т. В. Маркушева

Институт биологии УНЦ РАН, Уфа, Россия

Широкое применение пестицидов в сельском хозяйстве привело к их значительному накоплению в почве. Даже незначительные концентрации таких соединений способны оказывать негативное влияние на здоровье человека. Известно, что в организме высших животных пестициды не способны метаболизироваться, что приводит к их накоплению в тканях и кумулятивному эффекту. Существенную роль в процессах детоксикации ксенобиотиков играет микробная биоконверсия. Одним из самых опасных пестицидов является 2,4,5-трихлорфеноксиуксусная кислота (2,4,5-Т).

Целью данной работы являлось выделение бактериального штамма-деструктора, осуществляющего деструкцию пестицида 2,4,5-Т.

В задачи исследования входило определение таксономического положения штамма, исследование эффективности утилизации 2,4,5-Т и субстратной специфичности в отношении других пестицидов и хлорароматических соединений.

В качестве объекта исследований был выбран бактериальный штамм из смешанных популяции микроорганизмов промзоны АО НУНПЗ г. Уфы.

В ходе работы была выделена культура, способная к деградации 2,4,5-Т. По данным последовательности гена 16S рРНК, штамм был определен как Stenotrophomonas sp. 33T. Эффективность деструкции пестицида в течение 9 суток составила 76%. Показано, что помимо 2,4,5-Т штамм может также использовать 2,4-дихлорфеноксиуксусную кислоту

(2,4-Д), 4-хлорфеноксиуксуную кислоту (4-ХФУК) и фенол в качестве единственного источника углерода и энергии.

Исходя из результатов проделанной работы, штамм Stenotrophomonas sp. 33T может быть использован для ремедиации среды, загрязненной пестицидами хлорароматической природы.

Работа выполнена при содействии грантов Программы Президиума РАН «Поддержка молодых ученых» и программы фундаментальных исследований Президиума РАН «Биоразнообразие и динамика генофондов».

148

АЛФАВИТНЫЙ УКАЗАТЕЛЬ ИМЕН

А

Автух А.Н., 3 Александрова С.С., 124 Алексеенко А.Л., 4, 5

Аленькина С. А., 5, 7

Алещенкова З.М., 134

Алимова Ф.К., 126, 127

Алтунина Л.К., 62

Ананьина Л.Н., 92 Андерсон П., 116 Андриянова Д.А., 93 Анисимова Л.Г., 147

Анорова Л.Н., 56 Антонюк Л.П.. 110

Ахметова А.И., 7 Ахова А.В.. 9

Б

Бардаева Ю.М., 11

Барышникова Л.М., 3

Батыр Л.М., 26, 95

Беляева П.Г., 71 Беляков А.Е., 15 Берестовская Ю.Ю., 77, 78

Бивол Ч.М., 26

Богуш В.Г., 124

Бонч-Осмоловская Е.А., 42

Борзенков И.А., 49 Борисова А.А., 124 Боровская А.Д., 81 Брюханов А.Л., 13 Бубина А.Б., 97, 145

Бурыгин Г.Л., 15, 34 Буторова О.П., 73

В

Ваккеров-Коузова Н.Д., 16, 18

Васильева Л.В., 77, 78

Василюк Н.В., 3 Верещагина О.А., 98

Веселовский В.В., 101 Ветчинкина Е.П., 58, 59, 99

Винникова А.Н., 101 Винокурова Н.Г., 3 Воронина Н.В., 74 Высочина Г.И., 127

Г

Галанина Л.А., 129

Гальченко В.Ф., 89

Галямина В.В., 71 Гаранкина В.П., 76

Герасименко Л.М., 37, 52, 54 Герасимчук А.Л., 73 Гладилина Ю.А., 124 Глазунов А.В., 56 Гоглева А.А., 20 Головнева Н.А., 121, 143

Граскова И.А., 4 Гришко В.В., 107, 108, 122, 124

Гулий О.И., 22

Д

Дагурова О.П., 76

Данилов И.М., 102

Данилов Л.Л., 101

Демаков В.А., 30

Джур С.В., 26

Долгих Н.П., 103 Дробкова В.А., 23 Дружинина Т.Н., 101

149

Е

Евтушенков А.Н., 35

Егорова Д.О., 32, 104

Еленчук Д.И., 26, 105 Елькин А.А., 107 Еренко Л.Н., 73 Ефремова Н.В., 26 Ешинимаев Б.Ц., 67

Ж

Жарикова Н.В., 147

Жигалова Е.А., 11 Журавлева Ю.В., 11 Журенко Е.Ю., 147 Журина М.В., 135

З

Забодалова Л.А., 102

Забудченко О.В., 73 Зайчикова М.В., 77 Захарова Е.Е., 13 Зенова Г.М., 79 Зорина А.А., 25, 54

Зосим Л.С., 26, 105 Зырянова Е.В., 9

И

Иванов Р.С., 28 Иванова А.Е., 49 Иванова Е.А., 79 Иванушкина Н.Е., 129 Ившина И.Б., 107, 108, 116, 122, 124 Игнатов О.В., 22, 59 Игумнова Т.Н., 80 Ижик А.В., 109 Ильина Е.Н., 81 Ильчукова А.В., 110

Исаева А.С., 81

К

Канапацкий Т.А., 13 Каннингхем К.Д., 116

Кантерова А.В., 29 Карначук О.В., 73 Карпов В.А., 49 Картыжова Л.Е., 134

Каюмов А.Р., 7, 41 Кизилова А.К., 78, 82, 89 Киселёва Е.П., 109 Клемантович A.В., 84 Козлов С.В., 30 Козлова А.В., 73 Колганова Т.В., 42

Колупаев А.В., 44, 112 Конова И.В., 129 Корнеева В.А., 13 Коробейников А.С., 114 Коробов В.В., 147 Коршунова А.В., 86 Коршунова И.О., 32 Костеневич А.А., 33 Костина Л.В., 116 Кочкина Г.А., 129

Кравченко И.К., 82, 89, 90 Криворучко А.В., 116 Крючкова Е.В., 34 Кудина И.В., 35 Кузнецова, М.В., 44, 87 Кунанбаев К.К., 118 Куприянова Е.В., 37 Куюкина М.С., 116

Л

Лаврентьева Е.В., 50

Лагоненко А.Л., 35 Ладутько Е.И., 119

Левенец О.О., 139 Летаров А.В., 81 Литти Ю.В., 38 Лобастова Е.Ю., 140 Лозинский В.И., 107, 108

150

Лось Д.А., 25, 54

М

Магданова Л. А., 39 Максимов А.Ю., 47, 103 Максимова А.В., 87 Максимова Н.П., 132, 138

Маркелова А.Г., 37, 52 Маркова Ю.А., 4, 5 Маркушева Т.В., 147 Маслак Д.В., 132 Матора Л.Ю., 5, 15 Медведкова К.А., 80 Мейчик Н.Р., 93 Меморская А.С., 98 Менько Е.В., 13, 82, 89 Миллер А.А., 73 Михайлова Е.М., 86 Мишин И.П., 73 Можарова И.В., 137 Морозова А.Н., 121 Морозова Ю.А., 126 Муравьева В.В., 81 Мухаметзянова А.Д., 41 Мямин В.Е., 84

Н

Назина Т.Н., 86

Наконечная О. И., 5 Намсараев Б.Б., 66 Науанова А.П., 118

Некрасова В.К., 38

Непомнящая Я.Н., 42

Нестерова Л.Ю., 45 Нетрусов А.И., 42 Никитина В.Е., 5, 7, 58, 59, 99

Николаева Н.В., 44 Новик Г.И., 29, 51, 109, 119, 130, 142 Ноговицина Е.М., 122, 124

Ножевникова А.Н., 38

О

Озерская С.М., 129

Октябрьский О.Н., 127

Олан О.П., 26

Омарова Е.О., 79 Омеличкина Ю.В., 4 Омельянюк Н.М., 124

П

Павлова Ю.А., 47

Панкова Г.А., 102

Песнякевич А.Г., 84

Петрушин А.Ф., 18 Пешкур Т.А., 116

Пименов Н.В., 13 Плакунов В.К., 135, 137 Плотникова Е.Г., 32, 92, 104 Покровская М.В., 124 Покровский В.С., 124 Полтараус А.Б., 86

Попова И.А., 15 Присяжная Н.В., 3 Пронина Н.А., 37 Прохоров А.В., 49 Пусенкова Л.И., 140

Р

Раднагуруева А.А., 50 Раутиан М.С., 16, 17 Рафаилова Э.А., 126 Рахуба Д.В., 51, 142

Романенко А.С., 4, 5

Рябая Н.Е., 121

С

Садовская Л.Е., 137 Самойлова З.Ю., 127

Самылина О.С., 52, 54

Сапунова Л.И., 33 Саралов А.И., 71 Сваровская Л.И., 62

151

Сергеева Я.Э., 93, 129 Серебренников В.М., 56 Сидоренко А.В., 130 Сидорук К.В., 124 Симанькова М.В., 38

Синеокий С.П., 130

Синетова М.П., 25, 52, 54 Скакун Т.Л., 132 Скворцов Е.В., 126, 127 Скворцова Н.Н., 102 Слободкин А.И., 42

Слободкина Г.Б., 42

Смирнова В.А., 132

Смирнова Г.В., 127 Соколов Н.Н., 124

Соколова Д.Ш., 86 Соловьёва Е.А., 134 Степанов А.Л., 90 Степанова Л.В., 58 Стрелкова Е.А., 135, 137

Т

Тамкович И.О., 33

Тарасова Е.В., 122

Темралеева А.Д., 59 Терёшина В.М., 98 Терещенко Н.Н., 97 Тропынина Т.С., 28, 140 Тугарова А.В., 110

Турковская О.В., 34 Турова Т.П., 86

У

Усов А.И., 93

Ф

Федоров Д.Н., 61 Фёдоров Е.Е., 34 Феклистова И.Н., 137, 138

Феофилова Е.П., 93, 94, 129 Филатов Д.А., 62

Филипьечева Ю.А., 15

Фишман К.С., 64

Х

Хайнасова Т.С., 139 Хасаева Ф.М., 3

Ц

Цыренова Д.Д., 66

Ч

Чернышова М.П., 34 Черобаева А.С., 90 Чижикова Н.П., 79

Ш

Шарипова М.Р., 7, 41 Шафикова Т.Н., 4 Шашков А.С., 3 Шелудько А.В., 110

Шестакова Н.М., 86

Шеховцова Н.В., 69 Широких А.А., 112 Широких И.Г., 112 Широков А.В., 140 Шишкин А.В., 126 Шувалова Э.В., 15 Шумков М.С., 9 Шумкова Е.С., 104 Шуниборова И.И., 142

Щ

Щетко В.А., 143 Щукин В.Н., 67

Э

Эль-Регистан Г.И., 110, 112

Эпова Е.Ю., 130

152

Я

Ягушкина А.Ю., 69 Яковлев М.Ю., 69 Якушев А.В., 145

Ясаков Т.Р., 147 Ястребова О.В., 92

РОССИЙСКАЯ АКАДЕМИЯ НАУК

ИНСТИТУТ МИКРОБИОЛОГИИ

ИМ. С.Н. ВИНОГРАДСКОГО РАН

НАУЧНЫЙ СОВЕТ ПО МИКРОБИОЛОГИИ РАН

РОССИЙСКИЙ ФОНД ФУНДАМЕНТАЛЬНЫХ ИССЛЕДОВАНИЙ

МОО «МИКРОБИОЛОГИЧЕСКОЕ ОБЩЕСТВО»

ПРОГРАММА

V МОЛОДЕЖНОЙ ШКОЛЫ–КОНФЕРЕНЦИИ

С МЕЖДУНАРОДНЫМ УЧАСТИЕМ

«АКТУАЛЬНЫЕ АСПЕКТЫ СОВРЕМЕННОЙ МИКРОБИОЛОГИИ»

26 – 27 ОКТЯБРЯ 2009 г.

Москва - 2009

154

Организационный комитет конференции

Председатель

Гальченко В.Ф., член-корр. РАН, директор Института микробиологии

им. С.Н. Виноградского РАН

Сопредседатель

Пименов Н.В., д.б.н., зам. директора Института микробиологии

им. С.Н. Виноградского РАН

Сопредседатель

Бонч-Осмоловская Е.А., д.б.н., зам. директора Института микробиологии

им. С.Н. Виноградского РАН

Юсупов С.К., зам. директора Института микробиологии

им. С.Н. Виноградского РАН

Мысякина И.С., к.б.н.

Хижняк Т.В., к.б.н.

Гальченко Н.В. – Секретарь Оргкомитета

Адрес оргкомитета: 117312, Москва, Проспект 60-летия Октября, д.7, корп.2. Учреждение

Российской академии наук Институт микробиологии им. С.Н. Виноградского РАН. Тел.:

(499) 135-01-80, Факс: (499) 135-65-30

E-mail: natgal@inmi.host.ru

155

26 октября (понедельник)

9.30

ОТКРЫТИЕ КОНФЕРЕНЦИИ

Приветствие Гальченко В.Ф.

член-корреспондент РАН, директор Института микробиологии им. С.Н. Виноградского РАН

ПЛЕНАРНАЯ СЕКЦИЯ

9.40–10.10 Анализ полных геномов новых гипертермофильных прокариот Д.б.н. Бонч-Осмоловская Е.А.

Институт микробиологии им. С.Н. Виноградского РАН, Москва, Россия

10.10–10.40 Алкалофильные аноксигенные фототрофные бактерии, биоразнообразие и эволюция

Д.б.н., проф. Горленко В.М.

Институт микробиологии им. С.Н. Виноградского РАН, Москва, Россия

10.40–11.10 Микробные процессы цикла углерода в Арктических морях. К.б.н. Саввичев А.С.

Институт микробиологии им. С.Н. Виноградского РАН, Москва, Россия

11.10–11.25 Перерыв

26 октября (понедельник)

СЕКЦИЯ I

РАЗНООБРАЗИЕ И ФИЗИОЛОГИЯ МИКРООРГАНИЗМОВ

11.25–11.40 Растения как возможные резервуары патогенных для человека бактерий

Алексеенко А. Л., Маркова Ю. А., Граскова И. А., Омеличкина Ю. В.,

Шафикова Т. Н., Романенко А. С.

Сибирский институт физиологии и биохимии растений СО РАН, Иркутск, Россия

11.40–11.55 Инактивация гена глутамилэндопептидазы в геноме Bacillus intermedius Ахметова А. И., Каюмов А. Р., Шарипова М. Р.

Казанский государственный университет им. В.И.Ульянова-Ленина,

Казань, Россия

156

11.35–12.10 Изменение факторов патогенности микроорганизмов под влиянием внешних условий Бардаева Ю. М., Жигалова Е. А., Журавлева Ю. В.

Иркутский государственный медицинский университет, Иркутск, Россия

12.10–12.25 Серологическое разнообразие почвенных ассоциативных бактерий рода Azospirillum

Бурыгин Г. Л.1, Филипьечева Ю. А.

2, Беляков А. Е.

1, Попова И. А.

2,

Шувалова Э. В.2, Матора Л. Ю.

1,2

1Институт биохимии и физиологии растений и микроорганизмов РАН, Саратов,

Россия; 2Саратовский государственный университет им. Н.Г. Чернышевского,

Саратов, Россия

12.25–12.40 Выделение и характеристика бактерий–симбионтов микронуклеусов инфузорий Paramecium bursaria и Paramecium caudatum. Ваккеров-Коузова Н. Д.

1, Раутиан М. С.

2

1Агрофизический институт, Санкт-Петербург, Россия;

2Санкт-Петербургский

государственный университет, Санкт-Петербург, Россия.

12.40–13.30 Обед

13.30–13.45 Биологические свойства грибов рода Сandida, изолированных при вагинальных инфекциях Дробкова В. А.

ГОУ ВПО ПГМА им. ак. Е.А.Вагнера Росздрава, Пермь, Россия

13.45–14.00 Роль серин-треониновых протеинкиназ в регуляции ответа на тепловой стресс у цианобактерии Synechocysts sp. Pcc 6803 Зорина А. А., Синетова М. П., Лось Д. А.

Институт физиологии растений им. К. А. Тимирязева, Москва, Россия

14.00–14.15 Метаболизм глифосата ризосферным штаммом Acinetobaсter sp. K7 Крючкова Е. В., Бурыгин Г. Л., Чернышова М. П., Фёдоров Е. Е.,

Турковская О. В.

Институт биохимии и физиологии растений и микроорганизмов РАН, Саратов,

Россия

14.15–14.30 Субклеточная локализация карбоангидразы бета-типа в кальцифицирующей цианобактерии Microcoleus chthonoplastes Куприянова Е. В.

1, Маркелова А. Г.

1, Герасименко Л. М.

2, Лось Д. А.

1,

Пронина Н. А.1

1Институт физиологии растений им. К.А. Тимирязева РАН, Москва, Россия;

2Институт Микробиологии им. С.Н. Виноградского РАН, Москва, Россия

14.30–14.45 Инактивация гена фитазы в геноме Bacillus subtilis Мухаметзянова А. Д., Каюмов А. Р., Шарипова М. Р.

Казанский государственный университет, Казань, Россия

14.45–15.00 Перерыв

157

15.00–15.15 Биоразнообразие сульфатредуцирующих бактерий в водах Черного моря Брюханов А. Л.

1,2, Корнеева В. А.

1, Канапацкий Т. А.

2, Захарова Е. Е.

2,

Менько Е. В.2, Пименов Н. В.

2

1Московский государственный университет им. М.В. Ломоносова, Биологический

факультет, кафедра микробиологии, Москва, Россия; 2Институт микробиологии им.

С.Н. Виноградского РАН, Москва, Россия

15.15–15.30 Изменение ультраструктуры клеток экстремально натронофильной цианобактерии ‘Euhalothece natronophila’ при снижении концентрации CO3

2-

+HCO3- в среде культивирования

Самылина О. С.1, Маркелова А. Г.

2, Синетова М. П.

2, Герасименко Л. М.

1

1Институт микробиологии им. С.Н. Виноградского РАН, Москва, Россия;

2Институт

физиологии растений им. К.А. Тимирязева РАН, Москва, Россия

15.30–15.45 Участие сверхспирализации ДНК в регуляции экспрессии стресс-индуцируемых генов цианобактерии Synechocystis sp. PCC 6803 Синетова М. П., Зорина А. А., Лось Д. А.

Институт физиологии растений им. К. А. Тимирязева РАН, Москва, Россия

15.45–16.00 Влияние повышенного температурного режима на спектр гидрофильных мицелиальных белков Grifola frondosa 0917 и Lentinus edodes f-249 Степанова Л. В., Ветчинкина Е. П., Никитина В. Е.

Институт биохимии и физиологии растений и микроорганизмов РАН, Саратов,

Россия

16.00–16.15 Влияние ацетата свинца на структурные и морфофизиологические показатели альго-цианобактериальных сообществ серой лесной почвы Темралеева А. Д.

Институт физико-химических и биологических проблем почвоведения РАН,

Пущино, Россия

16.15–16.30 Биосинтез индолил-3-уксусной кислоты аэробными метилотрофными бактериями-фитосимбионтами

Федоров Д. Н.

Институт биохимии и физиологии микроорганизмов им. Г.К. Скрябина РАН, Пущино,

Россия

16.30–16.45 Влияние света, трансформированного светокорректирующей пленкой, на активность углеводородокисляющих микроорганизмов в жидкой среде Филатов Д. А., Алтунина Л. К., Сваровская Л. И.

Институт химии нефти СО РАН, Томск, Россия

16.45–17.00 Перерыв

158

26 октября (понедельник)

17.00 – 19.30

СЕКЦИЯ I

РАЗНООБРАЗИЕ И ФИЗИОЛОГИЯ МИКРООРГАНИЗМОВ

СТЕНДОВАЯ СЕССИЯ

27 октября (вторник)

ПЛЕНАРНАЯ СЕКЦИЯ

10.00-10.30 Адаптация мицелиальных грибов к неблагоприятным факторам: биохимический механизм и практическое значение Д.б.н., проф. Феофилова Е. П.

Институт микробиологии им. С.Н. Виноградского РАН, Москва, Россия

10.30-11.00 Археи: детекция, новые линии К.б.н. Перевалова А. А.

Институт микробиологии им. С.Н. Виноградского РАН, Москва, Россия

11.00-11.30 Механизмы выживаемости бактерий К.б.н. Мулюкин А. Л.

Институт микробиологии им. С.Н. Виноградского РАН, Москва, Россия

11.30-12.00 Малоизученная филогенетическая группа Acidobacteria: от клонов до изолятов К.б.н. Панкратов Т. А.

Институт микробиологии им. С.Н. Виноградского РАН, Москва, Россия

12.00–13.00 Обед

27 октября (вторник)

СЕКЦИЯ II

МОЛЕКУЛЯРНАЯ ЭКОЛОГИЯ И ГЕОХИМИЧЕСКАЯ

ДЕЯТЕЛЬНОСТЬ МИКРООРГАНИЗМОВ

13.00–13.15 Структура и функциональная роль цианобактерий и фототрофных несерных пурпурных бактерий перифитонных сообществ природных и техногенных вод Камского бассейна Беляева П. Г., Галямина В. В., Саралов А. И.

Институт экологии и генетики микроорганизмов УрО РАН, Пермь, Россия

13.15–13.30 Развитие и функционирование бактерий оборотной воды в цикле обогащения апатит-нефелиновых руд Воронина Н. В.

Институт проблем промышленной экологии Севера Кольского научного центра РАН,

Апатиты, Россия

159

13.30–13.45 Инструментальная оценка биоразнообразия лактобацилл влагалища человека Исаева А. С.

1, Муравьева В. В.

2, Боровская А. Д.

2, Ильина Е. Н.

2,

Летаров А. В.1

1Институт микробиологии им. С. Н. Виноградского РАН, Москва, Россия;

2Научно-

исследовательский институт физико-химической медицины, Москва, Россия

13.45–14.00 Полиамины способствуют формированию низкоуровневой устойчивости

Escherichia coli к фторхинолонам Нестерова Л. Ю.

Институт экологии и генетики микроорганизмов УрО РАН, Пермь, Россия

14.00–14.15 Нитрифицирующие микроорганизмы в почвах европейской части России

Черобаева А. С.1, Степанов А. Л.

1, Кравченко И. К.

2

1Московский Государственный Университет им. М.В. Ломоносова, Факультет

почвоведения; 2Учреждение Российской Академии наук Институт микробиологии

им. С.Н. Виноградского РАН, Москва, Россия

14.15–14.30 Перерыв

27 октября (вторник)

14.30 – 17.15

СЕКЦИЯ II

МОЛЕКУЛЯРНАЯ ЭКОЛОГИЯ И ГЕОХИМИЧЕСКАЯ

ДЕЯТЕЛЬНОСТЬ МИКРООРГАНИЗМОВ

СТЕНДОВАЯ СЕССИЯ

27 октября (вторник)

СЕКЦИЯ III

ПЕРСПЕКТИВНЫЕ НАПРАВЛЕНИЯ МИКРОБНОЙ

БИОТЕХНОЛОГИИ

13.00–13.15 Углеводный состав мицелия и спор представителей высших и низших мицелиальных грибов Андриянова Д. А.

1, Усов А. И.

2, Мейчик Н. Р.

3, Феофилова Е. П.

1

1Институт микробиологии РАН, Россия, Москва, Россия;

2Институт органической

химии РАН, Россия, Москва, Россия; 3Московский Государственный Университет,

Россия, Москва, Россия

13.15–13.30 Значение экзогенных липидов в ликопиногенезе мицелиального гриба Blakeslea trispora Верещагина О. А., Меморская А. С., Терёшина В. М.

Институт микробиологии им. С.Н. Виноградского РАН, Москва, Россия

160

13.30–13.45 Анализ белкового состава, лектинов и фенолоксидаз в процессе морфообразования ксилотрофного базидиомицета Lentinus edodes (berk.) Sing Ветчинкина Е. П., Никитина В. Е.

Институт биохимии и физиологии растений и микроорганизмов РАН, Саратов,

Россия

13.45–14.00 Окислительная биотрансформация тиоанизола актинобактериями рода Rhodococcus Елькин А. А.

1, Гришко В. В.

2, Лозинский В. И.

3, Ившина И. Б.

1

1Институт экологии и генетики микроорганизмов УрО РАН, Пермь, Россия;

2Институт технической химии УрО РАН, Пермь, Россия

14.00–14.15 Трансформация пестицидов почвенной микрофлорой Колупаев А. В., Широких А. А., Широких И. Г.

Лаборатория биомониторинга Коми НЦ УрО РАН и ВятГГУ, Киров, Россия

14.15–14.30 Перерыв

14.30–14.45 Идентификация возбудителей болезней фасоли и их взаимодействие с биопрепаратами на основе антагонистов Коробейников А. С.

Новосибирский государственный аграрный университет, Новосибирск, Россия

14.45–15.00 Влияние Rhodococcus-биосурфактантов на процесс мобилизации и десорбции нефтяных углеводородов из почвы

Костина Л. В.1, Криворучко А. В.

1, Куюкина М. С.

1, Пешкур Т. А.

2,

Андерсон П.2, Каннингхем К. Д.

2, Ившина И. Б.

1

1Институт экологии и генетики микроорганизмов УрО РАН, Пермь, Россия;

2Исследовательский центр оценки загрязненных земель и ремедиации, Эдинбург,

Великобритания

15.00–15.15 Влияние гербицида топик на рост и развитие штамма бактерии Bacillus

megaterium

Кунанбаев К. К.1, Науанова А. П.

2

1Научно-производственный центр зернового хозяйства им. А.И. Бараева, Казахстан;

2Казахский агротехнический университет им. С.Сейфулина, Казахстан

15.15–15.30 Протеолитическая активность бактериального штамма Brevibacillus brevis

B-398

Ладутько Е. И., Новик Г. И.

ГНУ «Институт микробиологии НАН Беларуси», Минск, Беларусь.

15.30–15.45 Направленная биотрансформация β-ситостерола в фармакологически активный стигмаст-4-ен-3-он Ноговицина Е. М.

1, Гришко В. В.

2, Тарасова Е. В.

3, Ившина И. Б.

1

1Институт экологии и генетики микроорганизмов УрО РАН, Пермь, Россия;

2Институт технической химии, Пермь, Россия;

3Пермский государственный

университет, Пермь, Россия

161

15.45–16.00 Роль липидов в антистрессовой защите мицелиальных грибов Сергеева Я. Э.

1, Конова И. В.

1, Галанина Л. А.

1, Кочкина Г. А.

2,

Иванушкина Н. Е.2, Озерская С. М.

2, Феофилова Е. П.

1

1Институт микробиологии им. С. Н. Виноградского РАН, Москва, Россия;

2Институт биохимии и физиологии микроорганизмов им. Г. К. Скрябина РАН,

Пущино, Россия

16.00–16.15 Биологические свойства коллекционных и выделенных из пробиотическх продуктов штаммов бифидобактерий

Сидоренко А. В.1, Новик Г. И.

1, Эпова Е. Ю.

2, Синеокий С. П.

2

ГНУ «Институт микробиологии НАН Беларуси», Минск, Беларусь; ФГУП

«Государственный научно-исследовательский институт генетики и селекции

промышленных микроорганизмов», Москва, Россия

16.15–16.30 Взаимодействие нефтеокислителя Dietsia sp. с галофильными спутниками в составе бинарных биопленок Стрелкова Е. А., Журина М. В., Плакунов В. К.

Институт микробиологии им. С. Н. Виноградского РАН, Москва, Россия

16.30–16.45 Исследование жизнеспособности штамма Bacillus subtilis 26д в баковых смесях с пестицидами Широков А. В.

1, Лобастова Е. Ю.

1, Пусенкова Л. И.

1, Тропынина Т. С.

2

1ГНУ Башкирский НИИ Сельского хозяйства Россельхозакадемии, Уфа, Россия;

2Институт биологии Уфимского научного центра РАН, Уфа, Россия

16.45–17.15 О микробиологической характеристике вермикомпостов Якушев А. В.

МГУ имени М.В. Ломоносова, Факультет почвоведения, Москва, Россия

17.15–17.30 Перерыв

27 октября (вторник)

17.30 – 19.45

СЕКЦИЯ III

ПЕРСПЕКТИВНЫЕ НАПРАВЛЕНИЯ МИКРОБНОЙ

БИОТЕХНОЛОГИИ

СТЕНДОВАЯ СЕССИЯ

162

СТЕНДОВЫЕ ДОКЛАДЫ

СЕКЦИЯ I

РАЗНООБРАЗИЕ И ФИЗИОЛОГИЯ МИКРООРГАНИЗМОВ

1. Автух А.Н.1, Присяжная Н.В.

2, Василюк Н.В.

2, Шашков А.С.

3, Винокурова Н.Г.

1,

Хасаева Ф.М.2, Барышникова Л.М.

1 Видовое разнообразие актиномицетов рода Kribbella. 1Институт биохимии и физиологии микроорганизмов им. Г.К. Скрябина

РАН, Пущино, Россия; 2Московский государственный университет им. М.В.

Ломоносова, Москва, Россия; 3Институт органической химии им. Н.Д. Зелинского

РАН, Москва, Россия.

2. Аленькина С.А.1, Наконечная О.И.

2, Матора Л.Ю.

1, Никитина В.Е.

1 Изменение метаболической активности корней пшеницы под влиянием лектинов азоспирилл. 1Институт биохимии и физиологии растений и микроорганизмов РАН, Саратов,

Россия; 2Саратовский государственный университет, Саратов, Россия.

3. Ахова А.В., Шумков М.С., Зырянова Е.В. Роль полиаминов в защите бактериальной ДНК от повреждающего действия фторхинолонов. Институт экологии и генетики

микроорганизмов УрО РАН, Пермь, Россия.

4. Ваккеров–Коузова Н.Д., Петрушин А.Ф. Мониторинг бактериального разнообразия почвы. Агрофизический институт, Санкт-Петербург, Россия.

5. Гоглева А.А. Новые аэробные метилобактерии – симбионты растений. Пущинский

государственный университет, Пущино, Россия; Институт биохимии и физиологии

микроорганизмов РАН, Пущино, Россия.

6. Гулий О.И., Игнатов О.В. Использование метода электрооптического анализа

клеточных суспензий для определения синергидного действия антибиотиков ампициллина и канамицина в отношении микробных клеток. Институт биохимии

и физиологии растений и микроорганизмов РАН, Саратов.

7. Зосим Л.С.1, Ефремова Н.В.

1, Еленчук Д.И.

2, Бивол Ч.М.

1, Батыр Л.М.

2,

Джур С.В.1, Олан О.П.

2 Координационные соединения CO(II) и Ni (II) как регуляторы активности супероксиддисмутазы у цианобактерии Spirulina platensis. 1Молдавский государственный университет, Кишинев, Молдова; 2Институт

Микробиологии и Биотехнологии АН РМ, Кишинев, Молдова.

8. Иванов Р.С., Тропынина Т.С. Анализ протеолитического процессинга в популяции

E.coli в течение жизненного цикла. Институт биологии Уфимского научного

центра РАН, Уфа, Россия.

9. Кантерова А.В., Новик Г.И. Жизнеспособность дрожжей рода Saccharomyces после криоконсервации. ГНУ «Институт микробиологии НАН Беларуси», Минск,

Беларусь.

163

10. Козлов С.В., Демаков В.А. Нитрилазная активность почвенных бактерий,

трансформирующих алифатические нитрилы. Институт экологии и генетики

микроорганизмов УрО РАН, Пермь, Россия.

11. Коршунова И.О.1, Егорова Д.О.

2, Плотникова Е.Г.

1,2 Грамположительные бактерии, выделенные из техногеннозагрязненных почв района солеразработок Пермского края (г. Березники). 1Пермский государственный университет, Пермь, Россия; 2Институт экологии и генетики микроорганизмов УрО РАН, Пермь, Россия.

12. Костеневич А.А., Сапунова Л.И., Тамкович И.О. Продукция β-галактозидазы бактериями Arthrobacter sp. в зависимости от источника азотного питания. ГНУ

«Институт микробиологии НАН Беларуси», Минск, Беларусь.

13. Кудина И.В., Лагоненко А.Л., Евтушенков А.Н. Физиолого-биохимическая и молекулярно-биологическая характеристика изолятов Erwinia amylovora, выделенных на территории Беларуси. Белорусский государственный университет,

биологический факультет, кафедра молекулярной биологии, Минск, Беларусь.

14. Литти Ю.В., Некрасова В.К., Ножевникова А.Н. Микробиологическая характеристика активного ила станции очистки сточных вод в Красной поляне, ЦАО МО РФ. Институт микробиологии им. С.Н. Виноградского РАН, Москва,

Россия.

15. Магданова Л.А. Влияние частоты адаптивного мутагенеза природных биопленкообразующих бактерий на развитие устойчивости к биоцидам. Институт экологии и генетики микроорганизмов УрО РАН.

16. Непомнящая Я.Н1., Слободкина Г.Б.

2, Колганова Т.В.

3, Бонч-Осмоловская Е.А.

2,

Нетрусов А.И.1, Слободкин А.И.

2 ‘Moorella quinolica’ sp. nov. – новая

термофильная анаэробная бактерия из наземных гидротерм Камчатки. 1Московский государственный университет им. М.В. Ломоносова, биологический

факультет, Москва, Россия; 2Институт микробиологии им. С.Н. Виноградского

РАН, Москва, Россия; 3Центр биоинженерии РАН, Москва, Россия.

17. Николаева Н.В.1, Кузнецова М.В.

1,2 Сравнение профилей антибиотикорезистентности

Pseudomonas aeruginosa и Acinetobacter baumannii, циркулирующих в многопрофильном стационаре. 1ГОУ ВПО ПГМА им. ак. Е.А. Вагнера Росздрава,

Пермь, Россия; 2Институт экологии и генетики микроорганизмов УрО РАН, Пермь,

Россия.

18. Павлова Ю.А.1,2

, Максимов А.Ю.1,2

Амидазы нитрилтрансформирующих почвенных бактерий. 1Пермский государственный университет, Пермь, Россия; 2Институт

экологии и генетики микроорганизмов УрО РАН, Пермь, Россия.

19. Прохоров А.В.1, Иванова А.Е.

1, Борзенков И.А.

1, Карпов В.А.

2

Углеводородокисляющие бактерии тропического Вьетнама. 1Институт

микробиологии им С.Н. Виноградского РАН, Москва, Россия; 2Институт проблем

экологии и эволюции им. А.Н. Северцова РАН, Москва, Россия

164

20. Раднагуруева А.А., Лаврентьева Е.В. Протеолитическая активность в щелочных гидротермах Прибайкалья. Институт общей и экспериментальной биологии СО

РАН, Улан-Удэ, Россия.

21. Рахуба Д.В., Новик Г.И. Влияние физиологического состояния Pseudomonas

fluorescens БИМ B-86 на инфицирование клеток фагом BV-1. ГНУ «Институт

микробиологии НАН Беларуси», Минск, Беларусь.

22. Серебренников В.М., Анорова Л.Н., Глазунов А.В. Глюкозный метаболизм в культуре Lactococcus lactis ssp. lactis bv. diacetylactis: влияние дрожжевого экстракта на распределение потока пирувата по конечным продуктам брожения. ФГУП ГосНИИгенетика, Москва, Россия.

23. Фишман К.С. Характеристика сульфатвосстанавливающих бактерий кальдеры Узон, Камчатка. Пущинский государственный университет, Пущино, Россия; Институт

биохимии и физиологии микроорганизмов РАН, Пущино, Россия.

24. Цыренова Д.Д., Намсараев Б.Б. Экофизиологические особенности культур цианобактерий, выделенных из соленых озер Южного Забайкалья. Институт

общей и экспериментальной биологии СО РАН, Улан-Удэ, Россия.

25. Щукин В.Н.1,2

, Ешинимаев Б.Ц.2 Мутант (гало)алкалофильного метанотрофа

Methylomicrobium alcaliphilum 20Z, дефектный по синтезу поверхностного H2O2-разлагающего белка. 1Пущинский государственный университет, Пущино, Россия; 2Институт биохимии и физиологии микроорганизмов РАН, Пущино, Россия.

26. Ягушкина А.Ю., Яковлев М.Ю., Шеховцова Н.В. Фенотипические свойства штаммов СМ-9 и СМ-10, выделенных из кристаллических пород глубоких пластов земной коры. Ярославский государственный университет им. П.Г.

Демидова, Ярославль, Россия.

СЕКЦИЯ II

МОЛЕКУЛЯРНАЯ ЭКОЛОГИЯ И ГЕОХИМИЧЕСКАЯ ДЕЯТЕЛЬНОСТЬ

МИКРООРГАНИЗМОВ

1. Буторова О.П.

1, Герасимчук А.Л.

1, Козлова А.В.

2, Забудченко О.В.

2, Еренко Л.Н.

1,

Мишин И.П.2, Миллер А.А.

3, Карначук О.В.

1 Образование сульфидов металлов

чистыми культурами сульфатредуцирующих бактерий, устойчивых к ионам меди. 1Кафедра физиологии растений и биотехнологии, Томский государственный

университет, Томск, Россия; 2Материаловедческий центр Томского

государственного университета, Томск, Россия; 3НПО «Вирион», Томск, Россия.

2. Гаранкина В.П., Дагурова О.П. Продукция и деструкция в заливе Посольский сор озера Байкал. Институт общей и экспериментальной биологии СО РАН, г. Улан-

Удэ, Россия.

165

3. Зайчикова М.В., Берестовская Ю.Ю., Васильева Л.В. Бактерии-диссипотрофы, развивающиеся в сообществе с грибами-ксилолитиками в ультрапресных условиях. Институт микробиологии им С.Н. Виноградского РАН, Москва, Россия.

4. Иванова Е.А.1, Омарова Е.О.

1, Зенова Г.М.

1, Чижикова Н.П.

2 Экспериментальные

цианобактериально-актиномицетные ассоциации и их роль в преобразовании кристаллической решетки глинистых минералов. 1Московский государственный

университет имени М.В. Ломоносова, Москва, Россия; 2Почвенный институт имени

В.В. Докучаева, Москва, Россия.

5. Игумнова Т.Н.1,2

, Медведкова К.А.1 Метанотрофное сообщество термальных

источников кальдеры Узон, Камчатка. 1Институт Биохимии и Физиологии

Микроорганизмов им. Г.К. Скрябина РАН, Пущино, Россия; 1,2 Пущинский

Государственный Университет, Пущино, Россия.

6. Кизилова А.К., Менько Е.В., Кравченко И.К. Молекулярный анализ накопительных метанокисляющих культур, выделенных из лесной и сельскохозяйственных почв. Институт микробиологии им С.Н. Виноградского РАН, Москва, Россия.

7. Клемантович A.В., Мямин В.Е., Песнякевич А.Г. Генетическая характеристика штаммов Clavibacter michiganensis subsp. michiganensis, выделенных на территории Беларуси в 2007–2008 годах. Белорусский государственный

университет, Минск, Беларусь

8. Коршунова А.В.1, Михайлова Е.М.

2, Шестакова Н.М.

2, Соколова Д.Ш.

2,

Турова Т.П.2, Полтараус А.Б.

3, Назина Т.Н.

2 Использование рибосомных и

функциональных генов в исследовании микробных сообществ высокотемпературных нефтяных пластов. 1

Факультет биоинженерии и

биоинформатики, МГУ им. М.В. Ломоносова, Москва, Россия; 2 Институт

микробиологии им. С.Н. Виноградского РАН, Москва, Россия; 3Институт

молекулярной биологии им. В.А. Энгельгардта РАН, Москва, Россия.

9. Максимова А.В.1, Кузнецова М.В.

2 ПЦР-анализ генов альдоксимдегидратаз у нитрилтрансформирующих почвенных бактерий. 1Пермский государственный

университет, г.Пермь, Россия; 2Институт экологии и генетики микроорганизмов

УрО РАН, г.Пермь, Россия.

10. Менько Е.В., Кизилова А.К., Кравченко И.К., Гальченко В.Ф. Выделение и характеристика накопительных культур метанотрофов из горячих источников кальдеры вулкана Узон, Камчатка. Институт микробиологии им С.Н.

Виноградского РАН, Москва, Россия.

11. Ястребова О.В., Ананьина Л.Н., Плотникова Е.Г. Изучение генетического разнообразия бактерий рода Rhodococcus, выделенных из района солеразработок. Институт экологии и генетики микроорганизмов УрО РАН, Пермь, Россия.

166

СЕКЦИЯ III

ПЕРСПЕКТИВНЫЕ НАПРАВЛЕНИЯ МИКРОБНОЙ БИОТЕХНОЛОГИИ

1. Батыр Л.М. Влияние координационных соединений Cu(II) на продуктивность и

накопления меди в биомассе цианобактерий Spirulina platensis CNM-CB-02. Институт Микробиологии и Биотехнологии АНМ, Кишинев, Молдова.

2. Бубина А.Б.1, 2

, Терещенко Н.Н.2 Фунгистатическая активность бактериального

сообщества биогумуса. 1Томский государственный педагогический университет,

Томск, Россия; 2ГНУ Сибирский НИИ сельского хозяйства и торфа, Томск, Россия.

3. Винникова А.Н., Дружинина Т. Н., Данилов Л.Л., Веселовский В.В. Химико-ферментативный синтез фрагментов О-антигенных полисахаридов грам-отрицательных бактерий с использованием синтетических липидных акцепторов. Институт органической химии им. Н. Д. Зелинского РАН, Москва, Россия.

4. Данилов И.М.1, Забодалова Л.А.

1, Скворцова Н.Н.

1, Панкова Г.А.

2 Исследование ферментативных способов получения низкомолекулярных пептидов. 1ГОУ ВПО

Санкт-Петербургский государственный университет низкотемпературных и

пищевых технологий, Санкт-Петербург, Россия; 2Институт высокомолекулярных

соединений РАН, Санкт-Петербург, Россия.

5. Долгих Н.П.1,2

, Максимов А.Ю.1,2

Биотрансформация ароматических нитрилов и амидов бактериями почвенной среды. 1Пермский государственный университет,

Пермь, Россия;2Институт экологии и генетики микроорганизмов УрО РАН, Пермь,

Россия.

6. Егорова Д.О., Шумкова Е.С., Плотникова Е.Г. Штамм Rhodococcus sp. G12а – деструктор хлорированных бифенилов. Институт экологии и генетики

микроорганизмов УрО РАН, Пермь, Россия.

7. Еленчук Д.И.1, Зосим Л.С.

2 Новые способы получения биомассы спирулины с

повышенным содержанием железа и хрома. 1Институт Микробиологии и

Биотехнологии АНМ, Кишинев, Молдова; 2Молдавский Государственный

Университет, Кишинев, Молдова.

8. Ижик А.В.1, Новик Г.И.

1, Киселёва Е.П.

2 Влияние препаратов клеточных стенок

пробиотических микроорганизмов на активность роста бактериальных культур после лиофилизации и низкотемпературной консервации. 1ГНУ «Институт

микробиологии НАН Беларуси», Минск, Беларусь; 2Институт биоорганической химии

НАН Беларуси, Минск, Беларусь.

9. Ильчукова А.В.1, Тугарова А.В.

1, Шелудько А.В.

1, Эль-Регистан Г.И.

2,

Антонюк Л.П.1 Алкилрезорцины регулируют рост, подвижность и

физиологическое состояние Azospirillum brasilense и Azospirillum lipoferum. 1Институт биохимии и физиологии растений и микроорганизмов РАН, Саратов,

Россия; 2Институт микробиологии им. С.Н. Виноградского РАН, Москва, Россия.

167

10. Морозова А.Н., Головнева Н.А., Рябая Н.Е. Накопление олигосахаридов при культивировании бифидобактерий на средах с лактозой. ГНУ «Институт

микробиологии НАН Беларуси», Минск, Беларусь.

11. Покровский В.С.1, Сидорук К.В.

2, Богуш В.Г.

2, Омельянюк Н.М.

1,

Покровская М.В.1, Александрова С.С.

1, Борисова А.А.

1, Гладилина Ю.А.

1,

Соколов Н.Н.1 Оптимизация экспрессии рекомбинантной L-аспарагиназы Yersinia

pseudotuberculosis. 1НИИ Биомедицинской химии им. В.Н. Ореховича РАМН, Москва,

Россия; 2НИИ Генетики и селекции промышленных микроорганизмов, Москва, Россия

12. Рафаилова Э.А.1, Шишкин А.В.

1, Морозова Ю.А.

1, Алимова Ф.К.

1,

Скворцов Е.В.2 Ферментный препарат для биоконверсии сырья в

кормопроизводстве. 1Казанский государственный университет им. В.И. Ульянова-

Ленина, Казань, Россия; 2 Институт органической и физической химии Казанского

научного центра Российской академии наук, Казань, Россия.

13. Самойлова З.Ю.1, Смирнова Г.В.

1, Высочина Г.И.

2, Октябрьский О.Н.

1

Исследование антиоксидантной активности экстрактов из листьев деревьев Западной Сибири. 1Институт экологии и генетики микроорганизмов УрО РАН,

Пермь, Россия; 2Центральный сибирский ботанический сад СО РАН, Новосибирск,

Россия.

14. Скакун Т.Л., Маслак Д.В., Смирнова В.А., Максимова Н.П. Использование нового комплекса биопестицид-гидрогумат для защиты растений от фитопатогенных микроорганизмов. Белорусский государственный университет, Минск, Беларусь.

15. Соловьёва Е.А., Картыжова Л.Е., Алещенкова З.М. Влияние совместной предпосевной обработки семян ассоциативными азотфиксирующими и фосфатмобилизующими бактериями на рост и развитие тритикале. ГНУ

«Институт микробиологии НАН Беларуси», Минск, Беларусь.

16. Феклистова И.Н., Можарова И.В., Садовская Л.Е. Стимуляция роста овощных культур комплексом биопестицид-лигногумат. Белорусский государственный

университет, Минск, Беларусь.

17. Хайнасова Т.С., Левенец О.О. Влияние последовательной адаптации сообществ хемолитотрофных микроорганизмов к плотности пульпы на их окислительную активность. Научно-исследовательский геотехнологический центр ДВО РАН, Россия.

18. Шуниборова И.И., Новик Г.И., Рахуба Д.В. Оптимизация условий низкотемпературного хранения дрожжей вида Debaryomyces hansenii. ГНУ

«Институт микробиологии НАН Беларуси», Минск, Беларусь.

19. Щетко В.А., Головнева Н.А. Антимикробные пептиды бифидобактерий, применение и свойства. ГНУ «Институт микробиологии НАН Беларуси», Минск, Беларусь.

20. Ясаков Т.Р., Анисимова Л.Г., Жарикова Н.В., Коробов В.В., Журенко Е.Ю.,

Маркушева Т.В. Stenotrophomonas sp. 33T – деструктор пестицида 2,4,5-T. Институт биологии УНЦ РАН, Уфа, Россия.

168

СОДЕРЖАНИЕ

СЕКЦИЯ I

РАЗНООБРАЗИЕ И ФИЗИОЛОГИЯ МИКРООРГАНИЗМОВ …….……………...… 3

СЕКЦИЯ II

МОЛЕКУЛЯРНАЯ ЭКОЛОГИЯ И ГЕОХИМИЧЕСКАЯ ДЕЯТЕЛЬНОСТЬ

МИКРООРГАНИЗМОВ…………………………………………………………………..… 71

СЕКЦИЯ III

ПЕРСПЕКТИВНЫЕ НАПРАВЛЕНИЯ МИКРОБНОЙ БИОТЕХНОЛОГИИ…….... 93

УКАЗАТЕЛЬ ИМЕН……………………………………………………………………..… 148

ПРОГРАММА КОНФЕРЕНЦИИ…………………………………………………...……. 153