Лекція 3. Лекція 3. Клональне Клональне мікророзмноження рослин.мікророзмноження рослин. Одержання безвірусного Одержання безвірусного

садивного матеріалусадивного матеріалуПланПлан

1. Завдання та переваги клонального 1. Завдання та переваги клонального мікророзмноження. мікророзмноження.

2. Типи клонального мікророзмноження. 2. Типи клонального мікророзмноження. 3. Основні етапи клонального 3. Основні етапи клонального

мікророзмноження. мікророзмноження. 4. Одержання безвірусного садивного 4. Одержання безвірусного садивного

матеріалу. матеріалу. 5. Вірусологічний контроль садивного 5. Вірусологічний контроль садивного

матеріалу.матеріалу.

1. Завдання та переваги 1. Завдання та переваги клонального клонального

мікророзмноження мікророзмноження

Клональне Клональне мікророзмноженнямікророзмноження – – масове нестатеве масове нестатеве розмноження рослин, розмноження рослин, генетично ідентичних генетично ідентичних вихідному екземпляру, вихідному екземпляру, з використанням з використанням техніки техніки in vitroin vitro

Ця біотехнологія існує Ця біотехнологія існує на на двох рівнях:двох рівнях:

--мінірівеньмінірівень - - для здійснення для здійснення швидкого розмноження унікальних швидкого розмноження унікальних рослин – донорів цінних генів, рослин – донорів цінних генів, стерильних ліній, гібридів, мутантів, стерильних ліній, гібридів, мутантів, сомаклональних варіантів для сомаклональних варіантів для селекції; селекції;

--макрорівеньмакрорівень длодержання значних длодержання значних кількостей посадкового матеріалу кількостей посадкового матеріалу вегетативно розмножуваних рослинвегетативно розмножуваних рослин

Переваги Переваги клонального клонального

мікророзмноженнямікророзмноження високі коефіцієнти розмноження (до 10високі коефіцієнти розмноження (до 1055 - -

101066 мериклонів за рік); мериклонів за рік); скорочення площ в закритому грунті, скорочення площ в закритому грунті,

зайнятих під маточними і зайнятих під маточними і розмножуваними рослинами; розмножуваними рослинами;

можливість цілорічної роботи в можливість цілорічної роботи в лабораторних умовах і планування лабораторних умовах і планування випуску рослин в необхідні строки; випуску рослин в необхідні строки;

можливість одержувати вегетативне можливість одержувати вегетативне потомство видів рослин, що важко потомство видів рослин, що важко розмножуються в звичайних умовах; розмножуються в звичайних умовах;

можливість одержувати посадковий можливість одержувати посадковий матеріал, оздоровлений від патогенів;матеріал, оздоровлений від патогенів;

можливість депонування рослин при можливість депонування рослин при низьких позитивних температурах або низьких позитивних температурах або кріозбереженнякріозбереження

2. Типи клонального 2. Типи клонального мікророзмноження.мікророзмноження.

1) активація розвитку вже 1) активація розвитку вже існуючих в інтактній рослині існуючих в інтактній рослині меристем (апекс стебла, меристем (апекс стебла, пазушні і сплячі бруньки пазушні і сплячі бруньки стебла);стебла);

2) індукція виникнення бруньок 2) індукція виникнення бруньок або ембріоїдів або ембріоїдів de novode novo..

•Схема мікроклонального розмноження рослин: а - вихідна рослина; б - різні типи експлантатів, які використовуються для мікророзмноження; в - ті самі експлантати в культурі in vitro; г - пряма регенерація рослин з існуючих в ізольованих експлантатах меристем або з меристем які утворюються з диференційованих клітин (наприклад, епідермісу) без виникнення калюсу; д - регенерація рослин з калюсу шляхом органогенезу (за: Кунах, 2005).

Останній тип ділиться на Останній тип ділиться на три три методиметоди::

а) виникнення а) виникнення організованих структур організованих структур безпосередньо із безпосередньо із спеціалізованих тканин спеціалізованих тканин експланту (тканин експланту (тканин репродуктивних органів, репродуктивних органів, епідермісу, епідермісу, субепідермальних тканин, субепідермальних тканин, мезофілу листка);мезофілу листка);

б) з первинного калусу, б) з первинного калусу, утвореного клітинами експлантуутвореного клітинами експланту

в) із субкультивованої в) із субкультивованої калусної тканини або клітин калусної тканини або клітин суспензійної культури суспензійної культури

Культура меристемКультура меристем – це асептичне – це асептичне вирощування на живильних вирощування на живильних середовищах ізольованої з апексу середовищах ізольованої з апексу або пазушної бруньки пагона або пазушної бруньки пагона апікальної меристеми з одним або апікальної меристеми з одним або двома листковими примордіями.двома листковими примордіями.

Культура апікальних меристем Культура апікальних меристем використовується для:використовується для:

1) одержання рослин, генетично 1) одержання рослин, генетично ідентичних вихідному генотипу;ідентичних вихідному генотипу;

2) одержання рослин, вільних 2) одержання рослин, вільних від патогенів;від патогенів;

3) зберігання зародкової плазми 3) зберігання зародкової плазми (кріозбереження). (кріозбереження).

Шляхи клонального Шляхи клонального мікророзмноженнямікророзмноження

1) регенерація пагонів нормальних 1) регенерація пагонів нормальних пропорцій з наступним їх поділом на пропорцій з наступним їх поділом на "однобрунькові" мікроживці, які "однобрунькові" мікроживці, які використовуються в якості використовуються в якості вторинних експлантів для вторинних експлантів для повторного циклу розмноження;повторного циклу розмноження;

2) стимуляція розвитку всіх 2) стимуляція розвитку всіх пазушних бруньок і пазушних бруньок і меристематичних бугорків в меристематичних бугорків в результаті пригнічення апікального результаті пригнічення апікального домінування первинного пагону. домінування первинного пагону. Регенеранти мають вигляд пучків Регенеранти мають вигляд пучків пагонів, кожен з яких може бути пагонів, кожен з яких може бути рекультивований з аналогічним рекультивований з аналогічним результатом результатом

Шляхи клонального Шляхи клонального мікророзмноженнямікророзмноження

Розроблено основні Розроблено основні технологічні прийоми технологічні прийоми клонального клонального мікророзмноження для мікророзмноження для значної кількості видів значної кількості видів рослин, зокрема, з рослин, зокрема, з родин родин Solanaceae, Solanaceae, Rosaceae, Asteraceae, Rosaceae, Asteraceae, Brassicaceae,Brassicaceae, Vitaceae Vitaceae

та ін.та ін.

3. О3. Основні етапи сновні етапи клонального мікророзмноженняклонального мікророзмноження

1-й етап1-й етап – ізолювання – ізолювання експланту, введення і ініціація експланту, введення і ініціація його розвитку в умовахйого розвитку в умовах in vitro in vitro;;

2-й етап2-й етап – власне – власне мікророзмноження;мікророзмноження;

3-й етап3-й етап – укорінення – укорінення мікропагонів;мікропагонів;

4-й етап4-й етап – адаптація – адаптація мікророслин до умов мікророслин до умов in vivoin vivo

Етапи клонального мікророзмноження Етапи клонального мікророзмноження лавандилаванди

1-й етап1-й етап – ізолювання експланту, – ізолювання експланту, введення і ініціація його введення і ініціація його розвитку в умовахрозвитку в умовах in vitro in vitro

2-й етап2-й етап – – власне мікророзмноженнявласне мікророзмноження

3-й етап3-й етап – – укорінення мікропагонівукорінення мікропагонів

4-й етап4-й етап – адаптація мікророслин – адаптація мікророслин до умов до умов in vivoin vivo

4. Одержання безвірусного 4. Одержання безвірусного садивного матеріалусадивного матеріалу

способами одержання способами одержання безвірусних рослин є:безвірусних рослин є:

1) відбір і розмноження здорових 1) відбір і розмноження здорових маточних рослин на основі маточних рослин на основі ранньої і точної діагностики; ранньої і точної діагностики;

2) біотехнологічні прийоми 2) біотехнологічні прийоми оздоровлення садивного оздоровлення садивного матеріалу матеріалу

Біотехнологічні Біотехнологічні методиметоди 1) культура апікальних 1) культура апікальних

меристем; меристем; 2) термотерапія; 2) термотерапія; 3) хемотерапія. 3) хемотерапія.

Культура апікальних меристем Культура апікальних меристем основується на:основується на:

1) наявності вільної від вірусів 1) наявності вільної від вірусів зони верхівкової меристемизони верхівкової меристеми

2) вірусінгібуючій дії компонентів 2) вірусінгібуючій дії компонентів живильного середовища;живильного середовища;

3) видалення вірусних часточок, 3) видалення вірусних часточок, що містяться в клітинах що містяться в клітинах меристеми, в ході диференціації. меристеми, в ході диференціації.

обеззаражування рослин від обеззаражування рослин від вірусів під дією підвищених вірусів під дією підвищених температур (найчастіше 36–42 температур (найчастіше 36–42

0С).0С).

Термотерапія - цеТермотерапія - це

МеханізмМеханізм терапевтичного ефекту терапевтичного ефекту вивчений недостатньо, і може вивчений недостатньо, і може

бути пояснений декількома бути пояснений декількома

гіпотезамигіпотезами 1) висока температура призводять до втрати 1) висока температура призводять до втрати

інфекційності вірусних часточок, викликаючи інфекційності вірусних часточок, викликаючи деструкцію їх нуклеїнової кислоти або білкової деструкцію їх нуклеїнової кислоти або білкової оболонки (у термолабільних вірусів);оболонки (у термолабільних вірусів);

2) висока температура діє на віруси через 2) висока температура діє на віруси через метаболізм рослини, викликаючи дисбаланс між метаболізм рослини, викликаючи дисбаланс між синтезом і деградацією вірусних часточок в синтезом і деградацією вірусних часточок в сторону деградації;сторону деградації;

3) під дією високих температур зростає 3) під дією високих температур зростає інгібуюча активність клітин рослини-господаря;інгібуюча активність клітин рослини-господаря;

4) під дією підвищених температур 4) під дією підвищених температур відбувається денатурація білкових вірусних відбувається денатурація білкових вірусних рецепторів клітини, які беруть участь в рецепторів клітини, які беруть участь в початкових етапах інфекційного процесу, і початкових етапах інфекційного процесу, і клітини втрачають сприйнятливість до вірусу.клітини втрачають сприйнятливість до вірусу.

ХемотерапіяХемотерапія – – застосування застосування вірусінгібуючих речовинвірусінгібуючих речовин

декілька класів речовин з прямою декілька класів речовин з прямою антивірусною активністю, які пригнічують антивірусною активністю, які пригнічують репродукцію вірусу в рослині (репродукцію вірусу в рослині (рибавірін, рибавірін, азацитидин та похідні олігоаденілатівазацитидин та похідні олігоаденілатів).).

сполуки, здатні активувати захисні сполуки, здатні активувати захисні механізми рослини та індукувати механізми рослини та індукувати системну набуту резистентність системну набуту резистентність ((бензотіадизол, стробілурин-похідні, бензотіадизол, стробілурин-похідні, саліцилова кислота, 2,6-саліцилова кислота, 2,6-дихлорізонікотинова кислота та індихлорізонікотинова кислота та ін). ).

5. Вірусологічний 5. Вірусологічний контроль садивного контроль садивного матеріалуматеріалу Технології одержання вільного від Технології одержання вільного від

вірусної інфекції посадкового вірусної інфекції посадкового матеріалу передбачають матеріалу передбачають застосування застосування вірусологічного вірусологічного контролюконтролю на всіх етапах на всіх етапах розмноження рослин. розмноження рослин.

Найбільш ефективним тестом на Найбільш ефективним тестом на наявність мінімальної кількості вірусу наявність мінімальної кількості вірусу в рослині є в рослині є імуноферментний аналіз імуноферментний аналіз (ІФА, ELISA – enzyme-linked-immuno-(ІФА, ELISA – enzyme-linked-immuno-sorbent assay). sorbent assay).

В основі ІФА лежить реакція між В основі ІФА лежить реакція між антигеномантигеном, що міститься в , що міститься в досліджуваному зразку, і досліджуваному зразку, і антитіламиантитілами до нього, міченими до нього, міченими ферментом. Антитіла виступають як специфічний детектор ферментом. Антитіла виступають як специфічний детектор антигену, а фермент – як маркер імунохімічної реакції, з допомогою антигену, а фермент – як маркер імунохімічної реакції, з допомогою якого візуалізується утворення комплексів посередництвом якого візуалізується утворення комплексів посередництвом кольорової реакції між ферментом і субстратом до нього. кольорової реакції між ферментом і субстратом до нього.

Непрямий варіант Непрямий варіант ІФАІФА

Безвірусні рослиниБезвірусні рослини відносять до категорії відносять до категорії оригінальний садивний матеріалоригінальний садивний матеріал, який , який використовується для створення використовується для створення оздоровлених маточниківоздоровлених маточників. У цих маточниках . У цих маточниках здійснюється комплекс профілактичних і здійснюється комплекс профілактичних і захисних заходів проти повторної інфекції: захисних заходів проти повторної інфекції: знищення бур’янів-резерваторів вірусів, знищення бур’янів-резерваторів вірусів, боротьба з хворобами і шкідниками боротьба з хворобами і шкідниками (можливими переносниками вірусів). (можливими переносниками вірусів). Паралельно проводиться робота з клонової Паралельно проводиться робота з клонової селекції. селекції.

Потомство оригінальних рослин – Потомство оригінальних рослин – елітний елітний садивний матеріалсадивний матеріал служить для закладки служить для закладки маточників супереліти та еліти в маточників супереліти та еліти в розсадницьких господарствах, які розсадницьких господарствах, які передають матеріал передають матеріал першої репродукціїпершої репродукції в в господарства, що спеціалізуються на господарства, що спеціалізуються на вирощуванні сільськогосподарської культури вирощуванні сільськогосподарської культури з метою одержання товарної продукції.з метою одержання товарної продукції.

Дякую за увагу!Дякую за увагу!