Оптимизация условий экспрессии в бактериальной системе и очистки зеленого

флуоресцентного белка (TagGFP2)

Крат Сергей, МБФ, гр. 4004Руководитель: н.с. ЦНИЛ Першина А.Г.

Актуальность

• Оценка эффективности трансфекции и экспрессии генетического материала в клетке

• Модельный белок для иммобилизации на наночастицах

Fluorescent Proteins and Their Applications in Imaging Living Cells and Tissues, Chudacov et. Al, 2010

TagGFP2

• Мономер• Флуоресценция (105% от

EGFP)• Не агрегирует• Не токсичен• Быстро созревает• Фотостабилен• Не требует доп.факторов

созревание флуорофора

http://www.evrogen.ru/protein-descriptions/TagGFP2-description.pdf

Задачи исследования

• Провести трансформацию E.coli XL-blue плазмидой pQE30-TagGFP2

• Оптимизировать условия экспрессии TagGFP2 в бактериальной системе

• Выделить и очистить белок TagGFP2 • Разработать методику определения

концентрации белка с использованием флуориметра

Материалы и методы

• Трансформация с использованием хлористого кальция (Маниатис, 1984)

• Оптимизация экспрессии при варьировании концентрации IPTG (0.1мМ – 1мМ) и температуры (25-40°C)

• Очистка белка с использованием Ni-NTA агарозы (Qiagen)

• Определение концентрации флуориметрическим (VersaFluor, Bio-Rad) и спекртофотометрическим методом (Лоури, Nanodrop 2000, Thermo scientific)

Планируемые результаты

• Будут подобраны оптимальные условия экспрессии, выделения и очистки флуоресцентного белка TagGFP2

• Будет получен высокоочищенный препарат TagGFP2

Благодарю за внимание!