反应 5 ：底物水平的磷酸化琥珀酰 -CoA 转化成琥珀酸，并产生 GTP 。这是三羧酸循环中唯一一个底物水平磷酸化。 琥珀酰 -CoA 的硫酯键是一个高能硫酯键，它的势能可被用来驱动磷酸键的形成。在琥珀酰 -CoA 合成酶的催化下，二磷酸鸟苷（ GDP ）磷酸化成三磷酸鸟苷（ GTP ）。

Succinyl-CoA + GDP + Pi succinate + GTP + CoASH

△G0’= -29 kJ/mol

这个反应与酵解中的两个底物水平的磷酸化类似，不同的是在动物细胞中核苷酸产物不是 ATP, 而是 GTP 。

琥珀酰 -CoA

GTP 可参与蛋白质合成。但大部分合成的 GTP 通过二磷酸核苷激酶的反应最终驱动 ATP的合成。

在植物和细菌中，通过琥珀酰 CoA 和 ADP 直接合成 ATP 。

GTP + ADP GDP + ATP G△ 0’= 0.0 kJ/mol

在合成 GTP 或 ATP 的反应中，先形成脱水的琥珀酰磷酸，然后通过使琥珀酰 -CoA 合成酶的一个特定的组氨酸磷酸化使酶活化。N- 磷酸组氨酸再把其磷酸转移到核苷二磷酸底物。

琥珀酰 -CoA 合成酶催化的反应中 N- 磷酸组氨酸残基的结构

反应 6 ：依赖于黄素的脱氢反应 6 ， 7 和 8 把 4 碳的琥珀酸转换成 4 碳的草酰乙酸。这三个反应的第一个是由琥珀酸脱氢酶催化的，依赖于 FAD 的脱氢。这是三羧酸循环中第三个氧化还原反应，琥珀酸脱氢生成延胡索酸。

氢的受体是酶的辅基 FAD，这个反应自由能变化不足以还原 NAD+ 。

FAD 是通过异咯嗪环上的第 8 （ 7 ）位碳上的甲基与酶蛋白质中的组氨酸残基上的咪唑环氮 3 连接。

黄素辅酶

有两种从维生素 B2 或核黄素 (riboflavin) 衍生出来的辅酶：· 黄素腺嘌呤二核苷酸（ flavin adenine dinucleotide, FAD ）· 黄素单核苷酸（ flavin mononucleotide, FMN ）。

异咯嗪

核糖醇

核黄素

黄素单核苷酸黄素腺嘌呤二核苷酸

还原的黄素需要再氧化以便使琥珀酸脱氢酶能再参与反应。因琥珀酸脱氢酶可直接与位于线粒体内膜的电子传递系统联接，琥珀酸脱氢产生的还原的黄素（ FADH2) 可以转移到酶的铁硫中心，然后进入电子传递系统再氧化。

琥珀酸脱氢酶中含有三种不同的铁硫簇： 2Fe-2S( 两个铁原子与两个无机硫结合 ) ， 3Fe-3S 和 4Fe-4S 。琥珀酸脱氢酶是三羧酸循环中唯一位于线粒体内膜的酶。心肌线粒体内膜提纯的酶分子量是 100000 ，由 70000 和 29000 两个亚基组成。

琥珀酸脱氢酶也有立体专一性，只形成反式异构体延胡索酸（反丁烯二酸），不形成顺式异构体马来酸（顺丁烯二酸）。马来酸不能参加代谢，对有机体有毒性。丙二酸是琥珀酸脱氢酶的竞争性抑制剂。

反应 7 ：碳 - 碳双键的水合反应 延胡索酸水化生成苹果酸

延胡索酸酶催化这个立体专一水化反应。用标记氘的实验证明 H+ 和 OH- 以反式加成，酶具有立体异构特异性， OH- 只加入延胡索酸双键的一侧，因此只形成 L- 苹果酸。延胡索酸的异构体马来酸不是这个酶的底物，这个酶也不能催化从 D-苹果酸脱水生成延胡索酸的逆反应。

延胡索酸酶分子量为 200000 ，由 4 个相同亚基组成，每个亚基含 3 个自由巯基，是 酶活性所必需的。已从猪心制备了延胡索酸酶结晶。

反应 8 ：脱氢产生进入下一轮循环的底物苹果酸脱氢生成草酰乙酸。这是三羧酸循环中第 4次氧化还原反应。 L- 苹果酸脱氢酶催化依赖于 NAD+ 的脱氢，完成循环。 NAD+ 接受氢还原成 NADH 。

在标准热力学条件下，平衡有利于逆反应。但是在生理条件下，反应产物草酰乙酸因不断合成柠檬酸而减少，使其在细胞中浓度极低，约少于 10-6mol/L，使反应向右进行。

++

三羧酸循环反应的总结 △G0’ 反应 酶 (kJ/mol)

1 乙酰辅酶 A + 草酰乙酸 + H2O 柠檬酸合成酶 -32.2 柠檬酸 + CoA-SH + H+

2a 柠檬酸 顺乌头酸 + H2O 顺乌头酸酶2b 顺乌头酸 + H2O 异柠檬酸 顺乌头酸酶 +6.33. 异柠檬酸 + NAD+ α-酮戊二酸 异柠檬酸脱氢酶 -20.9

+ CO2 + NADH + H+

4 α-酮戊二酸 + NAD+ + CoASH α- 酮戊二酸脱氢酶 -33.5琥珀酰辅酶 A + CO2 + NADH + H+

5 琥珀酰辅酶 A + Pi + GDP 琥珀酰辅酶 A合成酶 -2.9琥珀酸 + GTP + CoA-SH

6 琥珀酸 + FAD 延胡索酸 + FADH2 琥珀酸脱氢酶 07 延胡索酸 + H2O 苹果酸 延胡索酸酶 -3.88 苹果酸 + NAD+ 草酰乙酸 +NADH + H+ 苹果酸脱氢酶 +29.7

总计 -57.3

三羧酸循环反应要点：（ 1 ）两碳片段（乙酰辅酶 A ）与 4 碳受体（草酰乙酸）结合形成柠檬酸。（ 2 ）当柠檬酸进一步代谢时， 以 CO2 形式失去两个碳。（ 3 ）有 4 个氧化反应， 3 个用 NAD+作辅酶，一个用 FAD作辅酶。（ 4 ）只有一个反应直接产生高能磷酸化合物。（ 5 ）草酰乙酸再产生，以进行下一轮循环。

三羧酸循环的 8 个反应可写成一个化学平衡方程，总反应式为：

乙酰辅酶 A + 2H2O + 3NAD+ + FAD + GDP + Pi　→ 2CO2 + 3NADH + 3H+ + FADH2 + CoA-SH + GTP

在动物中，琥珀酰 CoA 合成酶反应形成的 GTP 在能量上与 ATP相等。在后面的讨论中将用 ATP 代替 GTP 。

如果考虑丙酮酸脱氢酶的反应，考虑到每分子葡萄糖产生 2 分子丙酮酸，葡萄糖通过酵解和三羧酸循环的分解代谢方程式为：

葡萄糖 + 6H2O + 10 NAD+ + 2FAD + 4ADP + 4 Pi　→ 6CO2 + 10 NADH + 10H+ + 2FADH2 + 4ATP

到此为止，每摩尔葡萄糖在这个方程式中只产生 4摩尔 ATP 。在酵解部分产生的 ATP 是 2摩尔。葡萄糖氧化产生的 ATP 大多数不是直接从酵解和三羧酸循环产生的，而是通过还原的电子载体在呼吸链中再氧化产生的。

t

三羧酸循环和氧化磷酸化所生成的 ATP

ADP ATP

葡萄糖完全氧化产生的 ATP ：每一轮三羧酸循环由琥珀酰 CoA 合成酶催化的反应产生一分子 GTP ， GTP 可产生 ATP 。共有 4 个脱氢反应，其中有 3 对电子经 NADH 进入电子传递链，最后传递给氧生成 H2O，每对电子产生 3 分子 ATP ， 3 对电子共产生 9 分子 ATP 。一对电子

经 FADH2 进入电子传递链，可产生 2 分子 ATP 。

每一轮循环共产生 1 + 9 + 2 = 12 分子 ATP 。若从丙酮酸脱氢酶的反应开始计算，共产生 15 分子 ATP 。

每分子葡萄糖可以产生 2 分子丙酮酸，因此每分子葡萄糖经酵解，三羧酸循环及氧化磷酸化 3 个阶段共产生 6 或 8 + 2X15 = 36-38 个 ATP 分子。

每摩尔葡萄糖完全氧化产生的 ATP摩尔数

2

2

2

2

葡萄糖氧化的△ G0’是 -2870kJ/mol, ATP 水解的△ G0’是 -30.5kJ/mol 。葡萄糖完全氧化能量的利用效率为 40%（ 38x30.5/2870 ）。

在标准条件下测定的值很可能要比在体内低。

糖，脂肪和某些氨基酸代谢最终产生乙酰 CoA ，通过三羧酸循环彻

底氧化成 CO2 。通过三羧酸循环进行氧化是体内最主要的产生 ATP 的途径，在生物

进化中保存下来。

三羧酸循环中碳骨架的不对称反应

乙酰 CoA经三羧酸循环产生两分子 CO2 ，草酰乙酸经循环可以再

次生成。用同位素 14C ， 13C 分别标记乙酰 CoA 的甲基及羧基碳，

发现在第一轮循环中没有标记的 CO2释放，说明释放出的两个碳原

子并非乙酰 CoA 的碳原子。

柠檬酸是对称分子，经酶催化生成的 α-酮戊二酸应可能有两个产物。若用标记乙酰 CoA 合成第一个羧基标记的柠檬酸，由此产生的 α-酮戊二酸应一半在 α羧基上标记，另一半在 γ羧基上标记，也就是α-酮戊二酸的两个羧基都应标记，但是事实上从体内分离的 α-酮戊二酸只是 γ羧基上有标记。

虽然柠檬酸是一个对称分子，但它以中间碳原子为中心形成一个四面体，且与顺乌头酸酶有三个不同作用位点，是不对称结合。 13CH2

14COO- 与 CH2COO- 不一致，是由于不对称结合造成的。柠檬酸脱水时氢原子仅来自草酰乙酸部分，所以三羧酸循环的第一轮没有标记的 CO2释出。

虽然第二轮循环开始有标记的 CO2释出，也不表明是来自乙酰 CoA ，因为琥珀酸是对称分子，所以使延胡索酸，苹果酸和草酰乙酸经第一轮循环后都出现同位素标记的碳原子。