Проблемы долговременного культивирования клеток человека и животных

Егоров Егор Евгеньевич доктор биологических наук, профессор, ведущий научный сотрудник Института молекулярной биологии им. В.А.Энгельгардта РАН

Смертные и бессмертные клеткиСмертные и бессмертные клетки

1890-е годы. Клетки асцитной опухоли 1890-е годы. Клетки асцитной опухоли

1913 1913 г. Каррель г. Каррель

1961 г. Хейфлик 1961 г. Хейфлик

Всегда можно было предположить, что какое-Всегда можно было предположить, что какое-либо новое усовершенствование техники либо новое усовершенствование техники культивирования снимет ограничения культивирования снимет ограничения пролиферативного потенциала, и клетки пролиферативного потенциала, и клетки мортальные станут иммортальными.мортальные станут иммортальными.

Схема маргинотомической редупликации ДНК (по Оловникову, 1971).

Cуществует некий счетчик, ограничивающий общее количество делений, отпущенных данной клетке.

Открытие теломеразыОткрытие теломеразы

1985 г. Грейдер и Блекборн. 1985 г. Грейдер и Блекборн. 1989 г. В клетках человека1989 г. В клетках человека..

Теломеразы - являются рибонуклеиновыми Теломеразы - являются рибонуклеиновыми ферментами. РНК-компонент теломеразы ферментами. РНК-компонент теломеразы содержит короткий район (матрицу), содержит короткий район (матрицу), комплкомплеементарный теломерной ДНК.ментарный теломерной ДНК.

CCоматические клетки лишены теломеразной оматические клетки лишены теломеразной активности. Их теломеры укорачиваются, как в активности. Их теломеры укорачиваются, как в процессе онтогенеза, так и при культивировании процессе онтогенеза, так и при культивировании клеток in vitro.клеток in vitro.

В иммортальных, в том числе в половых клетках В иммортальных, в том числе в половых клетках есть теломеразная активность, и не происходит есть теломеразная активность, и не происходит укорачивания теломер.укорачивания теломер.

Схема действия теломеразы.

При аутосомно-доминантном варианте При аутосомно-доминантном варианте наследственного дискератоза, происходят наследственного дискератоза, происходят мутации РНК, что приводит к снижению мутации РНК, что приводит к снижению теломеразной активности, укорачиванию теломеразной активности, укорачиванию теломер, и развитию преждевременного теломер, и развитию преждевременного старения в высоко пролиферирующих старения в высоко пролиферирующих тканях. тканях.

антисипацияантисипация

Причины миелодиспластических Причины миелодиспластических синдромовсиндромов

Каталитическая субъединица Каталитическая субъединица теломеразы - представитель древнего теломеразы - представитель древнего семейства обратных транскриптаз (ОТ)семейства обратных транскриптаз (ОТ)

hTERThTERT ( (human telomerase reverse human telomerase reverse transcriptasetranscriptase). ).

Отличается от других ОТ наличием Отличается от других ОТ наличием последовательности, называемой “T-мотив’’ последовательности, называемой “T-мотив’’

Гомологии обратных транскриптаз. Т - теломеразные мотивы;.

Эволюционное дерево обратных транскриптаз.

Структура гена hTERT. Черным обозначены экзоны, серым - нетранслируемые районы. Т -

теломеразный мотив, 1, 2, A, B’, C, D, E - мотивы обратных транскриптаз. 1, α, β, 2,3,4 - сайты альтернативного сплайсинга.

МЕХАНИЗМЫ РЕГУЛЯЦИИ ТЕЛОМЕРАЗНОЙ МЕХАНИЗМЫ РЕГУЛЯЦИИ ТЕЛОМЕРАЗНОЙ АКТИВНОСТИАКТИВНОСТИ

Амплификация гена Амплификация гена hTERThTERTАльтернативный сплайсинг Альтернативный сплайсинг hTERThTERT

Метилирование не ответственно за репрессию Метилирование не ответственно за репрессию hTERThTERT в соматических клетках. в соматических клетках.

Некоторые раковые клеточные линии, Некоторые раковые клеточные линии, экспрессирующие hTERT, обладают экспрессирующие hTERT, обладают гиперметилированными промоторными гиперметилированными промоторными районами hTERT.районами hTERT.

Промоторная область Промоторная область hTERThTERT..

СредиСреди факторовфакторов транскрипциитранскрипции, , известныхизвестных каккак активаторыактиваторы hTERT, hTERT, онкобелоконкобелок c-Myc c-Myc являетсяявляется наиболеенаиболее хорошохорошо изученнымизученным..

Считают, что белок вируса папилломы Считают, что белок вируса папилломы EE6 6 способен активировать транскрипцию способен активировать транскрипцию hTERT hTERT совместно с с-совместно с с-MycMyc. .

Негативные регуляторы hTERT, это факторы Негативные регуляторы hTERT, это факторы транскрипции MZF-2, p53, транскрипции MZF-2, p53, MeninMenin и Mad1. и Mad1.

MeninMenin (продукт гена опухолевого супрессора (продукт гена опухолевого супрессора MENMEN 1). Мутации в гене 1). Мутации в гене MENMEN1 приводят к 1 приводят к множественным эндокринным неоплазиям множественным эндокринным неоплазиям ((MENMEN). Подавление транскрипции ). Подавление транскрипции Menin Menin вызывает активацию транскрипции вызывает активацию транскрипции hTERThTERT, , появление теломеразной активности, появление теломеразной активности, удлинение теломер и иммортализацию удлинение теломер и иммортализацию нормальных фибробластов человека. нормальных фибробластов человека.

Подавление!!!Подавление!!! экспрессии экспрессии hTERThTERT может может быть стратегией вирусного канцерогенеза. быть стратегией вирусного канцерогенеза. Онкоген Онкоген Tax Tax вируса Т-клеточной лейкемии вируса Т-клеточной лейкемии человека (человека (HTLVHTLV-1) блокирует транскрипцию -1) блокирует транскрипцию hTERThTERT. Блокирование теломеразы происходит . Блокирование теломеразы происходит на ранних стадиях заражения лимфоцитов, на ранних стадиях заражения лимфоцитов, что вместе с бесконтрольным усилением что вместе с бесконтрольным усилением пролиферации и инактивацией пролиферации и инактивацией pp53 53 способствует быстрому накоплению мутаций способствует быстрому накоплению мутаций и, в дальнейшем, к раковой эволюции клеток.и, в дальнейшем, к раковой эволюции клеток.

ТЕЛОМЕРЫТЕЛОМЕРЫ

Цитологи называют теломерами концевые Цитологи называют теломерами концевые участки хромосом, видимые в световом участки хромосом, видимые в световом микроскопе. Это очень большие структуры, микроскопе. Это очень большие структуры, охватывающие районы в миллионы пар охватывающие районы в миллионы пар оснований ДНК. оснований ДНК.

Молекулярные биологи имеют дело со Молекулярные биологи имеют дело со значительно меньшим концевым районом значительно меньшим концевым районом хромосомы, перекрывающим тысячи хромосомы, перекрывающим тысячи нуклеотидных пар. Именно с этими нуклеотидных пар. Именно с этими теломерами оперирует теломерная теория.теломерами оперирует теломерная теория.

Разнообразие теломерной ДНК

субъединица теломерного повтора

Организм

TTAGGG

Все позвоночные, Nicotiana tabacum и виды Aloe,Physarum polycephalum, Didimium iridis,Histoplasma capsulatum,Trypanosoma brucei,два вида класса Polychaeta, некоторые муравьи и ракообразное Asellus aquaticus

TTTAGGGРастения: Arabidopsis thaliana, рожь, кукуруза, ячмень, пшеница

TTTTAGGG Chlamydomonas reinhardtii

TTAGGБольшинство насекомых, некоторые ракообразные

TTAGGC Нематоды, Caenorhabditis elegans

TTGGGG Tetrahymena thermophila

TTTTGGGG Euplotes crassus

G1-8A Dictyostelium discoideum

TG2-3(TG)1-6 Saccharomyces cerevisiae

Повтор 53 нуклеотидаTetrahymena thermophila (митохондриальная ДНК)

Повтор 350 нуклеотидов Chironomus tentans

Повтор 375 нуклеотидов Лук (Allium cepa) и некоторые лилейные

Ретротранспозоны HeT-A (~6 kb) и TART (~10 kb)

Drosophila melanogaster

Согласно теории недорепликации, образуется только

один одноцепочечный

участок на две новосинтезирован

ные теломеры.

Расчеты показывают, что последовательности, содержащие повторяющиеся кластеры GGG могут легко образовывать неканонические структуры (триплексы, квадруплексы).

Гуанины внутри тетрады стабилизируются Хугстеновскими водородными связями.

Планарная структура из 4 гуанинов,

стабилизированнаяХугстеновскими

водородными связями.

Возможное участие квадруплексов в

биологических процессах

Различные варианты G-4 структур.

Теломерная ДНК формирует петли. В силу ограничения свободного вращения, ДНК в петле имеет напряженную конформацию. При укорачивании теломерной ДНК вследствии недорепликации, наступает момент, когда длина теломерного повтора не позволяет образоваться петле. Теломерный конец ДНК приобретает свободную конформацию, которая воспринимается клеткой, как сигнал повреждения. В результате запускается механизм пролиферативного старения клеток.

М1-М2 гипотеза иммортализации клеток человека

Белки различных опухолевых ДНК-содержащих вирусов способны увеличивать пролиферативный потенциал клеток человека и тем самым обходить (отменять) М1. Этими свойствами обладают Т-антиген SV40, антигены Е6/Е7 вируса папилломы человека типа 16, антигены Е1а/Е1в аденовируса типа 5.

В реализации М1 участвуют белки р53 и рRb. Вероятно пролиферативный блок при М1 опосредуется факторами типа р21, которые подавляют активность комплексов циклин/CDK.

Обход (отмена) М1 позволяет клеткам Обход (отмена) М1 позволяет клеткам пролиферировать дополнительное время (для пролиферировать дополнительное время (для фибробластов человека - около 30-40 фибробластов человека - около 30-40 удвоений популяции), пока второй механизм удвоений популяции), пока второй механизм (М2) не вызовет состояние кризиса. (М2) не вызовет состояние кризиса.

Кризис характеризуется процессом Кризис характеризуется процессом пролиферации, сопровождающимся массовой пролиферации, сопровождающимся массовой гибелью клеток. При этом размер популяции гибелью клеток. При этом размер популяции какое-то время может быть стабильным. С какое-то время может быть стабильным. С низкой вероятностью после кризиса могут низкой вероятностью после кризиса могут

возникнуть иммортальные клетки.возникнуть иммортальные клетки.

ОСОБЕННОСТИ КЛЕТОК ЧЕЛОВЕКА

Механизмы старения в кризисных клетках либо инактивированы, либо уничтожены.

Бессмертные клетки человека в культуре появляются только после продолжительного пребывания в состоянии кризиса.

Частота спонтанной трансформации диплоидных фибробластов человека примерно на порядок ниже частоты спонтанного мутационного события.

Реактивация теломеразы происходит в 85% опухолей.

Клетки не нуждаются в теломеразной активности на ранних стадиях канцерогенеза, поскольку имеют достаточной длины теломеры.

Большинство опухолевых клеток человека изначально начинают пролиферацию из-за изменений в регуляции роста, но не из-за реактивации теломеразы.

КРИЗИС (M2)

Механизмы, ограничивающие рост клеток во время кризиса, когда происходит чрезвычайное (полное) укорачивание теломер отличаются от механизмов остановки пролиферации во время старения, когда длина теломер составляет несколько тысяч оснований.

Кризис начинается, когда отдельные, самые короткие теломеры полностью исчезают. Дальнейшее укорачивание прямо или косвенно ведет к потерям генетического материала, несовместимым с жизнью клетки.

В любой момент в клетке существует самая короткая теломера. Процесс репликации такой теломеры приводит к образованию полной копии и укороченной. Клетка с укороченной копией умирает, в то время как другая клетка продолжает размножаться.

Процесс повторяется.

Гипотеза, объясняющая длительное поддержание размера популяции во время кризиса.

Теломеры кризисных клеток воспринимаются клеткой как двуцепочечные разрывы.

Эти разрывы чиняться путем теломерных слияний.

Образуются дицентрики.

Происходят ряд событий слияние-мост-разрыв

Многократно возрастает генетическая изменчивость

Облегчается реактивация теломеразы

Последовательные этапы клонирования при развитии опухоли.

РОЛЬ РЕПРЕССИИ ТЕЛОМЕРАЗЫ В ПРОТИВОРАКОВОЙ ЗАЩИТЕ.

2 50 = 1 тонна

Если положить, что в среднем частота мутаций 1 на 106 клеток, то каждое такое событие потребует примерно 20 генераций (220 = 106). Значит, для образования опухоли потребуется, в среднем, от 60 до 140 генераций.

Как видно, ограничение в 50 удвоений вполне достаточно для остановки роста большинства опухолей на еще не диагностируемых стадиях.

Поскольку примерно 90% опухолей человека обладают теломеразной активностью, можно утверждать, что реактивация теломеразы участвует в канцерогенезе.Прямым свидетельством в пользу этого является обнаружение онкогена, кодирующего субъединицу теломеразы у куриного вируса болезни Марека (опухоль). Хотя сама по себе экспрессия теломеразы не нарушает регуляцию

роста клеток, однако она является “разрешением” для разного рода измененных клеток эволюционировать в составе организма. Такая эволюция неизбежно приводит к злокачественной опухоли.

Почему репрессия теломеразы ненадежна в клетках мыши, а в клетках мелких холоднокровных организмов (рыб, раков) она вообще отсутствует?

Если сравнить человека и мышь в единицах клетка-деление, то мы получим различия примерно в 100 000 раз.

Если не принимать в учет проблемы, связанной с канцерогенезом, то экспрессия теломеразы является позитивным признаком. Для клеток - это поддержание стабильности генома, для организма - это возможность регенерации.

В эволюции должна вырабатываться некая средняя стратегия регулирования экспрессии теломеразы, в зависимости от многих параметров: продолжительности жизни, размера организма, его температуры, метаболизма и пр.

Нетеломеразные способы удлинения Нетеломеразные способы удлинения теломертеломер

ALTALT - альтернативные способы удлинения - альтернативные способы удлинения теломер у человекателомер у человека

Примерно в 5% опухолей человека теломеры Примерно в 5% опухолей человека теломеры поддерживаются без участия теломеразы. поддерживаются без участия теломеразы. Необычайно высокая доля Необычайно высокая доля ALTALT обнаружена в обнаружена в мультиформных глиобластомах - 25%. мультиформных глиобластомах - 25%.

Значение теломеразы в диагностике опухолей

Способы подавления опухолей, Способы подавления опухолей, опосредованные теломерами и теломеразойопосредованные теломерами и теломеразой

ИммунотерапияИммунотерапияИспользование промоторов теломеразыИспользование промоторов теломеразыБыстрый запуск репликативного старенияБыстрый запуск репликативного старенияМодифицированные нуклеозиды и Модифицированные нуклеозиды и нуклеотидынуклеотидыВведение в клетки гена, кодирующего Введение в клетки гена, кодирующего антисмысловую последовательность к РНК антисмысловую последовательность к РНК компоненту теломеразы компоненту теломеразы Введение в клетки олигонуклеотидов, Введение в клетки олигонуклеотидов, комплементарных РНК компоненту комплементарных РНК компоненту теломеразы.теломеразы.РНК-интерференцияРНК-интерференцияБлокирование сборки теломеразыБлокирование сборки теломеразы

Ненуклеотидные мелкие молекулы - ингибиторы теломеразы

теломестатин

Принцип подавления теломеразы соединениями, стабилизирующими квадруплексы.

ТЕЛОМЕРИЗАЦИЯ КЛЕТОКТЕЛОМЕРИЗАЦИЯ КЛЕТОК

Теломеризация не ведет к злокачественной Теломеризация не ведет к злокачественной трансформации трансформации

Теломеризация не только иммортализует клетки, Теломеризация не только иммортализует клетки, но и меняет экспрессию ряда генов. но и меняет экспрессию ряда генов. increased expression of active b-catenin increased expression of active b-catenin ((Wnt pathway Wnt pathway ))

Теломераза влияет на работу митохондрий.Теломераза влияет на работу митохондрий.

В 2001г. были подобраны условия культивирования, при которых эпителиальные клетки иммортализуются при помощи введения только одного гена hTERT.

Клетки надпочечниковТеломеризованные клетки оказались способными формировать функциональную ткань надпочечников при трансплантации в мышей SCID.

Стромальные клетки костного мозгаКлетки поджелудочной железыКлетки печениХондроцитыБета-клетки островков Лангерганса,лечение диабета

Telomerase gene therapy in adult and old mice delays aging and increases longevity without increasing cancer

Increased median and maximumlongevity of AAV9-mTERT treated mice.

Bruno Bernardes de JesusElsa VeraKerstin Schneeberger Agueda M. Tejera Eduard AyusoFatima BoschMaria A. Blasco

EMBO Mol Med2012, 4, 1–14

insulin sensitivity, osteoporosis, neuromuscularcoordination and several molecular biomarkers of aging