Χρωμοπλάστες

Το χρώμα των ανθέων σε πολλά φυτά οφείλεται στην παρουσία ειδικών χρωστικών ουσιών. Το χρώμα οφείλεται στην εκλεκτική απορρόφηση κάποιου τμήματος του ορατού φωτός και την ανάκλαση των υπολοίπων. Η απορρόφηση αυτή μπορεί να οφείλεται σε συζυγιακά συστήματα των χρωστικών ουσιών.Οι χρωστικές συντίθενται συνήθως με τη δράση ειδικών ενζύμων των φυτών. Αποθηκεύονται δε σε ειδικά οργανίδια του κυτταροπλάσματος, τους χρωμοπλάστες, που ανήκουν στην ευρύτερη κατηγορία των πλαστιδίων, όπως είναι οι χλωροπλάστες.

Χρωμοπλάστες σε ΗΜ

Υπάρχουν διάφορες κατηγορίες χρωστικών ουσιών. Κλασική είναι η αναφορά στις ανθοκυανίνες, οι οποίες προσδίδουν ένα κοκκινο-μωβ χρώμα. Επίσης, οι φλαβονόλες δίνουν άσπρο χρώμα, τα καροτενοειδή δίνουν κίτρινο-πορτοκαλί χρώμα.Οι ανθοκυανίνες συμπεριφέρονται ως δείκτες, κι έτσι ανάλογα με το pH του περιβάλλοντος αλλάζουν χρώμα. Μάλιστα το φυτό προκαλεί ποικιλομορφία του pH στο άνθος κι έτσι προκύπτουν ποικιλόμορφοι χρωματισμοί σε αυτό. Λόγου χάρη, οι ανθοκυα-νίνες, από κόκκινο σε μωβ και μπλέ αυξανομένου του pH.

Απομόνωση χρωστικών από πέταλα

1. Παίρνουμε μια μικρή σχετικά ποσότητα πετάλων από ένα είδος λουλουδιού και τη λειοτριβούμε σε πορσελάνινο γουδί με 1-2 ml αιθανόλη, περίπου 70%.

2. Χύνουμε το διάλυμα της χρωστικής σε δοκιμαστικό σωλήνα

Μελέτη των οξεοβασικών ιδιοτήτων διαφόρων τύπων λουλουδιών

Στο παρόν πείραμα εξετάστηκαν μακροσκοπικά οι οξεοβασικές ιδιότητες των χρωστικών διαφόρων τύπων λουλουδιών. Τα αποτελέσματα φαίνονται στον παρακάτω πίνακα. Ωστόσο, το γεγονός ότι το υλικό ήταν πρωτογενές, κι όχι καθαρό, εξηγεί και το ότι σε αλκαλικό περιβάλλον το χρώμα γινόταν πράσινο συνήθως, αλλά μετά επανερχόταν στη μορφή που αντιστοιχεί στο όξινο ή ακόμη και στο φυσιολογικό χρώμα του λουλουδιού. Ενδέχεται να εξηγείται με τη δράση ενδοκυτταρικών ενζύμων ή άλλων συστατικών των πετάλων, που επηρεάστηκαν από το αντίστοιχης οξύτητας περιβάλλον. Τέλος, το ότι σε κάποιες περιπτώσεις το αρχικό χρώμα ταυτίζεται με το χρώμα κάποιας από τις δύο περιπτώσεις, δείχνει ότι και στο φυσικό του περιβάλλον, το φυτό έχει επιλέξει την αντίστοιχη οξεοβασική κατάσταση.

Άνθος (φυσικό χρώμα)

Χρυσάνθεμο (λιλά)

Χρυσάνθεμο(κόκκινο)

Πανσες (μωβ)

Ανεμώνη(μωβ)

Χρώμα (όξινο pH) Φούξια (κοκκινωπό)

Φούξια Φούξια (ροζε)

Κόκκινο

Χρώμα (αλκαλικό pH)

Πράσινοκίτρινο

Πράσινοπορτοκαλί

Πράσινο σκούρο πορτοκαλί

Κίτρινο

Άνθος (φυσικό χρώμα)

Ζέρμπερα (κόκκινη)

Τουλίπα (πορτοκαλί)

Τουλίπα(ροζ)

Τριαντάφυλλο(κόκκινο)

Χρώμα (όξινο pH) Κόκκινο Πορτοκαλί Πορτοκαλο-κόκκινο

Τριανταφυλλί φωτεινό

Χρώμα (αλκαλικό pH)

Λαδί φωτεινό πορτοκαλί

Πορτοκαλο-κεραμυδί

Πράσινο φωτεινόκίτρινο

Καφέ-κεραμυδί

Άνθος (φυσικό χρώμα)

Γαριδάκι Τουλίπα κόκκινη

Τουλίπα πορτοκαλί - κόκκινο

Σκυλάκι ροζ

Χρώμα (όξινο pH) Φούξια

Χρώμα (αλκαλικό pH)

Λαδί κιτρινωπό φωτεινό

Παρατήρηση: το πράσινο χρώμα που αρχικά εμφανίζεται και μετά αντικαθίσταται από το αντίστοιχο χρώμα, πρέπει να οφείλεται στην παρουσία διαφόρων μορίων όπως οι ημικινόνες, που αρχικά αντιδρούν στο όξινο ή το αλκαλικό pH και έπειτα επιστρέφουν στην αρχική κατάσταση.

1

Ηλεκτροφόρηση χρωστικών λουλουδιών

Α) Υλικά-μέθοδοιΥλικά για αυτοσχέδια συσκευή ηλεκτροφόρησης:

Πλαστικό δοχείο, στην περίπτωσή μας τρυβλίο Petri Αγαρόζη (ή άγαρ) Πλαστικό υλικό για την κατασκευή χτενακίου 7-10 μπαταρίες των 9V 2 ακροδέκτες (καλώδια με πιαστράκια) Αλουμινόχαρτο

Υλικά για ρυθμιστικό διάλυμα (buffer) ηλεκτροφόρησης: Μαγειρική σόδα Απιονισμένο νερό

Υλικά για προετοιμασία δείγματος για ηλεκτροφόρηση: Γλυκερόλη Σταγονόμετρα ή πιπέττες Pasteur

Υλικά προς ηλεκτροφορητικό διαχωρισμό: Χρωστικές που απομονώθηκαν στο προηγούμενο πείραμα και μίγματα τους

Β) Πορεία

Προετοιμασία συσκευής ηλεκτροφόρησης

Χτενάκια:

Παίρνουμε υλικό, και με βάση το πατρόν σχεδιάζουμε με μολύβι τα χτενάκια..Στη συνέχεια κόβουμε τα χτενάκια με βάση το σχέδιό μας, χρησιμοποιώντας το ψαλίδι ή το χαρτοκόπτη και το χάρακά μας.

Σημασία έχουν τα εξής:

Το υλικό που θα χρησιμοποιηθεί να έχει το κατάλληλο πάχος ώστε να δημιουργηθούν πηγαδάκια πάχους 1-2 mm περίπου.

Τα δοντάκια να είναι τέτοιου βάθους, ώστε ο ‘πάτος’ από τα πηγαδάκια να απέχει τουλάχιστον 3-5mm από τον πάτο της συσκευής. Αυτό πρέπει να έχει προβλεφθεί κατά την κατασκευή του πατρόν, λαμβάνοντας υπόψη:1) τις διαστάσεις του δοχείου που θα χρησιμοποιηθεί και 2) το πάχος του τζελ της αγαρόζης που θα φτιάξουμε.

Τα χτενάκια πρέπει να μπορούν να τοποθετηθούν με ακρίβεια πάνω στα τοιχώματα του δοχείου, έτσι ώστε να μην κουνιούνται και να δημιουργηθούν τα πηγαδάκια με ακρίβεια. Αυτό έχει επίσης προβλεφθεί κατά την κατασκευή του πατρόν.

Τα ‘δοντάκια’ της χτένας να είναι καλοσχηματισμένα έτσι ώστε να σχηματιστούν καλά και τα ‘τετράγωνα’ πηγαδάκια στο πήκτωμα της αγαρόζης.

Ενδεικτικές διαστάσεις πηγαδιών: Πλάτος 5 mm, απόσταση από πάτο 2-3 mm, πάχος 1-2 mm.

Κατασκευή συσκευής:

Τοποθετούμε από ένα κομμάτι αλουμινόχαρτο στις δύο αντίθετες πλευρές του δοχείου Συνδέουμε τις μπαταρίες σε σειρά. Αρκεί να ενώσουμε το θετικό πόλο της πρώτης με τον

αρνητικό πόλο της δεύτερης, και το θετικό πόλο της δεύτερης με τον αρνητικό της τρίτης κοκ.

2

Στη συνέχεια τοποθετούμε τους ακροδέκτες στους ελέυθερους πόλους των μπαταριών και, αφότου προετοιμάσουμε τα δείγματα και τα φορτώσουμε στα πηγαδάκια, το ποθετούμε τους ακροδέκτες στα αλουμινόχαρτα, όπως φαίνεται στο σχήμα. Έτσι, το κύκλωμα είναι κλειστό και διαρρέεται από ρέυμα. Η ηλεκτροφόρηση ξεκίνησε!

Παρασκευή ρυθμιστικού διαλύματος (buffer): Για να παρασκευάσουμε διάλυμα 1% w/v, αρκεί να διαλύσουμε 1g μαγειρική σόδα σε 100 ml

νερού.

Πηκτή αγαρόζης (τζελ): Για να υπολογίσουμε το πάχος του τζελ, όταν αυτό στερεοποιηθεί στο δοχείο, αρκεί να

εφαρμόσουμε τον τύπο του όγκου στερεού σώματος (από τη γεωμετρία), αναλόγως με το σχήμα του δοχείου, αρκεί αυτό να είναι ορθογώνιο παραλληλεπίπεδο ή κυλινδρικό. Αν έχει άλλο σχήμα, μπορούμε να ογκομετρήσουμε έμμεσα το δοχείο με ογκομετρικό κύκλινδρο και νερό.Ενδεικτικά, ένα πάχος 5-7 mm είναι αρκετό.

Για την παρασκευή του πηκτώματος μπορούμε να χρησιμοποιήσουμε αγαρόζη ή, επειδή αυτή μπορεί να είναι ακριβή, μπορούμε να χρησιμοποιήσουμε εναλλακτικά άγαρ (όχι όμως nutrient agar)

Για να παρασκευάσουμε μια πηκτή αγαρόζης με περιεκτικότητα 1% σε αγαρόζη, διαλύουμε 1g αγαρόζης (¼ της κουταλιάς του γλυκού) σε 100ml (¼ του φλυτζανιού) buffer.

3

Θερμαίνουμε το διάλυμα ώστε να διαλυθεί πλήρως η αγαρόζη και τότε (πριν βράσει) την απομακρύνουμε και την ψύχουμε στους 50ο C, δηλαδή περίπου ωσότου γίνει ανεκτή από το δέρμα.

Αν τυχόν στερεοποιηθεί, απλώς την ξαναζεσταίνουμε! Αποχύνουμε το διάλυμα στο δοχείο και αμέσως τοποθετούμε προσεκτικά τα χτενάκια. Η απόσταση των πηγαδιών πρέπει να είναι περίπου 2-3 cm από το αλουμινόχαρτο του ενός

πόλου. Αφήνουμε το διάλυμα να πήξει, στάδιο κατά το οποίο προετοιμάζουμε τα δείγματά μας.

Σημείωση: η συσκευή πρέπει να βρίσκεται σε επίπεδη επιφάνεια. Αφότου πήξει το τζελ, αφαιρούμε τα χτενάκια αργά και προσεκτικά, κι έτσι ο κενός χώρος

που απομένει αποτελεί τα πολυπόθητα πηγαδάκια, στα οποία θα ‘φορτώσουμε’ τα δείγματα. Επειδή κατά την ηλεκτροφόρηση θα δημιουργηθούν φυσαλίδες από την ηλεκτρόλυση του

νερού, κόβουμε με μαχαίρι μια λωρίδα 1cm περίπου πριν από τα χτενάκια και στο άλλο άκρο του τζελ.

Γεμίζουμε το δοχείο με buffer, έτσι ώστε να καλύπτει το τζελ κατά 0,5 cm περίπου.

Προετοιμασία δειγμάτων για ηλεκτροφόρηση

Όταν βάλουμε το καθένα δείγμα στο πηγαδάκι του, πρέπει αυτό να μείνει μέσα στο πηγαδάκι και να μην βγει. Γι’αυτό, το αναμιγνύουμε με γλυκερόλη, η οποία έχει μεγάλο σχετικά ειδικό βάρος, κι έτσι το δείγμα θα ‘καθίσει’ μέσα στο πηγαδάκι.

Eπειδή τα δείγματα θα μετακινηθούν κατά μήκος του τζελ, πρέπει να ξέρουμε ανά πάσα στιγμή πού βρίσκονται, έτσι ώστε να μην φτάσουν στο τέρμα του τζελ. Γι’αυτό, στην περίπτωση που είναι άχρωμο το δείγμα μας, προσθέτουμε και 1 σταγόνα χρωστικής μπλε της βρωμοφαινόλης. Στην περίπτωση των χρωστικών δε χρειάζεται, φυσικά.

Παίρνουμε διαδοχικά από μια μικρή ποσότητα κάθε δείγματος και την τοποθετούμε στο πηγαδάκι της. καταγράφουμε ποιο δείγμα βάλαμε σε κάθε πηγαδάκι. Η τεχνική της τοποθέτησης είνια ίσως το πιο απιτητικό στάδιο και θα μπορόυσαν οι μαθητές να εξασκηθούν σε αυτό. Ωστόσο υπάρχουν κι άλλες τεχνικές λεπτομέρειες.

Εκτέλεση της ηλεκτροφόρησης

Συνδέουμε τους πόλους της μπαταρίας με τη βοήθεια των ακροδεκτών. Τώρα το σύστημά μας δαιρρέεται από ηλεκτρικό ρεύμα και τα μόρια του δείγματος κινούνται κατά μήκος του τζελ της αγαρόζης, το καθένα με διαφορετική ταχύτητα. Έτσι διαχωρίζονται!

Όταν το μέτωπο της ηλεκτροφόρησης φτάσει στο τέρμα, ή τουλάχιστον όταν προκύψουν διακριτές ζώνες των συστατικών του δείγματος, σταματάμε την ηλεκτροφόρηση αποσυνδέοντας τους ακροδέκτες (ανοικτό κύκλωμα).

Καταγράφουμε τις παρατηρήσεις μας.

4

Γ) Εφαρμογή: Ηλεκτροφορητικός διαχωρισμός χρωστικών που απομονώθηκαν από λουλούδια.

Στην εφαρμογή αρχικά αξιολογήθηκε η ηλκτροφορητική ικανότητα των χρωστικών που απομονώθηκαν από τα οκτώ είδη λουλουδιών που αναφέρθηκαν στο πρώτο πείραμα. Εκτός από το τριαντάφυλλο που δεν έδειξε να επηρεάζεται από το ηλεκτρικό πεδίο, σε όλες τις άλλες περιπτώσεις οι χρωστικές έτρεξαν.

Από τη συγκριση του τρόπου με τον οποίο η κάθε χρωστική έτρεξε, παρατηρήθηκε ότι κάποιες έχουν κοινή περίπου συμπεριφορά (σε τάση περίπου 60V) και έτσι δεν ενδείκνυνται για διαχωρισμό, όταν βρεθούν σε μίγμα. Αντιθέτως, κατά τη δοκιμαστική εκτέλεση του πειράματος παρατηρήθηκε ότι η χρωστική του μωβ πανσέ και της κόκκινης ζέρμπερας έδειξαν αρκετά διαφορετικό πρότυπο. Η κόκκινη ζέρμπερα ‘τρέχει’ πιο γρήγορα από τον πανσέ κι έτσι αποφάσισα να εφαρμόσω το διαχωρισμό σε αυτές τις δύο χρωστικές, το οποίο μετά από δοκιμές φάνηκε να πετυχαίνει (σε τάση όμως μεγαλύτερη από 60V). Αρχικά φαίνεται καθαρά η διάκριση μιας κεραμυδί ζώνης (ζέρμπερα) που αποχωρίζεται από την μπλε σκούρα (πανσές). Αργότερα βέβαια δυσχεραίνεται η διάκριση των δύο ζωνών γιατί τόσο τα χρώματα ατονούν, όσο και οι ζώνες διασπείρονται (smear) αφού οι χρωστικές στην πραγματικότητα αποτελούν μιγματα ουσιών που υπήρχαν στα πέταλα.

Η εφαρμογή λοιπόν περιλαμβάνει:

Παρατήρηση της ηλεκτροφορητικής δραστηριότητας των δύο χρωστικών ξεχωριστά.

Παρατήρηση του διαχωρισμού του μίγματος των δύο χρωστικών σε δύο διακριτές ζώνες, κατανόηση της έννοιας του διαλύματος δύο ουσιών σε κοινό διαλύτη.

Βιβλιογραφία – Hλεκτρονικές διευθύνσεις:

1. Raven, P.H., Evert, R.F., & Eichorn, S.E. (1999). Biology of plants (6th ed.). New York: W. H. Freeman and Company/Worth Publishers.

2. Hopkins, W.G. (1999). Introduction to plant physiology (2nd ed.) Toronto, ON: John Wiley & Sons.

3. Scientific American, Ελληνική Έκδοση, τέυχος 1ο Ιανουάριος 1999

4. Τhe Cell , Alberts , Oxford University Press

5

5. http://www.nexusresearchgroup.com/fun_science/fun_sci.htm .

6. www.caliban.mpiz-koeln.mpg.de/~stueber/snapdragon/ biochemistry/anthocyanin.html

6