МЕТОД ГОМОЗИГОТИЗАЦИИ

МАТЕРИАЛА В КУЛЬТУРЕ ИЗОЛИРОВАННЫХ

МИКРОСПОР ЯЧМЕНЯ Работа выполнена в рамках гранта МОН РК по теме: «Технология культуры изолированных микроспор в создании генетически однородных и стабильных сортов ячменя»№ гос. регистрации 0112РК02744

Цель исследований: - Повышение частоты регенерации in vitro сортов ячменя в

культуре изолированных микроспор; -Оптимизация параметров культуры клеток и регенерации

растений in vitro; - Отработка первичного протокола культуры микроспор

ячменя Задачи исследований:

- Отбор сортов ячменя для улучшения биотехнологическими методами. Выбор условий для дигаплодизации генотипов ячменя в массовых масштабах.

- Цитологические методы определения плоидности растений.

- Отработка эффективной технологий ускоренной гомозиготизации генотипов ячменя (культура микроспор).

- Разработка культур микроспор выбранных сортов, регенерация растений, удвоение хромосом.

Сбор и подготовка колосьев

1. длина верхнего междоузлия – 16-18 см, длина колоса – 4.5-6.5 см

2. длина верхнего междоузлия – 9,5-12,5 см, длина колоса – 3.5-5 см

Рисунок 1.

9,5-12,5 cм16-18 cм

Культура изолированных микроспор

РИСУНОК 2. Микроспоры: A - свежевыделенные; B - после деления

Развитие из культуры микроспоры

Рисунок 3.

1 – эмбриоидо-подобные структуры (каллусы, эмбриоиды) на питательной среде

2 – меристемати-ческие очаги на регенерационной питательной среде

Развитие из культуры микроспоры

Рисунок 4.

1 – растения на питательной среде для регенерации

2 - доращивание растений-регенерантов в грунте

Таблица 1 – Влияние стадии развития микроспор в пыльниках ячменя на частоту формирования новообразований на

индукционной среде В

Сорта и линии ячменя

Фаза развития микроспор

% пыльников с новообразованиями

поздняя одно-

ядерная

ранняя дву-

ядерная поздняя одно-

ядерная

ранняя дву-

ядерная

Айдын 36 34 0.45 ± 0.84 0.32 ± 0.06

Байшешек 31 35 0.37 ± 0.08 0.20 ± 0.14

Береке 54 39 35 2.74 ± 0.108 0.27 ± 0.03

№275-1 40 42 4.57 ± 0.108 0.41 ± 0.39

Таблица 2 - Влияние источника углеводов на регенерацию растений, сорт Байшешек

Вариант опыта

Количествоновообра-зований,

шт.

Частота регенерации

Количество зеленыхрастений

Количество альбиносов

штук % штук % штук %

6% сахароза 175 94 53,7 75 80,5 19 19,5 6% мальтоза 95 67,4 73,4 64 98,4 2 1,6 6% сахароза+ актив. уголь

97 25 25,8 10 44,1 15 56,8

Fфакт. - - 24,2 - 22,6 - 22,6 НСР05 - - 12,4 - 13,1 - 13,1

Таблица 3 – Питательная среда B для предобработки микроспор

Компоненты среды мг/л

KCl 1490

MgSO4 x 7H2O 250

CaCl2 x H2O 150

Маннитол (0.3 M) 54 630

pH=7.0

Таблица 4 – Питательная среда А для культивирования микроспор

Компоненты среды мг/л KNO3 2830

(NH4)2SO4 463

KH2PO4 400

CaCl2 x2H2O 166

MgSO4 x 7H2O 185

Fe-EDTA 5 мл из 100-x MS

B5-витамины 1 мл из 1000-x стока

B5 микросоли 1 мл из 1000-x стока

Мальтоза 90 000

МЕС буфер 1950

Глютамин 500

pH=6,2

Оценка плоидности растений-

регенерантов

Рисунок 5. 1- диплоид, 2 – гаплоид

1 2

Таблица 5 - Протокол получения дигаплоидов ячменя

в культуре изолированных микроспор

1 этап – Сбор и подготовка колосьев на стадии незрелых соцветий: отбор растений в поздней одноядерной стадии развития микроспор, предобработка изолированных колосьев низкими температурами при +4°+5°C в течение 21-28 суток.

2 этап - Выделение и обработка пыльников: стерилизация колосьев, выделение пыльников на жидкую питательную среду В. Цитологический анализ.

3 этап – Изолирование и очищение микроспор: гомогенизация (300об/мин х 90сек), фильтрация, центрифугирование (900об/м х 3мин), флотирование интактных клеток в градиенте 20% мальтозы, центрифугирование (850об/м х 5мин), смешивание фракции микроспор со средой. Инкубирование эксплантов в темноте 28 дней при 25°C.

Продолжение таблицы №5

4 этап – Деление микроспор и разбавление культуральной среды: после 1-ой недели микроспоры начинают делиться и образуют колонии, каллусы и эмбриоиды. В чашки Петри добавляют среды А с уменьшенным содержанием мальтозы (20 мг/л).

5 этап - Регенерация и укоренение: пассирование эмбриоидоподобных структур на твердую регенерационную среду (MS соли + витамины + 0,1мг/л зеатина + 0,01мг/л гибберелловой кислоты). Через 3-4 недели образовавшиеся растения-регенеранты переносятся на среду для укоренения (1/2 MS соли + витамины + 15 г/л сахарозы).

6 этап – Удвоение хромосом. Контроль уровня плоидности. Пересадка в грунт, опрыскивание раствором ГК. Получение семенного материала. Кариологический и биохимический контроль полученных дигаплоидов.

- Приготовление питательных сред и стерилизации материала, инструментов по Ф.Л.Калинину и др., 1980.

- Выделение микроспоры и получение гаплоидов ячменя по методам гаплоидной технологии по А.М.Тураеву и др., 1990; АЦФГР, 1997.

- Цитоэмбриологические анализы по методике З.П. Паушевой, 1974.

- Статистическая обработка – В.П.Доспехов 1987;

Методика проведения НИР

- Выращивание донорных растений; - Сбор и подготовка колосьев на стадии незрелых

соцветий; - Воздействие холодом (холодовой стресс) пыльников; - Стерилизация колосьев; - Выделение пыльников в асептических условиях; - Подготовка питательных сред; - Изолирование и очищение микроспор; - Наблюдения за делением микроспор; - Перенос эмбриоидоподобных структур на твердую регенерационную среду; - Колхицинирование гаплоидных растений ячменя; - Высадка регенерантов в грунт.

1. Заявление на патент РК на изобретение в РГКП «НИИС» “Способ создания генетически однородных и стабильных дигаплоидных генотипов ячменя на основе культуры изолированных микроспор.” Регистрационный №2013/0085.1 от 29.01.13. Башабаева Б.М., Абугалиева А.И., Исмагул А.Ж.

2. Башабаева Б.М. А.Ж. Исмагул, А.И. Абугалиева, Б.Ш. Алимгазинова, Б.С. Сариев. Культура изолированных микроспор в создании генетически однородных и стабильных дигаплоидных генотипов ячменя //Биотехнология. Теория и практика. Май. 2013.

С П А С И Б О З А

В Н И М А Н И Е!