高锰酸钾吸收曲线绘制 双缩脲法测定蛋白质 蛋白质各种定量方法优缺点的比较

综合性设计性实验 -1

此实验共包括如下三个部分1. 第一部分：高锰酸钾吸收曲线绘制2. 第二部分：双缩脲法测定蛋白质3. 第三部分：蛋白质各种定量方法优缺点的比较

试剂使用规则 使用试剂前应该仔细辨认标签，看清名称及浓度，是否为本实验所需。 取出试剂后，立即将瓶塞盖好，放回原位；未用完的试剂决不可倒回原瓶。 取标准溶液时，应该将标准溶液倒入干试管中，再用干净吸管吸取标准液，以免污

染瓶中的标准液体。 使用滴管时，滴管尖端朝下，避免试剂流入橡皮帽内。 使用有毒试剂及强酸强碱时，尽可能用量筒取，若用吸管只能用吸耳球取，切勿用

嘴吸取，以免造成意外。

吸量管的使用 正确拿法：中指和拇指拿住吸管上端，食指顶住吸量管顶端。 移液管的使用：使用时应根据需量取的液体体积，选用能一次吸取即可的最小规格的移

液管，以减少误差，如用 5 ml 移液管吸取 4.5 ml 蒸馏水，用 0.5 ml 的移液管吸取 0.5

ml 0.0125% 的高锰酸钾溶液。取液：用吸耳球吸取液体至刻度上，眼睛看着液面上升；吸完后用食指顶住吸量管上端。

调刻度：吸量管与地面保持垂直，下口与试剂瓶接触，并成一角度；用食指控制液体下降至最上一刻度处；液体凹面、刻度和视线应在一水平面上。

放液：吸量管移入准备接受溶液的容器中，使其出口尖端接触器壁，并成一角度，吸量管仍保持垂直。放开食指，使液体自动流出。吸量管应最后靠壁 15 秒。

吸量管上端标有“吹”字。将所量液体全部放出后，还需要吹出残留于管尖的溶液。此类吸量管为“吹出式”，未标“吹”字的吸量管，则不必吹出管尖的残留液体， 0.5ml 以下的都要吹。

吸量管尖应接触受器内壁，但不应插入受器内的原有液体之中，以免污染吸量管及试剂。

吸取血液、尿、组织样品、粘稠试剂或有颜色的吸量管，用后应及时用自来水冲洗干净。如果吸取一般试剂的吸量管可不必马上冲洗，待实验完毕后，用自来水冲洗干净，晾干备用。

吸量管的使用注意事项

一般玻璃仪器：如试管、烧杯、锥形瓶等，先用自来水洗刷后，用洗衣粉刷洗，再用自来水反复冲洗，最后用蒸馏水淋洗 2 ～ 3 次，干燥备用。

容量分析仪器：吸量管、滴定管、容量瓶等，先用自来水冲洗，待晾干后，再用铬酸洗液浸泡数小时，然后用自来水充分冲洗，最后用蒸馏水淋洗 2 ～ 3 次，干燥备用。

比色杯：用毕立即用自来水反复冲洗。洗不净时，用盐酸或适当溶剂冲洗，再用自来水冲洗。避免用碱液或强氧化剂清洗，切忌用试管刷或粗糙布 ( 纸 ) 擦拭。

上述所有玻璃器材洗净 ( 以倒置后器壁不挂水珠为干净的标准 ) 后，根据需要晾干或烘干。

玻璃器皿的清洗方法

分光光度法 光是一种电磁波，通常用频率和波长来描述光。 人的视觉所能感觉到的光称为可见光，波长范围在 400 ～ 760nm ，人的眼睛感觉不到

的还有红外光（波长大于 760-5000000nm）、紫外光（波长 200-400nm）、 X射线等。 在可见光区，不同波长的光呈不同的颜色，但各种有色光之间并没有严格的界线，而

是由一种颜色逐渐过渡到另一种颜色。

溶液的颜色与吸收光颜色的关系

Beer-Lambert 定律－吸收光谱法基本定律 描述物质对单色光吸收强弱与厚度和待测物浓度的关系。 含义：一束单色光通过溶液时，光能被吸收的程度与溶液的浓度和液层厚度成正比。

A ＝ KCL 或 lgI0/I =KCL

A 为溶液对光的吸光度，反映了物质对光的吸收程度；C 为溶液浓度；L为溶液厚度；I0 为照射待测物质的单色光强度， I为透过待测物质光线的光强度，透光度T= I/I0 即溶液透过光的强度与入射光的强度之比；K 为吸光系数，是物质在单位浓度和单位厚度的条件下对入射光的吸光度。实验中溶液厚度不变，则 A ＝ KC

光吸收示意图

I0 I

b

C

吸收光谱和物质的定性分析 物质的吸收光谱与物质分子结构有关。 吸收光谱曲线是物质的特征曲线。用各种不同波长的光线作为入射光测定物质的吸光度

（ Absorbance ），然后以波长（ λ）为横轴，相应的吸光度（ A）为纵轴，按结果作图，可得到该物质的吸收光谱曲线，这种曲线体现了物质对不同波长的光的吸收能力。

在一定的温度、 pH值等条件下吸收光谱的曲线形状是一定的。在吸收光谱中，往往可找到一个或几个吸收最大值，该处的波长称为最大吸收波长（ λmax ）。物质不同，它们的最大吸收波长也往往不同。

不同浓度的 VitB12 溶液对相同波长的光的不同吸收

µg/ml

A

λ＝ 550nm

原理：根据物质对于入射光的特征吸收，可应用于物质溶液的定性检测 比较吸收光谱曲线：在相同的条件下，吸收光谱曲线不同，表明物质的化学结构不同。 比较最大吸收波长：不同物质的最大吸收波长不同；化学结构相似的物质最大吸收波长相同，吸收系数不同。

比较吸光度的比值：多用于检测物质的纯度（ DNA A260/A280=1.8 纯度鉴定 )

物质定性分析常用方法

物质的定量分析 标准曲线法 配制一系列不同浓度的标准溶液，用选定的显色剂显色。选用合适波长的入射光。测定时先以空白溶液调节透光率100%，然后分别测定标准系列的吸光度。以吸光度为纵坐标，浓度为横坐标作图得到一条通过原点的直线，叫做标准曲线（或称 A-C 曲线）。

标准管法 对个别样品进行测定，且 A-C 曲线线性良好直接比较测定结果。 A 标 =K 标 c 标 b 标

A 测 =K 测 c 测 b 测 c 测 =A 测 /A 标 ×c 标

分光光度计的基本构造

仪器中光源经过单色器中的单色原件（如棱镜），所得到的单色光（入射光）进入样品室，透出的光被受光器（光电池或光电色）产生光电流，放大后在测量仪上显示出吸光度（ A）或透光度（ T）。

光 源 单色器 样品室 受光器 测量器

722 分光光度计使用方法 接通电源，打开仪器电源开关，打开样品室盖，预热 10min;

将空白液或对照液及测定液分别装入比色杯 3/4 体积并用擦镜纸擦净外壁，放入样品室内 , 空白液一般放于最外格，样品比色杯放入位置与试管位置对应 ;

调好波长 ;

调节按钮 开盖时，调 T 参数 调为 100

合上盖，调 A 参数 调为 0;

逐步拉出样品室拉杆（听到“咔”一声），读取吸光度值 (A ） ;

读数完打开样品室盖，再将读数写入记录本。

722 分光光度计使用注意事项 样品室盖应轻开轻放； 比色皿拿其磨砂面，液体装入约3/4高度，并用擦镜纸擦净外壁，每次用完后自来水

冲洗干净，倒置于滤纸上； 倒取试剂时不能在仪器表面上方操作，仪器上请勿放任何物品； 每调换一次波长，都应将空白溶液的吸光度调至“ 0” 。

第一部分 高锰酸钾吸收曲线的绘制

实验目的 掌握分光光度计的原理、操作和应用 能够熟练使用移液管

实验原理高锰酸钾水溶液对不同波长的光线可有不同的吸收程度。用 722 型分光光度计测定相应波长下的高锰酸钾吸光度并作图可得吸收曲线，分析高锰酸钾溶液的最大吸收波长。

实验操作 取 0.0125％高锰酸钾溶液 0.5m1 ，加蒸馏水 4.5ml ，作为测定管 ;另用蒸馏水作为空白

管； 用 722型分光光度计测定不同波长的吸光度， 从 450nm 至 500nm ，每隔 10nm ； 502nm 至 538nm ，每隔 2nm ； 540nm 至 560nm ，每隔 10nm ； 在座标纸上以吸光度 (A) 为纵座标，波长 (nm) 为横座标，绘制吸收曲线，并指出最大吸

收波长； 熟练 722 分光光度计的操作，在不进行测量时样品室盖应打开； 两人合作，一人操作分光光度计，一人记录数据。

第二部分 双缩脲法测定蛋白质含量

实验目的了解和掌握双缩脲测定蛋白质浓度的原理和方法。

蛋白质在强碱性溶液中与稀硫酸铜溶液作用产生颜色反应，生成紫红色化合物，称为双缩脲反应。

具有两个或两个以上肽键的化合物皆有双缩脲反应，蛋白质在碱性溶液中，能与Cu2+形成紫红色络合物，颜色深浅与蛋白质浓度成正比，故可以用来测定蛋白质的浓度。

在一定的浓度范围内，颜色的深浅与蛋白质含量呈线性关系。因此可用比色法测定蛋白质浓度。

NH

O

NHNH

O

NH

C

C

NH

O

NH

O

NH

C

C加热180 C�o

+NH

2

2

2

2

2

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实验原理

紫红色铜双缩脲复合物分子结构

在分光光度法中，许多不吸收光的无色物质可以用显色反应变成有色物质，使之能进行比色测定，并能提高测定的灵敏度和选择性。在比色分析或分光光度分析中，将待测组分转变成有色化合物的反应叫做显色反应，与待测组分反应生成有色化合物的试剂叫显色剂。

在实际分析中，同一待测组分可与多种显色剂发生显色反应，生成不同的有色物质。为了保证测定的灵敏度和准确度，在分析时常需对显色反应进行选择，选择原则如下：

1. 选择性好，干扰少或干扰易消除； 2. 灵敏度要高； 3. 生成有色化合物的组成恒定，化学性质稳定； 4. 生成的有色化合物与显色剂之间的颜色须有明显的差别，最大吸收波长之差大于 60nm 。

显色剂与显色反应

管号试剂 0 1 2 3 4 5 6

牛血清标准蛋白溶液（ml ） 2mg/ml — 0.6 1.2 1.8 2.4 3.0 0

待测蛋白液（ml） — — — — — — 3.0

蒸馏水（ml） 3 2.4 1.8 1.2 0.6 0 0

蛋白质浓度（mg/ml） 0 0.4 0.8 1.2 1.6 2.0 未知

实验步骤1. 按下图表所示加入相应的试剂或样品

2. 各管混匀后加入双缩脲试剂 3.0ml ，充分混匀；3. 37 度水浴 30min ；4. 在 540nm 处以 0号管调零点测定各管吸光度；5. 绘制标准曲线：以吸光度为纵坐标，蛋白质浓度为横坐标；6. 对照标准曲线，求待测蛋白质浓度。

读数时要注意读的是 A 的值； 注意正确标记试管（用记号笔清晰标记于试管 2/3 高处）； 准确记时。

注意事项

第三部分：蛋白质各种定量方法优缺点的比较 此部分要求学有余力的学生，主要是参加大学生课外科研项目的学生，在教师指导下，利用课余时间，通过互联网络查询相关资料进行系统综述，最好是评述。

对于较好的综述或评述将登载在汕头大学医学院生物化学与分子生物学教学网站上。

给予该生当年期末生物化学与分子生物学课程基本原理与基本理论部分开卷考试部分免试奖励。而该生的相应部分成绩，由辅导教师根据综述或评述的情况给出，并记入总分。

这充分体现了实验课是理论课的基础，实验课为理论课服务，二者的有机综合十分有助于培养学生分析、归纳以及总结问题的能力。