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九十六年度教育部 「生物及醫學科技人才培育先導型計畫」 基因體與蛋白質體醫學暑期學分班課程表. PART II. 主題: 細胞轉染技術與分析 運用流式細胞儀觀察細胞程式性死亡. 課程名稱 : 進階實驗課程 B— 細胞科技實驗 學分數 :1 學分 ( 實驗 ) 負責教師 : 黃昭祥、 楊堉麟 、葉怡玲 授課時間 :96/08/04, 05, 11, 12 教室 : 尖端生物技術科技人才培育計畫實驗室. 基因表現產物之分析 SEAP: 實驗規劃. 96 well( 一 , 二組 ). - PowerPoint PPT Presentation
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課程名稱 : 進階實驗課程 B—細胞科技實驗 學分數 :1學分 ( 實驗 )負責教師 : 黃昭祥、楊堉麟、葉怡玲 授課時間 :96/08/04, 05, 11, 12教室 : 尖端生物技術科技人才培育計畫實驗室
主題:•細胞轉染技術與分析 •運用流式細胞儀觀察細胞程式性死亡
PART II
96 well( 一 , 二組 )1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12
A
B P NRKCONNF-kB
NRKCON
C-Myc
NRKBMP
2 NF-kB
NRKBMP
2C-
Myc
BMP:
1ug
C
D
E
F P NRKCONNF-kB
NRKCON
C-Myc
NRKBMP
2 NF-kB
NRKBMP
2C-
Myc
BMP:2ug
G
H
96 well( 三 , 四組 )1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12
A
B P NRKCONNF-kB
NRKCON
C-Myc
NRKBMP
2 NF-kB
NRKBMP
2C-
Myc
BMP:4ug
C
D
E
F P M13CONNF-kB
M13CON
C-Myc
M13BMP
2 NF-kB
M13BMP
2C-
Myc
BMP:1ug
G
H
96 well( 五 , 六組 )1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12
A
B P M13CONNF-kB
M13CON
C-Myc
M13BMP
2 NF-kB
M13BMP
2C-
Myc
BMP:2ug
C
D
E
F P M13CONNF-kB
M13CON
C-Myc
M13BMP
2 NF-kB
M13BMP
2C-
Myc
BMP:4ug
G
H
訊息誘導出的轉錄因子(蛋白質)
SEAP 分泌型鹼性磷酸酵素
SEAP 基因
BMP-2基因產物誘導 SEAP基因表現 (本次實驗)
BMP-2 基因
Signal transduction
BMP2
receptor
pMyc-SEAP
Myc element
訊息誘導出的轉錄因子(蛋白質)
SEAP 分泌型鹼性磷酸酵素
SEAP 基因
BMP-2基因產物誘導 SEAP基因表現 (本次實驗)
BMP-2 基因
Signal transduction
BMP2
receptor
pMyc-SEAP
Myc element
實驗設計用意探討 BMP-2基因表現是否可以誘導特定轉錄因子表現。
SEAP DETECTION SYSTEM
WHY
原理簡介
WHY 冷光 better than 螢光 ?LOW BACKGROUND:HIGH S/N RATIOHIGH SENSITIVITY (due to above reasons)EVEN BETTER THAN ISOTOPE
偵測波長決定偵測靈敏度
靈敏
Gamma-ray X-ray 冷光 螢光 可見光
偵測波長決定偵測解析度
解析度
Gamma-ray X-ray 冷光 螢光 可見光
0.1mm1nm0.1nm
EMS FMS LMS
m
Pathway Profiling System Detection system一 . 材料 :Assay Buffer , chemiluminescent enhancer , 5X
Dilution Buffer , 25mM CSPD (冷光受質) Positive control placental alkaline phosphatase 二 . 試驗前配置的working solution : 1. 1X Dilution Buffer : 以 Mini-Q water 將 5X
Dilution Buffer 做 1:5 稀釋2. 1.25mM CSPD Substrate working solution : 將
25mM CSPD chemiluminescent substrate 與chemiluminescent enhancer 做 1:19 稀釋
各重要成分介紹
三 . 步驟 :1. 將 15l sample 加到 96-well plates 的每個 well 裡2. 再加入 45 l 的 1X Dilution Buffer 至每個 sample well 中
,混合均勻3. 將 step 2 的 diluted sample 在 65Oc的水浴漕裡,反應 30分鐘
4. 反應 30 分鐘後,再將 96-well plate 放在冰上 2~3 分鐘回溫5. 再加入 60l 的 Assay buffer 至每個 sample well 裡,反應
5 分鐘6. 再加入 60l 的 diluted CSPD Substrate 至每個 sample
well 中,反應 10 分鐘7. 並在 step6 之後的 30 分鐘內,以 x-ray 方式壓片 /洗片(定影 , 顯影)
Why heating 65’C 考
Why Assay buffer Rx 5 ‘ 考
預期結果P NRK
CONNF-kB
NRKCON
C-Myc
NRKBMP
2 NF-kB
NRKBMP
2C-
Myc(第一組為例)
結論?
結論?
結論?
結論?
結論?
預期結果
結論?
(第一組為例 BMP: 1ug )
(第二組為例 BMP: 2ug )
(第三組為例 BMP: 4ug )
P NRKCONNF-kB
NRKCON
C-Myc
NRKBMP
2 NF-kB
NRKBMP
2C-
Myc
使用細胞NRK: NORMAL RAT KIDNEY (fibroblast
cells)MDCK: MADIN DARBY CANINE KIDNEY
(tubule)M13: MURINE MESANGIAL CELLS
Apoptosis 組別實驗內容規劃.壹 NRK 、 NRK+ 植物萃取物 A
.貳 NRK+ 植物萃取物 B 、 NRK+H2O2
.參 NRK+pCMV-BMP2
.肆 M13 、 M13 +BSA
.伍 MDCK 、 MDCK+Mannitol 、 MDCK+H2O2
.陸 M13 +H2O2
步驟1. 首先將上清液移至 15ml 離心管。2. 加入 1ml 的 PBS wash 細胞,勿沖洗避免細胞剝落。3. 將上清液移至步驟 1 的離心管。4. 加入 1ml 的 Tyrpsin 在 37℃ 反應 5min 。5. 加入 3ml 的 PBS 將細胞洗下並移到步驟 1 的離心管。6. 加入 3ml 的將細胞徹底洗下並移到步驟 1 的離心管。7. 使用 2000 rpm 離心細胞 5min 後,再以同轉數再離心 1min 。8. 倒去上清液,並可使用 200μl 的 Tip 吸乾殘餘的 PBS ,移入 Flow
管。9. 加入 100uL 染劑 , 於 RT 培養 30 分鐘 , 持續震盪10. 加入 200μl 的 Binding buffer 並充分混合均勻。11. 上機分析,分析前請再次混合均勻避免細胞沉澱。 Read FL-1 (Annexin) and FL-2 (PI)
試劑置備與參數設定staining sol’n配製: 32μl annexin V-FITC + 800 μL binding
buffer + 32 μL Propidium iodine(PI) = 600μl Flow cytometer設定參數P1 - FSC LinP2 - SSC LinP3 – FL-1 (Annexin-V) LogP4 – FL-2 (PI) Log
Detection of ROS
Introduction
盡可能避光
H2DCFDA
IntracellularEsterase
Oxidized by ROS
黃綠螢光
Detect by Flow cytometer
ROS DETECTION PRINCIPLE
1. 刺激時間終了後 此盤刺激過的細胞不做任何變動 並加入約 50uM/ml ( 1mM stock solution 加 100μl 至各 well )的 H2DCF-DA 在 37℃ 反應 30min 。
2. 把上清的 medium 移到 15ml 離心管 。3. 使用 2ml PBS wash 細胞然後把 PBS 移到步驟 2 的離心管。4. 再加入 2ml PBS 並在室溫反應 10min 。5. 將此 PBS 移到步驟 2 。6. 加入 0.5ml trypsin 在 37℃ 反應 5 min 。7. 然後使用步驟 2 的離心管內的 PBS+Medium 的混合液沖洗細胞並移到步驟 2 。8. 以 2000 rpm 離心 5min 。9. 倒去上清液 , 再加入 2 ml PBS 並 mix 細胞,使細胞打散。10. 再以 2000 rpm 離心 5min 。11. 倒去上清液 , 然後再加入 1 ml Flow cytometer 專用的 PBS 並混 合均勻。12. 將步驟 11 移動到 Flow cytometer 專用的試管13. 上機分析上機分析,分析前請再次混合均勻避免細胞沉澱。
實驗步驟
NRK
CON CON+DCFH CON+DCFH
植物萃取物A + DCFH
第 1 組 實驗組別規劃
植物萃取物A + DCFH
植物萃取物A + DCFH
植物萃取物 A 對纖維母細胞氧化壓力的影響
NRK
CON CON+DCFH CON+DCFH
第 2 組
植物萃取物B + DCFH
植物萃取物B + DCFH
植物萃取物B + DCFH
植物萃取物 B 對纖維母細胞氧化壓力的影響
NRK
CON CON+DCFH CON+DCFH
pCMV-BMP2+DCFH
第 3 組
BMP-2 基因表現對纖維母細胞氧化壓力的影響
pCMV-BMP2+DCFH
pCMV-BMP2+DCFH
M13
CON CON+DCFH BSA+DCFH
H2O2+DCFH BSA+DCFHH2O2
第 4 組 ( 只做上面一排 )
H2O2 與白蛋白對腎絲球細胞氧化壓力的影響
MDCK
CON CON+DCFH Mannitol+DCFH
CON+DCFH Mannitol+DCFH
CON
第 5 組
高滲透壓對遠端腎小管細胞氧化壓力的影響
M13
CON CON+DCFH BSA+DCFH
H2O2+DCFH BSA+DCFHH2O2
第 6 組 ( 只做下面一排 )
高 H2O2 或白蛋白對腎絲球細胞氧化壓力的影響
預期結果
ControlDCFH
Treatment +DCFH
( 增加 ROS) ( 不增加 ROS)