北京大学生物基础实验教学中心 创新性实验教学项目汇报

2007-12-21

序号

项目名称 所属学科类别

负责人 完成时间

经费万元

1 斑马鱼发育特异基因表达 in situ 杂交 遗传发育 樊启昌 2010 1 ． 5

2 斑马鱼发育相关基因的过量表达和对发育影响的观察

遗传发育 樊启昌 2010 1 ． 5

3 线虫的 RNA 干涉 遗传发育 滕俊琳 2010 1 ． 5

4 线虫发育相关基因的诱变 遗传发育 滕俊琳 2008 0 ． 5

5 线虫突变品系互补实验判定两个隐形突变基因是否为等位基因

遗传发育 滕俊琳 2008 1 ． 5

6 线虫突变基因拯救实验 遗传发育 滕俊琳 2008 1

发育相关基因的表达，诱变及其功能研究

发育生物学实验

7 植物形态与植物基因转化及其转基因植物鉴定 普通生物 佟向军 2010 1

8 无脊椎动物的比较解剖： 体腔、循环、神经等系统的比较

普通生物 许崇任 2009 1,5

9 脊椎动物的比较解剖：循环、骨骼（中轴骨）等系统的比较

普通生物 许崇任 2009 1.5

10 斑马鱼早期胚胎发育过程的研究及显微注射操作技术

普通生物 佟向军 2010 1

11 转基因斑马鱼及对水环境污染的反应——环境监测

普通生物 佟向军 2010 1.5

12 抑菌物质的筛选与环境中微生物的检测 普通生物 殷 莹 2010 0.5

普通生物学实验

13 绿色，红色，黄色荧光蛋白（ GFP ， RFP,YFP ）的基因克隆及表达（设计实验）

分子生物 文 津 2007 1

14 融合蛋白（ GFP 与 GST ）的基因克隆和表达（设计实验）

分子生物 文 津 2007 1

15 增强型绿色荧光蛋白（ EGFP ）突变基因 (BFP) 在大肠杆菌中的表达与检测（设计实验）

分子生物 郝福英 2008 1

16 双报告基因系统的构建及其初步检测（设计实验）

分子生物 郝福英 2009 1.5

17 携带报 携带报告基因 EGFP 的温度敏感型表达载体的构建、鉴定和表达量的测定（设计实验）

分子生物 郝福英 2009 1

18 利用重组 利用重组酵母，以绿色荧光蛋白作为报告基因检测环境中雌二醇含量（设计实验）

分子生物 郝福英 2010 1.5

分子生物学实验

19 利用双向电泳对蛋白质进行分析鉴定 生物化学 周先碗 2007 1

20 细胞凋亡的发生与凋亡细胞的检测 细胞生物 张丽君 2007 1

21 北温带落叶阔叶林带植物群落次生演替的分析及其演替实质的探讨

植物学 饶光远 2007 0.5

22 生长激素对白皮松微管形成层活动的影响

植物学 饶光远 2007 0.5

实验教学平台

分子生物学实验题目（ 1—6）

题目一 GFP蛋白的基因克隆及表达

DH5αα(pEGFP(pEGFP--N3N3))

DH5αα(pET(pET--28a28a))

质粒提取

质粒提取

质粒pEGFP-N3

质粒pET-28a

BamH I

BamH I

Not I

Not I

插入片断

载体片断

回收

回收

连接

重组质粒

pET-28a-GFP

转化

转化

BL-21(?)

DH5αα(?)(?)

菌落PCR鉴定

酶切鉴定

菌落PCR鉴定

酶切鉴定

BL-21pET-28a-GFP

质粒质粒pET-28a-GFP

诱导表达

检测结果

转化BL-21

pET-28a-GFP

诱导表达

检测

1

pEGFP-N3

4700bp

P MCS(591-665)

EGFP

BamH I (661)

Not I (1398)

重组图示

1

pET-28a5369bp

lacI (773-1852)

pBR322 origin

Kan

(399

5-48

07)

f1 origin

T7 Promoter (386)

Not (166)BamH (198)

1

pET-28a-GFP6019bp

lacI (773-1852)

pBR322 origin

Kan

(399

5-48

07)

f1 origin EGFP

T7 Promoter (386)

Not I

BamH I

• PCR的粘性末端克隆法（简称PCR法）

我纯化的EGFP 我纯化的EGFP 我纯化的EGFP干品

由定点突变改造的EGFP经肉眼即可分辨出其自发荧光

野生型绿色荧光蛋白（wtGFP）在紫外光激发下发出微弱的绿色荧光，经过对其发光结构域特定氨基酸的定点改造，EGFP能在可见光的波长范围被激发（吸收区红移），发光强度比原来强上百倍。

题目二 EGFP基因在 pGEX-4T-1载体中的克隆和表达

构建 EGFP-pGEX重组质粒 重组质粒的获得、阳性克隆的筛选鉴定、蛋白质表达和分析PCR基因扩增、 DNA的限制性内切酶酶切、 DNA连接及质粒转化、DNA 序列分析、蛋白质转移等

绿色荧光蛋白（GFP） 我院开设的普通生物学实验通选课中，已经使用了GFP，反响较好

研究得较为透彻、科研中常用

片段较小，较易于重组 改造后的EGFP，在可见光或长波紫外线激发下发射绿色荧光，直观的实验事实更易于引起学生兴趣

实验流程

重组质粒EGFP-pGEX的获得以及阳性克隆的筛选和鉴定（两种方案）

重组质粒的测序 EGFP-GST融合蛋白的诱导表达和蛋白质转移

题目三 增强型绿色荧光蛋白（ EGFP ）突变基因在大肠杆菌中的表达与检测

Expression and detection of site-directed mutagenic EGFP gene in E.coli

EGFP 的定点突变：实验目的原理： EGFP 家族中的几个成员 CFP 、 YFP 等与 EGFP有很高的同源性，本实验

利用已有的 EGFP 序列通过定点突变技术得到 CFP 、 YFP 等同源蛋白的 DNA序列并对表达产物进行观察与分析。

实验内容：查找 EGFP 、 CFP 、 YFP 等同源蛋白的碱基序列；通过碱基序列的对比分析设计引物进行定点突变实验；筛选阳性突变体并对表达产物进行观察分析。

实验室提供的实验材料：大肠杆菌 E.coli菌株 DH5α、 BL21，质粒 pET－ 28a － EGFP/pEGFP-N3，各种实验器材及实验试剂

突变原理突变原理11: PCR: PCR重叠延伸法重叠延伸法

（1） （2）

（3）

实验中学到用到的实验技术： DNA 定点突变技术

突变原理突变原理22：：大引物合成法大引物合成法

P1

PCR 1: P1+P3

PCR 2: Megaprimer+P2

P2

*

*

Megaprimer*

P3*

*

*Megaprimer

重组质粒在BL21(DE 3)中的表达情况（1）

分别离心10mL培养菌液

EGFP EGFPY67H

重组质粒在BL21(DE 3)中的表达情况（2）

经过镍柱纯化的蓝色荧光蛋白与绿色荧光蛋白（紫外光激发）

题目四 双报告基因系统的构建及其初步检测

Why this subject is selected?

1. 构建双报告基因质粒（ Luciferase-GFP ）， ★ GFP 作为信号蛋白，用于定性鉴定， ★ Luciferase 作为报告蛋白，用于定量检测，做到灵敏、准确的检测生物系统中目的蛋白、核酸等的变化。

2. 优化 Touchdown PCR 的条件，为分子生物学实验增加了一种选择。

What have I done?

★ 构建质粒 pET 28a-Luciferase

★ 构建质粒 pET 28a-Luciferase-GFP

★ 重组质粒表达情况的初步鉴定

Luciferase

Sal IEcoR I

Sal I EcoR I

6.9kb 图2 重组过程图

ResultsResults1 2 3 4

1号管：转入重组质粒pET28a-Luciferase-GFP BL21菌株表达结果2号管：转入重组质粒pET28a-Luciferase BL21菌株表达结果3号管：未转化质粒的BL21菌株表达结果4号管：转入pET28a-GFP BL21菌株表达情况

荧光素酶浓度标准曲线

y = 4E+15x - 150R2 = 0. 9999

1. 00E+001. 00E+011. 00E+021. 00E+031. 00E+041. 00E+051. 00E+061. 00E+071. 00E+081. 00E+09

1. 00E-14 1. 00E-12 1. 00E-10 1. 00E-08 1. 00E-06

题目五 携带报告基因 EGFP 的温度敏感型表达载体 的构建、 鉴定和表达量的测定

Why this subject is selected?

★ 对分子生物学教学实验的改进： 温度诱导概念的引入 ★ 诱导方便，精确调控 ★ 适用于多种菌株，缩短实验流程 ★ 酶切效率高，价格便宜 ★ EGFP 的定量检测What have I done?

★ 重组质粒 pBV220-EGFP 的构建 ★ 绘制 EGFP 的浓度 - 荧光强度的标准工作曲线

绘制EGFP的浓度-荧光强度的标准工作曲线

浓度（mg/mL）

0 0.002 0.005 0.01 0.02 0.05 0.1

荧光强度（ × 1000）

0.0301 0.12320 0.78807 4.61498 12.0506 41.3431 81.7732

EGFP -的浓度 荧光强度的标准工作曲线

y = 0. 0012xR2 = 0. 9923

0

0. 02

0. 04

0. 06

0. 08

0. 1

0. 12

0 20 40 60 80 1001000荧光强度（乘以 ）

mg/mL

浓度（

）

用Excel处理数据：

pBV220-EGFP的表达量随温度变化的曲线图

012345678

30 32 34 36 38 40 42 (温度 摄氏度）

(mg/

L)表达量

30323436384042

用origin7.5处理数据：

在不同温度下诱导 EGFP 表达量变化： 定性： SDS-PAGE 定量：用荧光仪测定破碎菌体上清中 EGFP 的 荧光强度 ,将不同温度下诱导得到的 EGFP 表达量对温度进行回归，建立数学模型

题目六 利用重组酵母，以绿色荧光蛋白作为报告基因检测 环境中雌二醇含量

雌二醇与雌激素受体（ estrogen receptor ）结合后，此复合物会与细胞核染色体上特异调控元件 ERE （ estrogen response element, E

RE ）结合并启动下游报告基因的表达。

我们通过一系列实验构建两个质粒分别将雌激素受体 hRE 与 ERE －报告基因（ GFP ）重组并转化感受态酵母细胞。这样构建好的酵母细胞株经不同浓度雌二醇

诱导作用后 , 下游报告基因 (GFP) 表达量会有雌二醇浓度依赖的剂量效应关系。

我们希望最终能通过检测下游报告基因蛋白质产物的表达量实现对外源雌激素含量的定性 / 定量监测。

探究酵母 GFP 荧光强度与雌二醇诱导浓度的关系表 1 不同浓度雌二醇诱导表达 GFP荧光强度

Times A1 A2 A3 A4 A5 A6

1 233.343 245.463 243.26 252.623 237.455 245.463

2 236.967 246.234 244.317 245.396 236.987 245.227

3 236.439 246.449 244.567 253.073 237.15 245.377

平均值 235.583 246.0487 244.048 250.364 237.1973 245.3557

雌二醇浓度 nmol/L 0 0.1 0.5 1 5 10

以雌二醇浓度为 X轴， GFP荧光强度为 Y 轴，绘制曲线。

关系曲线

225

230

235

240

245

250

255

0 0. 1 0. 5 1 5 10nmol / L雌二醇浓度

荧光强度

进一步改进实验的建议 :

我们很想进一步改进实验，真正的完成一个比较圆满的结局，无奈大实验时间有限。所以如果以后还有人继续进行这个实验的话，可以在我们的基础上进行：

1. 我们的鉴定只是初步的，继续做这个题目的同学可以先那我们的质粒 去测序，分析以下测序结果，包括是否有突变，特别是移码突变，插入的位置和顺序是否正确。

2. 酵母转化中，我觉得酵母感受态浓度低了，酵母菌似乎很少，可以适当多离心一些菌下来，如果可能，最好测一下 OD ，做到心中有数；因为共转两个质粒效率会降低不少（我们就仅有 1 个阳性克隆），有时间最好做两次转化，分别转两个质粒，最好尽量多得到一些阳性克隆，可以重复李湘民老师的实验。

3. 得到阳性酵母菌后，可以先做个蛋白电泳加 WESTERN

确定一下 hER （雌二醇受体）的表达量，这个也可以用老师提供的雌二醇耦连 EGFP 的化合物测定；检查了 hER 的表达量以后，用雌二醇诱导一下，在检查 EGFP 是否表达，通过这个检查程序，如果出现问题，也能确定问题是否出在表达量上，以及具体是哪个蛋白的表达量。

4. 雌二醇诱导浓度可以再多做几个浓度， 包括 50 ， 100 ， 500nmol/L ， 这样可以更加深入的了解这个系统的信息输入和输出的量级。加入雌二醇前，各管酵母，最好测个 OD ，确保酵母数量基本一致，以固定非相关参数。

暂时就想到这些，其实深入做下去，题目本身还是有很多可以

挖掘和完善的东西，是挺有意思的一个题目。

学生体会 :

尽管大实验只有三周的时间，但是我们全组齐心合作，大家一起认真完成一件事的感觉让时间过的特别充实而有意义，

从选题，到设计，再到自己动手做实验，最后到今天的结题总结，一个看似很小的题目让我们体会到了一个完整的设计方案解决问题的过程，更让我们体验了小组合作的乐趣。

在我们大学的最后一个秋天，能有这样一次难忘的合作经历让

我感到很欣慰。

谢谢！

不当之处请批评指正！