生物大分子相互作用的研究方法三峡大学医学院

盛德乔shengdq@ctgu.edu.cn

世界上只有一种疾病，那就是——基因表达异常

Roger J. Williams(Nutrition Against Disease: Environmental Prevention

1971 )

核酸和蛋白质是生物体内重要的生物活性大分子，各自有其结构特征和特定功能，是生命活动的主要组成部分。

两者的相互作用构成了诸如生长、繁殖、运动、遗传和代谢等生命活动。

HGP 完成之后，大量的基因被发现和定位，基因功能的研究成为分子生物学研究的中心问题之一。

转录因子与特定 DNA 元件结合启动转录

蛋白质—核酸

基本转录复合物

染色质结构与基因表达

蛋白质和核酸的相互作用——参与了很多体内的生物学过程，弄清 DNA- 蛋白质相互作用的机制，对我们了解 DNA 转录调控和基因表达机制，揭示各种生命活动现象具有极其重要的指导作用。

蛋白质和蛋白质间的相互作用——蛋白质是细胞活性及功能的最终执行者，每个蛋白质并不是独立地行使其功能，它们在细胞中通常与其他蛋白质相互作用形成大的复合体，在特定的时间和空间内完成特定的功能 。

EGF 信号传导通路

蛋白质—蛋白质相互作用传递信息

蛋白质— DNA 相互作用产生效应

DNA- 蛋白质相互作用的研究方法

蛋白质和核酸的相互作用参与了很多体内的生物学过程，弄清 DNA- 蛋白质相互作用的机制，对我们了解 DNA 转录调控和基因表达机制，揭示各种生命活动现象具有极其重要的指导作用。

http://www.piercenet.com/method/methods-detecting-protein-dna-interactions

研究 DNA- 蛋白质相互作用的技术有很多，包括： DNase I 足迹试验 电泳迁移率变动实验 (EMSA) 酵母单杂交技术 染色质免疫沉淀技术（ ChIP ） ChIP-Sequence 技术 甲基化干扰试验 噬菌体展示技术 核酸适体技术 等等。

1. DNase I 足迹试验

蛋白质结合在 DNA 片段上，能保护结合部位不被 DNase 破坏， DNA 分子经酶切作用后遗留下该片段 ( 亦称“足迹” ) ，进而可以确定它的序列。在电泳凝胶的放射性自显影图片上，相应于蛋白质结合的部位没有放射性标记条带。

DNase I 足迹试验是一种鉴别 RNA 聚合酶等蛋白质在 DNA 上结合位点的方法，它不仅能找到与特异性 DNA 结合的目标蛋白，而且能告知目标蛋白结合在哪些碱基部位。足迹试验的方法较多，常用的有 DNase I 足迹试验和硫酸二甲酯足迹试验 (dimethylsulfate ， DMS) ，两者原理基本相同。

DNase I 足迹试验的实验流程如下：1. 待检双链 DNA 分子用 32P 作末端标记，通常只标记一端；

2. 蛋白质与 DNA混合，等两者结合后，加入适量的 DNase I ，消化 DNA 分子，控制酶的用量，使之达到每个 DNA 分子只发生一次磷酸二酯键断裂，并列设置未加蛋白质的对照；

3. 从 DNA 上除去蛋白质，将变性的 DNA加样在测序凝胶中作电泳和放射性自显影，与对照组相比后解读出足迹部位的核苷酸序列。

精确控制酶量

Actual experimental results. Lanes 1–4 contained DNA bound to 0, 10, 18, and 90 pmol of protein, respectively (1 pmol = 10–12 mol). The DNA sequencewas obtained previously by standard dideoxy sequencing.

2. 电泳迁移率变动实验

电泳迁移率变动实验 (electrophoresis mobility shift assay , EMSA)又称凝胶阻滞实验，是一种简单、快速和灵敏的体外检测 DNA 与蛋白质相互作用的技术。

基本原理——在凝胶电泳中，由于电场的作用，裸露的 DNA朝正电极移动的距离与其分子量的对数成反比。如果此时 DNA 分子与某种蛋白质结合，那么，由于分子量增大，它在凝胶中的迁移作用便会受到阻滞，在特定电压和时间内朝正电极移动的距离也就相应缩短了，导致在聚丙烯酰胺凝胶电泳上发生阻滞，形成滞后带。

EMSA

A double-stranded oligonucleotide containig a NF-B- binding site is labeled with a radioactive isotope and incubated with a nuclear extract.During gel-electrophoresis, NF-B bound to the oligonucleotide causes a shift compared to the free probe.

NF-B

Free Probe

Radioaktively labeled oligonucleotidewith NF-B - binding site (probe) and bound NF-B

Radioactively labeled oligonucleotide with NF-B - binding site (probe)

Nuclear extract of non-activated cells

Nuclear extract ofactivated cells

EMSA 的主要实验步骤：–探针制备 (设计、合成、标记、纯化、退火 )

– 具体实验设计– 核蛋白 (?) 制备及浓度测定– EMSA操作– 实验时竞争设计 !

凝胶阻滞试验一定要排除非特异结合。其方法是在 DNA- 蛋白质结合反应体系中，加入超量的非标记的竞争 DNA(competitor DNA/冷探针 ) 。 如果它与同位素标记的探针 DNA 结合的是同一种蛋白质，那么由于竞争 DNA 与探针 DNA 相比是极大超量的，这样绝大部分蛋白质都会被其竞争结合掉而使探针 DNA仍处于自由的状态，所以在电泳凝胶的放射自显影图片上就不会出现阻滞的条带。

探针突变？

抗体超迁移检测（ antibody supershift assay ）是在凝胶阻滞实验的基础上进一步发展而来。在 DNA- 蛋白质结合反应体系中加入抗目的 DNA 结合蛋白质的特异抗体。由于抗体的结合，使 DNA-蛋白质 -抗体的分子量增加， DNA- 蛋白质复合物在聚丙烯酰胺凝胶中的迁移率进一步降低，出现“超迁移带”。

3. 酵母单杂交yeast one-hybrid system

EMSA 技术是一种简单和灵敏的检测 DNA- 蛋白质相互作用的技术，但它不能发现新的 DNA- 蛋白质的相互作用。（只能验证！）

酵母单杂交技术不仅能验证和检测已知的 DNA-蛋白质相互作用，还能筛选、发现新的 DNA- 蛋白质相互作用。

1993年建立以来，应用酵母单杂交体系已经验证了许多已知的 DNA 与蛋白质之间的相互作用，同时发现了新的 DNA 与蛋白质的相互作用，并由此找到了多种新的转录因子。

基本原理——真核生物基因的转录起始需转录因子参与，转录因子通常由一个 DNA 特异性结合功能域和一个或多个其他调控蛋白相互作用的激活功能域组成，即 DNA 结合结构域 (DNA-binding domain ， BD) 和转录激活结构域 (activation domain ， AD) 。 BD 有特异性 AD 没有特异性（可独立起作用）

用于酵母单杂交系统的酵母 GAL4 蛋白是一种典型的转录因子， GAL4 的 DNA 结合结构域靠近羧基端，含有几个锌指结构，可激活酵母半乳糖苷酶的上游激活位点 (UAS) ，而转录激活结构域可与 RNA 聚合酶或转录因子 TF IID 相互作用，提高 RNA 聚合酶的活性。在这一过程中， DNA

结合结构域和转录激活结构域可完全独立地发挥作用。

据此，我们可将 GAL4 的 DNA 结合结构域置换为文库蛋白编码基因，只要其表达的蛋白能与目的基因相互作用，同样可通过转录激活结构域激活 RNA 聚合酶，启动下游报告基因的转录。

该系统需包含：(1)文库蛋白的编码基因与 GAL4 转录激活域融合

表达的 cDNA 文库质粒；(2)含目的基因与下游报告基因的报告质粒。其中，文库的设计和筛选实验是整个酵母单杂交系统的核心技术。

Element

元件串连四聚体插入报告基因质粒

ADcDNA文库质粒载体

构建含有元件核心序列的报告基因质粒

将报告基因质粒整合到 YM4271 菌株

检测各种报告基因的背景表达

双重报告基因菌株构建

MATCHMAKERcDNA文库的扩增利用双重报告基因菌株筛选文库

阳性克隆的分离与鉴定

筛选所得阳性质粒测序及 BLAST 分析

酵母单杂交体系主要有以下 3 种用途：1. 确定已知 DNA— 蛋白质之间是否存在相互作

用；2. 分离结合于目的顺式调控元件或其他短 DNA

结合位点蛋白的新基因；3. 定位已经证实的具有相互作用的 DNA 结合蛋

白的 DNA 结合结构域，以及准确定位与 DNA 结合的核苷酸序列。

4. 染色质免疫沉淀技术 (ChIP)

染色质免疫沉淀技术 (chromatin immuno-precipit

ation assay, ChIP) 是基于体内分析发展起来的方法，它能真实、完整地反映结合在 DNA 序列上的调控蛋白，是目前确定与特定蛋白结合的基因组区域或确定与特定基因组区域结合的蛋白质的最好方法。

染色质免疫沉淀技术基本原理在生理状态下把细胞内的 DNA 与蛋白质交联在一起，超声波将染色质打碎后，用所要研究的目的蛋白特异性的抗体沉淀这种交联复合体。只有与目的蛋白结合的 DN

A 片段才能够被沉淀下来，通过对目的片断的纯化与检测，从而获得蛋白质与 DNA 相互作用的信息。

染色质免疫沉淀技术一般包括：1. 细胞固定2. 染色质断裂3. 染色质免疫沉淀4. 解交联反应5. DNA 的纯化6. DNA 的鉴定

ChIP

利用目的蛋白质的特异抗体通过抗原 -抗体反应形成 DNA- 蛋白质 -抗体复合物，然后使用 Agarose beads或Magna beads沉淀此复合物，特异性地富集与目的蛋白结合的 DNA 片段。再经过多次洗涤，除去非特异结合的染色质

ChIP 流程图

ChIP-chip 技术Biotechniques. 2007 December ; 43(6): 791–797.

5. ChIP-Seq 技术

ChIP-Seq 技术是将染色质免疫共沉淀获得的微量 DNA 片断进行大规模测序。通过免疫共沉淀得到目的 DNA （ > 10ng, 200bp左右），将获得的 DNA片段加上接头后进行 PCR扩增，得到 ChIP- Seq 文库后直接进行大规模测序。 ChIP-Seq 是继 ChIP-ChIP 后，蛋白 / 核酸相互作用研究的又一技术突破。实现了全基因组范围内更精确、更敏感、更经济的定位目蛋白所有的结合位点。

主要步骤– 常规的染色质免疫沉淀 (ChIP) 技术，获得

目的 DNA 片段；– DNA 片段的末端修复，将 ‘ A’ 碱基加入

到 DNA 片段的 3‘末端；– DNA 片段末端加上接头；– PCR扩增加上接头的 DNA 片段；– DNA 在 Cluster Station 成簇扩增；– Illumina Genome Analyzer 上的测序；– 生物信息学分析。

染色质免疫共沉淀↓

目的 DNA 片段↓

DNA 片段的末端修复↓

将 ‘ A’ 碱基加入到 DNA 片段的 3‘末端↓

DNA 片段末端加上接头↓

PCR扩增加上接头的 DNA 片段↓

文库检测↓

DNA 在 Cluster Station 成簇扩增↓

Illumina Genome Analyzer 上的测序↓

生物信息学分析

蛋白质 - 蛋白质相互作用的研究方法

蛋白质是细胞活性及功能的最终执行者，每个蛋白质并不是独立地行使其功能，它们在细胞中通常与其他蛋白质相互作用形成大的复合体，在特定的时间和空间内完成特定的功能。因此，后基因组时代的一个研究热点就是探索蛋白质 - 蛋白质的相互作用及其在调控各种生命活动中的作用。

研究蛋白质—蛋白质相互作用的技术有很多，包括：

GST融合蛋白进行 Pull down 实验 免疫共沉淀（ Co-IP ）技术 酵母双杂交 Co-IP— 质谱 蛋白质芯片技术 荧光能量转移技术 噬菌体展示技术等等

1. GST融合蛋白进行 Pull down 实验

融合蛋白 pull-down 技术基本原理是将一种蛋白质固定于某种基质上 ( 如 Sepharose),当细胞抽提液经过该基质时，可与该固定蛋白相互作用的配体蛋白被吸附，而没有被吸附的“杂质”则随洗脱液流出。被吸附的蛋白可以通过改变洗脱液或洗脱条件而回收下来。

为了更有效地利用 pull-down 技术，可以将待纯化的蛋白以融合蛋白地形式表达，即将“诱饵”蛋白与一种易于纯化地配体蛋白相融合。

1988年 Smith 等利用谷胱甘肽－ S－转移酶（ gl

utathione-S-transferase , GST ）融合标签从细菌中一步纯化出 GST融合蛋白。

从此 GST融合蛋白在蛋白质相互作用研究领域里得到极大的推广。 GST融合蛋白在经过固定有 G

ST (glutathione) 的色谱柱时，就可以通过 GST

与 GSH 的相互作用而被吸附。当再有细胞抽提物过柱，就可得到能够与“诱饵”蛋白相互作用的兴趣蛋白

GST融合蛋白 pull-down 技术的应用：1. 鉴定与已知融合蛋白相互作用的未知蛋白质2. 鉴定两个已知蛋白质之间是否存在相互作用

2. 免疫共沉淀（ Co-IP ）

免疫共沉淀技术（ Co-Immunoprecipitation ）是以抗原 -抗体之间的特异性结合为基础的研究蛋白质相互作用的经典方法。是确定两种蛋白质在完整细胞内生理性相互作用的有效方法。

原理：当细胞在非变性条件下被裂解时，完整细胞内存在的许多蛋白质－蛋白质间的相互作用被保留了下来。如果用蛋白质 X 的抗体免疫沉淀 X ，那么与 X 在体内结合的蛋白质 Y也能沉淀下来。

实验步骤及内容1. 构建真核表达质粒，质粒转染后 24-48 h 可收

获细胞，加入适量细胞裂解缓冲液（含蛋白酶抑制剂），冰上裂解 30min, 细胞裂解液于 4℃， 最大转速离心 30 min 后取上清；

2. 取少量裂解液以备 western blot 分析，剩余裂解液加 1mg 相应的抗体加入到细胞裂解液， 4℃缓慢摇晃孵育过夜；

3. 取 10 ml protein A 琼脂糖珠，用适量裂解缓冲液洗 3 次，每次 3,000 rpm离心 3 min；

4. 将预处理过的 10 ml protein A琼脂糖珠加入到和抗体孵育过夜的细胞裂解液中 4℃缓慢摇晃孵育 2-4h ，使抗体与 protein A琼脂糖珠偶联（ protein A 可特异结合免疫球蛋白的 Fc 段）；

5. 免疫沉淀反应后，在 4℃以 3,000 rpm 速度离心3 min ，将琼脂糖珠离心至管底；将上清小心吸去，琼脂糖珠用 1ml裂解缓冲液洗 3－ 4次；最后加入 15 ml 的 2×sds 上样缓冲液，沸水煮 5 分钟；

6. SDS-PAGE, western blotting或质谱仪分析。

IP-immunoprecipitation

IB-immunoblotting

免疫共沉淀的优点为：1. 相互作用的蛋白质都是经翻译后修饰的，处

于天然状态；2. 蛋白的相互作用是在自然状态下进行的，可

以避免人为的影响；3. 可以分离得到天然状态的相互作用蛋白复合

物。

免疫共沉需注意的问题：1. 细胞裂解采用温和的裂解条件，不能破坏细胞

内存在的所有蛋白质－蛋白质相互作用，多采用非离子变性剂（ NP40或 Triton X-100) 。不能用高浓度的变性剂（ 0.2％ SDS) ，细胞裂解液中要加各种酶抑制剂。

2. 选择合适的抗体，有些抗体不一定适合做 IP 。3. 使用对照抗体。

3. 酵母双杂交（ Yeast two-hybrid system ）

基本原理—真核生物的转录激活因子通常具有两个可独立存在的结构域，即 DNA 结合域（ DNA binding domain, BD ）与转录激活域（ Transcriptional activation domain ， AD ）。这两个结构域各具功能，互不影响。但一个完整的激活特定基因表达的激活因子必须同时含有这两个结构域。不同来源的激活因子的 BD区与 AD 结合后则可特异地激活被 BD 结合的基因表达。

基于这个原理，人们将两个待测蛋白分别与这两个结构域建成融合蛋白，并共表达于同一个酵母细胞内。如果两个待测蛋白间能发生相互作用就会使 AD 与 BD 形成完整的转录激活因子并激活相应的报告基因表达。通过对报告基因表型的测定可以很容易地知道待测蛋白分子间是否发生了相互作用。

酵母双杂交系统由三个部分组成：1. 与 BD融合的蛋白表达载体，被表达的蛋白称诱饵蛋白（ bait ）；

2. AD融合的蛋白表达载体，其表达的蛋白称靶蛋白（ prey ）；

3. 带有一个或多个报告基因的宿主菌株。常用的报告基因有 HIS3 、 URA3 、 LacZ 和 ADE2等。而菌株则具有相应的营养缺陷型。双杂交质粒上分别带有不同的抗性基因和营养标记基因，有利于杂交质粒的鉴定与分离。

筛选文库

4. Co-IP— 质谱 免疫共沉淀联合质谱（ Mass-spectrometric

）技术：在生理条件下，用靶蛋白相应抗体沉淀靶蛋白， SDS-PAGE 电泳分离，切下相应条带做质谱分析，得到相应条带蛋白质的一级结构。

12

3

5

4

6789

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12

13

75kD

50kD

37kD

20kD

25kD

100kD质谱分析，得到一级结构

Co-IP

5. 蛋白质芯片技术 蛋白质芯片是指固定于支持介质上的蛋白

质构成的微阵列。又称蛋白质微阵列 (Protein microarray) 。是在一个基因芯片大小的载体上，按使用目的的不同，点布相同或不同种类的蛋白质，然后再用标记了荧光染料的蛋白质结合，扫描仪上读出荧光强弱，计算机分析出样本结果。

基本原理 是将各种蛋白质有序地固定于滴定板、滤膜和

载玻片等各种载体上成为检测用的芯片，然后，用标记了特定荧光抗菌素体的蛋白质或其他成分与芯片作用，经漂洗将未能与芯片上的蛋白质互补结合的成分洗去，再利用荧光扫描仪或激光共聚焦扫描技术，测定芯片上各点的荧光强度，通过荧光强度分析蛋白质与蛋白质之间相互作用的关系，由此达到测定各种蛋白质功能的目的。

实验步骤 1. 固体芯片的构建：常用的材质有玻片、硅、云母及各种膜片等。

2. 探针的制备 3. 生物分子反应：使用时将待检的含有蛋白质

的标本如尿液、血清、精液、组织提取物等，按一定程序做好层析、电泳、色谱等前处理，然后在每个芯池里点入需要的种类。

4. 信号的检测及分析：直接检测模式是将待测蛋白用荧光素或同位素标记，结合到芯片的蛋白质就会发出特定的信号，检测时用特殊的芯片扫描仪扫描和相应的计算机软件进行数据分析，或将芯片放射显影后再选用相应的软件进行数据分析。

6. 荧光共振能量转移技术

荧光共振能量转移（ Fluorescence resonance ener

gy transfer, FRET ）是近年来迅速发展的一种新技术，其最大的特点就是可以在活体细胞生理条件下对蛋白质间的相互作用进行实时的动态研究，已成为现代蛋白质组学研究的有力工具。

荧光能量共振转移是距离很近的两个荧光分子间产生的一种能量转移现象。当供体荧光分子的发射光谱与受体荧光分子的吸收光谱重叠，并且两个分子的距离在 10nm范围以内时，就会发生一种非放射性的能量转移，即 FRET 现象，使得供体的荧光强度比它单独存在时要低的多（荧光猝灭），而受体发射的荧光却大大增强（敏化荧光）。

FRET 技术中常用的荧光蛋白对是黄色荧光蛋白 (Yellow fluorescence protein ， YFP) 和青色荧光蛋白 (Cyan fluorescence protein, CFP) 。 CFP 的发射光谱与 YFP 的吸收光谱相重叠。将供体蛋白CFG 和受体蛋白 YFG 分别与两种目的蛋白融合表达。当两个融合蛋白之间的距离在 5-10nm 的范围内，则供体 CFP 发出的荧光可被 YFP吸收，并激发 YFP 发出黄色荧光，此时通过测量 CFP荧光强度的损失量来确定这两个蛋白是否相互作用。两个蛋白距离越近， CFP所发出的荧光被 YFP接收的量就越多，检测器所接收到的荧光就越少。

This diagram depicts most of the known protein-protein interactions centered on telomeric proteins.

The Best Protein Interaction Databaseshttp://www.genengnews.com/insight-and-intelligence/the-best-protein-

interaction-databases/77900035/