Инициация трансляции у эукариот

Регуляция экспрессии генов на уровне трансляции

Особенности мРНК

Прокариоты Эукариоты

Часто полицистронна Обычно моноцистронна

m7G-кеп на 5’-конце и

длинный поли(А)-хвост на 3’-конце

Метаболическая нестабильность

Образует комплекс с белками, Метаболически стабильнее

2

Особенности инициаторной тРНК

• Прокариоты• N-формил-метионил-тРНК-f (F-Met-

tRNAf) (аминогруппа блокируется – тРНК не может участвовать в элонгации)

• Эукариоты

• Не формилируется

3

Инициаторная тРНКМет по структуре отличается от других тРНК

Инициация: как рибосома оказывается на AUG-кодоне

4

• Инициация может происходить как недалеко от 5’-конца, так и в середине мРНК со стартового кодона (обычно AUG)

• 30S связывается непосредственно с сайтом инициации

• Пуриновая SD-последовательность комплементарно спаривается с 16S рРНК -> ассоциация 30S субчастицы с мРНК

• Белок S1 связывается с мРНК перед SD

ПрокариотыЭукариоты

3 способа инициации:•Модель сканирования: взаимодействия малой субъединицы с кэпом и сканирование 5’UTR•Инициация на внутренних AUG-кодонах•Реинициация (после освобождения полипептида рибосома не диссоциирует)

Инициация: прокариоты

5

Отличительная особенность:

Сначала 30S связывается с мРНК в районе старт-кодона,

затем к комплексу присоединяется тРНК.

Факторы инициации:• IF-1 – стабилизация инициаторного

комплекса• IF-2 + GTP – присоединение к комплексу

инициаторной тРНК• IF-3 –препятствует ассоциации

рибосомы, препятствует узнаванию не AUG-кодона

IF-2

IF-1

eIF5B

eIF1A

eIF1IF-3

Прокариоты Эукариоты

Объединение большой и малой субчастиц, ГТФ-азыП: Присоединение Мет-тРНК к 30S

Препятствуют инициации с не AUG-кодона

Инициация: эукариоты

eIF2 GTP Met-tRNAi

eIF3

6

Площадка для связываниямногих других факторов

Тройной комплекс, имеет высокое сродствок 40S. После гидролиза GTP сродство теряется, фактор eIF2 и GDP отделяются.

Обеспечивают активную конформацию малой субчастицы, посадку тРНК в Р-участок

Стимулирует гидролиз ГТФ в тройном комплексе

7

Инициация: эукариоты

Инициация у эукариот на внутренних старт-кодонах

• IRES – internal ribosomal entry sites

• Обеспечивают внутреннюю инициацию на некоторых мРНК эукариот (в основном используются вирусами)

• Относительно большие и сложные структуры (в отличие от SD-последовательностей прокариот)

• Механизм действия: связывание компонентов транскрипционного аппарата

• Примеры:

• Пикорнавирусы (полиовирус, вирусы гепатита А, простого насморка, ящура)

• Связывают 4G, не требует 4E

• HCV (вирус гепатита C)

• Связывает 40S, не требует 4F

• CrPV (вирус паралича сверчка)

• Связывает 80S, не требует никаких факторов

8

Инициация у прокариот• Что влияет на эффективность:• Степень комплементарности и длина последовательности SD• Вовлечение инициаторной последовательности во вторичные и

третичные структуры

• Регуляция:• Репрессия за счет белков, связывающихся с инициаторными

районами• Вторичная структура может усиливаться связыванием с

белками или низкомолекулярными лигандами • Riboswitches – связывают низкомолекулярные лиганды

(витамины, нуклеотиды и т.п.), производящие «переключение» между различными вторичными структурами

9

• Фосфорилирование eIF2

• Связывание eIF4E белком 4E-BP

• С помощью белков, связывающихся с 5’UTR и блокирующих сканирование (На примере регуляции мРНК ферритина белком IRE-BP)

• С помощью белков, связывающихся с 3'UTR

• С помощью микроРНК

10

Регуляция инициации: эукариоты

Глобальная регуляция(модуляция активности основных

факторов инициации)

мРНК-специфическая регуляция (за счет регуляторных белков или

некодирующих РНК, которые связываются с мРНК)

Регуляция инициации: эукариотыГлобальная регуляция (1). Фосфорилирование eIF2

• В ответ на различные условия стресса одна из 4 киназ фосфорилирует альфа-субъединицу фактора eIF2 по Ser51

• Фосфорилированный eIF2 – ингибитор для eIF2B (за счет слишком плотного связывания)

• Не происходит реактивации комплекса

eIF2 GTP Met-tRNAi

11

• Фактор eIF2 входит в состав тройного комплекса• Комплекс участвует в выборе инициирующего кодона

• При узнавании инициаторного кодона: eIF2*GTP -> eIF2*GDP + Pi• eIF2*GDP не имеет сродства к рибосоме -> отщепляется• eIF2*GDP необходимо реактивировать (eIF2B – guanine nucleotide-exchange factor)

Регуляция инициации: эукариотыГлобальная регуляция (1)

Противоположное действие фосфорилированного фактора eIF2

• GCN4 мРНК в дрожжах

• Кодируемый белок является транскрипционным активатором генов, регулирующих биосинтез аминокислот

• Имеет 4 короткие ORF ближе к 5’-концу от инициаторного кодона GCN4

• Трансляции GCN4 начинается благодаря реинициации

12

• eIF4E в составе eIF4F связывается с кэпом, в результате чего комплекс связывается с мРНК

• eIF4E-binding proteins (4E-BPs) в дефосфорилированной форме конкурируют с eIF4G за связывание с eIF4E ->

• 4E-BPs ингибируют кэп-зависимую трансляцию

13

Регуляция инициации: эукариотыГлобальная регуляция (2). Связывание eIF4E

General 4E-BPs

мРНК-специфичные 4E-BPs

14

Регуляция инициации: эукариотыГлобальная регуляция

Общая схема

• Наиболее изученный механизм

• мРНК кодирует белок ферритин, отвечающий за связывание излишков железа в клетке. При малом количестве железа вреден.

• IRE – iron-responsing elements – области мРНК, участвующие в регуляции• IRP - IRE regulatory proteins – регуляторные белки (IRE-BP)• При недостатке железа IRP связываются со шпилькой IRE в 5’ UTR• Блокирует сканирование 5’UTR

15

Регуляция инициации: эукариоты мРНК-специфическая регуляция

Белки, связывающиеся с 5’UTR (Регуляция мРНК ферритина белком IRE-BR)

16

Регуляция инициации: эукариоты мРНК-специфическая регуляция

Белки, связывающиеся с 3’ UTR

•На примере мРНК церулоплазмина

•Репрессируется интерфероном-гамма (IFNγ)

•Фактически ингибитором является сложный комплекс GAIT. Один из составляющих его белков – L13а из 60S

•IFNγ индуцирует фосфорилирование L13а -> этот белок высвобождается из 60S и присоединяется к GAIT

•GAIT-комплекс связывается с GAIT-элементом в 3’UTR и блокирует посадку 43S на мРНК

• Механизм до конца не выяснен

• Небольшие молекулы ~22 нуклеотида

• Действуют в комплексе с белками (miRNP или RISC – RNA-induced silencing complex)

• Комплементарно связывается с 3’UTR

17

Регуляция инициации: эукариоты мРНК-специфическая регуляция

Микро РНК (miRNA)

•Блокирует инициацию трансляции (скорее всего, белки miRNP-комплекса связываются с кэпом, вытесняя факторы eIF4F)