روش های شناسایی آزمایشگاهی دکتر سعید مویدنیا

آزمایشگاهی شناسایی های روش

مویدنیا سعید دکتر

از چه روشهایی برای بررسی آزمایشگاهی تستهای روماتولوژی استفاده می شود؟•

تفاوت روشهای مذکور در چیست و کدام ارجحند؟•

رعایت کدام عوامل پیش آزمونی مهمند؟•

چه عواملی در آزمونهای مذکور تداخل دارند؟

چکونه به وجود تداخالت پی ببریم؟•

رفع تداخالت چگونه امکان پذیر هستند؟•

عناوین:

ایمنی سنجش روشهای از immunoassay عمدتا. باشد می

Ab (Label) I…MA

Ag (Label) …IA

.1. است متفاوت رفته کار به لیبل نوعRIA IRMA رادیواکتیوEIA IEMA آنزیمFIA IFMA فلورسانس

CIA ICMA لومینسانس

است . متفاوت سازی نشاندار جایگاهرقابتی ) ( ژن آنتی

ساندویچی ) ( بادی آنتی

است؟ بهتر روش کدام

1. Imprecision

2. Gole dependency

3. Work of renge

4. robatsness

5. sensivity

نوع نمونه؟1.

زمان نمونه گیری؟2.

نگهدارنده؟3.

نگهداری؟4.

مصرف دارو؟5.

ایکتر، لیپمیک، همولیز؟6.

انالیت باالی غلظت در کاذب منفی نتایج کسب

گویند قالب یا هوک پدیده را

YYY

Y

YYY

YY

YYY

YYY

YYY

YYY

YYY

YYY

Hook Effect

Hetrophil antibody effect

بادی آنتینشاندار

بادی آنتیبيمار

نشاندار ژن آنتی

ر بیما ژن آنتی Competitive Binding Reaction

بيمار بادی آنتی نشاندار – بادی آنتی آنتی

بیمار ژن آنتی

منوکلونال ضد بادی آنتی

ژن آنتی

ژن آنتی

بادی آنتیاختصاصی

نشاندار

Non-competitive Binding Reaction

بيمار بادی آنتی

بادی آنتی منوکلونالنشاندار

ژن آنتیآنتی- آنتی

بادی

Antibody capture Method

: نمود رعایت االیزا آزمایش در باید که عملی نکاتکیت دستور طبق آزمایش مراحل کلیه انجام

کار شروع از قبل اتاق دمای به کیت رساندن

انکوباسیون دمای تنظیم

آن درب بستن گیرو رطوبت حاوی کیسه داخل به اضافی استریپهای برگرداندنآلودگی از جلوگیری برای محلول یا نمونه هر برای سمپلرجدید نوک از استفاده

. باشد شده سرسمپلرمحکم بر سمپلر نوک

مواد افزودن هنگام در وحباب کف ازایجاد اجتناب

. شود اجتناب وسایرچاهکها چاهک دیواره به محلولها یا نمونه ازپاشیدن

انکوباسیون شروع زمان تایمروثبت تنظیم

( شستشوواسپیراسون ازنظرانسدادکانالهای کنید شستشوراچک کاردستگاهناکامل(

. مجاورسرازیرنشود چاهکهای شستشوبه محلول

شده توصیه دفعات تکرارشستشوبه

شستشو گیردرانتهای نم کاغذ با باقیمانده ذرات گرفتن

. نشود خشک چاهکها کف

دستورسازنده طبق ازسوبسترا استفاده و تهیه

سمپلرآلوده نوک با سوبسترا محلول شدن ازآلوده اجتناب

Common enzymes

1. Horseradish Peroxidase

2. Alkaline Phosphatase

Immunochemical tests for infectious disease can be:

1. Qualitative

2. Semi Quantitative

3. Quantitative.

Microplate Reader

1. wavelength range to that used in ELISA, generally between

2. 400 to 750 nm (nanometres)

3. Some readers (ultraviolet range between 340 to 700 nm.

Microplate Reader

INSTALLATION REQUIREMENTS1. A clean, dust free environment.2. A stable work table away from equipment that vibrates(centrifuges, agitators). 3. An electrical supply source, which complies with thecountry’s norms and standards.

Pipettes and Best pipetting practice

Manual single channel

Manual multi channel

Electronic single channel

Electronic multi channel

PIPETTINGGUIDE TO PIPETTING

• ONLY USE FIRST STOP !

• DO NOT DRIP

• DO NOT PRESS HARD INTO WELL

• DO NOT USE TOO ACUTE AN ANGLE

• MAKE SURE TIP TOUCHES SIDE OF WELL AND LIQUID

Pipetting tips

• Forward Pipetting technique

Pipetting tips

• Reverse Pipetting technique • Highly viscous fluid• Avoid foaming

ایمنواس{ی اتغ{ير ط{بيعي در آزمايش{وهماهن{گ ي{ا نت{ايج غ{ير منتظ{ره نامق{ادير •

باشد يا يك وضعيت باليني نادر وممكنست نشاندهنده تداخل تكنيكي

گ{اهي س{نجش نمون{ه از آنج{ایی ک{ه ش{دت ت{داخل در روش{های مختل{ف متف{اوت اس{ت، •

ديگر, موجب تشخيص تداخل مي شود.روشی با

ELISA VIDEO

میکروسکوپی فلورسنت

Fluorescence immunoassays

• FIA based on labeling immunoreactants with fluorescent

probes.

• Detection and quantitation of Drugs, Hormones, Proteins,etc,

Ultra Violet spectrum

By convention, the ultraviolet spectrum is broken into arbitrary divisions:

1. Long wave or "UVA“ (~400—350 nm)

2. Mid wave or "UVB" (~350—300 nm)

3.Short wave or "UVC" (~300—200 nm)

4.Far ultraviolet (<200 nm)

• Since ultraviolet light is invisible,

the visible (fluorescent) result may appear as if by

"magic" when viewed in a darkened room .

FluorescenceStokes Shift

• is the energy difference between the lowest energy peak of absorbence and the highest energy of emission

495 nm 520 nm

Stokes Shift is 25 nm

Fluoresceinmolecule

Flu

ores

cnec

e In

tens

ity

Wavelength

Ethidium

PE

cis-Parinaric acid

Texas Red

PE-TR Conj.

PI

FITC

600 nm300 nm 500 nm 700 nm400 nm457350 514 610 632488 Common Laser Lines

Characteristics of IFA OR FIA

1- Specificity

2- Sensitivity

3- Rapidity

4- Cost effectiveness

5.- Subjectivity

Fluorescent Microscopy

Specification of microscopes

Slides and cover glasses

Immersion oil

Mounting media

Fluorescent Microscope : • Early fluorescence microscope utilized transmitted light with oil

darkfield sub stage condensers• Epifluorescence microscope

Advantages : 1. The objectives serve as condenser2. The area of illumination is restricted to the area being observed3. Bright illumination

Fluorescence Microscope with

Color Video (CCD)

35 mm Camera

Fluorescent Microscope

ObjDichroic Filterective

Arc Lamp

Emission Filter

Excitation Diaphragm

Ocular

Excitation Filter

EPI-Illumination

ic

Excitation Sources

LampsXenonXenon/Mercury

LasersArgon Ion (Ar)Krypton (Kr)Helium Neon (He-Ne)Helium Cadmium (He-Cd)Krypton-Argon (Kr-Ar)

The various aspects of the microscope that affect the specificity and

sensitivity

a. Light source : powerful light sources are needed

• The most common sources are 100-200W high pressure mercury

short arc lamp

• The 100 W bulb is brightest , offering a life of 200hrs

• Frequent on-off switching reduces lamp life

• Do not touch the bulb to avoid etching


sensitivity

b. Optics :

• The role of objectives is crucial intensity varies proportionally to the 4X power of numerical apertures


sensitivityc. Filters : 1. Exciter2. Barrier3. Dichroic beam splitter


sensitivityd. Calibration

Optical standard (OS) slide1. Monitor the emission light2. Assure optical alignment 3. Improve lab proficiency


sensitivitye. Controls Serum controls : negative , low positive, high positive tissue control

Monting medium : a. Buffered glycerin : undergo rapid photo bleaching (fading), the

slides can not be stored for prolonged period. b. Semipermanent, polyvinyl-alcohol medium

• One of the limitation of fluorescent microscopy is fading upon excitation due to irreversible decomposition of the fluorochromes

• The fading can be reduced if mounting media contain antioxidants such as DTT(ditiotetrol) βME(betametaethanol) , P-phenylene diamine

Elements of FIA

1- Antigens, Antibodies (analyte)

2- Labeled antibodiesa) Essential requirementb) Checker – board titration c) flurecent protein reitio(FPR)

3- Control specimen

4- Observation (lam ,lamel ,emer oil)

5- Staining procedures

Inherent Problems of Fluorescent assays :

1) Auto Fluorescenta) Serum Protein emit at 320 to 350 nmb) Bilirubin emit at 430 to 470 nmc) Sample treatment with proeolytic, oxidaizing agents

2) Quenching by Bilirubin and Hb3) Photodestruction due to repeated excitation ( repeated measurement within short period)

The cell during interphase

Structure of the nuclear membranes

HEp-2 cells allow recognition of over 30 different nuclear and cytoplasmic patterns which are given by upwards of 100 different autoantibodies.

HEp-2 cells have many advantages over rodent tissues

1. They are a more sensitive substrate that allows identification of many patterns.

2. Human origin ensures better specificity than animal tissues.

3. The nuclei are much larger so that complex nuclear details can be seen.

HEp-2 cells have many advantages over rodent tissues

4. The cell monolayer ensures that all nuclei are visible.

5. Cell division rates are higher so that antigens produced only in cell division are easily

located eg.,

centromere and mitotic spindle patterns.

6. There is no obscuring intercellular matrix

7. Antigen distribution is uniform

Documents

روش های شناسایی آزمایشگاهی دکتر سعید مویدنیا