Скоблов Михаил Юрьевич

Молекулярная биология

Лекция 7. Репликация и репарация.

Часть 1. Репликация ДНК

Эксперимент Мезельсона и Сталя

1958 год

Артур Корнберг

ДНК-полимераза

• В 1956 г. Корнберг выделил из клеток бактерии Е. coli фермент ДНК-полимеразу (ДНК-полимераза I).

• Этот фермент осуществлял синтез ДНК при наличии в реакционной смеси всех четырех дезоксинуклеозидтрифосфатов: АТФ, ГТФ, ТТФ, ЦТФ и молекулы ДНК

• В 1959 г. получил нобелевскую премию «За открытие механизмов биологического синтеза рибонуклеиновой и дезоксирибонуклеиновой кислот».

Основные этапы репликации:

1. Инициация

2. Элонгация

3. Терминация

Репликация ДНК

Репликация ДНК — процесс синтеза дочерней молекулы дезоксирибонуклеиновой кислоты на матрице родительской молекулы ДНК.

«Каждая цепь двуцепочечной ДНК служит матрицей при синтезе комплементарной цепи и в результате образуются две пары цепей, в каждой из которых только одна является родительской» – Уотсон и Крик.

Основные ферменты репликации

• ДНК-полимераза - фермент катализирующий полимеризацию дезоксирибонуклеотидов на матрице ДНК по принципу комплементарности

• ДНК-лигаза – фермент катализирующий образование фосфодиэфирных связей между 5'-фосфорильной и 3'-гидроксильной группами соседних дезоксинуклеотидов в местах разрыва двуцепочечной ДНК

• ДНК-хеликаза – фермент разделяющий цепи двухцепочечной ДНК на одинарные.

• ДНК-топоизомераза - фермент изменяющий степень сверхспиральности ДНК, путем внесения одноцепочечных разрывов в ДНК.

• ДНК-праймаза — это фермент РНК-полимераза, синтезирующий короткий фрагмент РНК, называемый праймером, комплементарный одноцепочечной матрице ДНК.

Ориентация цепей в ДНК

Репликация ДНК у E.coli

STEP1: DnaB helicase(blue) separates a dsDNA into two ssDNAs, as cutting the hydrogen bands between base pairs. Topoisomerase(lime green) has a role in rewinding the twist of double helices which was generated by the dsDNA separation. STEP2: The separated ssDNA has a tendency of annealing. For preventing annealing, Single-Stranded DNA Binding Protein: SSB bind to separated ssDNA. STEP3: DnaG primase(purple) is activated by binding to DnaB helicase, and synthesizes a short RNA primer approximately 10 nucleotides long using a ssDNA as a template. STEP4: DNA polymerase III elongates a new ssDNA strand by adding a deoxyribonucleotide at a time in the 5'-3' direction to the RNA primer, using a ssDNA as a template.

Репликация ДНК у E.coli

• Лидирующая цепь удлиняется ДНК-полимеразой в направлении 3’-конца

• Отстающая цепь удлиняется по иному механизму:

Репликация ДНК у E.coli

Репликации у прокариот

Инициация репликации • Репликация ДНК начинается в специфических местах называемых точками начала

репликации (origin). • Чем больше размер генома организма, тем большее количество точек репликации

ему необходимо: у E.coli, бактериофага лямбда, вируса SV40 – один origin, в эукариотических клетках – множественные начала репликации расположеные на расстоянии 20 т.п.н..

• Скорость репликации у бактерий порядка 100 000 пар нуклеотидов в минуту, у эукариот - 500—5000.

Элонгация

• Репликация E.coli занимает около 40 минут, в то же время клетки делятся примерно каждые 20 минут – репликация ДНК инициируется при не законченной предыдущей.

Репликации у прокариот

Терминация репликации

Топоизомераза II также принимает участие в рахсождении двух дочерних кольцевых ДНК - конкатамеров

Репликация ДНК по принципу катящегося кольца

Одноцепочечная ДНК Двухцепочечная ДНК

Репликации у эукариот

Ori - AT-богатые, легкоплавкие участки длинной ~200 пн, расположенные, как правило, между генами в промоторных областях.

Репликация теломер Теломе́ры (от др.-греч. τέλος — конец и μέρος — часть) — концевые участки хромосом

Нобелевская премия по физиологии и медицине 2009 года американских учёных Элизабет Блэкбёрн (Elizabeth H. Blackburn), Кэрол Грейдер (Carol W. Greider) и Джек Шостак (Jack W. Szostak) «за открытие того, как теломеры и фермент теломераза защищают хромосомы»

Репликация теломер Теломераза — фермент, добавляющий особые повторяющиеся последовательности ДНК (TTAGGG у позвоночных) к 3'-концу цепи ДНК на участках теломер, которые располагаются на концах хромосом в эукариотических клетках.

Клеточный цикл и его регуляция

• Период существования клетки от одного деления до другого называется митотическим или клеточным циклом.

• У высших организмов он занимает от 10 до 30 часов, у человека 24 часа

• У бактерий – менее часа, около 20 минут

Разница в репликации у прокариот и эукариот

Часть 2. Репарация

• У бактерии кишечной палочки E.coli известно более 50 генов, контролирующих процессы репарации.

• В среднем в процессе репликации генома млекопитающего длинной 3 млрд нуклеотидов возникает не более 3 ошибок

• Ежедневно в молекулах ДНК каждой клетки человеческого тела около 100000 звеньев повреждаются за счет разнообразных эндогенных процессов и экзогенных генотоксичных воздействий.

• Менее 1 повреждения ДНК из 1000 превращается в мутацию.

Источники повреждения ДНК

Репарация ДНК

• Репарация генетических повреждений – свойство живых организмов восстанавливать нарушения и повреждения, возникшие в ДНК в результате ошибок репликации, а также при воздействии разнообразных эндогенных и внешних мутагенных факторов.

• Повреждение ДНК – это не мутация.

• Мутация – это наследственное (фиксированное) изменение в нуклеотидной последовательности генома организма.

Основные повреждения ДНК

Наследственные заболевания

• Частота генетических заболеваний варьируется от 1:10 000 до 1:1 000 000 • Бывают и уникальные заболевания, 1 на 6 000 000 000 • Общая частота генетических заболеваний в популяции составляет около 3% • В арабских странах около 6% (за счет близкородственных браков)

Генетический груз популяции

каждый человек является носителем в среднем трех аутосомно-рецессивных аллелей

Болезни ассоциированые с дефектами системы репарации

Репарация ДНК

1. Репарация неспаренных оснований.

2. Восстановление исходной структуры.

3. Эксцизионная репарация • Вырезание оснований • Вырезание нуклеотидов.

4. Пострепликативная репарация

• Рекомбинационная репарация • SOS-репарация – мутагенный или

«ошибочный» путь репарации.

Прямая репарация

• В следствии УФ-излучения возникают пиримидиновые димеры (часто тиминовые димеры) или 6-4-фотопродукт

• В основном они блокируют транскрипцию, и только небольшая часть приводит к мутациям.

Тиминовый димер 6-4-фотопродукт

Фотореактивация

• В фотореактивации участвует фермент фотолиаза, мономерный флавин-

зависимый фермент, и кофакторы : FADH- и 5,10-метенилтетрагидрофолат

(5,10-MTHF)

• Фотолиаза связывается в темноте с димерами ТТ

• На свету кофактор абсорбирует фотон

• Используя эту энергию фотолиаза расщепляет ТТ димер

• Фотолиаза освобождает ДНК

Фотолиазы

• Принадлежат большому семейству фотолиаз-криптохромов.

• Представители этого семейства широко распространены во всех царствах

• У растений криптохромы регулируют рост, регулируемый синим светом, а у животных – циркадные ритмы.

Эксцизионная репарация

Mismatch repair

Nucleotide excision repair (NER)

Base excision repair (BER)

Mismatch repair (MMR)

Мисматч репарация: выявляет некомплементарную пару только на дочерней цепи ДНК и производит замену неправильного основания только на дочерней цепи.

Mismatch repair (MMR)

Перед репликацией ДНК находится в метилированной форме, вновь синтезированная цепь - неметилирована

Mismatch repair (MMR)

Основные белки метил-направляемой MMR в E. Coli:

• Mut S и Mut L узнают ММ

• Mut H - • Узнает полуметилированный • сайт GATC и делает надрез

• MutU (UvrD) –геликаза II

раскручивает дуплекс и освобождает надрезанную область

Mismatch repair у человека

Mismatch repair у человека

• Система MMR у эукариот организована сложнее функционирует эффективнее по сравнению с бактериями.

• У эукариот MMR исправляет все некомплементарные пары оснований и, кроме того, репарирует делеции или инсерции в рекомбинационных гетеродуплексах размером до 12 н.

• У бактерий MMR неспособна исправлять пары С*С и репарирует делеции/инсерции не более 3 н. в рекомбинационных гетеродуплексах.

• Ключевые белки MMR – MutL и MutS высококонсервативны, их гомологи обнаружены у всех организмов от E.coli до человека.

• Если у E.coli эти белки (и кодирующие их гены) уникальны, то у эукариот имеется по несколько их гомологов (паралогов). Например, у дрожжей Saccharomyces cerevisiae обнаружены 3 гомолога MutL и 6 гомологов MutS, у человека – 11 гомологов MutL и 4 MutS.

Эксцизионная репарация

Base excision repair - BER

• ДНК гликозилазы, распознают аномальные основания ДНК и катализируют гидролитическое расщепление N-glycosyl связи, между основанием и сахаром.

• Образуется AP-сайт (apurinic/apyrimidinic) • АП-сайт распознается АП-эндонуклеазой,

которая вводит в нить ДНК разрыв. • Фосфодиэстераза отщепляет от ДНК

сахарофосфатную группу, к которой не присоединено основание.

• Брешь размеров в 1 н. застраивается ДНК-полимеразой I и концы ДНК соединяются ДНК-лигазой.

В каждой клетке млекопитающих за одну 20-ти часовую генерацию спонтанно возникает около 10000 апуриновых сайтов и около 500 – апиримидиновых.

Эксцизионная репарация

Nucleotide excision repair - NER

• Узнавание повреждений

• Связывание мультисубъединичного комплекса с поврежденным сайтом

• Двойное надрезание поврежденной цепи на несколько нуклеотидов от поврежденного сайта в обоих направлениях 5' и 3'

• Освобождение олигонуклеотида, содержащего повреждение между двумя надрезами

• Заполнение образовавшейся бреши ДНК полимеразой

• Лигирование

Эксцизионная репарация

• У эукариот система эксцизионной репарации нуклеотидов функционирует по той же схеме, что и у бактерий, но организована сложнее и работает эффективнее, по сравнению с бактериями.

• Эукариотическая эксцинуклеаза включает, по крайней мере 17 белков, и при эксцизии вырезаются 29 н.

Пострепликативная репарация

• Этот способ восстановления целостности ДНК заключается в репарации пробелов, образующихся в дочерних цепях напротив не удаленных в ходе репликации димеров.

• Основная часть таких пробелов репарируется путем рекомбинационных обменов между двумя сестринскими цепями. В процессе используются ферменты ДНК-полимераза I и лигаза, и белок RecA.

SOS-репарация • Ключевая роль в SOS-индукции принадлежит белку RecA. Он

связывается с белком SSB и с однонитевой ДНК и образует ДНК-белковые филламенты, представляющие собой активную форму белка, обозначаемую как RecA*.

• RecA* является сигналом, запускающим индукцию SOS-регулона (около 30 генов), продукты которых необходимы для выживания клетки при массовых повреждениях ДНК.

• В SOS-регулон входят гены UmuD, UmuC и DinB, продукты которых необходимы для «обходной» (translesion) репликации.

• Обходная репликация является неточной, склонной к ошибкам. В результате повышается частота мутаций.