核磁共振基本原理 8讲

核磁共振原理及其在生物学中的应用

第七章仪器和实验方法 § 7.1 — § 7.3

核磁共振基本原理 8讲

吴季辉

样品的准备样品的体积

现代超导谱仪一般使用 5mm 直径样品管，溶液体积 0.5ml-0.7ml ，至少 0.4ml 。早期作 13C-NMR 谱使用 10mm直径样品管，溶液体积 1.5-2ml 。


吴季辉

在样品管中溶液的深度由两个因子决定，样品若超过一定高度，超过部分将会接收不到发射线圈发射的射频造成浪费；若太低则样品与空气磁化率的不同造成界面磁化率突变会影响样品中磁场的均匀性

样品的浓度

由于核磁共振实验固有的低灵敏度，所以它需要比一般红外、紫外实验更大的样品量，这往往成为核磁共振技术在生物学中应用的一个关键问题

对于质子磁共振波谱，样品浓度一般在 10-2-10-

4 M 。在 FT 谱仪中通过多次波谱累加可以降低对最低浓度的要求，只要时间足够，在原则上对于一个分子量 20000 的蛋白质，可以得到 1-3mg 样品的 1H 核磁共振波谱


吴季辉

样品的浓度对于 13C 谱来说，由于 13C 的低灵敏度，

样品浓度的最低限度是 10-2M 。对于一个分子量为 20000 的蛋白质，使用 10mm 直径的样品管，样品体积是 1.5ml ，则需要大约 300mg 的样品

天然小蛋白质 5mM同位素标记的蛋白质 >1mM

溶剂的选择

一个理想的溶剂必须满足以下的条件： 1. 样品在其中有高溶解度； 2. 在我们所感兴趣的波谱范围内没有溶剂峰； 3. 在做变温实验的温度范围内保持液体状态通常使用一些氘代溶剂 •减少溶剂峰的干扰


吴季辉

锁场

• 采用氘核内锁稳定磁场，起锁场的作用 • 氘代氯仿是一个很理想的溶剂，它既适

合于 1H ，也适合于 13C ，在整个质子谱范围内透明，再加上化学性质惰性，便宜，所以是常用的溶剂

• H2O 是生物分子最适宜的溶剂 (90%H2O,

10%D2O)

蛋白质 NMR 研究的溶液条件

选择的 pH 值尽量在偏酸性如 pH 3~5 ，也可以稍为高一些，但尽量不要大于 7 。这是因为蛋白质中的酰胺质子 NH 在 pH 3~5之间与水的交换最慢，在其他 pH 特别是7 以上交换加快，导致 NH 的信号减弱甚至消失，而 NH 的信息对于蛋白质主链乃至侧链谱峰的认证都十分重要


吴季辉

缓冲体系的成份首先要保证蛋白质的稳定及高溶解度，蛋白质的浓度通常要求有数 mM

其次要考虑缓冲液中其他成份对蛋白质谱图的干扰，在这方面磷酸盐缓冲液最好，其他的如Tris 或乙酸等有机成份由于本身也有 CH 质子，其化学位移与蛋白质中的 CH 相近，因而有干扰，特别是缓冲液浓度较蛋白质高出很多时。如果作同核谱，最好能用氘代的 Tris和乙酸等；

作异核谱时影响相对小一些，但其他有机成份也应控制在数十 mM 内。无机盐浓度不宜大于数百 mM ，否则会影响核磁谱仪探头的调谐。在样品溶液中不能有重金属离子污染，因有顺磁性会降低核磁信号的强度和分辨率，必要时可在透析液中加 EDTA 等除去。

样品的处理

离心：样品（特别是生物大分子）溶解后，应该离心除去可能的微小颗粒，以免影响匀场，降低分辨率

除氧：在高分辨结构和弛豫研究中除氧是极为重要的（特别是小分子），溶解在溶液中的分子氧具有顺磁性，它会极大的减少弛豫时间，必须将氧除去。除氧的方法通常有两种，一种叫冰冻－抽真空－融化 : 即把样品放在 NMR 样品管内冰冻，然后抽真空，融化，重复上述过程四次，最后在真空中将管口封住。另一种方法是将氮气或氦气，氩气强迫通过整个样品体积把氧赶走


吴季辉

核磁共振谱仪的主要指标分辨率 (resolution)谱仪的分辨率被定义为能区分两个接近的共振峰的能力，和一般光谱仪不一样它不是由能区分的最小频率间距1-2表示，因为 1-2 与仪器的频率有关， 250MHz

的谱仪可以区分的频率间距自然大于 60MHz 谱仪。核磁共振谱仪的分辨率受到谱线宽度的限制，谱线不是无限窄的，它有一定的宽度，用共振峰半高处的宽度表示。表观线宽不仅取决于弛豫过程，而且取决于仪器本身

老式的谱仪用 10%(v/v)的邻二氟苯 /四氯化碳作为标样，测定某条指定的谱线的半高宽，大致在 0.1-0.5Hz

现代的 FT谱仪用 1-3%氯仿 /氘代丙酮作为标样，测定氯仿主峰的半高宽


吴季辉

氯仿 /氘代丙酮的 NMR谱


吴季辉

核磁共振谱仪的主要指标

线型 (lineshape)仅仅最小线宽还不足以表征分辨率，特别是所观察的两个峰高度相差甚大时，这时分辨率在很大程度上受到强峰接近基线处形状的影响。这时还要进行一种波峰检验 (Hump test)

老式的谱仪用 10%(v/v)的氯仿 / 四氯化碳作为标样，测定氯仿主峰的 0.5%处即 13C卫星线高度处谱线的宽度，大致在 7-15Hz

现代的 FT谱仪用 1-3%氯仿 /氘代丙酮作为标样，测定氯仿主峰的 0.55%及 0.11%处谱线的宽度


吴季辉

13C卫星线指与 13

C 相耦合的质子产生的谱线

旋转边带样品旋转时由于磁场不够均匀而在强峰两边产生的弱峰，与主峰的距离为旋转速度的倍数


吴季辉

氯仿 /氘代丙酮的 NMR 谱 (Hump test)


吴季辉

核磁共振谱仪的主要指标灵敏度 (sensitivity)灵敏度是指谱仪能够测量出弱信号的能力。核磁共振谱仪的灵敏度不仅受到放大器增益的限制，而且受到电子线路中随机噪声的限制，如果弱信号和噪声振幅大小相同，则弱信号就不能检测出来。

灵敏度以信噪比表示

S/N＝ 2.5H/h

其中 H 是信号高度， h 是噪声振幅的峰－峰值。 h 值除以 2.5 的原因是：按照噪声理论，噪声振幅的峰值是无意义的，只有均方根噪声才有意义，二者之间的转化因子在核磁共振中选为 2.5


吴季辉

1H 灵敏度老式的谱仪用 1%(v/v)的乙基苯 /四氯化碳作为标样，测定某些指定谱线的信噪比，大致在 20-300 或更高

现代的 FT谱仪用 0.1%(v/v)的乙基苯 /氘代氯仿作为标样，同样测定某些指定谱线的信噪比

13C 灵敏度老式的谱仪用 90%的乙基苯 /四氯化碳作为标样，测定某些指定谱线的信噪比，得到的信噪比和质子一般同数量级

现代的 FT谱仪用 10%(v/v)的乙基苯 /氘代氯仿 (1H去耦 )或 ASTM(40% p-Dioxane/60%氘代苯 ) (1H不去耦 )作为标样，同样测定某些指定谱线的信噪比


吴季辉


吴季辉

脉冲付里叶变换超导核磁共振谱仪

脉冲付里叶变换超导核磁共振谱仪核磁共振基本原理 8讲

吴季辉

脉冲付里叶变换核磁共振谱仪

•Magnet

•Probe

•Console

•Computer


吴季辉

超导磁体核磁共振基本原理 8讲

吴季辉

对磁体的要求

•高磁场强度•高均匀性•高稳定性


吴季辉

对磁体的要求：高磁场强度核磁共振基本原理 8讲

吴季辉

高场谱仪分辨率的提高

550600650 Hz

750800850900950 Hz

11001150120012501300135014001450 Hz

900 MHz

600 MHz

400 MHz

Current Data ParametersNAME txioestradiolEXPNO 3PROCNO 1

F2 - Acquisition ParametersDate_ 20010126Time 16.50INSTRUM spectPROBHD 5 mm TXI 13C ZPULPROG zgTD 65536SOLVENT CDCl3NS 4DS 0SWH 7440.476 HzFIDRES 0.113533 HzAQ 4.4040694 secRG 180DW 67.200 usecDE 6.00 usecTE 300.0 KD1 3.00000000 sec

======== CHANNEL f1 ========NUC1 1HP1 10.00 usecPL1 -4.00 dBSFO1 900.0236581 MHz

F2 - Processing parametersSI 65536SF 900.0200000 MHzWDW GMSSB 0LB -0.30 HzGB 0.3PC 4.00

Oestradiol-acetate


吴季辉

对磁体的要求：高均匀性•在 100MHz 的谱仪中，假若磁场变化 10-9 ，就会使频率变化 0.1Hz ，所失去的分辨率就等于或超过自然线宽•影响磁场均匀性的原因：磁体设计方案；探头形状与材料；样品管厚度不均匀，同心度不好；样品溶解不均匀，有悬浮颗粒；磁体附近有铁磁性物体•解决方法：在探头周围放置多组线圈，称为匀场线圈，通上适当大小的电流，产生校正磁场，提高总磁场的空间均匀度•低温匀场线圈：同主线圈一起浸在液氦中，平常电流不可调节•室温匀场线圈：工作在室温，有二三十组线圈，每换一个样品均需调节其电流大小（称为匀场）•要进一步提高分辨率，可以让样品管绕其自身的轴旋转，以平均掉垂直于转轴平面中的磁场梯度。样品旋转会伴随旋转边带的产生，转速不同，边带的位置也不同。样品旋转不能太快，否则会产生涡流。通常旋转速度为 20-50Hz ，一般边带小于主峰的 1-2%


吴季辉

对磁体的要求：高稳定性磁场变化的原因：磁体的老化；附近有金属物体移动；温度的波动

解决方法：监视 2H 锁信号的共振频率（由氘代溶剂提供）

场频联锁：磁场变化共振频率变化产生校正电流产生补偿磁场总磁场保持不变


吴季辉

探头

功能：放置样品管，发射射频脉冲，接收核磁信号；

组成：射频线圈及调谐电路；梯度磁场线圈；热电偶，加热器件，传送恒温气流的杜瓦管道；样品管进出用的气流通道


吴季辉


吴季辉

脉冲谱仪普遍采用单线圈探头，发射与接收由同一线圈完成


吴季辉

匀场系统 (The Shim System)

• 低温匀场系统• 室温匀场系统• the on-axis (spinning) shims (z,z2,z3,z4..)

• the off-axis (non-spinning) shims (x,y,xy...)

锁场系统 (The lock-system)

• 氘锁系统• 保证磁场稳定

脉冲发生器

•频率综合器：产生所需频率的射频电流•脉冲编程器：控制脉冲的时序，长度，幅度，相位甚至形状 •射频放大器：产生足够的功率（几十至几百W）•通常一台谱仪有若干射频通道，分别工作在不同的核的共振频率上，在实验中可以同时施加作用于不同核的射频脉冲


吴季辉

接收器

•前置放大器：由于核磁信号很弱，前置放大器总是尽量靠近探头，其性能决定了仪器能达到的信噪比•相敏检波：从射频信号中检出低频的核磁信号（相当于旋转坐标系中的信号），并完成正交检波

•模数转换器：或称ADC ，完成模拟信号的数字化，一般谱仪考虑到转换速度和动态范围，配置的为 16bit ADC ，其动态范围为 -28 到 28-1即 -32,768到32,767


吴季辉

核磁共振信号的检测样品中磁化强度矢量按 Bloch 方程在空间运动，磁化强度矢量在空间的运动将在接收线圈中引起感应电动势，假设线圈在 y轴方向

所以在接收线圈上可以得到包含核磁化向量的大小，进动频率和起始相位的高频信号（高频 FID）


吴季辉

单一线圈不能区分正负频率和相位

正交检波区别正负频率及相位

相敏检波器及正交检波

相敏检波器实际上相当于一个混频器或模拟乘法器，接收到的核磁信号与参照信号（与射频场同频）经相敏检波器得到的输出为低频 FID ，但不能区别正负频率及相位

两路正交的相敏检波器完成正交检波，以区别正负频率及相位


吴季辉

数据获取

sfo1: spectrometer frequency offset of the first (observe) channel

bf1 is the so-called basic-spectrometer frequency, e.g. 500.13 MHz and o1 is the offset,

sfo2: spectrometer frequency offset of the second (decoupler) channel

• required for example for acquisition of proton decoupled carbon spectra. The proton frequency is then defined on the second channel and should correspond to the center of the proton spectrum.

如何选择谱宽

dwell time.

The signal is sampled stroboscopically

and neighboring data points are separated by the dwell time.

离散采样 •脉冲付里叶变换核磁共振方法的优点之一是可以对数据进行各种处理（信息加工）•模拟的 FID信号必须经过离散采样，并对信号数字化，才能送到计算机处理 •采集的离散化数据同原始的模拟数据有相同点 ,也有不同点 :

在一定条件下 ,离散化数据可以代表原始的模拟数据•采样定理


吴季辉

采样定理要使采集的离散的时间序列能代表原来的模拟信号，采样速率必须遵守采样定理，即

fs 2fh

其中 fs 是采样频率，表示每秒钟采样次数， fh 为被采样的模拟信号的最高频率。从上式可见，每个周期至少采取两点

采样速率不够引起将导致信号折迭现象，这是离散化导致的后果

dw = 1/sw or dw = 1/2sw


吴季辉

采样定理

信号折迭现象

采样速率是 2000Hz ， 1600Hz处的谱线由于采样速率不够而折迭，将出现在 400Hz处


吴季辉

数字分辨率根据采样定理，要得到一个最高频率为 (Hz) 的谱，所需要的最小采样速度是每秒 2 个点，如果采集的数据点数目是 N ，整个 FID 采集时间是 At ，则满足以下关系式

2 At = N

如果采用正交检波，则射频照射频率可以放在谱的中心，这时谱宽为 2 ，经过 Fourier 变换后的频域信号谱线频率的数字精确度（数字分辨率）相当于谱宽为点数所除，为 FID采集时间的倒数

注意要区分谱仪分辨率和这里所说的数字分辨率。前者是由磁场的均匀度决定的，而后者由可选择的谱宽和数据点决定，它是对谱仪分辨率的实际限制，影响信号的确定和线型


吴季辉

相干叠加 •采样得到的 FID 信号可以进行多次累加以提高信噪比•由于信号是有规律的出现的，所以 n 次累加所得信号的大小与累加次数 n 成正比•而噪声是随机的 , 假设噪声按高斯分布 , 正的和负的等几率分布 , 则经过 n 次累加 , 噪声的大小和累加次数 n的平方根成正比•于是信噪比等于


吴季辉

FFT 快速 Fourier 变换FID 信号必须经过 Fourier 变换才能变为普通的核磁共振波谱。这种变换是靠计算机上进行的离散 Fourier 变换实现的，它的正负变换的表示式分别为

直到 1965年 Cooley-Tukey提出了快速 Fourier 变换算法，使原先的 N2 次运算减为 (Nlog2N)/2 次运算，使运算次数大大减少，并且节省了计算机的内存，才使脉冲付里叶变换谱仪成为现实


吴季辉

窗函数处理

可以对 FID 信号进行数学处理，以提高信噪比或提高分辨率

各种窗函数形式

(a)未加权 FID; (b)线性截趾 ; (c)升指数函数 ; (d)梯形函数 ; (e) 降指数函数 ; (f)卷积差函数 ; (g)正弦钟函数 ; (h) 移位的正弦钟函数 ; (i)LIRE; (j)Gauss函数


吴季辉

改进灵敏度或分辨率的各种方法比较 (计算机模拟谱 )

(左 ) 无噪声 ; (右 ) 含有噪声 ; (a) 未加权波谱 ; (b) 梯形函数 ; (c) 升指数函数 ; (d) 卷积差函数 ; (e) 正弦钟函数 ; (f) LIRE; (g) Gauss函数


吴季辉

相位调整（调相）

•通常 Fourier 变换得到的核磁共振波谱需要进行调相

形成复数对的低频 FID 信号经过 Fourier 变换得到复数频域信号，相当于吸收信号和色散信号，一般保留实部

当核磁化向量的起始相位为零时，其实部对应于吸收信号，虚部对应于色散信号

当核磁化向量的起始相位不为零时，实部及虚部并不简单地对应于吸收信号和色散信号，而是它们的线性叠加


吴季辉

BRUKER 谱仪• sw: spectral width• gives the width of the acquired spectrum (on Br

uker instruments, sw is in units of ppm, swh in units of Hz).

• dw: dwell time• is the time spacing between sampling of two co

nsecutive data points.• dw = 1/sw or dw = 1/2sw• The dwell time is determined by the inverse of

the spectral width (or the inverse of twice the spectral width, depending on the quadrature detection mode).

• td: time domain data points• The number of points that are sampled is called "time domain" da

ta points (td). The longer the FID is sampled the better will be the resolution in the spectrum provided

• there is still signal in the FID.• aq: acquisition time• determines the total time during which a single FID is sampled• aq = td * dw• for 1D spectra, aq is set such that the signals have completely dec

ayed towards the end of the FID (which corresponds to the transverse relaxation time T2). If aq is set to a shorter value, the resolution is lower, if aq is >> T2, only noise will be sampled at the end of the FID, and therefore the experimental time is unnecessarily prolonged.The complete measuring time for a simple 1D spectrum is approx.

• ttot = ns (RD+aq)• in which ns is the number of scans and RD the relaxation delay (v

ide infra).

• ns: number of scans• the number of FIDs which are co-added. The signal to nois

e ratio of a measurement increases as• which means that in order to improve the S/N by a factor o

f two the measurement time must be increased by a factor of 4. Sometimes, the minimum number of ns is determined

• by the phase-cycle of an experiment.• RD: relaxation delay• time between end of sampling of the FID and start of the n

ext experiment. On Bruker instruments, the relaxation delay is characterized by the parameter d1. The effective

• time for relaxation is given by the repetition rate• S• N ∝ns

Documents

核磁共振基本原理 8讲