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한방재활의학과학회지 제17권 제1호(2007년 1월)
J Oriental Rehab Med 2007;17(1):27-41
27
HL-60 세포의 Apoptosis에 대한 가미항백탕의 효과
정상필․김경수․송정섭․박성 ․정문재․이수경․권 달․송용선
원 학교 한의과 학 한방재활의학과교실
￭ 수 : 2006년 12월 21일, 수정 : 2007년 1월 9일, 채택 : 2007년 1월 14일￭ 교신 자 : 권 달, 주 역시 남구 주월동 543-8 원 학교 한의과 학 부속 주한방병원 한방재활의학과교실
Tel : (062) 670-6452, Fax : (062) 670-6767, E-mail : [email protected]
Effect of Gamihangbak-tang(Jiaweikangbai-tang)
on Apoptosis of HL-60 Cells
Sang-Pil Chung, O.M.D., Kyeong-Su Kim, O.M.D., Jung-Sup Song, O.M.D., Seong-Heak Park, O.M.D.,
Moon-Jae Jung, O.M.D., Su-Kyung Lee, O.M.D., Young-Dal Kwon, O.M.D., Yung-Sun Song, O.M.D.
Dept. of Oriental Rehabilitation Medicine, College of Oriental Medicine, Won-Kwang University
Objectives :
To investigate anti-leukemic effect of Gamihangbak-tang(Jiaweikangbai-tang) using human promyelocytic leukemic HL-60 cells.
Methods :
Cell viability was determined using MTT assay. Morphological change was observed under a fluorescence microscope through DAPI-Methol staining.
DNA fragmentation was analyzed by agarose gel electrophoresis. Caspase activity was measured by using a fluorogenic caspase substrate. Cleavage
of caspase-3, PARP and Bid, expression of Bcl-2 and Bax, release of cytochrome C, and activation of MAPKs (ERK, JNK, p38) were determined by
Western blot analysis.
Results :
Gamihangbak-tang(Jiaweikangbai-tang) treated HL-60 cells increased time-dependently DNA fragments and apoptotic bodies. Activities of caspase-3, 8,
9 increased on 30min after Gamihangbak-tang(Jiaweikangbai-tang) treatment and greatly increased after 3h treatment. PARP cleavage also increased
89 kDa PARP fragment on 3hr after Gamihangbak-tang(Jiaweikangbai-tang) treatment. Expression of Bcl-2 and Bax in Gamihangbak-tang
(Jiaweikangbai-tang) treated HL-60 cells was not changed, but caspase-8-dependent Bid cleavage was observed. Gamihangbak-tang(Jiaweikangbai-
tang) also induced cytochrome C release from mitochondria into the cytosol. Activation of ERK, p38, and JNK increased in apoptosis induced by
Gamihangbak-tang(Jiaweikangbai-tang) in HL-60 cells, but only ERK activation was concerned in Gamihangbak-tang(Jiaweikangbai-tang)-induced
apoptosis.
Conclusions :
Apoptosis induced by Gamihangbak-tang(Jiaweikangbai-tang) in HL-60 cells induce caspase-3 activation through Bid cleavage by caspase-8, caused cy-
tochrome C release from mitochondria, and ERK activation.
Key words : HL-60, Gamihangbak-tang(Jiaweikangbai-tang), Apoptosis, ERK, p38, JNK
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Ⅰ. 서 론
AS1011), sulforaphane
2), paclitaxel
3), campto-
thecin4)
, 7-hydroxystaurosporine (UCN-01)4)
, su-
lindac sulfide5), sulindac sulfone
5)과 같은 부분
의 항암제는 apoptosis에 의한 세포사멸을 유도
한다. Apoptosis는 로그램된 세포사멸로 알려
져 있고 그에 따른 신호 달기 의 활성과 세포
증식과 세포사멸사이의 균형을 유지하는데 요
한 역할을 수행하는 선택 이고 생리 인 과정이
다6-8)
. 따라서 apoptosis는 항암치료에 있어 요
한 상으로, 항암제는 apoptosis에 의하여 암세
포에 한 항암효과를 발휘하는 것으로 알려져
있다9)
.
Apoptosis를 이끄는 표 인 두 가지 경로가
있다. 하나는 수용체가 개된 apoptosis이며, 다
른 하나는 화학 으로 유도된 apoptosis 경로이
다10-12)
. 사멸수용체에 의한 apoptosis는 사멸도메
인과 caspase-8과 caspase-3 등을 연속 으로 모
집하여 apoptosis를 유발한다. 이와 조 으로,
화학 으로 유도된 apoptosis는 caspase-8에 의한
Bid 단을 수반한다. 그것에 의하여 미토콘드리
아로부터 cytochrome C를 방출시키게 되며, 방
출된 cytochrome C는 Apaf-1과 결합하여 dATP
존재 하에서 caspase-9를 활성화 시킨다13-15)
. 활
성화된 caspase-9는 다수의 단백질을 단시키는
caspase-3과 같은 downstream effector caspase를
활성화시켜 apoptosis를 유발하게 한다. Cyto-
chorme C의 방출은 한 caspase-8 의존 으로
나타나는 과정이 없이, Bax단백질에 의해 미토콘
드리아를 직 으로 자극하여 apoptosis가 이루
어지기도 한다11,16-18)
.
Mitogen-activated protein kinase (MAPKs)는
세포증식, 분화, apoptosis와 같은 다양한 세포반
응들의 조 에 여하는 serine/threonine kin-
ases이다19,20)
. 주요한 세 가지 MAPKs subfamily
들은 extracellular signal-regulated kinase (ERK),
c-Jun N-terminal kinase (JNK/SAPK), p38 kin-
ase이다. 각각의 MAPKs는 특정한 인산화 경로
를 통하여 활성화된다. ERK 경로는 주로 mi-
togen과 성장인자들에 의해 활성화되고 세포성장
생존과 분화를 조 하는데 요한 역할을 수
행한다21,22)
. 조 으로 JNK와 p38 경로는 화학
는 환경 스트 스에 한 반응에 의해 활
성화되고 주로 apoptosis 유도에 여한다22,23)
.
한편 천연물로부터 분리된 물질들은 백 병세
포를 효과 으로 사멸시킨다는 결과가 최근에 많
이 보고되고 있다24-32)
. 특히 貝母25)
, 白芷26)
, 黃芩27)
,
樗根白皮28)
, 桑寄生29)
, 人蔘30)
, 黃芪31)
, 甘草32)
등
은 여러 가지 유형의 암을 치료하는데 빈번히 사
용된 천연물들이다. 이 연구에서, 와 같은 기
조사를 통하여 항백 병효과가 있는 것으로 연
구된 약재들을 복합방으로 구성한 항백탕은, HL-
60세포에서 caspase-3와 caspase-8 경로를 경유하
여 apoptosis를 유도하 고 한 세포성장을 억
제시키고 과립백 구분화를 유도하 다33).
본 논문에 사용된 가미항백탕은, 이 작용을 더
보완하기 하여 본래의 항백탕에 목단피를 가미
하고 용량을 변형하여 구성한 것이다. 목단피에
서 분리된 Penta-O-galloyl-beta-D-glucose (PGG)
는, HL-60세포에서 apoptosis를 유도하고34)
, U937
세포에서는 NF-κB활성 억제를 통하여 항암제의
활성을 증가시키고 한 암의 이를 유발할 수
있는 IL-8신호를 차단하는 것으로 보고된 바 있
다35). 따라서 본 연구에서는 인간 골수성백 병
세포주인 HL-60 세포의 apoptosis에 한 가미항
백탕의 작용기 을 살펴본 결과, 유의한 결과를
얻었으므로, 이에 보고하고자 한다.
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HL-60 세포의 Apoptosis에 한 가미항백탕의 효과
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Table Ⅰ. The Botanical Origins and Ration of Crude
Herbs of Gamihangbak-tang(Jiaweikangbai-
tang)
Crude herbs Botanical origin Weight(g)
黃芩 Scutellariae Radix 60
牧丹皮 Moutau Cortex 60
桑寄生 Loranthi Ramulus 60
樗根白皮 Ailanthi radicis Cortex 60
白芷 Angelicae dahuricae Radix 60
黃芪 Astragal Radix 40
人蔘 Ginseng 40
甘草 Glycyrrhizae Radix 40
貝母 Fritillariae Rhizoma 40
Ⅱ. 실험재료 및 방법
1. 시약 항체
3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyl tetra-
zolium bromid (MTT), 4,6-diamidino-2-phenyl-
indole (DAPI), propidium iodine (PI), Ribonu-
clease A (RNase A), protease inhibitor cocktail
은 Sigma-Aldrich Chemical (St. Louis, MO,
USA)로부터 구입하 다. N-Acetyl-Asp-Glu-Val-
Asp-pNA (Ac-DEVD-pNA), N-Acetyl-Ile-Glu-Thr-
Asp-pNA (Ac-IETD-pNA), N-Acetyl-Leu-Glu-His-
Asp-pNA (Ac-LEHD-pNA), PD98059, SB203580,
SP600125은 Calbiochem (La Jolla, CA, USA)로부
터 구입하 다. Anti-procaspase-3, anti-Bax, an-
ti-Bcl-2 항체는 Santa Cruz Biotechnology, INC.
(Santa Cruz, CA, USA)로부터 구입하 다. Anti-
Bid, anti-cytochrome c 항체는 BD PharMingen
(San Diego, CA, USA)로부터 구입하 다. Anti-
PARP, anti-ERK, anti-phospho-ERK, anti-p38, an-
ti- phospho-p38, anti-JNK, anti-phospho-JNK 항
체들은 Cell Signaling Technology INC. (Beverly,
MA, USA)로부터 구입하 다.
2. 가미항백탕 제조
가미항백탕은 Table Ⅰ과 같이 9가지 한약재로
구성되어 있다. 가미항백탕 460g을 증류수 7L를
사용하여 100℃에서 3시간 동안 추출하 다. 추
출물은 2,000rpm에서 15분 동안 원심 분리하여
비수용성성분을 제거하 다. 상층액은 부크 퍼
넬 에 와트만 No. 4 필터페이퍼를 통하여 여과
하 다. 여과물은 12시간 동안 -20℃에 보 후,
동결 건조하 다. 추출물의 수율(w/w)은 약
34.39% 다. 동결 건조된 추출물은 PBS에 40㎎/
㎖ 농도로 용해하여 -20℃에 보 하 고, 실험에
사용하기 에 희석하여 사용하 다.
3. 세포배양
HL-60세포는 American Type Culture Collec-
tion (ATCC, Rockville, MD, USA)로부터 분양받
았고, 10% fetal bovine serum (FBS, Invitrogen,
Burlington, ON, Canada), 100U/㎖ penicillin,
100㎍/㎖ streptomycin이 포함된 RPMI 1640 배
지(Invitrogen, Burlington, ON, Canada)를 사용
하여 37℃와 5% CO2 상태에서 배양하 다.
4. 세포독성검사
세포는 24 well 이트에 1×105 cells/well로
seeding하 다. 세포는 가미항백탕을 일정한 농
도로 증가시켜 24시간 동안 처리하 다. 처리 후
에, 5㎎/㎖ MTT용액 100㎕를 각각의 well에 첨
가하 고 4시간 동안 배양하 다. 비수용성의
MTT-formazan 결정들은 등량의 solubilization
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용액 (10% SDS/0.01 N HCl)을 첨가하여 용해시
켰고 5% CO2 와 37℃조건하에서 12시간 동안 배
양하 다. Formazan의 양은 SpectraMAX 250
microplate spectrophotometer (Molecular Devices,
Sunnyvale, CA)를 이용하여 570㎚에서 측정하
다. 세포생존율의 페센트는 방정식[(mean OD of
treated cells/mean OD of control cells) × 100]
으로 계산하 다.
5. DNA분 검사
DNA는 WizardⓇGenomic DNA Purification
Kit (Promega, Madison, USA)을 사용하여 추출
하 다. 간략하게, HL-60 (2×106 cells/dish)은
180㎍/㎖ 가미항백탕을 0.5, 1, 3, 6시간 동안 처
리하 다. 세포는 harvest한 후, ice-cold PBS에
두 번 세척하고 DNA를 제조사의 로토콜에 따
라서 추출하여, TE buffer (10 mM Tris-HCl, pH
8.0, 1 mM EDTA)로 4℃에서 12시간 동안 배양
하 다. DNA는 0.5㎍/㎖ of ethidium bromide
을 포함한 1.2% 아가로스 젤을 통하여 100V에서
2시간 동안 분리하여 분석하 다. DNA밴드는
UV transilluminator하에서 찰하 다.
6. DAPI염색
Rat mesangial cells는 35-㎜ 배양 시에 4×
105cells/dish로 seeding하 다. 24시간 배양 후,
180㎍/㎖ 가미항백탕을 3시간 는 6시간 동안
처리하 다. 세포는 cytospin을 사용하여 슬라이
드 에 부착하 다. 부착된 세포는 DAPI-메탄
올 (1㎍/㎖)용액에 세척되고 DAPI-메탄올 용액
으로 37℃에서 15분 동안 염색되었다. 염색된 세
포는 메탄올로 세척되고 미경으로 찰하
다. apoptosis 세포는 핵응축, apoptosis body
와 같은 apoptosis의 뚜렷한 특징에 의해 구별되
었다.
7. Caspase 활성검사
세포는 lysis buffer (50mM HEPES, pH 7.4,
100mM NaCl, 0.1% CHAPS, 1mM DTT, 0.1mM
EDTA)에 freezing/thawing에 의해 lysis되고
Cells lysate는 4℃에서 10,000rpm으로 1분 동안
원심 분리하여 얻었다. Caspase활성검사는 제조
사의 protocol에 따라서 수행하 다. 간략하게,
10㎕ cell lysates (30㎍ total protein)+88㎕ re-
action buffer (50mM HEPES, pH 7.4, 100mM
NaCl, 0.1% CHAPS, 10mM DTT, 0.1mM EDTA,
10% glycerol)와 2㎕ fluorogenic Ac-DEVD-pNA
(caspase-3), Ac-IETD-pNA (caspase-8) 는 Ac-
LEHD-pNA (caspase-9) substrate (200µM final
concentration)를 혼합하 다. 샘 은 37℃에서 3
시간 동안 배양 후 enzyme-catalyzation되어 방출
된 p-nitroanilide를 SpectraMAX 250 microplate
spectrophotometer로 405㎚에서 측정하 다.
8. Western blot analysis
세포는 ice-cold PBS로 세척하 고 1% pro-
tease inhibitor cocktail이 포함된 ice-cold lysis
buffer (50mM Tris-HCl, pH 7.4, 150mM NaCl,
1% NP-40, 0.5% sodium deoxycholate, 0.1%
SDS, 1mM sodium vanadate)로 얼음 에서 30
분 동안 lysis하 다. Cell lysate들은 온원심분
리기로 14,000×g로 15분 동안 원심분리하 고,
단백질 농도는 Bradford assay를 이용하여 측정
하 다. 총 30㎍의 단백질 샘 을 10% 는 12%
SDS-PAGE 젤로 분리하 고 40V에서 3시간 동
안 nitrocellulose membrane상에 transfer하 다.
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HL-60 세포의 Apoptosis에 한 가미항백탕의 효과
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Fig. 1. Effect of Gamihangbak-tang(Jiaweikangbai-tang)
on cytotoxicity in HL-60 cells. The cells were
treated with various concentrations of Gami-
hangbak-tang(Jiaweikangbai-tang) for 24 h and
the cells were tested for viability by MTT
assay. Values are mean±SD, N= 3.
0
20
40
60
80
100
120
0 50 100 150 200 250 300 350 400 450
Concentration. of Gamihangbak-tang(Jiaweikangbai-tang) (㎍/㎖)
Cell v
iabiliity
(% o
f C
ontr
ol)
Membrane은 5% milk가 포함된 Tris-buffered
saline+Tween-20 (20mM Tris-HCl, pH 7.6, 150
mM NaCl, 0.05% Tween-20)에 blocking하 고,
1차 항체를 probing하 다. 면역 활성은 퍼옥시
아제가 붙어있는 항-래빗 는 항-마우스 2차 항
체를 사용하여 SuperSignal West Pico Chemilu-
minescent (Pierce, Rockford, IL, USA)에 의해
탐지하 다.
9. 세포내 분획
세포내 분획은 Pae HO et al31)
방법에 의해
실행하 다. 가미항백탕을 처리한 후, 세포(4×
106 cells)는 haverst되고 ice-cold PBS에 세척하여
1% protease inhibitor cocktail이 첨가된 ice-cold
lysis buffer (250mM sucrose, 1 mM EDTA,
0.05% digitonin, 25mM Tris-HCl, pH 6.8, 1mM
DTT) 30 동안 가볍게 lysis하 다. Lysate는
4℃에서 4분 동안 11,000rpm에서 원심 분리하
다. 원심분리 후, 상층액(미토콘드리아가 없는 세
포질분획)과 pellet (미토콘드리아를 포함한 분획)
을 획득하 다. 상층액과 pellet은 15% PAGE에
서 기 동하 고 anti-cytochrome C 항체를 사
용하여 western blot하 다.
10. 통계처리
모든 데이터의 결과는 마이크로소 트 오피스
의 엑셀 (EXCEL) 2003 로그램을 통하여 통계
처리 하여 mean ± standard deviation (SD)로 기
록하 다.
Ⅲ. 실험결과
1. HL-60세포에 한 가미항백탕의 세포독성
효과
세포독성에 한 가미항백탕의 효과는 MTT검
사를 사용하여 측정하 다. 가미항백탕은 HL-60
세포의 생존율을 농도 의존 으로 감소시켰다
(Fig. 1). HL-60세포의 성장을 50% 억제하는 농
도 (IC50)는 략 180㎍/㎖이었다.
가미항백탕에 한 HL-60세포의 세포독성효과
가 apoptosis에 의한 결과인지를 조사하기 해
DAPI염색을 통한 세포형태변화와 기 동을 통
한 DNA분 상을 조사하 다. DAPI염색은 apop-
tosis에 의한 세포의 형태 인 변화를 찰하는데
사용된다. Dye는 DNA와 결합하여 형 색소이고
형 미경에서 블루형 을 나타낸다. 밝은 블루
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Fig. 2. The effect of Gamihangbak-tang(Jiaweikangbai-tang) on DNA fragmentation, and morphology in HL-60 cells.
(A) The cells were treated with 180㎍/㎖ of Gamihangbak-tang(Jiaweikangbai-tang) for 0, 0.5, 1, 3, and 12h.
DNA was extracted, then separated by agarose gel (contained EtBr) electrophoresis, and visualized under UV
light. M, 100 bp DNA ladder marker. (B) Cells were treated with 200㎍/㎖ of Gamihangbak-tang
(Jiaweikangbai-tang) for 0, 3, and 64h. After, cells were subjected to cytospin, stained with DAPI-MeOH and
observed under a fluorescence microscope.
를 나타내는 apoptosis핵은 염색체응축과 apop-
tosis body에 의해 쉽게 구별할 수 있다. HL-60
세포를 3시간 는 6시간 동안 IC50농도로 가미
항백탕을 처리하 다. Apoptosis 세포는 가미항
백탕 처리 3시간 후부터 찰되었고 응축된 핵의
염색체를 가진 세포인 apoptosis body가 나타났
다(Fig. 2A). internucleosome을 180~200염기 으
로 자르는 endogenous DNase에 의한 DNA 분
은 apoptosis의 생화학 인 증거이다. HL-60세
포에 IC50농도의 가미항백탕을 0.5, 1, 3, 6시간동
안 처리하여 internucleosomal DNA 분 상을
아가로스젤 기 동을 통하여 조사하 다. in-
ternucleosomal DNA 분 상의 ladder pattern
은 시간 의존 으로 찰되었다. HL-60세포는 가
미항백탕을 3시간 동안 처리 후부터 DNA분
상이 유도되었다(Fig. 2B).
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HL-60 세포의 Apoptosis에 한 가미항백탕의 효과
33
Fig. 3. The effect of Gamihangbak-tang(Jiaweikangbai-tang) on activation of caspase-3, -8, -9, and proteolytic
cleavage of PARP in HL-60 cells. HL-60 cells were treated with Gamihangbak-tang(Jiaweikangbai-tang) (180
㎍/㎖) for 0.5, 1, 3, and 6 h. (A) Caspase-3, -8, and -9 activities were measured with AC-DEVD-pNA,
AC-IETD-pNA, and AC-LEHD-pNA respectively. The activation was measured as the increase in activity (%)
with respect to control cells (100%). Values are mean±SD, N=3. (B) Whole cell lysates were subjected to
SDS-PAGE followed by Western blot analysis with an anti-caspase-3 and anti-PARP antibodies.
2. HL-60세포에서 가미항백탕에 의한 apop-
tosis 유도효과
Caspase family는 apoptosis를 수행하는데
요한 역할을 하고 있다. caspase-3, -8, -9는 apop-
tosis에 한 요한 세포의 수행자이다. 가미항
백탕에 의한 procaspase-3, -8, -9의 활성을 조사
하 다. Caspase활성검사는 가미항백탕 처리에
의해 시간 의존 으로 유도된 caspase-3, -8, -9의
활성을 보여주었다. Caspase의 활성은 가미항백
탕 처리 후 0.5시간부터 찰되었다(Fig. 3A).
Procaspase-3의 활성을 재검증하기 해, procas-
pase-3과 PARP를 western blot으로 분석하 다.
가미항백탕은 procaspase-3의 단을 시간 의존
으로 유도하 다(Fig. 3B). Poly(ADP-ribose)
polymerase (PARP)은 caspase-3의 활성에 의해
단되는 다수의 단백질 의 하나이다. 비록
PARP가 세포생존에 있어서 필수 이지는 않지
만, PARP의 단은 apoptosis의 다른 증거이
다. 가미항백탕을 다양한 시간으로 처리한 HL-60
세포는 시간 의존 으로 116 kDa PARP를 89
kDa로 분 을 유도하 다(Fig. 3B).
3. HL-60에서 Bcl-2와 Bax의 발 Bid
단을 통한 cytochrome c 방출에 한
가미항백탕의 효과
항apoptosis인자인 Bcl-2와 원apoptosis인자인
Bax발 에 가미항백탕이 미치는 향을 조사하
기 하여 western blot 통하여 Bcl-2와 Bax의 단
백질수 을 조사하 다. 가미항백탕에 의해 유도
된 HL-60세포의 apoptosis에서 Bcl-2와 Bax의 발
에는 아무런 향을 미치지 못했다(Fig. 4).
Bid 단은 화학 으로 유도된 cytochrome c방
출에서 요한 역할을 하고 있다. 가미항백탕을
처리한 HL-60세포에서 Bid의 단으로 인하여
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Fig. 4. Effect of Gamihangbak-tang(Jiaweikangbai-tang)
treatment on expression of Bcl-2 and Bax, BID
cleavage, and cytochrome c release in HL-60
cells. HL-60 cells were treated with Gami-
hangbak-tang(Jiaweikangbai-tang) (180㎍/㎖) for
0.5, 1, 3, and 6 h. Bcl-2 and Bid was de-
termined by Western blot analysis using anti-
Bcl-2, anti-Bax, anti-BID, anti-cytochrome c
antibodies.
Fig. 5. Effects of Gamihangbak-tang(Jiaweikangbai-
tang) on activation of ERK, p38 and JNK in
HL-60 cells. The cells were treated with
Gamihangbak-tang(Jiaweikangbai-tang) (180㎍
/㎖) for 0.5, 1, 3 and 6h. Cells were the
lysed, and the supernatants were subjected
to Western blot analysis using anti-ERK,
anti-p-ERK, anti-p38, anti-p-p38, anti-JNK and
anti-p-JNK antibodies.Bid의 단백질 수 이 감소하 다(Fig. 4). 다음으
로 Bid 단에 의한 미토콘드리아로부터 cyto-
chrome C의 방출을 조사하 다. 가미항백탕에
의해 유도된 apoptosis에서 cytochrome C의 방
출을 조사하기 하여 세포질분획과 미토콘드리
아분획으로 분리하여 western blot을 통해 각각
분회의 cytochrome C의 단백질 수 을 조사하
다. 미토콘드리아분획에서 cytochrome C는 가미
항백탕 처리 후 3시간부터 감소하기 시작하 고,
세포질분획에서도 한 가미항백탕을 3시간 처리
후부터 cytochrome C의 방출이 증가하 다(Fig. 4).
4. HL-60세포에서 가미항백탕에 의해 유도된
apoptosis에서 MAPKs의 활성효과
MAPKs신호 달기 은 apoptosis의 조 에서
요한 역할을 수행하고 있다. 가미항백탕에 의
해 유도된 HL-60세포의 apoptosis에서 MAPKs의
련하여 ERK, p38, JNK의 활성에 한 가미항
백탕의 효과를 조사하 다. ERK, p38, JNK은
HL-60세포에서 가미항백탕 처리 후 0.5시간부터
활성이 증가하 지만 그 이후부터는 큰 증가를
보이지 않았다(Fig. 5).
ERK, p38, JNK의 활성이 가미항백탕에 의해
유도된 apoptosis에 련되었는지를 검증하기
해 가미항백탕에 의해 유도된 HL-60세포에서
MAPKs inhibitor의 효과를 caspase-3 활성과
PARP 단을 통하여 조사하 다. HL-60세포는
MAPKs inhibitor를 1시간 동안 처리한 후, 가
미항백탕을 처리하 다. PD98059 (ERK inhibi-
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HL-60 세포의 Apoptosis에 한 가미항백탕의 효과
35
Fig. 6. Effect of ERK, p38 and JNK inhibitors on Gamihangbak-tang(Jiaweikangbai-tang)-induced apoptosis in HL-60
cells. The cells were preincubated with each inhibitor (ERK inhibitor, PD98059; p38 inhibitor, SB203580; JNK
inhibitor, SP600125) for 1hr, and then treated with 180㎍/㎖ Gamihangbak-tang(Jiaweikangbai-tang) for 6hr.
(A) The caspase-3 activity was measured as the increase in activity (%) with respect to control cells (100%).
Values are mean±SD, N=3. (B) PARP cleavage was determined by Western blot analysis using anti-PARP
antibody.
tor)는 가미항백탕을 처리한 세포에서 caspase-3활
성과 PARP 단을 감소시켰지만, SB203580 (p38
inhibitor), SP600125 (JNK inhibitor)는 caspase-3활
성과 PARP 단에 아무런 향을 주지 못했다
(Fig. 6).
Ⅳ. 고 찰
백 병은 상 으로 은 빈도로 일어나지만
성 는 만성 질병과 같이 일어나는 액학
악성종양이다. 백 병은 조 세포 분화의 장애로
인하여 발병한다. 조 모세포는 그 자신을 self-
renewal하여 다양한 액세포형태로 분화시킨다.
정상 인 조 모세포는 골수에서 세포성장, 분화,
세포사멸의 균형을 유지하는 외부성장요인에 의
한 제한 인 경로를 통하여 액세포로 분화된
다. 백 병의 기 조 구세포는 골수의 미세
환경 내에서 외부자극과 각각의 구세포로 분화
에 하여 반응하지 않는다. 이로 인하여 백 병
세포는 immortalization되고, 골수에서 다른 세포
의 비율보다 높은 세포수로 성장하게 되고 말
액으로 퍼져나가게 된다. 결국 백 병세포는
apoptosis가 일어나지도 않고 분화도 일어나지
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한방재활의학과학회지 제17권 제1호(2007년 1월)
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않게 된다. 재 백 병치료는 과다 증식하는 백
병세포를 apoptosis로 유도하거나 분화를 유도
하는 쪽으로 수행되고 있다36)
.
가미항백탕은 항백 작용이 있는 貝母25), 牧丹
皮34,35)
, 樗根白皮28)
, 黃芩27,37)
, 白芷26,38)
비롯하여
모두 9가지 한약재로 구성된 한방처방이다. 貝母
는 인간 골수성 HL-60세포에서 성장 억제와 과
립백 구분화를 유도하 고, ATRA와 병용 처리
하 을 때 분화유도 효과가 더욱 증가하는 것으
로 보고되었다25). 牧丹皮에서 분리된 Penta-O-
galloyl-beta-D-glucose (PGG)는 HL-60세포에서
세포고사를 유도하는 것으로 보고되었고34)
, U937
세포에서는 NF-κB활성 억제를 통하여 항암제의
활성을 증가시키고 한 암의 이를 유발할 수
있는 IL-8신호를 차단하는 것으로 보고되었다35)
.
樗根白皮는 K562세포에서 apoptosis를 유도하는
세포독성 효과를 가지는 것으로 보고되었고28)
.
黃芩으로부터 분리된 baicalin과 白芷로부터 분리
된 imperatorin은 HL-60세포에서 암억제와 련
된 유 자들의 발 을 증가시키고, 암세포 증식
을 활성화시키는 유 자들의 발 을 억제시키는
것으로 보고되었다.26,27,37,38).
Apoptosis는 백 병세포치료에서 화학요법제
에 한 요한 반응이다. apoptosis 세포는 세포
축소, 염색질 응축, DNA 분 상, apoptosis
body의 형성, caspase활성과 같은 특성으로 구별
된다. apoptosis 기 은 caspase라 불리는 cystein
의존 aspartate 주도 단백질분해효소 패 리의
활성과 련되어 있다.
본 연구에서 가미항백탕은 인간 골수성 HL-
60 세포에 하여 세포독성을 나타내었고(Fig. 1),
이러한 세포독성은 HL-60세포의 apoptosis를 통
하여 유발되었다(Fig. 2). 가미항백탕에 의한 HL-
60세포의 apoptosis 유도는, caspase-8의 활성에
의한 Bid 단을 통하여 미토콘드리아로부터 cy-
tochrome C를 방출하여 caspase-9의 활성을 경
유하여 caspase-3을 활성에 의해 이루어졌다(Fig.
3,4). 가미항백탕은 HL-60세포에서 caspase-8을
활성화시켰지만 그에 한 기 이 명확하지 않
다. caspase-8의 활성은 사멸수용체를 통하여 활
성화되기도 하지만 그들 자신이 oligomerization
에 의해 autoactivation되기도 한다39). 따라서
HL-60세포에서 가미항백탕에 의한 caspase-8의
활성에 한 연구가 앞으로 더 필요하다.
미토콘드리아로부터 cytochrome C의 방출은
apoptosis에서 요한 사건이다40)
. Cytochrome C
의 방출은 caspase-8의 효과를 증폭시키는 역할
을 수행한다41). Caspase-8은 apoptosis경로에 수
반되는 effector caspase들을 미토콘드리아 의존
으로 는 비의존 으로 활성화시킨다. 미토콘
드리아 비의존 경로에서 caspase-8은 직 으
로 caspase-3을 활성화시키지만, 미토콘드리아 의
존 경로는 caspase-9의 활성을 통하여 cas-
pase-3를 활성화시킨다. Caspase-8에 의한 직
인 caspase-3의 활성은 caspase-8의 양이 많이
존재할 때 수반되지만 caspase-8의 양이 게 존
재할 경우 caspase-8은 apoptosis 메커니즘을 완
벽하게 이행하기 해 미토콘드리아를 요구하게
된다. caspase-8의 은 양의 효과는 caspase활성
의존 인 cytochrome C를 통하여 증폭된다41). 가
미항백탕은 미토콘드리아로부터 cytochrome C의
방출을 유도하 다(Fig. 4). 이 결과들은 가미항백
탕에 의해 유도된 HL-60세포의 apoptosis는 cas-
pase-8의 활성을 경유한 미토콘드리아 의존 경
로에 의해 수반된다는 것을 보여주고 있다.
가미항백탕은 한 원apoptosis인자인 Bid의
단을 유도하 다(Fig. 4). Bid는 살아있는 세포
의 세포질에서 비활성형태인 구체로 존재하고
caspase-8에 의해 단되어서 활성화된다. 단된
Bid는 미토콘드리아의 외막에 된다. 활성화
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HL-60 세포의 Apoptosis에 한 가미항백탕의 효과
37
된 Bid는 미토콘드리아로부터 cytochrome C를
완벽하게 방출시킨다. Bax는 Bcl-2 family의
다른 원apoptosis인자로 apoptosis상태에서 미토
콘드리아의 외막에 하여 cytochrome C의 방
출에 여한다. 가미항백탕은 Bax의 단백질수
에 아무런 향을 미치지 못했다(Fig. 4). Cyto-
chorme C의 방출에서 Bax는 Bid보다는 cyto-
chrome C를 강하게 방출시키지 못한다. Bax는
체 마이토콘드리아의 cytochrome C의 20% 정
도만을 방출시킨다42). Bid는 한 미토콘드리아
의 외막에 Bax의 oligomerizaiton과 를 발
하는 역할을 하고 있다43)
.
Caspase에 더하여 MAPKs 한 apoptosis를
재하는 것으로 알려져 있다. MAPK serine/
threonine kinase superfamily는 다양한 세포 외
자극에 의하여 활성화되고 세포성장, 분화, apop-
tosis에서 요한 조 역할을 수행하는 신호 달
cascade를 수반한다44)
. MAPKs는 다양한 세포 외
자극에 한 반응에 의해 활성화되고 명확한
downstream 표 을 가짐으로써 세포의 반응에
서 다양한 역할을 수행한다. ERK는 세포 성장과
생존을 이끄는 mitogen 자극에 의해 일차 으로
활성화된다45)
. 다른 한편으로 JNK와 p38은 apop-
tosis를 유도하는 UV조사, DNA손상, 과산화수
소, 열쇼크, 삼투압쇼크에 의해 활성화 된다45). 스
트 스 조건에서 apoptosis를 조 하는 MAPKs
신호기 의 요성은 범 하게 연구되고 있다.
통 으로, ERK는 종종 성장인자에 한 반응
이나 세포증식과 분화를 조 에 하여 활성화되
기 때문에 MAPKs family에서 생존요인으로 보
여지고 있다45). 성장인자 결핍, 기질분리, 세포독
성물질에 의해 유도된 apoptosis는 ERK 활성에
의해 억제될 것이다46)
. 그러나 몇몇 연구에서는
ERK가 화학물질에 의한 apoptosis를 이끄는 원
인으로 작용할 것이라고 보고되었다47,48)
. 본 연구
에서도 가미항백탕을 처리한 HL-60세포에서 ERK,
p38, JNK의 활성이 증가하 다(Fig. 5). 그러나
가미항백탕에 의해 유도된 HL-60세포의 apopto-
sis에 한 MAPKs inhibitor (PD98059; ERK in-
hibitor, SB203580; p38 inhibitor, SP600125; JNK
inhibitor)를 처리하 을 경우 HL-60세포의 apop-
tosis는 c-Raf에 의한 ERK활성을 억제하는 ERK
inhibitor (PD98059)에 의해 caspase-3의 활성과
PARP분 이 감소되었다(Fig. 6). 이 결과들은 ERK
경로만이 가미항백탕에 의해 유도된 HL- 60세포
의 apoptosis에 수반되는 것을 보여주고 있다.
결론 으로 가미항백탕에 의한 HL-60세포의
세포독성은 caspase-8에 의한 Bid 단과 미토콘
드리아로부터 cytochrome C 방출에 의한 cas-
pase-9을 경유한 capase-3의 활성 ERK경로를
통하여 apoptosis가 유도되었다.
Ⅴ. 결 론
가미항백탕이 HL-60세포의 apoptosis 유도효
과 기 에 미치는 향을 분자생물학 방법
으로 실험하 으며, 다음과 같은 결론을 얻었다.
1. 가미항백탕은 HL-60 세포의 생존율을 농도
의존 으로 감소시켰다.
2. HL-60세포의 가미항백탕에 의해 유도된
apoptosis에서 caspase-3, -8, -9 활성이 증
가함을 확인할 수 있었다.
3. HL-60세포에서 가미항백탕은 Bcl-2와 Bax의
발 에는 아무런 향을 주지 못하 고, 가
미항백탕에 의해 유도된 caspase-8에 의한
Bid분 을 확인할 수 있었고, 분 된 Bid에
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의하여 미토콘드리아로부터 cytochrome c
의 방출을 확인할 수 있었다.
4. 가미항백탕에 의해 유도된 HL-60세포의
apoptosis에서 ERK, p38, JNK활성이 증가
하 지만, ERK활성만이 apoptosis에 련
되어 있음을 확인할 수 있었다.
이상의 결과는 가미항백탕에 의해 유도된 HL-
60세포의 apoptosis는 caspase-8의 활성에 의한
미토콘드리아 경로를 경유하여 caspase-3를 활성
과 ERK활성에 의해 유도됨을 확인할 수 있었다.
앞으로 가미항백탕은 임상에서의 항백 병 효능
을 입증하기 하여 동물실험모델을 통하여 in
vivo실험 연구가 필요할 것으로 생각된다.
감사의 글
본 연구는 2005년도 원 학교 교비 연구비
지원에 의해 수행되었습니다.
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