凋亡相关基因－凋亡相关基因－ BaxBax在不同细胞中表达产物差异检测在不同细胞中表达产物差异检测

实验（实验（ 11 ））

原 理原 理 免疫细胞化学（免疫组化）是将抗原、抗体免疫细胞化学（免疫组化）是将抗原、抗体

间的免疫反应引入细胞标本，并通过对其所带有间的免疫反应引入细胞标本，并通过对其所带有的特殊标记物的显示，籍以对细胞内某抗原或抗的特殊标记物的显示，籍以对细胞内某抗原或抗体作定性、定位以及定量检测。 体作定性、定位以及定量检测。

亲和组织化学：亲和组织化学：则将一些具有双价或多价结则将一些具有双价或多价结合力的物质合力的物质 (( 生物素生物素 )) ，应用于免疫组化，使得抗，应用于免疫组化，使得抗原抗体的亲和力比免疫组化高出原抗体的亲和力比免疫组化高出 100100 万倍。其更万倍。其更具高灵敏性和高特异性。具高灵敏性和高特异性。

原 理原 理Bax——Bax—— 凋亡相关基因凋亡相关基因 Bcl-2Bcl-2 家族成员家族成员 细胞损伤时其蛋白构象发生改变（寡聚细胞损伤时其蛋白构象发生改变（寡聚

化）化） 作用线粒体膜，使其膜通透性增加，释放作用线粒体膜，使其膜通透性增加，释放 CC

ytcytc ，细胞凋亡，细胞凋亡

原 理原 理 本次实验以本次实验以 BaxBax 构象蛋白为抗原，用构象蛋白为抗原，用

小鼠特异性抗体（一抗）与其结合，再用小鼠特异性抗体（一抗）与其结合，再用生物素标记的羊抗小鼠抗体（二抗）与前生物素标记的羊抗小鼠抗体（二抗）与前者结合，形成了生物素复合物。者结合，形成了生物素复合物。

此复合物与此复合物与 SABCSABC 作用，使得检测物作用，使得检测物被放大，最后在显色剂被放大，最后在显色剂 DABDAB 的作用下，的作用下， BBaxax 构象蛋白显色（褐色）。构象蛋白显色（褐色）。

器材与试剂器材与试剂 仪器：移液枪、枪头、滴管、显微镜仪器：移液枪、枪头、滴管、显微镜 材料：培养细胞材料：培养细胞 试剂：甲醇、试剂：甲醇、 PBSPBS 、封闭液、一 抗、 二抗、、封闭液、一 抗、 二抗、 SABCSABC 、、 DAB DAB 、、 0.30.3 ％％ HH22OO22-PBS-PBS 、、

试 剂 说 明试 剂 说 明 PBSPBS ： 磷酸盐缓冲液（ ： 磷酸盐缓冲液（ 0.01M pH7.4 0.01M pH7.4 ）） 封闭液： 山羊血清封闭液： 山羊血清 (( 或或 BSA)BSA) ，用时，用时 PBSPBS 稀释稀释 一 抗： 小鼠一 抗： 小鼠 IgGIgG ，用时，用时 PBSPBS 稀释稀释 二抗： 生物素标记的羊抗小鼠二抗： 生物素标记的羊抗小鼠 IgGIgG 0.30.3 ％ ％ HH22OO22-PBS-PBS （甲醇）（甲醇） 消除内源性过氧化物酶活性作用消除内源性过氧化物酶活性作用 SABC (avidin-biotin-peroxidase complex SABC (avidin-biotin-peroxidase complex 链酶亲链酶亲

和素和素 —— —— 生物素——过氧化物酶复合物生物素——过氧化物酶复合物 ) ) ：： 抗生物素，起到放大作用抗生物素，起到放大作用 DAB(diaminobenzidine)DAB(diaminobenzidine) 显色液：显色液： 3,33,3´-´- 二氨基联苯胺二氨基联苯胺

实验步骤实验步骤 培养细胞（培养细胞（ 9696 孔板，每组孔板，每组 33 正常、正常、 33 损伤、损伤、 33 损伤恢损伤恢

复）复） PBS PBS 洗洗 33 次 次 (( 轻轻地摇动洗涤轻轻地摇动洗涤 )) 甲醇固定甲醇固定 10min10min PBS PBS 洗洗 33 次 次 (( 轻轻地洗涤轻轻地洗涤 )) 加入封闭液（加入封闭液（ 1:101:10 ）） 25µl25µl ，， 37 37 ℃℃ ，， 30min30min 以上以上 加一抗（加一抗（ 1:3001:300 ）） 2525µµll ，， 37℃37℃ ，， 1h1h 以上 以上 (( 或或 4℃4℃ 过夜过夜 )) PBS PBS 洗洗 33 次 次 (( 轻轻地摇动洗涤轻轻地摇动洗涤 )) 加二抗（加二抗（ 1ml PBS1ml PBS 加入生物素化山羊抗小鼠加入生物素化山羊抗小鼠 IgG 10µlIgG 10µl ））

25µl25µl ，， 37 37 ℃℃ ，， 1h1h 以上以上 PBS PBS 洗洗 33 次 次 (( 轻轻地摇动洗涤轻轻地摇动洗涤 ))

实验步骤实验步骤 加加 0.30.3 ％ ％ HH22OO22-PBS/-PBS/ 甲醇，甲醇， 37 37 ℃℃ ，， 30min30min PBS PBS 洗洗 33 次 次 (( 轻轻地摇动洗涤轻轻地摇动洗涤 )) SABCSABC 工作液（工作液（ 1ml PBS1ml PBS 加入加入 SABC 10SABC 10µlµl ，混，混

匀）匀） 20-3020-30µµll ，， 37 ℃37 ℃ ，， 3030 分钟分钟 PBS PBS 洗洗 33 次 次 (( 轻轻地摇动洗涤轻轻地摇动洗涤 )) DABDAB 显色：显色： DABDAB 显色工作液配制（现配）：显色工作液配制（现配）： 1ml1ml 蒸馏水，加蒸馏水，加

试剂盒中试剂盒中 AA 、、 BB 、、 CC 试剂各试剂各 50ul50ul ，混匀后加至，混匀后加至细胞孔板，镜下控制，以蒸馏水终止反应。细胞孔板，镜下控制，以蒸馏水终止反应。

观察结果观察结果

实验结果实验结果

缺糖前 Hela 细胞

缺糖 24h Hela 细胞

缺糖 48h Hela 细胞

缺糖前 PC 12 细胞

缺糖 24 h PC 12 细胞

缺糖 48 h PC 12 细胞

注意事项注意事项 一、二抗的稀释度、孵育时间和温度与染色强度、一、二抗的稀释度、孵育时间和温度与染色强度、

背景有直接关系。背景有直接关系。 染色背景过高，在染色背景过高，在 DABDAB 显色之前，用含显色之前，用含 0.01-0.0.01-0.

0202 ％％ TWEEN20TWEEN20 的的 PBSPBS 洗涤标本洗涤标本 44 次，再次，再 PBPBSS 洗洗 22 次，然后次，然后 DABDAB 显色。 显色。 DABDAB 有毒性（小有毒性（小心）心）

SABCSABC 试剂盒保存在试剂盒保存在 44 ℃ ℃ 为佳为佳 (2(2 年年 )) ，而，而 -20-20 ℃ ℃短期内生物活性则被破坏 。短期内生物活性则被破坏 。

购试剂盒时注意厂家批号，其差异很大，会影响购试剂盒时注意厂家批号，其差异很大，会影响稳定性。稳定性。

告 知告 知

实验（四）实验（四）

细胞内微核的检测细胞内微核的检测 家系分析家系分析