1

细胞凋亡细胞凋亡Cell apoptosisCell apoptosis

倪培华

2

对于一个多细胞生物来说，要维持对于一个多细胞生物来说，要维持完整性和完整性和保持平衡性保持平衡性，凋亡是一个非常重要的生物学过，凋亡是一个非常重要的生物学过程。程。 For For multicellular organismmulticellular organism, to maintain the , to maintain the integrity aintegrity and balancend balance, apoptosis is a very important biological , apoptosis is a very important biological processes.processes.

第一节 细胞凋亡的生物学意义 Apoptosis of biological signification

一、细胞凋亡的概念与生物学意义 （一）概述 (Summary)

3

多细胞生物的诞生、生长、发育、存活多细胞生物的诞生、生长、发育、存活以及死亡，无一不伴随着细胞凋亡过程。以及死亡，无一不伴随着细胞凋亡过程。Essential part of life for every multicellular organi

sm from worms to humans. (Faddy et al.,1992)Apoptosis plays a major role from embryonic dev

elopment to senescence.

1976

1993

1842

1972

1983-19861985-1988

1980

1973

1989

19911991

1996

1993

1996

1997

Carl Vogt---cell death

John Kerr first used “apoptosis”

John Sulston-apoptosis

ced Bcl-2

apoptosis and DNA degradation

Ladder DNA

Fas was discovered

P53 Cloning of Fas

Bax

Caspase named

ICE ／ CED-3 . Yuan JY,Cell 1993

cytochrome c

Apaf-1

History of cell death researchHistory of cell death research

5

细胞坏死（ necrosis ）

细胞凋亡（ apoptosis ）

细胞自噬（ autophagy)

( 二 ) 细胞死亡的方式

程序性死亡Programmed cell death,PCD

6

Cell death by injury-Mechanical damage -Exposure to toxic

chemicals

Cell death by suicide -Internal signals -External signals

7

( 三 ) 、细胞坏死 （ necrosis ）

化学因素strong acidstrong basetoxic substanc

e 物理因素 heat radiation生物因素 Pathogen缺氧 hypoxia

影响因素

– Necrosis derived from Greek “nekrosis,”meaning “deadness.”

– Necrosis is lethal cell injury or accidental cell death in the living organism.

坏死细胞的形态改变Necrosis of the cells to change morphology

早期核无明显形态学变化

胞质内线粒体和细胞器肿胀，染色质凝聚，崩解

10

随着胞质内蛋白变性、凝固或碎裂，以及嗜碱性核蛋白的降解，细胞质呈现强嗜酸性，导致细胞结构完全消失，细胞膜和细胞器破裂， DNA 降解，细胞内容物流出，引起周围组织炎症反应 炎症反应

11

12

13

14

15Necrosis

16

结扎大鼠肝的左、中叶门静脉后

1972 年 Kerr 实验

在正常鼠肝中也偶然见到这一现象

周围细胞发生缺血性坏死有肝动脉供应区的实质细胞仍存活，只是范围逐渐缩小，其间一些细胞不断转变成细胞质小块，不伴有炎症

17

（四）凋亡

Apoptosis 凋亡

Cells in the fall as the leaves

of the same death

Apoptosis derived from Greek “apo,”meaning “away from,” and “ptosis,”meaning “to fall.”

18

蝌蚪尾巴的脱落

Apoptosis is needed for proper development

Why should a cell commit suicide?

19

脊椎动物的神经系统的发育

哺乳动物指（趾）的形成

20

Apoptosis is needed to destroy cells

Examples: Cells infected with viruses Cells of the immune system Cells with DNA damage Cancer cells

Why should a cell commit suicide?

凋亡是生物体普遍存在的现象

并非每个细胞都能走到终点，相当一部分细胞，甚至绝大部分细胞都会在中途凋亡

胚胎形成衰老和损伤细胞的清除自身反应性 T 淋巴细胞的清除肿瘤的发生、发展和转归干细胞

胸腺的 T 细胞 95% 存活不到成熟 T 细胞阶段 原始和幼稚红细胞在骨髓中发生“原位溶血”

22

细胞凋亡是指为维持内环境稳定，由基因控制的细胞自主的有序的死亡。也称为细胞程序性死亡（ programmed cell death ， PCD ）

Apoptosis is a means to maintain the stability of the environment from gene to control the cell's own death in an orderly manner.

凋亡概念 Concept of apoptosis

② 凋 亡 小 体 apoptotic body有结构完整的细胞器，还有凝缩的染色体，可被邻近细胞吞噬消化，因始终有膜封闭，没有内容物释放 ,不引起炎症

凋亡细胞的主要特征

①染色质 chromatin聚集、分块、位于核膜上，胞质凝缩，最后核断裂，细胞通过出芽的方式形成许多凋亡小体

24

A 、 Normal cell

B 、 Apoptosis: Apoptotic bodies

膜出芽

线粒体裂解

细胞器

减少

细胞皱缩

核片段化 染色质凝聚

APOPTOSIS: Morphology

膜出芽或改变

线粒体裂解细胞器 减少

细胞皱缩

核片段化染色质凝聚

APOPTOSIS: Morphological events

出芽

出芽 & 凋亡小体

Apoptotic body

M M

28

29

30

31

32

33

34

35

36

37

38

39

40

早期的细胞核呈 波纹状或呈折缝样部分染色质出现浓缩状态；

细胞核的染色质高度凝聚、边缘化

细胞核裂解为碎块，产生凋亡小体

③凋亡细胞中仍需要合成一些蛋白质，但是在坏死细胞中 ATP 和蛋白质合成受阻或终止

⑤凋亡通常是生理性变化 细胞坏死是病理性变化

④核酸内切酶活化，导致染色质 DNA 在核小体连接部位断裂，形成约 200bp整数倍的核酸片段，凝胶电泳图谱呈梯状

细胞凋亡的生化特征－ DNA 阶梯

43

44

45

Summary :Apoptosis and necrosis

Apoptosis Necrosis

区别点 细胞坏死 细胞凋亡起因 病理性变化或剧烈损伤 生理或病理性范围 大片组织或成群细胞 单个散在细胞细胞膜 破损 保持完整，一直到形成

凋亡小体染色质 呈絮状 凝聚在核膜下呈半月状细胞器 肿胀、内质网崩解 无明显变化细胞体积 肿胀变大 固缩变小凋亡小体 无 有DNA 呈涂抹状 呈梯状蛋白合成 无 有调节过程 被动进行 受基因调控炎症反应 有 无

Distinguish of necrosis and apoptosis

47

Necrosis vs. Apoptosis

Cellular condensation Membranes remain

intact Requires ATP Cell is phagocytosed, no tis

sue reaction Ladder-like DNA fragmenta

tion In vivo, individual cells app

ear affected

Cellular swelling Membranes are broken ATP is depleted Cell lyses, eliciting an

inflammatory reaction DNA fragmentation is

random, or smeared In vivo, whole areas of

the tissue are affected

Necrosis Apoptosis

48

Sydney Brenner, H. Robert Horvitz, John E Sulston

2002 年 10月 7日

英国人悉尼·布雷诺尔 ,美国人罗伯特·霍维茨 ,英国人约翰·苏尔斯顿

在器官发育的遗传调控和细胞程序性死亡方面的研究 ，获诺贝尔生理与医学奖

Apoptosis: Pathways

Death Ligands

Effector CEffector Caspaseaspase 33

Death Receptors

Initiator Caspase 8

PCD

DNA damage & p53

Mitochondria/Cytochrome C

Initiator Caspase 9

“Extrinsic Pathway”

“Intrinsic Pathway”

一、细胞凋亡的相关基因（一） Fas受体是凋亡的主要引发剂

1 、 Fas受体基因(Fas receptor gene)

表达：跨膜蛋白

又称作 APO-1/CD95属 TNF 受体家族

第二节 细胞凋亡的相关基因

51

2 、 Fas配体基因

Fas ligand gene

52

3、作用 (effect)

Fas受体与 Fas配体的相互作用启动了细胞凋亡的通路

当载有 Fas配体的细胞相互作用时，载有 Fas受体的细胞将会发生凋亡

活化的 Fas 三聚体聚集

激活凋亡

Fas 的聚集过程Fas 能形成同源三聚体homology trimers三聚体在与配体作用前装配 配体的作用可能是引起三聚体装配成更大的聚合体FasL 作用 Fas时，一个聚集过程能使 Fas激活通路的下游

Fas forms trimers that are activated when binding to FasL causes aggregation.

54

Fas介导的细胞凋亡途径

Fas 的特点 胞外区：三个富含半胱氨酸胞内区：死亡结构域（ Death domain ， DD ）

•FasL与 Fas 结合•Fas 三聚化使胞内的 DD 区构象改变，然后与接头蛋白 FADD 的 DD 区结合

FADDFADD （（ Fas-associated death domainFas-associated death domain ））

FADD 的 N 端 DED 区（ death effector domain ）能与 Caspase-8 （或 -10 ）前体蛋白结合形 成 DISC (death-inducing signaling complex ) 引 起 caspase-8 、 10 通过自身剪激活启动 caspase 的级联反应，使 caspase-3 、 -6 、 -7 激活，这几种 Caspase可降解胞内结构蛋白和功能蛋白，最终导致细胞凋亡

死亡受体通路（死亡受体通路（ Extrinsic or cytoplasmic pathwayExtrinsic or cytoplasmic pathway ））■■ 死亡受体 死亡受体 TNFRTNFR 、、 FasRFasR 、、 DRDR33 、、 DRDR44 、、 DRDR55 等等

是一类通过与相应配体结合，传递细胞凋亡信号的跨胞膜蛋白 是一类通过与相应配体结合，传递细胞凋亡信号的跨胞膜蛋白

■■ 通路（通路（ pathwaypathway ））FSAL

FADDFADD

Pro-caspase-8Pro-caspase-8

Caspase-8Caspase-8

Caspase-3Caspase-3Pro-caspase-3Pro-caspase-3

细胞凋

细胞凋

亡亡

生长因子、信号、生长因子、信号、 FasFas 抗抗体体

FasR

FADDFADD （（ Fas-associated death domainFas-associated death domain ）； ）； DDDD （（ death domaideath domainn ）；）；

DED DED （（ death effector domaindeath effector domain ）。）。

DEDDED DEDDED

DDDD

57

Ligand-induced cell death

“The death receptors”

Ligand-induced trimerization

Death Domains

Death Effectors

Induced of Caspase 8

Activation of Caspase 8

FasL

Trail

TNF

58

（二）、 Caspase家族 半胱氨酸蛋白酶，是引起细胞凋亡的关键酶，一旦被激活，能将细胞内的蛋白质降解，使细胞不可逆的走向死亡。

Active site: Cysteine

Cleavage site: Asparatic acid Cysteine Asparatic acid specific protease

Aps-Xxx

天冬氨酸特异性的半胱氨酸蛋白水解酶

59

两大、两小亚基组成的异四聚体大、小亚基由同一基因编码前体被切割后产生两个活性亚基

大小亚基结合（二聚体）

caspase 激激活（四聚体）

■■ CaspaseCaspase 激活形式激活形式

Pro-caspase ： 20KD 亚基、 10KD 亚基 剪切

Caspase（ cysteine aspartate-specific proteas

e ）

60

ICE白介素 -1 β转换酶基因 能将白介素前体切割为活性分子2 个亚族ICE亚族 参与炎症反应CED-3 家族 参与细胞凋亡

（ Interleukin-1 β-converting enzyme ）

执行者 caspase-3、 6、 7 ，可直接降解胞内的结构蛋白和功能蛋白，引起凋亡，但不能通过自催化或自剪接的方式激活

启动者caspase-8、 9 ，受到信号后，能通过自剪接而激活，引起 caspase级联反应，如 caspase-8 可依次激活 caspase-3、 6、 7

CED-3 家族 参与细胞凋亡

62

A：蓝色参与炎症反应 红色为执行者 绿色为启动者

63

The caspase cascade involved in apoptosis

A. Procaspase activation by proteolytic cleavage.

B. Caspase cascade

64

（三）、 Apaf-1 Apaf-1称为凋亡酶激活因子 -1 （ apoptotic protease activating factor-1 ）

在线虫中的同源物为 ced-4

在线粒体参与的凋亡途径中具有重要作用

Apaf-1 结构特点CARD （ caspase recruitment domain ）结构域，能召集 caspase-9 ced-4 同源结构域，能结合 ATP/dATP C端结构域，含有色氨酸 / 天冬氨酸重复序列，当细胞色素 c 的结合到这一区域后，能引起 Apaf-1多聚化而激活。

Apaf-1具有激活 Caspase-3的作用，而这一过程又需要细胞色素 c （ Apaf-2 ）和 caspase-9 （ Apaf-3）参与 Apaf-1/细胞色素 c复合体与 ATP/dATP 结合后Apaf-1就可以通过其 CARD 结构域召集 caspase-9 ，形成凋亡体 激活 caspase-3，启动 caspase级联反应

67

膜通透性↑、线粒体肿胀、△膜通透性↑、线粒体肿胀、△ m↓m↓

Apaf-1Apaf-1 活化活化Cyt.cCyt.c

线粒体途径（线粒体途径（ Intrinsic or mitochondrial pathwIntrinsic or mitochondrial pathwayay ））

CaCa2+2+

NONO

缺氧缺氧活性氧活性氧

应激应激

MPTMPT 开放开放 Cyt.cCyt.c

+

Pro-caspase-9Pro-caspase-9Caspase-9Caspase-9

ATPATP

Apaf-1Apaf-1++

Apaf-1Apaf-1 活化活化Cyt.cCyt.c

CARDCARD

ApoptosomeApoptosome

Pro-Caspase-3Pro-Caspase-3 凋凋亡亡Caspase-3Caspase-3

MPT: 线粒体通透性转运孔道

Pro-caspase-2Pro-caspase-2caspase-2caspase-2

Pro-caspase-6Pro-caspase-6 Caspase-6Caspase-6

Pro-caspase-7Pro-caspase-7 caspase-7caspase-7

Pro-caspase-9Pro-caspase-9

ICADICAD （抑制性 （抑制性 CADCAD ））CADCAD （ （ caspasecaspase 活化活化 DNADNA 酶）酶）

CDACDA 进入细胞核内降解进入细胞核内降解 DNADNA 细胞凋亡细胞凋亡

剪切细胞内结构蛋白剪切细胞内结构蛋白

caspase-9caspase-9

Activation of caspase-3Activation of caspase-3 （共同通路）（共同通路） (Effector caspase)(Effector caspase)

Caspase-3Caspase-3

Pro-caspase-3Pro-caspase-3

Apoptosis: Pathways

Death Ligands

Effector Caspase 3

Death Receptors

Initiator Caspase 8

PCD

DNA damage & p53

Mitochondria/Cytochrome C

Initiator Caspase 9

“Extrinsic Pathway”

“Intrinsic Pathway”

70

细胞凋亡的调控机制

功能 基因功能 基因

抑制凋亡基因抑制凋亡基因 Bcl-2Bcl-2 Bcl-X Bcl-XLL 、、 A1/Bfl-1A1/Bfl-1 、、 Bcl-wBcl-w 、、 Bcl-GBcl-G 和和 Mcl-1Mcl-1

等等

促凋亡基因促凋亡基因 P53P53 、、 BaxBax 、、 BadBad 、、 BakBak 、、 BidBid 、、 BimBim 、、 BikBik 、、 BB

okok 、 、

Bcl-BBcl-B 、、 Bcl-XsBcl-Xs 、、 KrkKrk 、、 MtdMtd 、、 Nip3Nip3 、、 NixNix 、、 NoxNox

aa 等等

双向调控基因双向调控基因 c-mycc-myc 、、 BelxBelx

【调控基因】【调控基因】

Regulated mechanism of Regulated mechanism of apoptosisapoptosis ））

71

（四）、 Bcl-2家族

Bcl-2为凋亡抑制基因，是膜的整合蛋白

功能相当于线虫中的 ced-9

在线粒体参与的凋亡途径中起调控作用，能控制线粒体中细胞色素 c等凋亡因子的释放。

72

1-4个 Bcl-2同源结构域（ BH1-4）有一个羧端跨膜结构域BH4是抗凋亡蛋白所特有的结构域BH3是与促进凋亡有关的结构域

Bcl-2 的结构特点

跨膜结构

抗凋亡

（ anti-apoptotic ），如：Bcl-2 、 Bcl-xl 、 Bcl-w、Mcl-1

分类

根据功能和结构可将Bcl-2基因家族分为两类

促进凋亡（ pro-apoptotic ），如：Bax 、 Bak、 Bad 、 Bid 、 Bim ，在促凋亡蛋白中还有一类仅含BH3结构，如Bid 、 Bad

74

75

Bcl-2

■■ Bcl-2Bcl-2 （（ Bcl-XBcl-XLL ）能够抑制线粒体）能够抑制线粒体 MPTMPT开放，开放， Cyt.c Cyt.c 、、 AIFAIF释放↓释放↓

■■ Bcl-2Bcl-2 也能特异地结合细胞色素也能特异地结合细胞色素 CC

■■ Bcl-2Bcl-2 能够结合和灭活能够结合和灭活 Apaf-1Apaf-1 ，阻断对，阻断对 caspase-9caspase-9 活活化化

CaspaseCaspase 抑制剂抑制剂

11．． Bcl-2Bcl-2 基因家族（基因家族（ Bcl-2 Family & regulating functionsBcl-2 Family & regulating functions ））

CARDCARD

MPTMPT 开放开放

膜通透性↑、线粒体肿胀、△膜通透性↑、线粒体肿胀、△ m↓m↓

Cyt.cCyt.c

ATPATP

Apaf-1Apaf-1++

Apaf-1Apaf-1 活化活化

Cyt.cCyt.c

Apaf-1Apaf-1 活化活化

Cyt.cCyt.c

+

Pro-caspase-9Pro-caspase-9

ApoptosomeApoptosome AIFAIF

Caspase-9Caspase-9

Pro-Caspase-3Pro-Caspase-3 Caspase-3Caspase-3 凋凋亡亡

caspase-independent apoptosis

77

（五） p53

抑癌基因在 G期监视 DNA 的完整性

78

如有 损 伤 ，则抑制细 胞增殖，直到 DNA修复完成。如果 DNA 不能被修复，则诱导 其调亡，

79

【促凋亡机制】【促凋亡机制】

■■ P53P53通过与通过与 Bcl-2Bcl-2基因相互作用，下调基因相互作用，下调 Bcl-2Bcl-2 的表达。的表达。

■■ P53P53诱导细胞凋亡的靶蛋白表达（线粒体和死亡受体介导）。诱导细胞凋亡的靶蛋白表达（线粒体和死亡受体介导）。

■■ P53P53 诱导线粒体内凋亡的相关蛋白（诱导线粒体内凋亡的相关蛋白（ BaxBax 、、 NOXANOXA 、 、 PUMPUM

AA ）表达，并触发细胞色素）表达，并触发细胞色素 CC释放和释放和 caspasecaspase 活化。活化。

■■ P53P53诱导死亡受体诱导死亡受体 FasFas表达。表达。

■■ P53P53 能使死亡受体再定位于细胞膜上。能使死亡受体再定位于细胞膜上。

pp5353 基因（抑癌基因）基因（抑癌基因） As a transcription factor, p53 regulates downstream genes impAs a transcription factor, p53 regulates downstream genes important in cell cycle arrest, DNA repair, and apoptosis. After DNA dortant in cell cycle arrest, DNA repair, and apoptosis. After DNA damage, p53 holds the cell at a checkpoint until the damage is repamage, p53 holds the cell at a checkpoint until the damage is repaired. If the damage is irreversible, apoptosis is triggered.aired. If the damage is irreversible, apoptosis is triggered.

80

81

第三节 细胞凋亡异常与疾病Diseases associated to apoptosis deregulationDiseases associated to apoptosis deregulation

凋亡不足凋亡不足 凋亡过度凋亡过度肿瘤 肝癌、恶性血液肿瘤、乳腺癌 发育异常 气管肿瘤 肝癌、恶性血液肿瘤、乳腺癌 发育异常 气管 --食管瘘、房（室）间隙缺食管瘘、房（室）间隙缺

、膀胱癌、肺癌、胶质瘤、前 损、唇（腭）裂、短肢畸形、、膀胱癌、肺癌、胶质瘤、前 损、唇（腭）裂、短肢畸形、

列腺癌等 尿道下裂以及多囊肾等列腺癌等 尿道下裂以及多囊肾等

发育异常 先天性消化道、胆道、肛门狭 发育异常 先天性消化道、胆道、肛门狭 CNS AlsheimerCNS Alsheimer 病、病、 Parkinson Parkinson 病、病、

窄或闭锁、动脉导管未闭、两 肌萎缩性侧索硬化症、色素性窄或闭锁、动脉导管未闭、两 肌萎缩性侧索硬化症、色素性

性畸形、甲状舌骨囊肿等 视网膜病，脊肌肉萎缩、早老性畸形、甲状舌骨囊肿等 视网膜病，脊肌肉萎缩、早老

免疫系统 系统性红斑狼疮、糖尿病、类 性痴呆免疫系统 系统性红斑狼疮、糖尿病、类 性痴呆

风湿性关节炎、桥本甲状腺炎 免疫系统 免疫缺陷病、风湿性关节炎、桥本甲状腺炎 免疫系统 免疫缺陷病、 AIDS AIDS

、多发性的硬化症等 、多发性的硬化症等

82

■■ pp5353 基因缺失或突变基因缺失或突变

调节调节 P53P53 的稳定性、细胞内定位或（和）活性发生异常的稳定性、细胞内定位或（和）活性发生异常

pp5353 表达或功能存在缺陷 细胞凋亡速率↓ 肿瘤发生 表达或功能存在缺陷 细胞凋亡速率↓ 肿瘤发生

（（ 50%50% 以上恶性肿瘤中存在以上恶性肿瘤中存在 P53P53异常）异常）

（一）细胞凋亡不足（（一）细胞凋亡不足（ Apoptosis inhibitionApoptosis inhibition ）） 1. 1. 肿瘤（肿瘤（ TumorTumor ））

22．自身免疫病（．自身免疫病（ Autoimmune diseasesAutoimmune diseases ））

针对自身抗原的免疫细胞未被及时清除，机体产生了针对自针对自身抗原的免疫细胞未被及时清除，机体产生了针对自

身抗原的体液免疫和细胞免疫，导致器官组织损伤。身抗原的体液免疫和细胞免疫，导致器官组织损伤。

83

（二）（二）细胞凋亡过度（细胞凋亡过度（ Apoptosis excessApoptosis excess ））1.1.心肌缺血与缺血心肌缺血与缺血 --再灌注损伤再灌注损伤■■特点特点

▲缺血早期以凋亡为主，晚期以细胞的坏死为主。缺血早期以凋亡为主，晚期以细胞的坏死为主。

▲在梗死灶的中心以坏死为主，梗死灶周边以凋亡为主；在梗死灶的中心以坏死为主，梗死灶周边以凋亡为主；

▲轻度缺血以凋亡为主，重度缺血以坏死为主；轻度缺血以凋亡为主，重度缺血以坏死为主；

■■机制机制

▲氧化应激、氧化应激、▲ FasRFasR 通路、通路、▲ p53p53 基因的转录增加。基因的转录增加。

84

一、细胞凋亡的形态学检测 Measurement of morphology

1 、光学显微镜和倒置显微镜（ 1 ） 未染色细胞

凋亡细胞的体积变小、变形细胞膜完整但出现发泡现象细胞凋亡晚期可见凋亡小体贴壁细胞出现皱缩、变圆、脱落 　　

第四节 细胞凋亡的检测技术

85

光镜观察

凋亡细胞呈圆形，胞核深染，胞质浓缩，染色质成团块状，细胞表面有“出芽”现象。

苏木素染色 (Hematorylin ,HE） :

（ 2 ） 染色细胞：

甲基绿 -派诺宁染色法

Giemsa 染色法

瑞氏（Wright ）染色法

86

2 、荧光显微镜和共聚焦激光扫描显微镜

吖啶橙（ acridine orange, AO) 染色，荧光显微镜观察：活细胞核呈黄绿色荧光，胞质呈红色荧光凋亡细胞核染色质呈黄绿色浓聚在核膜内侧，可见细胞膜呈泡状膨出及凋亡小体

HO 33342 (Hoechst 33342) ， HO 33258 (Hoechst 33258), DAPI 染料与 DNA 的结合是非嵌入式主要结合在 DNA 的 A-T 碱基区紫外光激发时发射明亮的蓝色荧光

87

Ⅰ期的细胞核呈波纹状（ rippled ）或呈折缝样（ creased ），部分染色质出现浓缩状态

Ⅱa 期细胞核的染色质高度凝聚、边缘化

Ⅱb 期的细胞核裂解为碎块，产生凋亡小体

88

3、电子显微镜观察法electron microscope

凋亡细胞体积变小，细胞质浓缩。凋亡Ⅰ期的细胞核内染色质高度盘绕，出现许多称为气穴现象（ cavitations ）的空泡结构Ⅱa 期细胞核的染色质高度凝聚、边缘化；细胞凋亡的晚期，细胞核裂解为碎块，产生凋亡小体。

89

4、荧光染料染色 -流式细胞测定 Flow cytometry,FCM

碘化丙啶（ Propidium Iodide ,PI）： PI is membrane impermeant and generally excluded from viable cells. PI is commonly used for identifying dead cells. 只能使坏死细胞染色红色 双苯并咪唑（ hoechst33342 ）： 可穿越细胞膜对活细胞和凋亡细胞的 DNA 染色蓝色

检测形态学及细胞膜完整性的 Hoechs-PI 双染色法

90

坏死细胞 PI复染呈现红色荧光

凋亡细胞

正常细胞

坏死细胞

凋亡细胞蓝色荧光明显强于活细胞和非凋亡细胞光

91

细胞凋亡研究 1. 鉴别凋亡与坏死 : Annexin Ⅴ/PI

2. 测定凋亡率 : Annexin Ⅴ、 TUNEL

3. 研究凋亡触发机制： Caspase 、 Fas 及 FasL

92

检测细胞膜成分变化的 Annexin V 联合 PI法 细胞凋亡早期位于细胞膜内侧的磷脂酰丝氨酸（ PS)迁移至细胞膜外测磷脂结合蛋白 V（ Annexin V）与 PS 结合Annexin V作为探针检测暴露在细胞外测的 PSAnnexin V标记荧光素（如异硫氰酸荧光素 FITC ）使用 PI拒染法（因坏死细胞 PS亦暴露于细胞膜外测，且对 PI 高染）进行凋亡细胞双染法后用流式细胞仪检测

93

94

正常活细胞 Annexin V 、 PI 均低染凋亡细胞 Annexin V 高染、 PI 低染坏死细胞 Annexin V/PI 均高染

95

二、细胞凋亡的生物化学检测技术

（一）染色体 DNA片段

凋亡细胞：间隔梯状条带坏死细胞：模糊片状条带正常细胞：点样处大片段

96

三、细胞凋亡的分子生物学检测技术

（一）末端转移酶介导的标记技术

原位缺口末端标记技术（ in situ end labelling technique,ISEL) ，即 TUNEL法，它是利用 TdT将标记的 dUPT接到 3·-OH端

（二）切口平移标记技术

97

98抗组蛋白抗体

抗 DNA抗体

OPDOPD

OPD

四、细胞凋亡的免疫学检测技术

正常：染色体被组蛋白包绕形成核蛋白复合体凋亡：产生的 DNA片段仍被组蛋白包绕

99