实验二 实验二

DNADNA 重组技术重组技术

实验目的

通过本实验学会重组 DNA连接以及鉴定重组子的方法。

基因重组基因重组：：不同的不同的 DNADNA 分子间发生共分子间发生共价连接形成重组价连接形成重组 DNA DNA 分子。分子。

重组重组 DNADNA

质粒质粒 DNADNA 基因片段基因片段

实验原理

外源 DNA 片段和线状质粒载体的连接，也就是在双链 DNA5’ 磷酸和相邻的3’ 羟基之间形成的新的共价键，如质粒载体的两条链都带有 5’ 磷酸，可生成 4 个新的磷酸二酯键，但如果质粒 DNA 已经去磷酸化，则只能行成2 个新的磷酸二脂键，在这种情况下产生的杂交体分子带有 2 个单链切口，当杂交体分子导入感受态细胞后可被修复。

实验原理相邻的 5’ 磷酸和 3’ 羟基间磷酸二酯键的形成可在体外由两种不同的 DNA连接酶催化，这两种酶就是大肠杆菌 DNA 连接酶和 T4 噬菌体 DNA 连接酶。

　　重组DNA技术基本原理：切、接、转、筛　　

多种酶切口多种酶切口

多克隆位点多克隆位点

限制性内切酶限制性内切酶

单一酶切口单一酶切口

限制性内切限制性内切酶酶切酶酶切切

酶切酶切

磷酸二酯键的形成磷酸二酯键的形成

DNADNA 连接酶连接酶

DNADNA 连接酶连接酶

DNADNA 连接酶连接酶

目的基因与载体的连接目的基因与载体的连接接接

TT44-DNA-DNA 连接酶连接酶： ： TT44-- 噬菌体噬菌体

连接温度：连接温度：不高于粘性末端熔点温度（不高于粘性末端熔点温度（ TTmm ） ） ≤ ≤15℃15℃ ： ： 15℃/6h15℃/6h ； ； 12℃/8h12℃/8h ； ； 8℃/128℃/12hh ；；

连接方式：连接方式：

相同粘性末端的连接相同粘性末端的连接 平头末端的连接平头末端的连接 不同粘性末端的连接不同粘性末端的连接 人工粘性末端的连接人工粘性末端的连接

粘端连接粘端连接

CCGG CCGGCCGG CCGG

GGCC GGCCGGCC GGCC

CGG CCGG C

C GGCC GGC

CGG CCGG C

C GGCC GGC

CCGGCCGG GGCCGGCC

HapⅡHapⅡ T4-DNAT4-DNA连接酶连接酶

平端连接平端连接

AGCTAGCT TCGATCGA

AluⅠAluⅠ DNADNA 连接酶连接酶

AGCT AGCTAGCT AGCT

TCGA TCGATCGA TCGA

重组体的转化重组体的转化

受体细胞受体细胞

转

JM109JM109 感受态感受态

含氨苄平板含氨苄平板

AmAm

重组重组质粒质粒 感受态感受态

原核细胞的转化（细菌转化）原核细胞的转化（细菌转化）

1)1) 受体细胞的选择受体细胞的选择

限制缺陷型限制缺陷型 : : 避免修饰和降解避免修饰和降解

重组缺陷型：重组缺陷型：避免重组整合避免重组整合

转化亲和型：转化亲和型：较高的可转化性较高的可转化性

遗传互补型：遗传互补型：利于筛选利于筛选

感染缺陷型：感染缺陷型：防止感染防止感染

22 ）转化方法）转化方法CaClCaCl22 诱导转化诱导转化电穿孔电穿孔PEGPEG 介导转化介导转化人工体外包装人工体外包装 特殊处理特殊处理

受体细胞受体细胞

细胞膜特性细胞膜特性改变改变

CaClCaCl22 处理处理

受体细菌受体细菌

50-100mmol/L

CaCl2

感受态感受态细菌细菌

重组体转重组体转入细菌入细菌

含氨苄平板含氨苄平板

连接连接连接连接

目的基因目的基因

基因载体基因载体

连接酶连接酶

转化转化

重组体克隆的筛选与鉴定重组体克隆的筛选与鉴定筛

宿主细胞宿主细胞

转化后的克隆群体：转化后的克隆群体：

11 遗传检测法遗传检测法

11 ）抗药性标志的选择）抗药性标志的选择

pBR322

Amp Tet

插入片段插入片段

AmpAmp平板平板

TetTet平板平板

22 ）标志补救（）标志补救（ ß-ß- 半乳糖苷酶半乳糖苷酶法）法）

lacZlacZAm

N2H

片片段段

COOHCOOH

片段片段

X-galX-gal

Lac ZLac Z

蓝色化合物蓝色化合物

X-galX-gal

（（ LacZLacZ 基因 基因 NN 端序列）端序列） 插入片段插入片段

（（ LacZLacZ 基因失基因失活）活）

LacZLacZ 基基因 因 NN 端端

序列序列

LacZLacZ 酶酶

2 2 电泳检测法电泳检测法

凝胶电泳检测凝胶电泳检测

加加样样孔孔

DNA MarkerDNA Marker

空质粒空质粒重组质粒 重组质粒

重组质粒酶切重组质粒酶切

重组质粒的重组质粒的 PCPCRR 扩增片段扩增片段

原位杂交原位杂交

3 3 菌落杂交筛选法菌落杂交筛选法

实验仪器

超净工作台超净工作台

离心设备台式高速冷冻离心机

恒温空气摇床恒温空气摇床

恒温培养箱

培养皿

恒温水浴锅

材料及试剂

E.coli DH5α

pUC19 质粒

λDNA

EcoRI 酶

3mol/L Kac (pH5.2)

Xgal (20mg/ml)

IPTG (200mg/ml)

材料及试剂 1. T4DNA 连接酶

2． 10×T4DNA 连接酶缓冲液 :

400mmol/L Tris-Cl pH7.5

100mmol/L MgCl2

100mmol/L DTT,

500 μg/ml BSA

5-10mmol/L ATP

试剂3．  限制性内切酶（ PstI ）

4．  10× 限制性内切酶缓冲液

500mmol/L Tris-Cl

100mmol/L MgCl2

1000mmol/L NaCl

1mg/L BSA

5. 灭菌去离子水

实验步骤1．    混合以下溶液于一个无菌离心管中

xμl pUC19 质粒 (0.1-4μg)

2μl 10× 酶切缓冲液

1－ 5U 限制性内切酶（ EcoRI ）

yμl 去离子水

终体积为 20μl

2．    在推荐温度下育温 1小时（一般为 37℃）

加入 5μl 电泳缓冲液终止反应，电泳检测结果。

酶切

实验步骤1．混合以下试剂

λ DNA 7.7μl

pUC19 DNA 1 .0μl

10×T4DNA 连接酶缓冲液 1.0μl

T4DNA 连接酶 (10u/μl) 0.3μl

混合液于 14℃ 培养 12小时

连接

转化及筛选

连接子的转化及筛选同实验一。

实验结果

实验报告

1.简述实验目的和实验原理及材料与试剂 ;

2.详述实验步骤；

3.画出实验结果示意图并分析。