培养基和试剂质量控制方法 GB 4789.28-201X

培养基和试剂质量控制方法GB 4789.28-201X

北京陆桥技术有限责任公司技术服务电话： 0532-82689263 技术部邮箱： sd@beijinglandbridge.

com 销售服务电话： 0532-82689263

北京陆桥技术有限责任公司www.beijinglandbridge.com

主要内容

培养基简介培养基简介11

培养基质量保证培养基质量保证22

培养基的质量要求培养基的质量要求33

培养基性能测试方法培养基性能测试方法44

测试结果的记录测试结果的记录55

培养基常见问题培养基常见问题66


1 、培养基简介

培养基液体、半固体或固

体形式的、含天然或合成成分，用于保证微生物繁殖（含或不含某类微生物的抑菌剂）、鉴定或保持其活力的物质。

1.1 定义



1.2.1 按组成成分分类1.2.2 按状态分类1.2.3 按用途分类1.2.4 按制备方法分类

1.2 分类



1.2.1 按组成成分分类

纯化学培养基：仅含有已知分子结构和纯度的化学成分的培养基。

未定义和部分定义的化学培养基：全部或部分由天然物质，加工过的物质或其他不纯的化学物质构成的培养基。



1.2.2 按状态分类液体培养基：一种或多种成分组成的水溶液。如：脑心浸出液肉汤、营养肉汤；

半固体培养基和固体培养基：含一定量固化物（琼脂、明胶等）的液体培养基。

半固体培养基：含 0.2%-0.8%琼脂粉，多用于细菌的动力观察、菌种传代保存及贮运细菌标本材料等。

固体培养基：含 1.5%-2%琼脂，多用于细菌的分离、鉴定、菌种保存


分类定义举例增菌培养基为微生物繁殖提供特定的生长环境，通常为液体

细分选择性增菌允许特定微生物繁殖，部分或全部抑制其他微生物生长 TTB 、 SC

非选择性增菌能使多种微生物生长的培养基 BHI 、 NB

分离培养基支持微生物生长的固体或半固态培养基细分选择性分离支持特定微生物生长而抑制其它微生物生长的分离培养基 XLD 、 BS

非选择性分离对微生物没有选择性抑制的分离培养基 NA

计数培养基能对微生物定量的选择性或非选择的培养基（注：可包含复苏、增菌等特性）

MYP 、 PCA

鉴别培养基（特异性培养基）

能进行一项或多项生理或生化特性鉴定的培养基麦康凯琼脂

鉴定培养基能产生一个特定的鉴定反应而不需要进一步确证实验的培养基蛋白胨水确证培养基经复苏、分离和增菌后，对微生物部分或完全鉴定或鉴别的培养基 BGLB 肉汤

运输培养基取样后处理前保持微生物活性且不允许明显增殖的培养基缓冲甘油 - 氯化钠溶液

保藏培养基一定时期内保护和维持微生物活性，防止长期保存造成不利影响，或使微生物在长期保存后容易复苏的培养基

营养琼脂斜面

复苏培养基能使受损或应激的微生物修复，使其恢复生长能力，但不一定促进微生物繁殖的培养基

悬浮培养基将测试样本的微生物分散到液相中，不产生增值或抑制作用的培养基磷酸盐缓冲液PBS

1.2.3 按用途分类


1.2.4 按制备方法分类即用型培养基：以即用形式或融化后即用形式置于容器内供应的液体、半固体和固体培养基

脱水合成培养基：使用前需加水和进行处理的干燥培养基

自制培养基：依据完整配方的具体成份配制的培养基



2 、培养基质量保证

质量保证—培养基生产企业提供文件

标明培养基各种成分、添加成分名称及产品编号；

批号培养基最终 pH值储藏信息和有效期质控证书和测试菌株性能测定结果及验收标准必要的安全和 / 或危害数据

质量保证—培养基使用者

每批培养基，应验收：• 产品合格证明• 包装的完整性• 产品的有效期• 生产企业文件的提供• 记录接受日期



2.1 脱水合成培养基——制备流程


2.2 脱水合成培养基——制备注意事项

概述：严格按照厂商提供的使用说明配置。

水：实验用水的电导率在 25 时不应超过 25μS/cm ，相当于电阻率≥ 0.4MΩcm 。

微生物污染≤ 103/mL ，最好在 102/mL 以下；定期检查实验用水是否受到微生物污染。





pH 值测定和调整：

使用 pH 计测定；

灭菌后冷却至 25 时测定 pH 值；

pH 值应在标准 pH±0.2 范围内；

使用 1mol/L 的氢氧化钠或盐酸溶液调整培养基的 pH 值。（如需灭菌后调整 pH 值，则使用灭菌溶液）



灭菌方式：湿热灭菌；煮沸灭菌；过滤除菌：

注意避免过度加热：1.大容积（＞ 1000mL)时容易过度加热；2. 放置物品太多或灭菌后未及时冷却。


SC 正常加热 SC 过度加热


2.3 脱水合成培养基——使用注意事项灭菌或复溶后培养基放入 47-50的恒温水浴锅中，冷却保温，直至使用；

培养基只可复融一次，融化后的培养基应尽快使用，放置时间不应超过 4 小时，未使用完的培养基不能重新凝固留待下次使用。

个别培养基使用前需要脱氧：松开容器盖子，沸水浴或蒸气浴中加热 15min，盖紧盖子，迅速冷却，如 FT培养基。




2.4 菌株定义标准菌株：至少定义到属或种水平的菌株，按菌株特性进行分类和描述，官方菌种保藏机构获得，最好来源于食品或水；

标准储备菌株：将实验室获得或供应商提供的标准菌株转接一代后得到的一套完全相同的独立菌株；

储备菌株：从标准储备菌株转接第一代的培养物；工作菌株：由标准储备菌株或储备菌株，或由经证明或未证明的标准物质转接一代获得的菌株

指在均一固定的浓度中含有具活性的定量化菌种，经证明的标准物是指其浓度已经证明。



标准 / 质控菌株主要来源美国菌种保藏中心American Type Culture Collection Center,ATCC

（英国）国家菌种保藏中心(UK) National Center for Typical Culture Collection,NCTC

中国工业微生物菌种保藏管理中心China Center for Industrial Culture Collection ,CICC

中国医学微生物菌种保藏中心China Center for Medical Culture Collection ,CMCC

注：陆桥均可代购以上菌株


ATCC菌株（进口）

CMCC菌株（国产）

注： ATCC菌株提供证书，可以自行到其网站下载。




标准菌株( 冻干菌种）

转种活化

标准储备菌株（ -80 冰箱保存的培养物）

转种活化储备菌株

（ 4 冰箱保存的培养物）

转种活化工作菌株

（用于培养基微生物质控的新鲜培养物）

详细请参考附录 C


获得标准菌株

验证和文件归档

依据生产商指引进行复苏

在 5% 的血琼脂、 TSA 或其它适合的固体培养基上进行分离

验证菌株的纯度和特性

符合

用适合的培养基制备菌悬液

分装进行冻存或冻干

NO

获得储存菌株

YES

通常悬浮于营养肉汤中适宜时间进行复苏

验证菌落形态和革兰氏染色或用生化试验进行鉴定

例如： TSB 添加 10%-15%甘油作为冷冻保护培养基

在不高于 -70 低温冷冻保存可延长保存的时间。

禁止采用较高的温度保存。


标准储备菌株

迅速解冻

在适合的固体培养基上培养 = 工作菌株

验证菌株的纯度和形态

NO

制备用于测试的工作菌株

符合

YES

在适合的固体培养基上培养

验证菌株的纯度和形态

符合YES接种到合适的培养基或冻存菌悬液 = 工作菌株

贮存物或贮存培养物

在适合的培养基上分离 = 工作菌株

验证纯度制备用于测试的

工作菌株

YES NO

NO

符合

此流程更合适


3 、培养基质量要求

基本 ( 感官和理化 ) 要求：—分装的量和 / 或厚度—外观、色泽和均一性—琼脂凝胶的硬度—水分含量—20 -25 的 pH值—缓冲能力

微生物要求：—微生物污染测试（只适用

于即用型培养基）—生长特性 1 、生长率 2 、选择性 3 、特异性 4 、抗菌试验特性注：详细参照 GB 4789.28附录F 培养基质量控制标准

性能评价和结果解释：1 、所有测试菌株的性能测试达到标准，则该批培养基的性能测试结果符合规定；2 、基本要求和微生物要求均符合规定，则该批培养基可被接受。


质构仪

水分测定仪

电极式 pH计

3 、培养基质量要求


3 、培养基质量要求生长特性概述

a ）定量方法；

b ）半定量方法；

c ）定性方法。

注：使用以上方法时，应使用参考培养基进行对照，有助于结果的解释。

选择近期批次中质量良好的，或具有长期稳定性的批次培养基或即用型培养基

通常可满足实验室的培养基性能检测要求

培养基生产商自制培养基新培养基或新供应商产品其他特殊要求

培养基性能测试第一法


4 、培养基性能测试方法

4.1定量方法悬浮培养基和运输培养基

非选择性固体分离和计数培养基

选择性固体分离和计数培养基


4.2半定量方法选择性液体增菌培养基

非选择性液体增菌培养基

选择性液体计数培养基





4.3定性方法

Mueller Hinton血琼脂

鉴定培养基和实验试剂

悬浮培养基和运输培养基


非选择性液体增菌培养基

选择性液体计数培养基

选择性液体增菌培养基


将适当稀释度的目标菌 0.1mL 分别涂布于待测培养基平板和参考培养基平板（可用螺旋平板法或倾注法），经培养后，计算PR。

PR = NS/NO

PR：生长率； NS ：待测培养基平板上得到的菌落总数； NO ：参考培养基平板上获得的菌落总数，应≥ 100CFU 。

结果解释：非选择性培养基和选择性计数培养基上目标菌的生长率应不小于 0.7 ；选择性分离培养基上目标菌的生长一般不小于 0.5 ，最低应为 0.1 。

接种水平为20CFU~200CFU

4.1 定量方法 —— 非选择性、选择性固体计数和分离培养基



例：木糖赖氨酸脱氧胆盐琼脂（ XLD ）测试菌株：鼠伤寒沙门氏菌，福氏志贺氏菌； 10倍稀释，选取适宜稀释度 0.1mL涂布 XLD平板和 TSA参比平板， 36±1 培养 18h~24h ；

计数：

PR = NS/NO=(132+139)/2

(172+175)/2=0.78

XLD TSA

鼠伤寒沙门氏菌 132,139 172,175

福氏志贺氏菌 130,135 182,187

PR = NS/NO=(130+135)/2

(182+187)/2=0.72

鼠伤寒沙门氏菌：

福氏志贺氏菌：

4.1 定量方法 —— 非选择性、选择性固体计数和分离培养基



待测培养基分装试管， 10mL/ 支（或 5mL/ 支）；目标菌浓度选择： 100CFU~1000CFU ；接种后，混匀：

立即吸取1mL ，用相应培养基倾注平板；剩余已接菌的待测培养基置 20~25放置 45min ，再吸取1mL 用相应培养基倾注平板；分别按标准方法中规定的培养条件培养后，计数；

结果观察与解释：：待测培养基中的菌落数变化应在 ±50% 内。。

4 、培养基性能测试方法4.1 定量方法 —— 悬浮培养基和运输培养基


制备 106~108CFU/mL 的工作菌悬液；用 1μL接种环划线平板， A区用按 0.5cm的间隔划四条平行线，按同样方法在 B、 C区划线，最后在 D区划一条连续曲线；培养后，评价菌落的形状、大小和生长密度，计算生长指数 G ；每条有菌生长的划线记为 1 分，如果仅一半的线有菌生长，记为 0.5分，没有生长或生长量少于划线一半的，记为 0分；结果解释：

目标菌在培养基上应呈典型的生长，目标菌生长指数 G 大于 6 ，培养基可接受；非选择培养基的 G 值通常较高。

4 、培养基性能测试方法4.2 半定量方法 —— 非选择性、选择性固体计数和分离培养基


非目标菌半定量测试方法用 1μL接种环划线平板，划六条平行直线；每条有菌生长的划线记为 1 分，如果仅一半的线有菌生长，记为 0.5分，没有生长或生长量少于划线一半的，记为 0分；结果解释

非目标菌的生长应部分或完全被抑制。

注：操作时用接种环而不用接种针，接种环完全浸入培养基中，取一满环接种物，接触容器边缘 3 次，去除多余液体。划线时，接种环与琼脂表面的角度应为 20°-30°，接种环压在琼脂表面的压力和划线速度前后一致，整个划线应快速连续，移取液体培养物时应将接种环伸入培养液下部分以防止环上产生气泡或泡沫。

4 、培养基性能测试方法4.2 半定量方法 —— 选择性固体计数和分离培养基


培养基分装， 10mL/ 支；新鲜菌液 10倍稀释后，选取 10CFU~100CFU稀释度工作菌悬液；取 1mL 工作菌悬液接入待测培养基；同时取 1mL倾注平板，做接种量计数用；按标准方法中的培养时间和温度进行培养（如增菌时间为 8h 以下，取10μL 增菌液倾注平板，再按适合的时间和温度培养，结果按附录 F 判定）；结果解释： 0 表示无混浊； 1 表示很轻微的混浊； 2 表示严重的混浊目标菌的浊度值应为 2.

4 、培养基性能测试方法4.2 半定量方法 —— 非选择性液体增菌培养基


4 、培养基性能测试方法4.2 半定量方法 —— 非选择性液体增菌培养基


混合菌接种：

同时分别将目标菌菌悬液（与待测培养基接种同一稀释度）和非目标菌菌悬液（比待测培养基接种小 10~100倍稀释度） 1mL倾注平板，用作接种量计数非目标菌接种：在待测培养基中接种等量混合菌试管中的非目标菌。培养液接种：混合菌培养液接种：用 10μL 接种环取 1 环培养后的混合菌培养液，划线

接种到特定的选择性平板上；非目标菌培养液接种：吸取 10μL 培养后的非目标菌培养液，涂布到非选择

性平板上；计算和结果解释目标菌在选择性平板上的菌落应› 10CFU 非目标菌在非选择性平板上的菌落数应‹ 100CFU

目标菌 10CFU~100CFU

非目标菌 1000CFU~5000CFU接菌量 1mL

则表示待测液体培养基的生长率良好

4.2 半定量方法 —— 选择性液体增菌培养基



例：亚硒酸盐胱氨酸增菌液（ SC ）目标菌株：鼠伤寒沙门氏菌 (10CFU~100CFU) ；

非目标菌：大肠埃希氏菌 (1000CFU~5000CFU) 铜绿假单胞菌 (1000CFU~5000CFU);

混合接种：混合菌 1mL接种待测培养基；分别将鼠伤寒沙门氏菌（ 10CFU~100CFU ）和大肠埃希氏菌，铜绿假单胞菌（小10~100倍稀释度） 1mL倾注平板，用于计数；

非目标菌接种：在待测培养基中接种等量混合菌试管中的非目标菌。

4 、培养基性能测试方法4.2 半定量方法 —— 选择性液体增菌培养基


4.2 半定量方法 —— 选择性液体增菌培养基


例：亚硒酸盐胱氨酸增菌液（ SC ）混合菌培养液的接种：用 10μL 接种环取 1 环培养后的混合菌培养液，划线接种到特定的选择性平板上；

非目标菌培养液接种：吸取 10μL 培养后的非目标菌培养液，涂布到非选择性平板上；

计算和结果解释鼠伤寒沙门氏菌的菌落应› 10CFU 大肠埃希氏菌和铜绿假单胞菌在非选择性平板上的菌落数应‹ 100CFU


目标菌接种：取 1mL目标菌（ 10CFU~100CFU稀释度）接种待测培养基，同时取 1mL倾注平板，用作接种量计数；非目标菌接种：取 1mL 非目标菌（ 1000CFU~5000CFU稀释度）接种待测培养基，同时取 1mL （比待测培养基接种小 10~100倍稀释度）倾注平板，用作接种量计数；结果解释： 0 表示无混浊； 1 表示很轻微的混浊； 2 表示严重的混浊。如需观察产气，记录小导管收集气体的体积比。目标菌的浊度值应为 2 ，产气应为 1/3 或以上；非目标菌的浊度值应为 0 或 1 ，无产气现象。

4 、培养基性能测试方法4.2 半定量方法 —— 选择性液体计数培养基


4 、培养基性能测试方法4.2 半定量方法 —— 选择性液体计数培养基


用 1μL 接种环取测试菌培养物在测试培养基表面划平行直线（细菌），或用接种针直接挑取斜面培养物点种接种（霉菌），按标准规定的培养条件培养。

结果解释结果解释 0 表示无生长； 1 表示微弱生长； 2 表示生长良好。目标菌：得分为 2 ，有典型的菌落外观、大小和形态；非目标菌（选择性）：得分为 0 或 1 ；非目标菌（特异性）：有典型的菌落外观、大小和形态。

4.3 定性方法 —— 非选择性、选择性固体计数和分离培养基



用 1μL 接种环取工作菌悬液，接种到待测液体培养基中，培养。

结果解释： 0 表示无混浊； 1 表示很轻微混浊； 2 表示严重混浊。目标菌：浊度值为 2 ；非目标菌：浊度值为 0 或 1 ；

注：有时可以观察到微生物生长后聚集成细胞团，沉积在试管或瓶子底部，发生这种情况时，小心振荡试管后再进行观察。

4 、培养基性能测试方法4.3 定性方法 —— 非选择性、选择性液体增菌和计数培养基


用 1μL 接种环取一环工作菌悬液直接接种到待测培养基中，混匀，立即用 10μL 接种环取一环划平行线接种平板；

剩余已接种菌液的待测培养基置 20~25 放置 45min ，再用10μL 接种环取一环划平行线接种平板；

按标准方法中规定的培养条件培养。

结果观察与解释前后平板上目标菌的生长情况应均为良好。

4.3 定性方法 —— 悬浮培养基和运输培养基



纸片扩散法（定性测试）平板制备：倾注平板，厚度为 4mm~5mm ，使用前适当干燥；质控菌：接种在血平板上复苏，纯度满意后，用于工作菌悬液制备；工作菌悬液：指控菌株悬浮与 TSB 肉汤中，浊度为 0.5 麦氏标准（约1×108CFU/mL~2×108CFU/mL ）；接种：将工作菌悬液涂布与待测的 MH平板上，贴上相应的抗生素纸片（每皿最多 6 片），平板翻转后培养。

注：调整菌悬液浊度与接种所有平板的时间不要超过 15min 。结果观察与解释

在无反射黑色背景下，观察有无抑菌环。结果解释参照附录 F 培养基质量控制标准。

4.3 定性方法—— Mueller-Hinton血琼脂



4.3.1 液体培养基制备 5McFrand浊度（约为 109CFU/mL ）的菌悬液；接种：吸取 0.05mL~0.08mL （约 1~2滴）至待测培养基内；按标准方法中规定的培养条件培养。结果观察与解释

需加指示剂的实验在微生物生长良好的情况下，按顺序加入指示剂，在观察结果。

例：尿素培养基 + ：阳性，奇异变形杆菌，培养基变玫红色； — ：阴性，大肠埃希氏菌，培养基变黄色或不变色

blank + —

4.3 定性方法——鉴定培养基



4.3.2 半固体培养基用接种针条取新鲜质控菌株，穿刺接种待测培养基内；按标准方法中规定的培养条件进行培养；结果观察与解释

需加指示剂的实验在微生物生长良好的情况下，按顺序加入指示剂，在观察结果。

例：半固体培养基

+ ：阳性，单增李斯特氏菌，呈伞状或月牙状生长； — ：阴性，蜡样芽孢杆菌，沿穿刺线生长。

+ —




4.3.3 高层斜面培养基和斜面培养基高层斜面（斜面与底层高约为： 2:3 ）；普通斜面（斜面与底层高约为： 3:2 ）；

接种：高层斜面：用接种针挑取新鲜质控菌株穿刺接种值琼脂高层，再在

斜面上划“之”字形；普通斜面：用接种针挑取新鲜质控菌株在斜面上划“之”字形；

结果观察与解释需加指示剂的实验在微生物生长良好的情况下，按顺序加入指示剂，

在观察结果。




质控菌株名称斜面 / 底部肠炎沙门氏菌（右一）产碱（红） / 产酸

（黄）福氏志贺氏菌产碱（红） / 产酸

（黄）弗氏柠檬酸杆菌（右二）产酸（黄） / 产酸

（黄）大肠埃希氏菌（左二）产酸（黄） / 产酸

（黄）

产气产 H2S

+ +

- -

+ +

+ -

例：三糖铁琼脂灭菌后制成高层斜面备用

空白对照（左一）：橘红色




实验室试剂

1 、按照试剂说明书进行实验；

2 、参照标准进行结果观察与解释。。



5 、测试结果的记录

制造商信息：培养基制造商或供应商应按客户的要求提供培养基常规信息和相

关测试菌株生长特性信息。

溯源性 : 按照质量体系的要求，对所有培养基性能测试的数据归档，并在

有效期内进行适当的保存。建议使用内部质量控制单进行文件记录并评价测试结果。


产品质量检验报告产品 MSDS






用于产品内部质量控制的评价测试结果和产品信息。


1 、培养基不能凝固

制备过程中过度加热；

低 pH 值造成培养基酸解；

称量不正确；

琼脂未完全溶解；

培养基成分未充分混匀。

培养基常见问题


2 、 pH 值不正确


水质不佳；

外部化学物质污染；

测定 pH 值时温度不正确；

pH 计未正确校准；

脱水培养基质量差 .



3 、颜色异常


水质不佳；

pH 不正确；

外来污染；

脱水培养基质量差。



4 、产生沉淀


水质不佳；

脱水培养基质量差；

pH 值未正确控制；

原料中的杂质。



5 、培养基出现抑制 /低的生长率



水质不佳；

使用成分不正确，如：成分称量不准，添加剂浓度不正确；

制备容器或水中的有毒残留物。



6 、选择性差



配方使用不对；

添加成分的加入不正确；例：加入添加成分时培养基过热或添加浓度错误；

添加剂污染。



7 、污染

不适当的灭菌；

无菌操作技术存在问题；

添加剂污染。




8 、容器洁净度

新购置的玻璃器皿应先在酸溶液内浸泡数小时

使用过的器皿在清洗时要注意不能有洗涤剂和自来水的残留

如果容器不洁净或有残留，可能导致培养基出现异常沉淀、微生物生长异常，也可能影响荧光现象的观察



含指示剂的培养基颜色异常

不正常沉淀

含琼脂培养基凝胶强度下降

要求

1. 蒸馏水或去离子水

2. pH在 5.5-7.5

9 、配制培养基用水的要求



10 、含琼脂培养基水浴及复溶的要求

水浴时间不宜超过 4h

如果不能在 4h 内及时使用，应迅速冷却，使其凝固，使用前再进行复溶

但不可多次复溶，否则会影响培养基的 pH 值，并导致凝胶强度下降


11 、常用加热煮沸方式

直接用电炉加热：耗时，含琼脂培养基容易烧糊

隔水煮沸的弊端 a 温度不够，达不到灭菌效果 b 经隔水煮沸的含琼脂培养基，在水浴的过程中易出现分层现象

为您提供一种快速便捷的方式第一步：采用微波炉适当加热第二步：在电炉上继续加热至沸腾




12 、灭菌过程对培养基质量的影响

如果没有达到设定的灭菌条件可能引发的问题：培养基pH 异常、颜色不均、灭菌效果不彻底

常用监测方法化学指示卡：使用方便，高压后可立即得知监测结果生物指示剂：准确性高



13 、导致颜色差异的原因

干粉颜色差异正常差异：由指示剂的批间差异造成的、在允许范围内的颜色差异产品变质：如 SC增菌液干粉变红，说明亚硒酸盐已被氧化，不能使用

溶液及平板颜色差异正常差异：①指示剂的批间差异造成的；②某些含有酸碱指示剂的培养基，其pH值是一个范围，在这个范围内，颜色略有差异也是正常现象

异常情况：① pH值异常导致的，可能是培养基或配制用水的 pH值异常；②高压灭菌过程对颜色产生了影响



14 、培养基保存的注意事项

培养基的保存条件：避光保存于阴凉干燥处，使用后，拧紧瓶盖，避免吸潮、氧化或污染。

干粉保质期：一般未开封的培养基可保质３年，已开封的可保质半年。建议在瓶体注明开封日期。

个别品种的特殊保存要求： SC 增菌液，建议开封后冷藏保存，可延长保质期


THANK YOU!THANK YOU!

Documents

培养基和试剂质量控制方法 GB 4789.28-201X