高效能液相層析儀高效能液相層析儀HPLC

High Performance Liquid Chromatography

HPLC 原理• HPLC 分析是利用動相通過靜相時，混合物中的各成份在靜相和動相之間的分布係數不相同（即親和力不同），使其在管柱中的滯留時間不相同而分離的方法• 若化合物與靜相親和力較強，則沖提較慢（即滯留時間長），而化合物與動相的親和力較強，則沖提較快（即滯留時間短），依此原理將樣品中的待測物與干擾物分離。

HPLC 原理• 在逆相層析法中，通常以高極性作為流動相，靜相為非極性，極性大的樣品成分會先被沖提出來，極性小的較慢沖提出來，因而達到分離效果• 在正相層析法中，則是以非極性為流動相，靜相為高極性，極性小的樣品成分會先被沖提出來，極性大的較慢沖提出來，因而達到分離效果• 樣品進行分離時也可以改變動相來進行梯度沖提• Column 選用較小顆粒的 Packing size 及較長鏈的填充物或者管柱半徑較小者以增加其分離效果

HPLC 原理• HPLC 適用於 1. 半揮發性化合物 2. 非揮發性化合物 3. 樣品沸點過高 4. 不宜加溫而不便使用氣相層析儀者的待測物• 應用此方法進行分析的先決條件是待測物必須溶於作為動相的溶劑中• HPLC 可用於 1. 液相樣品的定性及定量分析 2. 製備純品之用途

HPLC 原理• 干擾可能來自於溶劑、試劑、玻璃器皿、塑膠器皿，及其 他處理過程所接觸器具之污染。這些干擾可能會產生假峰或基線偏 高。因此，必須以試劑水進行系統空白試驗，以確定在此分析條件 下，所用的物質及器具均未受污染。• 由於分析高濃度樣品再接著分析低濃度樣品時，會引起跨樣品的污染，為減低跨樣品間的污染，樣品注射針須用溶劑清洗，遇到異常濃度樣品時須注射一針空白溶劑以檢查樣品間之交叉污染之可能。

HPLC 原理加入沖提液 ( 動相 ) 沖提

將樣品 ( 混合物 ) 加入 Column 管柱中，隨著沖提液持續沖提，混合物內的不同溶質會因極性不相同而逐漸分離開來，最後由偵測器偵測出訊號

靜相

Sample

Packed C

olumn

偵測器Time

HPLC 原理

Detector signal Time

HPLC 裝置圖

Detector

溶劑儲存槽

溶劑分配閥

氣源

Pump

column

樣品注射閥

壓力傳感器

逆壓調節閥防逆流

驅動流速

過濾器小孔徑 除去固體

利用小針筒將氣體抽走

排放閥使流速穩定之長管路

動相儲存槽與溶劑處理系統• 動相之選擇可先以 TLC 片預測• 動相儲存槽通常配有除去溶解氣體 ( 氮氣 or 氧

氣 ) 的配件，此溶解氣體會在管柱及偵測器中形成氣泡而干擾分析操作結果• 溶劑中可能含有灰塵等顆粒性物質，會對 pump造成損害及阻塞管線，故 HPLC 中配有過濾器• 故動相在使用之前，須先進行過濾、除氣之前處理動作

Pump

Pump 選擇條件 :

• 輸出壓力應可達 6000Psi(408.27atm)

• 輸出流速應穩定• 流速範圍應於 0.1-10 mL/min 之間• 應使用抗腐蝕的組件

管柱的選擇• 液－固相層析• 液－液相層析• 離子交換層析• 離子對層析• 分子篩層析

液－固相層析• 液－固相層析 (liquid-solid chromatography ； LSC)是指當固定相為固體的液相層析，主要作用力為吸附作用 (adsorption) 。• 其固定相顆粒大小約為 5~10 μm 的矽膠顆粒，而面積約為 200 m2/g ，在矽膠顆粒表面不規則地接上 -

OH 基，利用這些 -OH 基與欲分離之化合物間之作用力不同而將不同化合物分離。• 由於移動相不應與固定相有作用，因此移動相中若含有水或極性溶劑將使分離效果降低。

液－液相層析• 液－液相層析 (liquid-liquid chromatography ； LLC)是指當固定相為液體的液相層析，主要作用力為分配作用 (partition) 。• 這裡所指的液體固定相指附著在均勻顆粒上之的液體。• 固定相液體與移動相液體不互溶，但因溶質成分會因對二種不互溶液體有分配率差異的作用，而達分離的效果。• 液－液相層析所使用的溶劑一定需先脫氣 (degas)，以免產生氣泡，而影響流速與分離效果。。

離子交換層析• 離子交換層析 (ion-exchange chromatography ； IEC) 是指當固定相為離子交換樹脂的液相層析管柱，作用力主要為離子交換作用。• 離子交換層析管柱主要用於分離與分析離子樣品。陰離子交換層析固定相為陰離子交換樹脂，試樣應為陰離子，移動相應以鹼液沖提；陽離子交換層析固定相為陽離子交換樹脂，試樣應為陽離子，移動相應以酸液沖提。• 影響離子交換層析管柱分析效果的因素有 pH值、離子性質、強度、溫度、有機溶劑添加、固定相性質與鉗合作用等。

離子對層析• 離子對層析 (ion-pair chromatography ； IPC) 是指固定相為類似結合相層析管柱的化學鍵結液體，移動相為添加與樣品相反電荷離子 (counter ion) 的水性緩衝液。• 試樣待測成分與樣品相反電荷離子僅溶在水性移動相中，但兩者所形成的離子對則會與固定相發生作用。• 離子對層析管柱適用於分析極性樣品、具解離性化合物或生理體液等。

分子篩層析• 分子篩層析 (size exclusion chromatography ； SEC)是指當固定相為分子篩的液相層析管柱，主要作用力為依尺寸大小分離的斥濾作用。• 分子篩為表面有微細孔洞的凝膠顆粒，當沖提進行時，尺寸越小的分子會跑到孔洞中而延後流出，因此越大的分子會越早被沖提出來。• 尺寸大小斥濾層析管柱適用於分析分子量高於

2,000 的不解離化合物或分子量差距大的樣品，也可作為檢測未知樣品的分子量分佈。

Column• 長 10-30 cm ，內徑 4-10 mm ，直線型管柱• 液相層析中，以多孔性填充物最常見，由直徑範圍 3-10 μm 的多孔性微粒構成，以矽酸鹽類最常見

O SiSi C18

CH3

CH3

逆相層析中 以非極性的 C18 鏈作為填充

• 較長鏈的管柱填充物其滯留時間長，可以允許使 用較大量樣品

偵測器• 偵測器用以偵測沖提流出液中待測化合物之訊號或含量，一般在測定時樣品為液態或溶液的儀器，均可使用作為

HPLC 的偵測器。• 最常配備的偵測器有紫外光 / 可見光偵測器、螢光偵測器、電化學偵測器及質譜儀偵測器等。• 理想的偵測器其反應時間短且和流速無關，應有最小的內部體積以減少帶加寬效應 (zone broadening) ，且應具備適當的靈敏度和選擇性、良好穩定性與再現性、干擾訊號低、非破壞性、線性範圍長及較不易受溫度之變化影響。

偵測器• 偵測器分為兩種類型 A.總體性質檢偵器 : 感應“動相”的折射係數 .介電常數 .密度等整體性質 B. 溶質性質檢偵器 : 只感應溶質的 UV吸收值 .螢光值 .IR值或者擴散係數電流等 各種不受流動相影響之性質

紫外光 / 可見光偵測器• 一般紫外光 / 可見光偵測器的靈敏度可達 10 － 8

g/mL ，優點是溫度效應低，易於梯度沖提，而且便宜、使用方便，可分析大部分的有機物質，所以是HPLC 的基本配備偵測器。

UV-Vis 偵測器構造圖

汞燈 ( 或氘燈 .鎢絲燈 )作為光源

雙光徑偵測器

solvent

sample solution

濾光片

兩者對 UV吸收之差 , 由光電管轉換成電訊號 ,即可記錄下來

* 使用濾光片分離出最常用的光譜線* 使用此種偵測器 , 應先確認受測之溶質在此波長範圍處有吸收現象

螢光偵測器• 螢光偵測器的優點是靈敏度高，可達 10 － 12 g/mL，適合作微量分析，其選擇性也比紫外光／可見光偵測器高很多，在食品分析常被利用來偵測維生素或特殊微量成分。使用折射率偵測器的待測樣品應具有折射率才會被偵測到，在食品分析常被利用來偵測醣類；使用分子篩層析定量時最好也能考慮折射率偵測器，以獲得較佳的線性關係。

電化學偵測器• 電化學偵測器在生物、藥物臨床分析上相當重要，目前在環境分析上的應用越來越多。其中電導度偵測器其靈敏度可達 10 － 7 g/mL，安培偵測器其靈敏度可

達 10 － 10 g/mL。雖然電導度偵測器和安培偵測器等電化學偵測器的靈敏度不低，但是化合物若能被電導度偵測器偵測到，除非量太低，不然亦可被紫外光/可見光偵測器偵測到；而能被紫外光/ 可見光偵測器偵測到的化合物，未必能讓電導度偵測器偵測到，這是因為測定方式不同所致，電化學偵測器在測量化合物時，必須含有電解質，使其產生電位變化。因此整體而言，電化學偵測器沒有比紫外光/ 可見光偵測器實用。

PDA 偵測器• 光電二極管矩陣偵測器 (photodiode array detector) 和紫外光 / 可見光偵測器非常相似，待測物須有吸收紫外光或可見光的能力，即含有雙鍵。• 光電二極管矩陣偵測器光學途徑設計與紫外光 / 可見光偵測器略有不同，樣品先通過樣品偵測槽後才進行分光，然後照射至光電二極管矩陣再量測各波長之吸收度。光電二極管矩陣偵測器不僅能提供吸收度的訊息，同時還能提供各波峰光譜，所得到的是三度空間的資訊，即滯留時間軸、吸收度軸與波長軸，由光譜的訊號即可判斷波峰的純度和強度。

質譜儀偵測器• 高效能液相層析儀接質譜儀 (mass spectroscopy)簡

稱 LC/MS ，是快速分離鑑定的高價設備，可分離並判斷混合物的樣品組成物。• 質譜分析主要是利用游離步驟將樣品中的化合物斷裂成快速移動的氣態離子，然後根據其質量電荷比

(m/z) 加以分離得質譜，此技術可提供混合物中無機和有機分析物的定性和定量組成，與各種複雜分子的物種結構。

THE END