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ÍNDICE
Págs.
1. RESUMEN ........................................................................................................ 1
1.1 Abstract ..................................................................................................... 1
2. INTRODUCCIÓN .............................................................................................. 2
3. OBJETIVOS ..................................................................................................... 7
4. MATERIAL Y METODOS ................................................................................. 8
4.1 Material ...................................................................................................... 8
4.2 Métodos ..................................................................................................... 9
4.2.1 Variedades de pescado ..................................................................... 9
4.2.2 Características de los medios utilizados ........................................... 9
4.2.3 Proceso de siembra .......................................................................... 12
4.2.4 Recuento de colonias ........................................................................ 13
4.2.5 Identificación de colonia .................................................................... 14
5. RESULTADOS ................................................................................................. 14
5.1 Sardina ...................................................................................................... 14
5.2 Acedia ........................................................................................................ 16
5.3 Caballa ....................................................................................................... 17
5.4 Merluza ...................................................................................................... 19
5.5 Boquerón ................................................................................................... 20
5.6 Sardina congelada .................................................................................... 22
5.7 Acedia congelada ..................................................................................... 23
5.8 Caballa congelada .................................................................................... 25
5.9 Merluza congelada ................................................................................... 27
5.10 Boquerón congelado .............................................................................. 28
- Comparativa de resultados ......................................................................... 30
6. DISCUSIÓN ...................................................................................................... 33
7. CONCLUSIONES ............................................................................................. 35
8. REFERENCIAS BIBLIOGRAFICAS ................................................................ 36
9. ANEXOS .......................................................................................................... 39
1
1. RESUMEN
La mayoría de los organismos marinos habitan en ambientes que presentan
un nivel relativamente rico en bacterias y otros microorganismos. Tanto los peces
como demás organismos marinos, mantienen una interacción intima con este
entorno, y por tanto con los microorganismos que en el existen. Una vez sabido
esto, los objetivos de este estudio fueron, por un lado, poner en manifiesto las
condiciones microbiológicas de distintas variedades de pescado tanto frescas como
congeladas, siendo estas sardina, acedia, caballa, merluza y boquerón, y por otro
lado, una vez realizado el cultivo de dichas variedades, comparar la carga
microbiana que poseen los productos frescos conservados en cámara fría frente a
estos mismos productos sometidos a ultracongelación, con una temperatura de -80º
C. Concluyendo que, los mesófilos totales en todos los productos se encuentran
dentro de los límites establecidos por la FAO y por la orden de 2 de agosto de 1991,
a excepción de la merluza fresca que pasaría los limites que establece la orden del 2
de agosto de 1991. Siendo por tanto, el producto que mayor carga microbiana
presenta.
Palabras clave: análisis microbiológico, microorganismos, productos de pesca,
cultivo, unidades formadoras de colonias y tinción de Gram.
1.1 Abstract
Most marine organisms live in environments with a relatively high level of
bacteria and other microorganisms. Both fish and other marine organisms maintain
an intimate interaction with this environment, and therefore with the microorganisms
that exist in it. Once this was known, the objectives of this study were, on the one
hand, to highlight the microbiological conditions of different varieties of both fresh and
frozen fish, these being sardines, acedia, mackerel, hake and boquerón, and, on the
other hand, after the cultivation of these varieties, compare the microbial load of the
fresh products kept in the cold chamber against the same products subjected to
ultrafreezing, with a temperature of -80ºC. Concluding that total mesophils in all
products are within the limits set by FAO and by the order of 2 August 1991, with the
exception of fresh hake which would exceed the limits laid down in the order of 2
August 1991. It is therefore, the product with the highest microbial load.
2
2. INTRODUCCIÓN
Los peces son seres vivos aclimatados tanto a la vida de agua dulce como de
agua salada. Van provistos de aletas para nadar y moverse en el agua, su piel está
recubierta de escamas y la respiración en branquial.
La morfología de los peces seria:
- Las aletas que son las encargadas de dirigir y efectuar los movimientos del
pez
- Las escamas van superpuestas unas a otras y cubiertas de una capa
lubrificante que facilita el deslizamiento del pez.
- La línea lateral, tiene como misión captar las vibraciones sonoras y las
corrientes del medio.
- El opérculo es una cubierta ósea para la protección de las branquias que
constituye el sistema respiratorio de los peces
En la parte interna del pez posee una serie de órganos necesarios para el
mantenimiento de la vida, como son:
- Sistema digestivo
- Corazón
- Sistema óseo, dividido en tres secciones: cráneo con mandíbulas y los arcos
branquiales, la espina dorsal, y esqueleto de las aletas y de la cola.
En cuanto a su reproducción, los peces se desarrollan a partir de huevos
puestos por la hembra que el macho ha fecundado previamente. (Madrid et al.,
1999)
La mayoría de los organismos marinos habitan en ambientes que presentan
un nivel relativamente rico en bacterias y otros microorganismos. (Hansen y Olafsen,
1999) Tanto los peces como demás organismos marinos, mantienen una interacción
intima con este entorno, y por tanto con los microorganismos que en el existen. En
el océano se estima que hay unas 3.6x1030 células microbianas, lo cual representa
más del 90% de la biomasa oceánica total, siendo en cambio el número de
partículas virales cien veces mayor que este. (Egerton et al., 2018)
3
La relación que tienen los peces con los microorganismos puede ser de dos
tipos, mutualista o patógena. Siendo la mayoría de las bacterias que causan
enfermedades en los peces marinos, patógenas oportunistas, estas se encuentran
presentes como parte de la microbiota normal de agua de mar. Pocas de estas
bacterias son patógenas obligadas, es decir, dependientes de un huésped vivo para
su propagación, como serian Renibacterium salmoninarum y Mycobacterium
spp. La alteración en la salud por factores como estrés ambiental, alteraciones de la
temperatura, cambios en la concentración de oxígeno o contaminantes (Rødsæther
et al., 1977; Wedemeyer y Goodyear, 1984) puede ocasionar una debilidad en las
defensas y permitir que las bacterias colonicen, penetren e invadan los tejidos del
huésped. Por tanto, el papel de la microbiota intestinal en los peces es importante, y
similar al de los humanos, teniendo como principales objetivos la recuperación de
energía y nutrientes, homeostasis metabólica, y la defensa frente a la invasión por
microorganismos extraños. (Egerton et al., 2018)
También son importantes las poblaciones bacterianas especificas asociadas a
los peces marinos, sobre todo para su alimentación, ya que proporcionan sustancias
celulares o micronutrientes como ácidos grasos esenciales, vitaminas, minerales o
incluso enzimas (Hansen y Olafsen 1999; MacDonald et al. 1986; Rimmer y Wiebe
1987). Además, las bacterias específicas tienen la capacidad para ocupar sitios de
fijación en el intestino de larvas, haciendo que se prevenga la proliferación de
bacterias oportunistas y lo colonicen, siendo por tanto un importante mecanismo de
defensa, especialmente durante las etapas larvales tempranas, cuando el sistema
inmune aun no se encuentra totalmente desarrollado. (Huys et al. 2001).
Aquellos estudios que investigan la microbiota intestinal de los peces difieren
en muchos niveles como, en las especies estudiadas, los métodos de recogida, y en
el análisis de muestras. Esto puede crear dificultades a la hora de comparar
resultados y extrapolar el verdadero nivel de diversidad. (Egerton et al., 2018)
A pesar de estas limitaciones, los resultados obtenidos son una comparación
que abarca de forma no-uniforme una diversidad de especies de peces, siendo más
de 30 estudios los que revelaron que los siguientes géneros son los que más
frecuentemente podemos encontrar: Vibrio, Photobacterium y Clostridium. En apoyo
de estos resultados, un meta-análisis de las comunidades intestinales de peces
4
marinos reveló que las bacterias Vibrionales (que incluye los géneros Vibrio y
Photobacterium) representan el 70% de las lecturas de secuencia (Sullam et al.,
2012).
Vribio anguillarum, Vribio salmonicida, y Vibrio vulnificus se encuentran entre
los principales patógenos bacterianos de peces marinos e invertebrados (Austin y
Austin, 1999).
Dentro del filo Proteobacteria y de la familia Vibrionaceae se encuentra el
género Photobacterium. Esta bacteria luminosa comúnmente se encuentra en la
superficie de peces sanos y se asocia originalmente con órganos emisores de luz,
un ejemplo seria: Photobacterium angustum, P. leiognathi y P.fosforo (Cahill, 1990).
Dentro del género Photobacterium, también hay miembros no-luminiscentes,
como P.iliopiscarium, que ha sido aislado de los intestinos de varias especies de
pescado (Onarheim et al., 1994; Urakawa et al., 1999).
Las fotobacterias actúan como bacterias mutualistas en el intestino huésped
ayudando con la digestión de la quitina (Itoi et al., 2006; MacDonald et al., 1986;
Ramesh y Venugopalan, 1989).
El género Clostridium es muy común dentro del phylum Firmicutes .Con más
frecuencia, Clostridium botulinum es la especie patógena asociada con peces
marinos. Hay seis tipos diferentes de cepas (A-F). Los peces son susceptibles al tipo
E y ocasionalmente B (Mazuet et al., 2016; Uzal et al., 2016).
Hay que decir que la composición de la microbiota en las diferentes especies
de pescado, es similar en todas ellas. Los microorganismos que se detectan más
frecuentemente en ellos son aquellos que se encuentran viviendo libres en el agua y
en los sedimentos y en pocas ocasiones son especies patógenas para los
mamíferos.
Por regla general, los peces de agua salada no suelen contener los
microorganismos típicos de la microflora de los mamíferos, es decir, Escherichia coli
y enterococos. La presencia de microorganismos humanos entéricos en los
productos de origen marino es una prueba de contaminación proveniente de fuentes
terrestres.
5
Las intoxicaciones por consumo de pescado se deben a la presencia de una
toxina en su carne, esta puede ser intrínseca al pescado o puede proceder del
alimento que los animales consumen. (TICMSF, 1999)
Se pueden distinguir la intoxicación por consumo de pez globo causado por la
toxina tetrodoxina y la ciguatera causado principalmente por la ciguatoxina. La
toxina de los escombridos es una excepción ya que es producida principalmente
por el atún, caballa u otros pescados. Tras la muerte del pescado hay una toxina que
se puede desarrollar conocida como histamina, producida por el crecimiento
microbiano en el producto. (Calvo-Carrillo y Mendoza Martínez, 2012)
La incidencia de problemas bacteriológicos y víricos se da mayormente en
India, Japón y países del sudeste asiático, debido a que en estas zonas se consume
más frecuentemente pescado crudo o poco cocinado. Los microorganismos que
causan mayores problemas son vibrios y Clostridium botulinum. (TICMSF, 1999)
Las especies de Vibrio son los principales grupos bacterianos vinculados a
peces marinos, como ya se ha mencionado anteriormente, encontrándose
ampliamente distribuidas en el medio de estos. Las bacterias de este género
facultativo predominan en la microbiota intestinal de una amplia gama de peces
marinos. Varios autores han descrito como la microbiota intestinal de peces está
relacionada con la composición microbiana de los alimentos ingeridos y del agua
(Blanch et al., 1997; Seki, 1969; Tanasomwang y Muroga, 1988).
Los microorganismos como Salmonella, Staphylococcus aureus y Clostridium
perfringens no son contaminantes típicos del medio ambiente del pescado, pero
últimamente están aumentando como productores de enfermedades por el consumo
de estos productos, ya que pueden contaminar el pescado durante su procesado o
distribución.
Por lo tanto para evitar una contaminación del producto, será necesario llevar
a cabo unos métodos de conservación correctos. (TICMSF, 1999).
Los métodos de conservación del pescado hasta la llegada al consumidor son
muy variados, el más común es la conservación del pescado por frío. Según la
intensidad de frío se encuentran: pescados frescos o refrigerados (temperatura
oscila entre -1 a 6 ºC), pescados congelados (temperatura oscila entre -16 a 25ºC) y
6
pescados ultracongelados, en menos de dos horas alcanza la temperatura de 0
hasta -5ºC, para después continuar la congelación hasta alcanzar las temperaturas
de -16 a -35º C.
Se pueden diferenciar dos procesos de congelación:
1. Congelación lenta, conseguida con sistemas tradicionales
2. Congelación rápida, conseguida con gases criogénicos y sobre todo con
nitrógeno líquido, que es el gas criogénico por excelencia.
La clasificación de bacterias según sus posibilidades de desarrollo y según
sea la temperatura ambiente seria:
- Termófilas a mayor de 45ºC
- Mesófilas entre 20-45ºC
- Sicrofilas entre 7-20ºC
- Sicotrofas a menor de 7ºC
Algunas de las ventajas de la congelación rápida es que, se consigue bajar
mucho la temperatura de forma muy rápida, lo que conlleva una detención más
pronta del desarrollo de los microorganismos presentes en el producto. Sin embargo,
cuando el enfriamiento es lento, se produce la formación de cristales de hielo
gruesos en los espacios intercelulares que rompen la estructura de los tejidos del
alimento, en cambio si la congelación es rápida, se forman cristales de hielo más
pequeños tanto en las células como en los espacios intercelulares, conservándose
así mucho mejor la estructura del alimento.
Otros sistemas de conservación serian:
- Secado, con este método el pescado pierde el agua y esto hace que se evite
el desarrollo de microorganismos. En un principio el pescado tendría un 80%,
después del secado tendrá un 10%
- Salazón, en este caso la sal penetra en su interior y desplaza al agua, con lo
que también estaríamos poniendo inconvenientes para el desarrollo de
microorganismos.
- Ahumado del pescado, este proceso hace que el pescado adquiera un sabor
y características especiales como resultado de la desecación y de la acción
7
del humo. El arenque fue uno de los pescados que en un principio se
sometieron a este proceso, en la actualidad se extiende también a las
angulas, salmón, truchas,etc. Este proceso produce varias acciones sobre el
producto:
Acción conservadora ya que se depositan sobre él una serie de sustancias
microbicidas tales como fenoles, nitratos… que inhiben el crecimiento y
desarrollo de microorganismos.
Acción antioxidante
Acción deshidratante durante el proceso se produce una pérdida de agua.
- Cocción del pescado, el calentamiento a temperaturas de 80/95ºC durante 10
a 20 minutos, destruye las enzimas y bacterias presentes.
- Irradiación del pescado, se realiza con la exposición del producto a
radiaciones de cobalto 60 o de radiaciones gamma, sin que quede actividad
residual de ningún tipo en el. Con este sistema se destruyen los
microorganismos presentes y se consigue un producto que es estable a
tempe0ratura ambiente.
- Liolificacion
- Envasado y conservación del pescado en atmósferas modificadas
(Madrid et al., 1999)
Tanto en el reglamento del 29 de abril de 2004 como en la directiva de la UE
91/493/CEE vienen recogidos los requisitos que se deben seguir desde que el
producto pesquero es capturado hasta que se encuentra en los diferentes
establecimientos. Además se explica el control sanitario y la inspección de las
condiciones de producción por la que deben pasar estos productos, para verificar de
este modo que se han cumplido los requisitos establecidos por la directiva.
3. OBJETIVOS
Los objetivos serán;
Por un lado, poner en manifiesto las condiciones microbiológicas de distintas
variedades de pescado tanto frescas como congeladas, siendo estas sardina,
acedia, caballa, merluza y boquerón.
8
Por otro lado, una vez realizado el cultivo de dichas variedades, comparar la
carga microbiana que poseen los productos frescos conservados en cámara
fría frente a estos mismos productos sometidos a ultracongelación, con una
temperatura de -80º C.
4. MATERIAL Y MÉTODOS
4.1 Material
Para llevar a cabo el análisis de las diferentes muestras de pescado, se ha
utilizado el siguiente material.
- Medios de cultivo
- Microscopio óptico
- Pipetas automáticas
- Puntas amarillas
- Gradillas
- Placas petri
- Balanza de precisión
- Homogeneizador llamado Stomacher® 80 Biomaster, Seward Ltd
- Bolsas para introducir los alimentos en el stomacher
- Tubos eppendorfs
- Asa de siembra
- Probetas
- Tubos falcon con tapón
- Portas de vidrio
- Mecheros bunsen
- Matraces Erlenmeyer
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- Vasos de precipitado
- Estufas de cultivo
- Colorantes para tinción: Cristal violeta, Safranina y Lugol.
- Alcohol
- Aceite de inversión
- Guantes
- Bata
4.2 Métodos
4.2.1 Variedades de pescado
Se llevara a cabo el análisis de distintas variedades de pescado (sardina,
acedia, caballa, merluza y boquerón), en una primera semana se analizara 5
variedades frescas conservadas en cámara fría, y en la siguiente semana se
analizaran estas mismas variedades, pero conservadas durante unos 6 días en el
congelador a -80ºC.
Las distintas variedades de pescado son un total de 5, han sido compradas en
distintos días y lugares. Estos productos serán sembrados, pero antes se deberá
preparar los medios que serán utilizados en la siembra. Se prepararan 5 medios,
uno general y cuatro selectivos.
4.2.2 Características de los medios utilizados
Todas las características de los medios tanto la composición, como objetivos
de estos, etc. Viene recogida en la página web de Scharlab S.L.
Como medio general:
- Medio TSA (Agar triptona y soja), cuya composición (g/L) es:
Peptona de caseína ................................... 15,0
Peptona de soja ......................................... 5,0
Cloruro sódico............................................ 5,0
10
Histidina ..................................................... 1,0
Lecitina ...................................................... 0,7
Polisorbato 80 ............................................ 5,0
Tiosulfato sódico ........................................ 0,5
Agar ........................................................... 15,0
Este medio es ampliamente utilizado, con dos peptonas que apoyan el
crecimiento de una amplia variedad de organismos, incluso el de los muy exigentes,
como Neisseria, Listeria o Brucella. Los microorganismos que suelen crecer en este
medio son; Escherichia coli, Staphylococcus aureus, Bacillus subtilis, Aspergillus
brasiliensis, Candida albicans y Pseudomonas aeruginosa.
El modo de preparación se lleva a cabo pesando 42g de agar para 1L de
agua destilada
Como medios selectivos:
- Medio EMB (Eosina-Azul de Metileno Agar), cuya composición ( g/L) es:
Peptona ...................................................... 10,000
Lactosa ....................................................... 10,000
Dipotasio hidrógeno fosfato ........................ 2,000
Yellowish Eosin ......................................... 0,400
Methylene Blue ........................................... 0,065
Agar ............................................................ 15,000
Se trata de un medio de uso selectivo diferencial para el aislamiento de
coliformes en diferentes muestras. En este medio crecerán enterobacterias Gram -,
ya que se trata de un medio extraordinariamente versátil que se utiliza normalmente
para la diferenciación de E. coli y Enterobacter aerogenes, además ha mostrado
gran eficacia en el diagnóstico rápido de Candida albicans, y también se utiliza para
crecimiento de Salmonella enterica y Salmonella typhimurium.
Para la preparación de este medio se pesa 36g para 1L de agua destilada.
- Medio KAA (Kanamicina Esculina Azida Agar), cuya composición (g/L) es:
Triptona ...................................................... 20,00
Extracto de levadura ................................... 5,00
11
Cloruro sódico ............................................ 5,00
Citrato disódico ........................................... 1,00
Esculina ...................................................... 1,00
Citrato férrico-amónico ............................... 0,50
Azida sódica ............................................... 0,15
Kanamicina sulfato ..................................... 0,02
Agar ............................................................ 15,00
Es un medio cuyo principal objetivo es la detección confirmativa y aislamiento
de estreptococos Gram+ del grupo D de Lancefield en muestras de alimentos. Los
microorganismos que se desarrollan en este medio son; Enterococcus faecalis.
Para su preparación se pesan 62g de medio para 1L de agua destilada.
- Medio MRS Agar (Man, Rogosa y Sharpe Agar), cuya composición (g/L) es:
Peptona proteosa ....................................... 10,00
Extracto de carne ....................................... 8,00
0Extracto de levadura ................................. 4,00
D(+)-Glucosa .............................................. 20,00
Acetato sódico ............................................ 5,00
Citrato triamónico ....................................... 2,00
Sulfato magnésico ...................................... 0,20
Sulfato manganoso ..................................... 0,05
Fosfato dipotásico ...................................... 2,00
Polisorbato 80............................................. 1,00
Agar ............................................................ 14,00
Es un medio de cultivo sólido para la detección, aislamiento y crecimiento de
lactobacilos Gram+ y otras bacterias del ácido láctico a partir de muestras de
alimentos y bebidas. En este los microorganismos que crecen son; Lactobacillus
sakei, Lactococcus lactis y Pediococcus pentosaceus.
Para su preparación se pesan 62g de medio para 1L de agua destilada.
- Medio V-J (Vogel Johnson Agar), cuya composición (g/L) es:
Peptona de caseína .................................... 10,00
Extracto de levadura ................................... 5,000
12
Manitol ........................................................ 10,00
Fosfato dipotásico ...................................... 5,000
Cloruro de litio ............................................ 5,000
Glicina ........................................................ 10,00
Rojo de fenol .............................................. 0,025
Agar ............................................................ 15,00
Es un medio de alta selectividad para el aislamiento e identificación de
estafilococos Gram +. Los principales microorganismos que crecen en este medio
son; Staphylococcus epidermidis y Staphylococcus aureus.
Para su preparación se pesan 60g de medio para 1L de agua destilada.
Además, hay que añadir asépticamente 20 mL de solución de telurito potásico al 1%,
este les da el color negro a las colonias.
Todos estos medios son de Scharlab (Barcelona), preparados según las
instrucciones del fabricante.
Además también se prepara solución salina al 0,9%, que será necesaria para
realizar las posteriores diluciones, y siguiente siembra en los medios. Esta será
preparada mezclando cloruro sódico junto a agua destilada.
Antes de iniciar el proceso de siembra, los medios serán esterilizados por
autoclavado a una temperatura de 120º durante 20 minutos, se atemperan a 50ºC y
se vierten en placas Petri.
4.2.3 Proceso de siembra
Para llevar a cabo la siembra de cada alimento se pesan 5 gramos iniciales,
se le añaden 0,045L de solución salina estéril al 0,9%, y posteriormente será todo
procesado en un homogeneizador llamado Stomacher® 80 Biomaster, Seward Ltd.
Seguidamente se preparan disoluciones seriadas, en tubos eppendorfs se
añade solución salina estéril al 0,9%, necesitando para los 5 alimentos un total de 20
tubos eppendorfs. Como de cada alimento hay que hacer 4 diluciones (de -1 a -4), a
cada tubo se le pondrá la inicial del alimento y la dilución a la que corresponde. Por
lo que la realización de las disoluciones seriadas seria de la siguiente manera:
13
De la solución madre ( solución 0) que sería la realizada con los 5g de
alimento más los 0,045L de solución salina estéril al 0,9%, se cogen 100µL con una
Pipeta automática y con puntas amarillas, estos 100 µL serán añadidos al primer
tubo siendo por tanto esta la solución -1, cambiamos la punta y agitamos el tubo
eppendorf, de nuevo se cogen otros 100 µL, pero de la solución -1, que se añade al
tubo que será nombrado como solución -2, se vuelve a cambiar la punta y a agitar el
eppendorf, y así sucesivamente hasta llegar a la solución -4.
Este procedimiento se realizara con cada alimento.
Una vez realizadas las soluciones seriadas, comenzaremos por el medio
general (medio TSA), del que se sembraran 100 µL de cada una las disoluciones (
0,-1,-2,-3 y -4), se hará por duplicado, por lo tanto, de este medio se necesitara un
total de 10 placas para cada alimento.
En el caso de los medios selectivos, se sembraran 100 µL solo de la
disoluciones 0 y otros 100 µL de la -1, también se hará por duplicado por lo que se
necesitaran, 4 placas para cada medio, y un total de 16 placas de medios selectivos
para cada alimento.
4.2.4 Recuento de colonias
Los recuentos se realizan tras 48 horas de incubación en la estufa a 37ºC,
excepto el medio MRS que será incubado a 30ºC. Se sumaran las colonias
obtenidas, solo en aquellas placas donde el número de colonias se encuentre entre
30-300, posteriormente se utilizara la siguiente formula, para saber la unidad
formadora de colonias por mililitro:
Dilución: será dependiendo de la placa en la que hayamos realizado el
recuento, 100, 10-1, 10-2, 10 -3 o 10- 4.
Volumen: se trata del volumen que ponemos en cada placa, 100 µL= 0,1mL
Se multiplica todo por 10, ya que sería una dilución de 5gr en 45mL de
solución salina
14
4.2.5 Identificación de colonias
Para llevar a cabo la identificación de las colonias, de aquellas placas donde
hemos realizado el recuento, se preseleccionaran aquellas que presentan una
morfología diferente y se les realizara una tinción de Gram y prueba de la catalasa.
- Tinción de Gram
Para realizar la tinción de Gram se utiliza un porta, sobre el cual se pone un
gota de agua destilada, y con el asa de siembra se extiende la colonia, que
previamente se ha cogido de algún medio. Después se fija, se deja enfriar, y se
añade cristal violeta, se espera 2 minutos, y se añade lugol, y se espera otros 2
minutos. Tras este tiempo, se lava con alcohol 96º y después con agua,
posteriormente se añade safranina, se espera 3 minutos, después se lava con agua,
se seca y se observa a x100 con una gota de aceite de inmersión.
- Prueba de la catalasa
La prueba de la catalasa consiste en poner una gota de agua oxigenada en un
porta y con una asa se expande la colonia que queremos saber si es catalasa + o -.
La enzima catalasa se encuentra presente tanto en animales como en plantas, y
también en algunas bacterias, por lo que será un método que aportara información a
la hora de identificar a una especie. Por lo que, cuando el resultado es positivo se
apreciara una gran cantidad de burbujas como resultado de la transformación del
agua oxigenada en agua y oxigeno, por el contrario, cuando es negativa no
aparecerán burbujas. Esta prueba solo se realiza con los medios selectivos: EMB,
KAA y V-J
5. RESULTADOS
Los resultados adquiridos se muestran en tablas donde se puede ver el
recuento obtenido, la morfología de las colonias, tinción de Gram y prueba de la
catalasa. Además de las imágenes de estos resultados, que podrán ser consultadas
en los diferentes anexos. Son 10 tablas en total, correspondientes a cada una de las
variedades, tanto frescas como congeladas.
5.1 Sardina
15
Medios Recuento Morfología de las colonias Tinción
de Gram1
Prueba de
la catalasa
Medio
TSA
Colonia con forma bacilar,
de pequeño tamaño y color
anaranjado.
Gram -
Colonia en forma de racimo,
siendo cocos, de color
blanquecino y pequeño
tamaño.
Gram +
Medio
EMB
Colonia con halo y color
negro, con forma bacilar Gram - -
Colonias de color negra, con
forma bacilar Gram + -
Medio
MRS --- --- ---
Medio
VJ
Colonia de color negro, con
forma de cocos Gram + +
Medio
KAA ---- --- ---
Tabla 1: Recuento e identificación de las colonias de sardina fresca.
Tras realizar el recuento y tinción en la sardina fresca (tabla 1), se puede
observar como en el medio TSA hay unidades formadoras de colonias,
algunas de la colonias de este medio son de forma bacilar teniendo estas un tamaño
mucho mayor que la demás, mientras que la demás colonias tienen un tamaño
menor, teniendo formas similar a los cocos. Las primeras se deducen que pueden
1 Ver imagen Anexo.1
16
ser Bacillus subtilis, mientras que las otras podrían tratarse de Staphylococcus
aureus, según la información aportada por el fabricante.
En el medio EMB el numero obtenido de unidades formadoras de colonias es
de , siendo este tres unidades logarítmicas menor que el anterior medio. En
este las colonias que se observan son con forma bacilar siendo unas de un color
negro mientras que otras son negras pero con halo grande incoloro, por lo que se
deduce que pueden pertenecer a la especie Enterobacter.
En el medio MRS no se produjo ningún crecimiento de colonias.
En el medio VJ el número de unidades formadoras de colonias es de ,
siendo este muy similar al del medio EMB. Las colonias observadas eran de color
negro, de pequeño tamaño, tras la tinción se vio que eran cocos en forma de
racimo, por lo que con este color y forma se puede deducir que se podría tratar de
Staphylococcus aureus o Staphylococcus epidermidis, según la información
aportada por el fabricante.
Por último, en el medio KAA no se produjo crecimiento de colonias.
5.2 Acedia
Medios Recuento Morfología de las colonias Tinción
de Gram2
Prueba de
la catalasa
Medio
TSA
Colonias de mayor tamaño
de tipo mucoso. Forma
bacilar
Gram -
Colonia de tamaño
intermedio de color
anaranjado. Forma de
cocos en racimos
Gram +
Medio
EMB --- --- ---
2 Ver imagen Anexo.2
17
Medio
MRS
Colonia de pequeño
tamaño. Forma de cocos en
racimos
Gram +
Medio
VJ
Colonia de color negro y
pequeño tamaño. Con
forma de cocos en racimo
Gram + +
Medio
KAA --- --- ---
Tabla 2: Recuento e identificación de las colonias de acedia fresca. Tras realizar el recuento y tinción en la acedia fresca (tabla 2), se vio que en el
medio TSA el número de unidades formadoras es de . En este medio se
vieron tres tipos de colonias diferentes.
En el medio EMB no se produjo crecimiento de colonias.
En el medio MRS el número de unidades formadoras de colonias es de ,
en este se vieron colonias de pequeño tamaño con forma de coco en racimo, por lo
que podría tratarse de Lactococcus lactis o Pediococcus pentosaceus, según
información aportada por el fabricante.
En el medio VJ el número de unidades formadoras de colonias es de ,
las colonias observadas son de color negro y pequeño tamaño con forma de coco
en racimo, y catalasa +. Podría deducirse de que son bacterias de la especie
Staphylococcus epidermidis o Staphylococcus aureus.
En el medio KAA no se produjo crecimiento.
5.3 Caballa
18
Medios Recuento Morfología de las colonias Tinción
de Gram3
Prueba de
la catalasa
Medio
TSA --- ---
Medio
EMB
Colonias de pequeño
tamaño y negro. Con forma
bacilar
Gram - -
Medio
MRS
Colonia de pequeño
tamaño, de color
blanquecino. Con forma de
cocos en racimo
Gram +
Medio
VJ
Colonias de pequeño
tamaño, de color negro. Con
forma de cocos
Gram + +
Medio
KAA --- --- ---
Tabla 3: Recuento e identificación de las colonias de acedia fresca.
Tras realizar el recuento y tinción en la caballa fresca (tabla 3), en el medio
TSA se obtuvieron unidades formadoras de colonias.
En el medio EMB el número de unidades formadoras de colonias es de ,
las colonias en este era de pequeño tamaño de color negro, y catalasa -, se puede
deducir que te trata de la especie Enterobacter o Klebsiella, según la información
aportada por el fabricante.
En el medio MRS el número de unidades formadoras de colonias es de ,
las colonias observadas en este caso son pequeñas y blanquecinas, con forma de
cocos, se puede tratar de la especie Lactococcus lactis o Pediococcus pentosaceus.
3 Ver imagen Anexo.3
19
En el medio VJ se obtuvo unidades formadoras de colonias, las
colonias de pequeño de color negro, y catalasa +. Se deduce que podría tratarse de
la especie Staphylococcus aureus o Staphylococcus epidermidis, según la
información aportada por el fabricante.
En el medio KAA no se produjo crecimiento de colonias.
5.4 Merluza
Medios Recuento Morfología de las
colonias
Tinción
de Gram4
Prueba de
la catalasa
Medio
TSA
Colonias de gran tamaño,
de color un poco amarillo.
Con forma bacilar.
Gram -
Medio
EMB
Colonias pequeñas negras
con halo incoloro. Con
forma bacilar.
Gram + -
Colonias pequeñas de
color negro. Con forma
bacilar
Gram + +
Medio
MRS --- --- ---
Medio
VJ --- --- ---
4 Ver imagen Anexo.4
20
Medio
KAA --- --- ---
Tabla 4: Recuento e identificación de las colonias de merluza fresca.
En la merluza fresca, tras la realización del recuento y tinción (tabla 4) se vio,
que en el medio TSA el número de unidades formadoras es , las colonias
eran de gran tamaño y amarillentas, con forma bacilar. Según las características
podría ser Bacillus subtilis,
En el medio EMB el número de unidades formadoras de colonias es de ,
se observaron dos tipos de colonias, unas eran pequeñas negras con halo incoloro y
las otras pequeñas de color negro. Las primeras catalasa – y las otras catalasa +.
Según las características y la información aportada por el fabricante, podría tratarse
de la especie Enterobacter o Klebsiella.
En los medios VJ, MRS y KAA, no se produce crecimiento de colonias.
5.5 Boquerón
Medios Recuento Morfología
de las colonias
Tinción
de Gram5
Prueba de
la catalasa
Medio
TSA
Colonias de gran tamaño
blanquecinas. Con forma
bacilar
Gram -
Colonias pequeñas de color
anaranjado. Con forma de
cocos agrupados
Gram +
5 Ver imagen Anexo.5
21
Medio
EMB
Colonias pequeñas con gran
halo. Con forma bacilar
Gram - -
Colonias de pequeño
tamaño negras con halo
blanquecino. Con forma
bacilar
Gram + -
Medio
MRS --- --- ---
Medio
VJ ---
--- ---
Medio
KAA --- --- ---
Tabla 5: Recuento e identificación de las colonias de boquerón fresco.
En el boquerón fresco, tras el recuento y tinción (tabla 5) se obtuvo que en el
medio TSA el número de unidades formadoras de colonias es de , se
distinguieron dos tipos de colonias, unas de gran tamaño blanquecinas con forma
bacilar y otras de pequeño tamaño de color anaranjado y con forma de cocos
agrupados.
En el medio EMB el número de unidades formadoras de colonias es de
, también se distinguieron dos tipos de colonias, unas pequeñas con gran
halo incoloro, con forma bacilar y otras de pequeño tamaño de color negro con halo
blanquecino, también con forma bacilar. Las primeras catalasa – y las segundas
también. Se puede decir que las que especies son Enterobacter o Klebsiella, según
las características y la información dada por el fabricante.
En los medios MRS, VJ y KAA no se produjo crecimiento de colonias.
22
5.6 Sardina congelada
Medios Recuento Morfología de las colonias Tinción
de Gram6
Prueba de
la catalasa
Medio
TSA --- ---
Medio
EMB
Colonias pequeñas
incoloras. Con forma similar
a las enterobacterias
Gram - -
Colonias de pequeño
tamaño de color negro con
halo. Con forma de cocos
Gram + +
Medio
MRS --- --- ---
Medio
VJ
Colonias de pequeño
tamaño de color negro. Con
forma de cocos
Gram + -
Medio
KAA --- --- ---
Tabla 6: Recuento e identificación de las colonias de sardina congelada.
Una vez realizado el recuento y la tinción de la sardina congelada (tabla 6), se
puede ver en el medio TSA que el número de unidades formadoras de colonias es
de .
Mientras que en el medio EMB el número de unidades formadoras de colonias
es de , distinguiéndose en este dos tipos de colonia, unas de pequeño
tamaño e incoloras con forma bacilar, y las otras de pequeño tamaño también pero
6 Ver imagen Anexo.6
23
de color negro con halo y con forma de cocos. Las primeras son catalasa – mientras
que las otras son catalasa +. Se puede deducir que se trata de las especies
Enterobacter o Klebsiella
En el medio MRS en cambio no se produce crecimiento de colonias.
En el medio VJ el número de unidades formadoras de colonias es de ,
siendo estas de pequeño tamaño y de color negro con forma de cocos, y catalasa -.
Por lo que según las características se puede deducir de que se trata de la especie
Staphylococcus epidermidis o Staphylococcus aureus.
En el medio KAA no se produce crecimiento de colonias.
5.7 Acedia congelada
Medios Recuento Morfología de las colonias Tinción
de Gram7
Prueba de
la catalasa
Medio
TSA --- ---
Medio
EMB
Colonia de tamaño medio de
color grisáceo con halo
blanquecino. Con forma
bacilar.
Gram - +
Colonias pequeñas de color
negro Con forma bacilar
agrupadas.
Gram - -
Colonias pequeñas
incoloras. Forma bacilar. Gram- +
Medio
MRS --- --- ---
7 Ver imagen Anexo.7
24
Medio
VJ
Colonias pequeñas de color
negro. Con forma de cocos
en racimos
Gram + -
Medio
KAA
Colonias de gran tamaño de
color amarillento. Con forma
bacilar
Gram - -
Colonias grandes de color
blanquecino. Con forma de
cocos.
Gram + +
Colonias grandes que hacen
que el medio vire de color.
Con forma bacilar.
Gram - -
Tabla 7: Recuento e identificación de las colonias de acedia congelada.
En el caso de la acedia congelada, una vez se realiza el recuento y tinción
(tabla 7), se ve como en el medio TSA el número de unidades formadoras de
colonias es de .
En el medio EMB el número de unidades formadoras de colonias es de ,
en este se pudo diferenciar tres tipos de colonias diferentes unas de tamaño medio
de color grisáceo con halo transparente y forma bacilar, otras de pequeño tamaño
de color negro con forma bacilar, y por último, otras pequeñas incoloras. Siendo,
catalasa +, catalasa – y catalasa +, respectivamente. Según las características,
podría tratarse de las siguientes especies Enterobacter o Klebsiella.
En el medio MRS no se ha producido crecimiento de colonias
En el medio VJ el número de unidades formadoras de colonias es de
, siendo estas de color negro y pequeñas, con forma de cocos en racimo y
catalasa -. Según las características, podría tratarse de las siguientes especies
Staphylococcus epidermidis o Staphylococcus aureus
25
En el medio KAA el número de unidades formadoras de colonias es de
, pudiéndose diferenciar tres tipos de colonias unas de gran tamaño de
color amarillento con forma bacilar, otras de gran tamaño también pero de color
blanquecino con forma de cocos, y las ultimas de gran tamaño pero que hacen que
el medio vire de color, con forma bacilar. Siendo catalasa -, catalasa + y catalasa -,
respectivamente. Este medio es muy selectivo, y deberían de crecer estreptococos
Gram+. Según las características y la información aportada por el fabricante.
5.8 Caballa congelada
Medios Recuento Morfología de las colonias Tinción
de Gram8
Prueba de
la catalasa
Medio
TSA
Colonia de medio tamaño
que han producido un
cambio de color en el medio.
Con forma bacilar
Gram -
Colonias de gran tamaño de
color anaranjado. Con forma.
Con forma bacilar.
Gram +
Colonias pequeñas de color
blanquecino. Con forma de
coco agrupados.
Gram +
Medio
EMB
Colonias de pequeño tamaño
incoloras. Con forma bacilar Gram - -
8 Ver imagen Anexo.8
26
Colonias de pequeño tamaño
de color negro con halo
blanquecino. Con forma
bacilar
Gram + +
Medio
MRS --- --- ---
Medio
VJ
Colonias pequeñas de color
negro. Con forma de cocos
en racimo.
Gram + +
Medio
KAA --- --- ---
Tabla 8: Recuento e identificación de las colonias de caballa congelada.
Tras realizar el recuento y tinción de la caballa congelada (tabla 8) se ve como
en el medio TSA el número de unidades formadoras de colonias es de , en
este medio podemos distinguir tres tipos de colonias diferentes unas de medio
tamaño que hacen que el medio vire de color y con forma bacilar, otras de gran
tamaño de color anaranjado con forma bacilar y por último, otras pequeñas de color
blanco con forma de cocos agrupados.
En el medio EMB el número de unidades formadoras de colonias es de
, distinguiéndose dos tipos de colonias, unas de pequeño tamaño incoloras
con forma bacilar, y otras de pequeño tamaño de color negro con halo blanquecino y
con forma bacilar. Siendo la catalasa – y la catalasa +, respectivamente. Según las
características y la información aportada por el fabricante podría tratarse de la
siguiente especie Enterobacter o Klebsiella
En el medio MRS no se ha producido crecimiento de colonias.
En el medio VJ el número de unidades formadoras de colonias es de ,
siendo estas pequeñas de color negro, con forma de cocos en racimo. Siendo la
27
catalasa +. Según las características y la información aportada por el fabricante
podría tratarse de la siguiente especies Staphylococcus epidermidis o
Staphylococcus aureus
En el medio KAA no se ha producido crecimiento de colonias.
5.9 Merluza congelada
Medios Recuento Morfología de las colonias Tinción
de Gram9
Prueba de
la catalasa
Medio
TSA --- ---
Medio
EMB
Colonias muy pequeñas de
color claro. Con forma
bacilar.
Gram+ -
Colonias de medio tamaño
de color grisáceo con halo.
Con forma de cocos
agrupados
Gram- -
Medio
MRS --- --- ---
Medio
VJ
Colonias pequeñas de color
negro. Con forma de cocos Gram+ -
Medio
KAA
Colonias con bacterias que
hacen que el medio vire de
color. Con forma bacilar
Gram - -
Colonias de mayor tamaño
amarillentas. Con forma de
cocos
Gram+ +
9Ver imagen Anexo.9
28
Colonias de pequeño
tamaño anaranjadas. Con
forma similar a enterococos
Gram+ +
Tabla 9: Recuento e identificación de las colonias de merluza congelada.
Una vez se ha realizado el recuento y tinción en la merluza congelada (tabla
9), se puede ver como en el medio TSA el número de unidades formadoras de
colonias es de .
En el medio EMB el número de unidades formadoras de colonias es de
, se puede diferenciar dos tipos de colonias, unas muy pequeñas de color
claro con forma similar a las enterobacterias y otras de medio tamaño de color
grisáceo con halo y con forma de cocos agrupados. Ambos tipos de colonias son
catalasa-. Según las características podría tratarse de la siguiente especie
Enterobacter o Klebsiella
En el medio MRS no se ha producido crecimiento de colonias.
En el medio VJ el número de unidades formadoras de colonias es de
siendo estas pequeñas y de color negro, con forma bacilar. La catalasa de esta
colonia es -. En este medio deben crecer estafilococos Gram+, según las
características podría tratarse de la especie.
En el medio KAA se pueden distinguir tres tipos de colonias una de ellas, con
bacterias que hacen que el medio vire de color y con forma bacilar, otra de mayor
tamaño de color amarillento con forma bacilar y por último, colonias de pequeño
tamaño anaranjadas, con forma similar a los enterococos. La prueba de la catalasa
es, catalasa -, catalasa- y catalasa +, para cada tipo de colonia, respectivamente.
Este medio es muy selectivo, y deberían de crecer estreptococos Gram+, según las
características podría tratarse de las especies.
5.10 Boquerón congelado
29
Medios Recuento Morfología de las
colonias
Tinción de
Gram10
Prueba de
la catalasa
Medio
TSA
Colonias grandes
anaranjadas. Con forma
bacilar
Gram-
Colonias pequeñas de
color blanco. Con forma
bacilar
Gram+
Medio
EMB
Colonias pequeñas
incoloras. Con forma
bacilar
Gram- -
Colonias pequeñas
negras con halo. Con
forma bacilar
Gram- -
Colonias pequeñas
negras. Con forma bacilar Gram+ -
Medio
MRS --- --- ---
Medio
VJ --- --- ---
Medio
KAA --- --- ---
Tabla 10: Recuento e identificación de las colonias de boquerón congelado.
10
Ver imagen Anexo.10
30
Por último, al realizar el recuento y la tinción en el boquerón congelado (tabla
10), se ve que en el medio TSA el número de unidades formadoras de colonias es
de , pudiéndose diferenciar en este medio, dos tipos de colonias, unas
grandes anaranjadas con forma bacilar, y las otras pequeñas y de color blanco con
forma bacilar también.
En el medio EMB el número de unidades formadoras de colonias es
de , se distinguen tres tipos de colonias diferentes, una de ellas son
pequeñas e incoloras con forma bacilar, otras pequeñas de color negro con halo y
con forma bacilar, por último, otras son pequeñas de color negro y con forma bacilar.
Siendo todas catalasa -. Según las características podría tratarse de las especies
Enterobacter, Klebsiella o Escherichia coli.
En los medios MRS, VJ y KAA no se produjo crecimiento de colonias.
Comparativa de resultados
Si comparamos los resultados obtenidos mediante graficas de cada variedad
de pescado, es decir, el producto fresco frente a este mismo pero sometido a
ultracongelación, se puede deducir que:
o Sardina fresca- sardina congelada
Figura1: Gráfica resultados sardina fresca vs sardina congelada
31
Como se puede observar en la figura 1, tras realizar el recuento de colonias,
en el medio TSA el número de colonias no cambia tras la congelación y se
encuentra cercano al límite establecido. En el medio EMB se produce un aumento
del número de colonias, aunque este es pequeño, ya que de 103 en la sardina fresca
aumenta a 104 tras la congelación, como consecuencia, tras la congelación se
superaría los niveles establecidos de enterobacterias totales. En el caso de medio
VJ se produce lo contrario que en el caso anterior, es decir de 103 en la sardina
fresca disminuye a 102, aunque la disminución no es muy grande se podría decir que
en este algunas de las especies han detenido su crecimiento.
o Acedia fresca- acedia congelada
Figura 2: Gráfica resultados acedia fresca vs acedia congelada
Como se puede observar en la figura 2, en el medio TSA tras realizar el
recuento de colonias se obtiene un crecimiento en número de colonias tras la
congelación, de 104 aumenta a 105, esto mismo ocurre con las colonias del medio
VJ, ya que de 103 aumenta a 104. En cambio, las colonias del medio MRS no crecen
tras la congelación. Por el contrario, las colonias del medio EMB crecen tras la
congelación, pero no se encontraban en la acedia fresca, este mismo caso ocurre
con las colonias del medio KAA, ya que solo se encuentran en la acedia congelada.
o Caballa fresca- caballa congelada
32
Figura 3: Gráfica resultados caballa fresca vs caballa congelada
Una vez realizado el recuento de colonias en los distintos medios de la
caballa, figura 3, se puede ver en el medio TSA como se produce un aumento del
número de estas después de la congelación, es decir de 104 aumentaría a 106. En el
medio EMB no se produce variación en el número de colonias. Por otro lado, en el
medio MRS las colonias tras la congelación desaparecen. Por último, en el medio VJ
se ve un pequeño aumento en el número de colonias, pasando de 102 a 103.
o Merluza fresca-merluza congelada
Figura 4: Gráfica resultados merluza fresca vs caballa congelada
33
En el caso de la merluza, figura 4, el recuento de colonias en el medio TSA se
produce una disminución de una unidad logarítmica, de 107 a 106. En el caso de las
colonias del medio EMB no crecen ni mueren, el número se mantiene. En cambio, tras la
congelación aparecen nuevas colonias de los medios VJ y KAA, que anteriormente no
se encontraban.
o Boquerón fresco- boquerón congelado
Figura 5: Gráfica resultados boquerón fresco vs boquerón congelado
En último caso, tras realizar el recuento de colonias en los medios del
boquerón, figura 5, se puede ver como en el medio TSA se produce una
disminución en el número de colonias de una unidad logarítmica, de 106 a 105, en
cambio, en el medio EMB se produce un aumento de 103 a 104.
6. DISCUSIÓN
Según la Orden del 2 de agosto de 1991 por la que se aprueban las normas
microbiológicas de los diferentes productos de pesca y acuicultura por grupos, para
el pescado fresco, refrigerado o congelado, establece que el recuento de colonias
aerobias mesófilas debe ser como máximo de /g, mientras que el de
enterobacteriae totales tiene que ser de /g, y el de salmonella- sighella tiene
que ser de 0.
34
Según la FAO, donde recoge el plan de muestreo y los limites microbiológicos
recomendados para los productos pesqueros. En el pescado fresco y congelado el
límite por gramo de APC (recuento de aerobios en placa), es de 5x105 hasta 107.
(Huss, 1997)
Por lo que, una vez conocidos algunos de los limites microbiológicos, se puede
iniciar con la discusión.
Como se puede observar, el recuento de mesófilos totales, cumple con los
límites establecidos según la FAO, ya que los valores se encuentran entre 104 - 107.
Sin embargo, según la orden del 2 de agosto de 1991, la merluza fresca que es el
producto donde la carga microbiana es de 107, se encontraría contaminada. Mientras
que la mayor diferencia se encuentra en la caballa, donde se produce un aumento
del número de colonias, es decir de 104 en la caballa fresca pasamos a 106 en la
caballa congelada, pudiéndose deber a una contaminación del producto, previa a la
congelación, debido a que en los demás productos de pesca el numero de colonias
se mantiene tras la congelación o incluso disminuye, a excepción de la acedia que
sufre un aumento de una unidad logarítmica.
En cuanto a los valores de enterobacterias, se encuentran entre 103 y 104, por
lo que en algunos casos se superan los niveles establecidos. Cabe destacar la
acedia ya que crecen tras la congelación, pero no se encontraban en la acedia
fresca, por lo que podría deberse a una contaminación previa a la congelación
debida a una mala manipulación. En el caso del boquerón y la sardina, lo que ocurre
es que se produce un crecimiento de las colonias tras la congelación, lo que podría
indicar que no se ha producido una parada del crecimiento de microorganismos,
como consecuencia, tras la congelación se superaría los niveles establecidos de
enterobacterias totales, según la orden del 2 de agosto de 1991.
Para los estafilococos, los valores son de 102 a 104, destacando el caso de la
merluza que tras la congelación aparecen nuevas colonias que anteriormente no se
encontraban, pudiéndose deber a una contaminación previa a la congelación.
También hay que destacar la acedia y la cabella, ya que se produce un aumento del
número de colonias tras la congelación.
35
En el caso de las bacterias lácticas, los valores son de 102, este caso no se
trata de una contaminación perjudicial, ya que se tratan de bacterias benignas. Cabe
destacar su presencia solo en la acedia y la caballa fresca, pero tras la congelación
mueren.
Por último, con respecto a los estreptococos los valores son de 104 y 105,
destacando que solo se encuentran estas colonias en la acedia y la merluza
congelada, y no en la fresca. Por lo que debido a la elevada carga microbiana que
presentan y además, tratándose de especies que crecen en un medio muy selectivo
podría decirse que se ha debido a una contaminación del alimento.
7. CONCLUSIONES
Las conclusiones que se pueden sacar de los recuentos microbiológicos
observados de los diferentes productos de pesca serian:
1) Cabe destacar que los mesófilos totales en todos los productos se
encuentran dentro de los límites establecidos por la FAO y por la orden de
2 de agosto de 1991, a excepción de la merluza fresca que pasaría los
limites que establece la orden del 2 de agosto de 1991. Siendo por tanto el
producto que mayor carga microbiana presenta.
2) Los estreptococos solo crecen en la acedia congelada y en la merluza
congelada, además con valores elevados, lo que podría suponer una
contaminación de los productos al tratarse de un medio selectivo.
3) Con respecto a las enterobacterias, mencionar que en la merluza fresca y
congelada, en la sardina congelada y en el boquerón congelado, se
superan los límites establecidos, según la orden del 2 de agosto de 1991.
4) Hay que destacar la presencia de bacterias lácticas, en acedia y caballa
fresca, estando estas presentes sobretodo en alimentos lácteos y
fermentados. Lo que nos puede indicar una contaminación de los
productos.
5) Por último destacar, que el valor más elevado de estafilococos se
encuentra en la acedia congelada, aumentado su valor tras la
congelación.
36
8. REFERENCIAS BIBLIOGRAFICAS
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Anexo: Normativa consultada
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se aprueba las normas microbiológicas, los limites de contenido en metales
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Parlamento Europeo y del consejo de 29 de abril de 2004 por el que se
establecen normas especificas de higiene de los alimentos de origen animal.
39
9. ANEXOS
Anexo.1: Sardina
Medio TSA
Colonias de color anaranjado y blanquecino, de pequeño tamaño
Con forma bacilar Gram-
Con forma de cocos Gram+
Medio EMB
Colonias con halo y de color negro
Con forma bacilar Gram-
Con forma bacilar Gram+
Medio VJ
Colonia de color negro Con forma de cocos Gram+
Anexo.2: Acedia
Medio TSA
40
Colonias de color anaranjado y otras de tipo mucoso, de pequeño y gran tamaño
Con forma bacilar Gram-
Con forma de cocos Gram+
Medio MRS
Colonia de pequeño tamaño Forma de cocos en racimo Gram+
Medio VJ
Colonia de color negro y pequeño tamaño
Con forma de cocos en racimo Gram+
Anexo.3: Caballa
Medio TSA Medio EMB
Con forma bacilar
Gram-
41
Medio MRS
Colonia de color blanquecino y
pequeño tamaño
Con forma de cocos en racimo
Gram+
Medio VJ
Colonia de color negro y pequeño
tamaño
Con forma de cocos
Gram+
Anexo.4: Merluza
Medio TSA
Colonia de color un poco amarillo y
gran tamaño
Con forma bacilar
Gram-
42
Medio EMB
Colonias de color negro
con halo y pequeñas de
color negro sin halo
Con forma bacilar
Gram+
Con forma bacilar
Gram+
Anexo.5: Boquerón
Medio TSA
Colonias de color
blanquecino y anaranjado,
de gran tamaño y otras
pequeñas
Con forma bacilar
Gram-
Con forma de cocos
Gram+
Medio EMB
Colonia de color negras
con gran halo y otras
negras con halo más
pequeño
Con forma bacilar
Gram-
Con forma bacilar
Gram+
43
Anexo.6: Sardina congelada
Medio TSA
Medio EMB
Colonia pequeñas
incoloras y otras de color
negro con halo
Con forma bacilar
Gram-
Con forma de cocos
Gram+
Medio VJ
Con forma de cocos. Gram+
44
Anexo.7: Acedia congelada
Medio TSA
Medio EMB
Colonias de color
grisáceo con halo,
otras de color negro
y otras incoloras
Con forma bacilar
Gram-
Con forma bacilar
Gram-
Con forma bacilar
Gram-
Medio VJ
Colonia de color negro y pequeño
tamaño
Con forma de cocos en racimo
Gram+
Medio KAA
Colonias de color
amarillento, de color
blanquecino y otras
de gran tamaño que
hacen que el medio
vire de color
Con forma bacilar
Gram-
Con forma de
cocos
Gram+
Con forma bacilar
Gram-
45
Anexo.8: Caballa congelada
Medio TSA
Colonia que han
provocado una
variación del
color del medio ,
otras de color
anaranjado y
otras de color
blanquecino
Con forma bacilar
Gram-
Con forma bacilar
Gram+
Con forma de
cocos agrupados
Gram+
Medio EMB
Colonia de color negro y
negras con halo
Con forma bacilar y
Gram-
Con forma bacilar y
Gram+
Medio VJ
Colonia de color negro de pequeño
tamaño Con forma de cocos , Gram+
46
Anexo.9: Merluza congelada
Medio TSA
Medio EMB
Colonias de color
claro y otras grisáceo
con halo
Con forma bacilar
Gram+ Con forma de cocos agrupados, Gram-
Medio VJ
Colonias de color negro y pequeñas Con forma de cocos, Gram+
47
Medio KAA
Colonias que
hacen que el
medio vire de
color y otras
amarillentas
Con forma bacilar
Gram-
Con forma de cocos
Gram+
Con forma de cocos
Gram+
Anexo.10: Boquerón congelado
Medio TSA
Colonias de color
anaranjado y otras
de color blanco
Con forma bacilar, Gram- Con forma bacilar, Gram+
Medio EMB
Colonias incoloras y
otras negras con
halo.
Con forma bacilar,
Gram-
Con forma bacilar.
Gram-
Con forma bacilar
Gram+
