Embed Size (px)
Citation preview
1
OKVIR OCENJEVANJA TEŽAVNOSTI
DIREKTIVA 2010/63/EU O ZAŠČITI ŽIVALI, KI SE UPORABLJAJO V ZNANSTVENE NAMENE
Skrb za živali,usmerjenost k napredku v znanosti
© N
ovo
Nor
disk
Okolje
Kazalo
Delovni dokument o okviru ocenjevanja težavnosti .......................................... 1-19
Primeri za ponazoritev postopka razvrstitve po težavnosti, ............................ 20-72
vsakodnevnega ocenjevanja in ocenjevanja dejanske težavnosti
1
Nacionalni pristojni organi za izvajanje Direktive 2010/63/EU o zaščiti
živali, ki se uporabljajo v znanstvene namene
Delovni dokument o okviru ocenjevanja težavnosti
Bruselj, 11. in 12. julija 2012
Komisija je ustanovila strokovno delovno skupino za oceno težavnosti postopkov, da bi
olajšala izvajanje Direktive 2010/63/EU o zaščiti živali, ki se uporabljajo v znanstvene
namene. Vse države članice in organizacije glavnih deležnikov so bile pozvane k imenovanju
strokovnjakov, ki bodo sodelovali pri tem delu.
Strokovna delovna skupina za oceno težavnosti se je sestala dvakrat, in sicer decembra 2011,
ko se je osredotočila na gensko spremenjene živali, in maja 2012, ko je razpravljala o
splošnem okviru za ocenjevanje dejanske težavnosti, ki jo občutijo živali med postopki.
Ta dokument je rezultat dela dveh sestankov strokovne delovne skupine, razprav z državami
članicami ter prispevka Komisije na pravnem področju v povezavi z razumevanjem okvira
ocenjevanja težavnosti, njegovih komponent, udeležencev ter delovnih orodij in metod.
Nacionalni pristojni organi za izvajanje Direktive 2010/63/EU so ta dokument podprli na
sestanku 11. in 12. julija 2012.
Izjava o omejitvi odgovornosti:
Besedilo v nadaljevanju naj bi bilo navodilo, ki naj bi državam članicam in drugim, ki
jih zadeva ta direktiva, pomagalo doseči skupno razumevanje določb v Direktivi. Vse
pripombe je treba upoštevati v okviru Direktive 2010/63/EU o zaščiti živali, ki se
uporabljajo v znanstvene namene.
Le Sodišče Evropske unije ima pravico pravno zavezujoče razlagati pravo EU.
2
Kazalo vsebine:
Relevantni členi Direktive 2010/63/EU .................................................................................................. 3
Splošno ozadje ........................................................................................................................................ 3
Splošni razmisleki za oceno težavnosti ................................................................................................... 4
Razmisleki pred študijo ........................................................................................................................... 5
Kazalniki težavnosti ................................................................................................................................ 6
Glavne kategorije ................................................................................................................................ 6
Dejavniki, ki jih je treba upoštevati v oceni dejanske težavnosti ....................................................... 7
Kako zagotoviti skladnost pri ocenjevanju dejanske težavnosti in razvrščanju po dejanski težavnosti? 9
Priprava posebnega ocenjevalnega lista za postopek .......................................................................... 9
Skladnost pri ocenjevanju dejanske težavnosti ................................................................................. 10
Kdo mora sodelovati pri oceni dejanske težavnosti? ............................................................................ 11
Orodja za spremljanje, mediji in drugi razmisleki ................................................................................ 11
Priloga I ................................................................................................................................................. 13
Glosar kliničnih opažanj ....................................................................................................................... 13
Priloga II ............................................................................................................................................... 16
Osnovna strokovna literatura, smernice in spletni viri o ocenjevanju dobrobiti živali med izvajanjem
znanstvenih postopkov .......................................................................................................................... 16
3
Relevantni členi Direktive 2010/63/EU
Člen 4(3): „Države članice zagotovijo izboljšanje vzreje, nastanitve in oskrbe ter
izboljšanje metod uporabljenih v postopkih, tako da se morebitne bolečine, trpljenje,
stiske ali trajne poškodbe, povzročene živalim, odstranijo ali zmanjšajo na minimum.“
Člen 15(1): „Države članice zagotovijo, da se vsi postopki razvrstijo kot
„nepovratni“, „blag“, „zmeren“ ali „težaven“ za vsak primer posebej na podlagi meril
za razvrščanje iz Priloge VIII.“
Člen 16(1)(d): „to [ponovna uporaba] je v skladu z veterinarskim mnenjem, ki
upošteva življenjske izkušnje živali.“
Člen 54(2): „Države članice letno zberejo in javno objavijo statistične podatke o
uporabi živali v postopkih, vključno s podatki o dejanski težavnosti postopkov ter o
izvoru in živalskih vrstah primatov razen človeka, ki se uporabljajo v postopkih. …“
Splošno ozadje
Direktiva 2010/63/EU o zaščiti živali, ki se uporabljajo v znanstvene namene, določa, da se
opravi prospektivna ocena projekta na podlagi težavnosti vsakega postopka (člen 15) in da se
opravi razvrstitev po težavnosti, ki je lahko „nepovratna“, „blaga“, „zmerna“ ali „težavna“. V
Prilogi VIII so napotki glede dejavnikov, ki jih je treba upoštevati glede prospektivne
težavnosti, in navedeni nekateri primeri za vsako posamezno kategorijo težavnosti.
Člen 54 o poročanju določa, da je treba v okviru statističnih podatkov poročati o dejanski
težavnosti bolečin, trpljenja, stiske ali trajnih poškodb, ki jih je žival občutila (v nasprotju s
prospektivno oceno ali napovedjo težavnosti, izdelano v času ocene projekta). Poleg tega je
dejanska težavnost vseh prejšnjih postopkov ključna pri določanju, ali je mogoče žival
ponovno uporabiti v nadaljnjih postopkih ali ne (člen 16).
Ti ukrepi omogočajo izboljšanje kakovosti znanosti in dobrobiti s predhodnim pregledom
predlogov projekta in bi morali z vključitvijo dejanskega trpljenja, ki ga občuti žival,
povečati preglednost in razumevanje učinka znanstvenih postopkov na dobrobit živali.
Glavne prednosti prospektivne ocene, spremljanja, ocenjevanja in evidentiranja
dejanske težavnosti obsegajo:
predvsem možnosti za izboljšanje in zmanjšanje trpljenja, čeprav bodo tudi
prospektivne razprave na splošno omogočile proučitev, ali je potrebna uporaba živali
ali ne (zamenjava) in ali je zasnova študije ustrezna za zmanjšanje uporabe živali
(zmanjšanje);
izboljšano dobrobit živali, na primer z zgodnejšim prepoznavanjem in lajšanjem
trpljenja;
izboljšano preglednost, saj naj bi statistični podatki bolje odražali dejanske stroške za
dobrobit živali;
4
izboljšano komunikacijo med osebami, odgovornimi za uporabo, oskrbo in
spremljanje živali;
podatke za retrospektivno oceno projekta, ko se ta izvaja (člen 39);
izboljšano kakovost znanstvenih podatkov zaradi boljše dobrobiti;
povečanje znanja o ocenjevanju težavnosti in kliničnih znakov, kar bo spodbudilo
večjo skladnost ocen, pod pogojem, da se pristopi in rezultati posredujejo na primer v
revijah, skupinah za razprave in na sestankih;
podatke za programe usposabljanja raziskovalcev, zootehnikov in veterinarjev za
laboratorijske živali, če se rezultati uporabijo za primere;
informacije na podlagi dokazov, ki se lahko uporabijo pri prospektivnah ocenah škode
in koristi za podobne prihodnje projekte.
Splošni razmisleki za oceno težavnosti
Proučevanje težavnosti v okviru postopka mora biti neprekinjen postopek, ki se začne z
začetnim načrtovanjem študije, nadaljuje z za študijo specifičnim vsakodnevnim
spremljanjem živali med projektom in konča z oceno „dejanske“ težavnosti ob dokončanju
študije, kar omogoča določitev nadaljnjih izboljšav za prihodnje študije.
OCENA TEŽAVNOSTI – NEPREKINJEN POSTOPEK
Priloga IIReferenčno gradivo
za ocenjevanjein točkovanje
NAČRTOVANJE PROJEKTA
Priloga IGlavne kategorije
kot podlaga za pripravoprojekta in posebnihlistov za točkovanje
Ocena in točkovanjedejanske težavnosti
MED PROJEKTOM
Statistične informacije
Retrospektivna ocena
projekta
Priloga IIReferenčno gradivo za
pripravoprojekta in posebnihlistov za točkovanje
Primer(i) posebne ocene težavnosti za projekt/postopek, vključno z listi za vsakodnevno ocenjevanje, orodji za točkovanje, izbiro metod spremljanja in končno oceno.
Dobra komunikacijamed vsemi
vključenimi osebami
Skladnost opažanj/usposobljenega osebja
Dogovor o ukrepanjuob opaženih
znakih bolečine,stiske ali trpljenja
Pripravaposebne
ocene težavnostiza projekt, vrsto
in sev
PO PROJEKTUanaliza in
povratne informacije
Povratne informacije
za prihodnje študije
Zagotovitev, da jev postopek vključeno
osebje z vsemipotrebnimi spretnostmi
Določitev orodij za spremljanje, pogostosti,
vrste točkovanja
Učinkovito vsakodnevnospremljanje
Vključitev podatkovv tematske preglede
Po potrebistalno pregledovanje
protokola za ocenjevanje
Razmislek o nadaljnjihmožnostih za
izvajanje treh R
5
S takšnim pristopom je več možnosti za upoštevanje in izvajanje načela 3R (zamenjava,
zmanjšanje in izboljšanje) ves čas postopka, izboljšanje komunikacije med vsemi vključenimi
osebami ter krepitev skladnosti.
Za učinkovito oceno težavnosti so potrebni:
• „ekipni“ pristop, pri katerem sodelujejo ljudje z različnim strokovnim
znanjem, izkušnjami in prednostnimi nalogami, kot so na primer raziskovalci,
zootehniki in osebje za oskrbo, lečeči veterinar;
• dobro načrtovanje;
• ustrezno nadaljnje izobraževanje in usposabljanje vsega vključenega osebja;
• sistemi za vsakodnevno ocenjevanje težavnosti, ki so ustrezno prilagojeni vrsti,
liniji in projektu ter obsegajo na podlagi zanesljivih podatkov pripravljeno in
strukturirano opazovanje živali v ustreznih časovnih presledkih (na primer bolj
pogosto med postopki in po njih);
• na podlagi zanesljivih podatkov izdelani in učinkoviti protokoli za ocenjevanje
vedenja in kliničnih znakov;
• analiza opažanj, da se o naravi in stopnji trpljenja presodi na podlagi
zanesljivih podatkov;
• ozaveščenost o težavnosti posameznega postopka in o potrebnem ukrepanju, če
se težavnost doseže ali preseže;
• skladen pristop k splošnemu presojanju dejanskega trpljenja (blago, zmerno,
težavno) za statistično poročanje;
• razmislek o tem, kako učinkovito je bilo izvedeno načelo 3R in ali so možne
izboljšave za prihodnje študije.
Razmisleki pred študijo
Postopek za zmanjšanje težavnosti med znanstvenimi postopki se začne na stopnji
načrtovanja, ko se proučuje, ali je uporaba živih živali potrebna in utemeljena za doseganje
znanstvenih ciljev ali ne.
Če je uporaba živih živali potrebna in utemeljena, je pomembno, da se izbere ustrezen
model in da je zasnova študije trdna.
Določiti je treba vse vidike študije, ki lahko povzročijo bolečine, trpljenje, stisko ali
trajne poškodbe, in proučiti je treba možnosti za zmanjšanje njihovih učinkov, na
primer s pregledom literature, posvetom s kolegi, zootehniki, veterinarjem in
Komisijo za dobrobit živali, če je to ustrezno.
Priporočena prospektivna razvrstitev postopkov po težavnosti mora temeljiti na
najvišji predvideni stopnji težavnosti za katero koli žival v študiji.
Pripraviti je treba načrt opazovanja živali, ki ustreza študiji in ji je prilagojen. Enotna
terminologija, ki jo razumejo vse osebe, vključene v študijo, izboljša skladnost
poročanja in razlag.
Zagotoviti je treba, da je za izvajanje študije ter spremljanje in oskrbo živali na voljo
dovolj izobraženega in usposobljenega osebja.
6
Kazalniki težavnosti
Obstajajo vedenja in klinični znaki, ki se lahko uporabijo za oceno težavnosti postopkov v
„kletki“ (ali bazenu, obori itd.). Terminologija za njihovo opisovanje mora biti razumljiva
vsem, ki so vključeni v uporabo, spremljanje in oskrbo živali. Za vsak sistem ocenjevanja
težavnosti je bistveno dobro razumevanje normalnega stanja zdravja, vedenja in dobrobiti
opazovane vrste (po potrebi linije).
Cilj mora biti:
doseganje najboljše možne kakovosti življenja živali;
zagotavljanje prepoznavanja kakršnega koli trpljenja zaradi znanstvenih postopkov in
zmanjšanja takšnega trpljenja, vendar
ob ohranitvi skladnosti z znanstvenimi cilji.
Vsak sistem ocenjevanja mora učinkovito zaznati odstopanje od normalnega stanja zdravja in
dobrobiti ter opazovalcu omogočati evidentiranje in posredovanje jasne, skladne ocene
posamezne živali.
Za opredelitev protokola za ocenjevanje težavnosti, ki je ustrezno prilagojen vrsti, liniji,
posameznim živalim in postopku, se lahko uporabi preprost, hierarhičen pristop. V postopku
priprave protokola za ocenjevanje v kletki je treba opredeliti vse škodljive učinke, do katerih
lahko pride kadar koli v življenjskih izkušnjah živali, tudi med nastanitvijo, rejo, oskrbo in
ravnanjem, ter škodljive učinke zaradi znanstvenih postopkov in njihovih posledic. S
proučitvijo vseh teh škodljivih učinkov je treba določiti kazalnike, ki se lahko uporabijo za
učinkovito oceno dobrobiti živali v kletki. Ti kazalniki morajo biti prilagojeni vrsti, liniji in
uporabljenim poskusom. Prav tako morajo biti lahko razumljivi in določljivi ter jih je mogoče
dosledno evidentirati. Vendar je pomembno, da obstaja tudi možnost za zajem in
evidentiranje vseh nepričakovanih škodljivih učinkov, na primer v polju za poljubno
besedilo.
Glavne kategorije
Spodaj je kot izhodišče za izdelavo celovitega seznama posebnih kazalnikov za vsak
postopek ali program oskrbe živali naveden sklop krovnih, „glavnih“ kategorij, ki se
uporabljajo za vse vrste. Cilj je izdelava za študijo specifičnega seznama zadostnega števila
kazalnikov, da se zmanjša tveganje neodkritih znakov trpljenja brez določitve prezapletenega
sistema, ki bi bil po nepotrebnem birokratski in zamuden.
Glavne kategorije so:
videz;
telesne funkcije;
okolje;
vedenje;
posebni kazalniki postopka;
7
poljubna opažanja (druga ustrezna opažanja).
Kazalnike znotraj vsake od teh kategorij je mogoče prilagoditi kateri koli vrsti. Uporabiti jih
je treba za izdelavo seznama značilnosti, ki jih je mogoče opazovati in ki jih ustrezno
usposobljen posameznik lahko oceni, da se presodi splošni status zdravja in dobrobiti živali.
O teh kazalnikih je treba razpravljati in jih izbrati skupaj z odgovornimi osebami za nadzor
dobrobiti živali in po potrebi s Komisijo za dobrobit živali. Potem jih je treba uporabiti pri
pripravi za študijo specifičnih sistemov vodenja evidenc na nivoju kletk, namenjenih za
vsakodnevno opazovanje, spremljanje in ocenjevanje. V Prilogi I je prikazano, kako je
mogoče te glavne kategorije podrobneje razčleniti in uporabiti za razvoj ustreznih
opazovalnih meril z uporabo skupne opisne terminologije.
V Prilogi II so informacije o smernicah in spletnih virih, ki so lahko v pomoč pri pripravi
ustreznih ocen dobrobiti živali med izvajanjem znanstvenih postopkov.
Dejavniki, ki jih je treba upoštevati v oceni dejanske težavnosti
Poudariti je treba, da lahko glede na posebne razmere številni elementi pozitivno ali
negativno vplivajo na težavnost in da je treba upoštevati razlike med vrstami živali.
Dejansko težavnost je treba oceniti posamezno, za vsak primer posebej in pri tem uporabiti
opažanja med vsakodnevnim spremljanjem živali. Uporabijo se lahko tudi dodatni parametri,
potrebni za namene študije, če je to ustrezno in so ti parametri na voljo. Za študijo so lahko
na primer potrebni tudi kazalniki, ki jih ni mogoče opazovati (kot so telesna temperatura,
telesna teža, biokemični parametri ali podatki biotelemetrije, kot je srčni utrip), v oceni
težavnosti pa jih je treba upoštevati, če lahko zagotovijo dodatne ustrezne informacije.
Dejanska težavnost, o kateri je treba poročati za posamezno žival, mora biti najvišja stopnja
težavnosti, ki jo žival občuti med postopkom, in ne sme temeljiti na težavnosti na koncu
postopka. Prav tako se ne sme šteti, da je ocena preprost postopek seštevanja, na primer več
blagih postopkov = zmerna težavnost. Ocena mora temeljiti na celotni oceni vseh izkušenj
živali od začetka do konca postopka.
Spodnji seznam vsebuje primere elementov, ki se upoštevajo in presojajo pri ocenjevanju
dejanske težavnosti.
Postopek, tehnika
Kirurški/nekirurški;
stopnja in trajanje omejitve premikanja;
neuporaba analgezije/anestezije, ko bi bila sicer potrebna ena od njiju ali obe;
nov model ali postopek;
okoljski elementi (vključno z nastanitvijo in omejevanjem hrane/vode);
stres/stiska;
ponavljajoči se postopki in časovni presledki med njimi (upoštevati je treba tudi
pogostost in kombinacijo posegov „pod pragom“);
8
ponovna ali stalna uporaba.
Vrsta, linija, razvojna stopnja, predhodne izkušnje
Upoštevati je treba predvsem to, da je za učinkovito predvidevanje in
ocenjevanje težavnosti nujno treba razumeti biologijo in vedenje vrste in linije
(ter včasih posamezne živali);
vrsta in linija;
izvor živali, na primer vzrejena za namene raziskav, prostoživeča ali divja ;
vir živali (vključno s predhodnimi bivalnimi razmerami) in prevoz;
genotip, fenotip, spol, starost, imunsko stanje;
naravno vedenje in biologija (na primer relativen pomen različnih čutil, kot je vid za
primate in voh za glodavce, in kakšen je lahko učinek nanje v laboratorijskem okolju);
posamezna/skupinska nastanitev – utemeljitev posamezne nastanitve družabnih živali
ali kratkotrajne ali dolgotrajne ločitve od oblikovanih skupin;
dnevni ritmi, na primer učinek izvajanja znanstvenih postopkov ali postopkov reje na
nočnih živalih med svetlim delom dneva;
ločitev od matere pri vseh vrstah, tudi glodavcih;
miselne sposobnosti, zavedanje, spomin, dojemanje učinkov postopkov.
Pogostost, intenzivnost
Pogostost in težavnost nista neposredno povezani, tj. ni nujno, da večja pogostost
povzroči večjo težavnost. To je zato, ker je učinek ponavljajočih se postopkov ali
tehnik na težavnost odvisen od številnih dejavnikov, kot so intenzivnost posameznega
posega, trajanje posega, vrsta in izkušnje posamezne živali;
če se posegi ponavljajo, obstaja možnost prilagoditve, kar lahko zmanjša težavnost, na
primer pri primatu razen človeka med izvajanjem blagih postopkov. Nasprotno lahko
ponavljanje poveča težavnost, na primer zaradi pričakovanja stresnega postopka ali
nastopa hiperalgezije v primeru operacije;
možnost za učenje s pozitivnim utrjevanjem ali „nagrajevanje“ po postopkih;
namesto „povratne stopnje“ težavnosti je treba evidentirati najvišjo stopnjo težavnosti.
Trajanje učinka
Trajanje je povezano z intenzivnostjo (in zato s težavnostjo);
vprašanje, ali je mogoče uporabiti zgodnje humane ali znanstvene končne točke.
Učinkovitost izboljšav
Ustrezna analgezija, anestezija in pooperacijska oskrba;
obogatitev – tako obogatitev okolja kot skupinska nastanitev družabnih živali;
9
pogoji nastanitve, reje in oskrbe – ali je mogoče izboljšati te pogoje v skladu s
sedanjimi najboljšimi praksami ali pa so za postopek potrebne omejitve, kot so
omejitev v manjših ogradah (na primer presnovne kletke), tla iz rešetk ali
izpostavljenost okoljskim pogojem, ki bi lahko povzročili stres;
navajanje živali na sodelovanje ali olajšanje privajanja postopkom;
učinkovitost protokolov za ocenjevanje v kletki.
Kumulativna težavnost
V okviru postopka, ki vključuje več korakov/posegov, je treba upoštevati vse
življenjske izkušnje posamezne živali, pri čemer omejitve sposobnosti za izboljšanje
nastanitve ali potreba po pogostem ulovu, ravnanju in omejevanju premikanja itd.
lahko vpliva na težavnost;
predhodni postopki v primeru ponovne uporabe;
pri proučevanju ponovne uporabe je treba upoštevati življenjske izkušnje, vključno z
elementi, kot sta pridobivanje (na primer zgodnja „odstavitev“) in prevoz.
Kako zagotoviti skladnost pri ocenjevanju dejanske težavnosti in razvrščanju po
dejanski težavnosti?
Na splošno je na stopnji načrtovanja študije potrebno sodelovanje ustreznih znanstvenikov,
zootehnikov, veterinarjev in osebja za oskrbo, da se zagotovijo primerni podatki, na podlagi
katerih je mogoče sprejeti odločitev o dejanski težavnosti na koncu postopka. Končna
razvrstitev v kategorijo dejanske težavnosti je rezultat analize evidenc opazovanja vedenja,
kliničnih znakov in drugih ustreznih parametrov v kletki.
Elementi, ki prispevajo k skladnosti, obsegajo:
– vključitev strokovnega znanja, izkušenj in prednostnih nalog z več področij – „ekipni
pristop“;
– usposabljanje za uporabo protokola za vsakodnevno ocenjevanje (vključno s skupno
terminologijo za opis opažanj);
– strokovno znanje in izkušnje s področja zdravja, dobrobiti in vedenja živali;
– redno pregledovanje rezultatov;
– komunikacijo med vsemi osebami, odgovornimi za izvajanje študije in spremljanje
živali (od zgoraj navzdol, od spodaj navzgor, med in znotraj);
– nadzor (na lokalni (na primer Komisija za dobrobit živali), regionalni, nacionalni
ravni in na ravni EU).
Za zagotavljanje skladnosti pri ocenjevanju dejanske težavnosti je treba upoštevati naslednja
ključna vprašanja:
Priprava posebnega ocenjevalnega protokola za postopek
Pred začetkom projekta se je treba dogovoriti o ocenjevalnih protokolih, ki so
prilagojeni vrsti, liniji in študiji, ter jih pripraviti;
10
pri pripravi posebnih ocenjevalnih protokolov za posamezne študije je treba
učinkovito uporabiti vse razpoložljive ustrezne informacije, na primer
predhodne izkušnje, rezultate študij in vitro ali in silico, pregled literature,
informacije iz poskusnih študij ter opažene klinične znake pri ljudeh ali drugih
živalih;
informacije o tem, katere parametre je treba opazovati in kako je treba izvajati
spremljanje, morajo biti na voljo ob kletki;
prospektivna razvrstitev po stopnji težavnosti bo deloma določila, kolikšna
vključitev je potrebna na delovni ravni, ali je med spremljanjem potreben
ekipni pristop ter kdo mora biti vključen v postopek dejanskega opazovanja in
evidentiranja. Osebe, ki so pripravile posebni protokol za ocenjevanje
posamezne študije, morajo opraviti in/ali potrditi razvrstitev po dejanski,
končni težavnosti;
glede na zapletenost študije so lahko koristni ločeni ocenjevalni protokoli za
ločene komponente, na primer standardni protokol za operacijo/perioperativno
oskrbo, ki se uporablja v kombinaciji s prilagojeno oceno protokola študije;
v nekaterih primerih je v posebne ocenjevalne protokole za študijo morda
treba vključiti tudi informacije v povezavi z upravljanjem kolonije, na primer
podatke o vzreji in rasti gensko spremenjenih živali.
Skladnost pri ocenjevanju dejanske težavnosti
Ocena dejanske težavnosti se opravi na koncu postopka, zanjo pa je treba na podlagi
vsakodnevnih ocen in ob upoštevanju opravljenih postopkov opraviti presojo splošne
težavnosti, ki jo je žival dejansko občutila.
Pogosto se uporablja pristop, pri katerem se opredelijo „blaga“, „zmerna“ in
„težavna“ stopnja za vsakega od kazalnikov, ki se uporabljajo pri
vsakodnevnem ocenjevanju, in nato presodi njihova težavnost za vsak primer
posebej;
tako kot pri vsakodnevnem spremljanju je pomembno, da so dejanska
merila za ocenjevanje prilagojena postopku, vrsti in liniji; na primer 10-
odstotna izguba telesne teže ima zelo različne posledice za zdravje in dobrobit
mlajše, odraščajoče podgane, odrasle miši s hitro rastočim tumorjem ali
odraslega psa;
bistven dejavnik je tudi upoštevanje obdobja, v katerem se pojavijo nekateri
od teh kazalnikov, zlasti v povezavi z izgubo telesne teže in uživanjem
hrane/vode.
Ocena se izvede z uporabo evidenc dnevnega ocenjevanja ter ob upoštevanju postopka, ki
je bil opravljen na živali, trajanja škodljivih učinkov in tega, ali je bila žival ponovno
uporabljena ali ne. Čeprav to nujno vključuje določeno mero subjektivnosti, bi moral biti
cilj ustreznega usposabljanja opazovalca zmanjšanje takšne subjektivnosti.
Razvrstitev po dejanski težavnosti, če živali poginejo
11
Če žival pogine, tj. če ni bila evtanazirana, je to lahko posledica poskusa ali drugih
nepovezanih vzrokov1;
o dejanski težavnosti za poginule živali je treba poročati kot o „težavni“, razen če je
na podlagi zanesljivih podatkov mogoče sprejeti odločitev, da žival pred smrtjo ni
občutila hudega trpljenja;
če je malo verjetno, da je smrt nastopila po hudem trpljenju, mora razvrstitev po
dejanski težavnosti odražati znane izkušnje pred smrtjo. Ustrezno je treba upoštevati
dejavnike, kot sta pogostost spremljanja, uporaba analgezije itd.;
„(trajno) škodo“ lahko utrpi le živa žival.
Pripraviti je treba primere za ponazoritev postopka razvrstitve po težavnosti,
vsakodnevnega ocenjevanja in ocenjevanja končne, dejanske težavnosti ter jih dati na
voljo znanstveni skupnosti.
Kdo mora sodelovati pri oceni dejanske težavnosti?
Opazovanje in evidentiranje učinkov sta pogosto ločena od razvrstitve po
dejanski težavnosti;
določiti je treba jasne odgovornosti, da se zagotovi učinkovito vsakodnevno
spremljanje živali z ustrezno podporo in nadzorom;
uvesti je treba postopek preverjanja, da se spodbudi skladnost, na primer s
primerjanjem ocenjevalnih točk, ki jih dodelijo različni posamezniki;
opazovanje in spremljanje živali ter ocenjevanje dejanske težavnosti mora biti
na osnovi kompleksnosti in težavnosti zadevne študije prožno in prilagodljivo,
čeprav je za zagotavljanje, da je trpljenje ugotovljeno in zmanjšano na
minimum ,pravno odgovorna oseba, navedena v odobritvi projekta;
tudi Komisije za dobrobit živali morajo imeti vlogo na ravni organizacije, da
se zagotovi skladnost;
k spodbujanju skladnosti lahko prispevajo tudi nacionalni odbori in pristojni
organi.
Orodja za spremljanje, mediji in drugi razmisleki
Uporabo protokolov za točkovanje je treba proučiti na stopnji načrtovanja
projekta;
protokoli za točkovanje morajo biti čim bolj preprosti, vendar dovolj podrobni
in prilagojeni vrsti študije;
že izdelani ocenjevalni protokoli se lahko uporabijo, če ustrezajo študiji, vrsti
in liniji;
1 Za namene poročanja statističnih podatkov se mora dejanska težavnost nanašati predvsem na težavnost
poskusnih postopkov in ne na nepovezane izredne dogodke, kot so izbruhi bolezni ali poplavljenost kletk.
Tovrstni izredni dogodki se nanašajo na zdravstvene težave ali rejo in oskrbo, ne na poškodbe zaradi postopkov,
vendar jih je treba evidentirati, podrobneje preiskati in nadalje spremljati, da se prepreči ponovitev.
12
elektronsko vodenje evidenc lahko pomaga zagotoviti skladnost in lahko
dostopnost vseh ustreznih informacij;
priporočena je uporaba enotnega jezika in terminologije;
evidentirani podatki morajo biti čim bolj objektivni;
prednosti in pomanjkljivosti (i) sistemov opazovanja s številčnim točkovanjem
in (ii) sistemov „binarnega“ opazovanja (pri katerih se kazalniki označijo kot
„prisotni“ ali „odsotni“) je treba proučiti za vsak primer posebej;
vse vrste evidenc za opazovanje morajo vključevati možnost dodajanja
poljubnega besedila in predhodno določenih kazalnikov, tako da je mogoče
evidentirati nepričakovana opažanja;
učinkovito izobraževanje ustreznega osebja je bistveno in mora obsegati
predvsem tehnike ocenjevanja težavnosti in dobrobiti ter spremljanja;
izdelati je treba načrt komuniciranja, ki vključuje zadevno osebje; načrt mora
vključevati mehanizem za hitro sporočanje nepričakovanih rezultatov vsem
ustreznim posameznikom in po potrebi pristojnemu organu;
spremljanje mora biti v sorazmerju s predvidenimi učinki – za postopke, ki
lahko povzročijo „hudo“ trpljenje, je na splošno potrebno pogostejše in
natančnejše spremljanje;
obstajati morajo jasna merila za posredovanje, na primer, če se opazijo
določeni parametri ali če se trpljenje približuje predhodno določeni stopnji.
Vse zadevno osebje mora vedeti, kakšna so ta merila ter kako je treba ukrepati
in s kom je treba stopiti v stik ob izpolnitvi teh meril.
Učinkovito izvajanje postopka ocenjevanja težavnosti bo živalim in vsemu osebju, ki je
vključeno v oskrbo in uporabo živali, zagotovilo boljšo dobrobit živali, znanstveno
veljavnost in preglednost.
Dobra notranja in zunanja komunikacija o postopku ocenjevanja težavnosti in uporabi
načela 3R bo zagotovila še obsežnejše koristi.
13
Priloga I
Glosar kliničnih opažanj
Uspeh vsakega načrta ocenjevanja težavnosti je odvisen od izbire kazalnikov dobrobiti, ki:
• jih je mogoče prepoznati brez težav in zanesljivo;
• so učinkoviti pri zagotavljanju dobrih ukrepov dobrobiti;
• ustrezajo znanstveni študiji, vrsti in liniji (kjer je to ustrezno);
• so praktični za izvajanje in živali ne vznemirijo preveč ter
• so primerni za skladne meritve, razlage in analize.
Zato je zaželen skupni pristop k evidentiranju kliničnih opažanj, saj bo to pomagalo pri razvoju skladnih pristopov k razvrstitvi po težavnosti. To
bi olajšalo primerjanje kliničnih ugotovitev med študijami in zagotovilo informacije osebam, ki so vključene v ocenjevanje težavnosti.
Opažanja so strukturirana na podlagi naslednjih šestih glavnih kategorij:
Videz/telesne funkcije/okolje/vedenje/posebni kazalniki postopka/poljubna opažanja
Glavne kategorije Področja, na katera se je treba
osredotočiti pri opazovanju živali
Posebni kazalniki, ki jih je treba spremljati
Videz Telesno stanje Izguba/povečanje telesne teže
Prevelika telesna teža
Premajhna telesna teža
Točke za telesno stanje, če so na voljo
14
Stanje dlake in kože
Piloerekcija
Neurejena/nenegovana
Mastna dlaka
Izgubljanje dlake
Dehidracija – izguba elastičnosti kože
Poškodbe kože – oteklina; krasta; vnetje; poškodba/rana
Onesnaženost z iztrebki ali urinom
Izloček Očesni; nosni; urogenitalni; madeži porfirina pri nekaterih vrstah, npr.
podganah
Oči
Udrte ali „motne“
Zaprte/polzaprte
Prizadetost/poškodba očesa (npr. vnetje roženice)
Gobec
Slinjenje
Malokluzija/predolgi zobje
Drugo
„Trpeč izraz“ – npr. polzaprte oči in izbočen nos pri miših
Trebušni krči
Otečen del telesa, npr. napet trebuh
Telesne funkcije Dihanje
Hitro dihanje (tahipnea)
Oteženo dihanje (hiperpnea)
Zelo oteženo dihanje (dispnea)
Piskanje ali drug zvok pri dihanju
Vnos hrane/vode Povečan/zmanjšan
Telesna temperatura
Povečana/zmanjšana; izmerjena telesna temperatura, če je na voljo (npr.
prek mikročipa ali telemetrične naprave, kontaktnega ali brezkontaktnega
merjenja temperature); barva okončin pri glodavcih
Čutila Prizadet vid, sluh ali ravnotežje
Okolje Okolje ograde, vključno z morebitno
steljo, materialom za gnezda, predmeti
za obogatitev
Prisotnost in konsistenca iztrebkov
Mokra stelja, npr. zaradi poliurije
Prisotnost izbljuvkov ali krvi
Ali se pri živali uporabljajo predmeti za obogatitev, npr. material za gnezda,
15
predmeti za žvečenje
Vedenje Socialna interakcija
Sprememba normalnega značaja – boječe/napadalne interakcije z drugimi
živalmi; tesnoba (npr. opazno odzivanje z bežanjem, skrivanje)
Osamljenost ali odmaknjenost od drugih živali v socialni skupini
Nezaželeno vedenje
Ponavljajoče se/stereotipno vedenje
Prekomerno obgrizovanje dlake in brkov (glodavci), trihotilomanija
Povečana napadalnost do ljudi ali drugih živali
Drža in gibanje
Neobičajna drža
Neobičajna hoja; hromost; odsotnost gibanja/otopelost/nerazpoloženost za
premikanje kljub spodbujanju
Neusklajeni gibi
Zgrbljenost; nagnjena glava
Drugo
Tremorji
Napadi/konvulzije/krči
Oglašanje; spontano ali izzvano. (Opomba: nekatere vrste, npr. glodavci, se
ponavadi oglašajo v ultrazvočnem območju, zato je slišno oglašanje še
posebej skrb vzbujajoče. Tudi oglašanje kuncev je na splošno neslišno za
ljudi, razen če je žival v stiski).
Posebni kazalniki
postopka
Ti kazalniki so opredeljeni na podlagi
posameznega projekta, njegovih
potencialno škodljivih učinkov in
pričakovanih kazalnikov teh učinkov
Pri modelu EAE med te kazalnike lahko na primer spadajo: ohlapen rep,
oslabelost zadnjih okončin, oslabelost sprednjih okončin, ohromelost,
nedelovanje mehurja
Poljubna opažanja Načrt ocenjevanja težavnosti mora vedno vključevati možnost za navedbo kakršnih koli opažanj nepričakovanih
negativnih učinkov na dobrobit.
16
Priloga II
Osnovna strokovna literatura, smernice in spletni viri o ocenjevanju dobrobiti živali
med izvajanjem znanstvenih postopkov
American College of Laboratory Animal Medicine (ACLAM) (2006): Guidelines for the
Assessment and Management of Pain in Rodents and Rabbits (Smernice za ocenjevanje in
uravnavanje bolečine pri glodavcih in kuncih), prenos na spletnem naslovu
http://www.tinyurl.com/65ez5vh.
Assessing the Health and Welfare of Laboratory Animals (AHWLA): dokumentacija za
usposabljanje. Glej http://www.ahwla.org.uk/index.html.
Canadian Council on Animal Care (CCAC): Welfare assessment (Ocenjevanje dobrobiti).
Glej http://www.ccac.ca/ in klikni na mikrostran o treh R (Three Rs) ter išči „welfare
assessment“ (ocena dobrobiti) (v angleščini ali francoščini).
Categorising the severity of scientific procedures on animals - Summary and reports from
three round-table discussions (Razvrstitev znanstvenih postopkov na živalih po težavnosti –
povzetek in poročila s treh razprav za okroglo mizo), uredili Jane A. Smith in
Maggy Jennings v imenu skupine Boyd Group in Kraljeve družbe za preprečevanje mučenja
živali (Royal Society for the Prevention of Cruelty to Animals – RSPCA), julij 2004.
Objavil oddelek RSPCA za živali za raziskave.
Delovna skupina FELASA za poročanje o kliničnih znakih pri laboratorijskih živalih
(2012) – (v tisku).
Institute for Laboratory Animal Research (ILAR) (2008): Recognition and Alleviation of
Distress in Laboratory Animals (Prepoznavanje in lajšanje stiske pri laboratorijskih živalih).
Washington, DC: National Academies Press.
Institute for Laboratory Animal Research (ILAR) (2009): Recognition and Alleviation of
Pain in Laboratory Animals (Prepoznavanje in lajšanje bolečine pri laboratorijskih živalih).
Washington, DC: National Academies Press. Glej http://dels.nas.edu/animal_pain/.
Johansen R, Needham JR, Colquhoun DJ, et al. (2006): Guidelines for health and welfare
monitoring of fish used in research (Smernice za spremljanje zdravja in dobrobiti rib, ki se
uporabljajo za raziskave). Laboratory Animals 40: 323–340.
Joint Working Group on Refinement (Skupna delovna skupina za izboljšanje) (2011): A
guide to defining and implementing protocols for the welfare assessment of laboratory
animals (Napotki za opredelitev in izvajanje protokolov za ocenjevanje dobrobiti
laboratorijskih živali). Laboratory Animals 45: 1–13.
17
Leach MC et al. (2008): Identification of appropriate measures for the assessment of
laboratory mouse welfare (Določitev ustreznih ukrepov za ocenjevanje dobrobiti
laboratorijskih miši). Animal Welfare 17: 161–170.
National Centre for the Three Rs (NC3Rs): Welfare assessment (Ocenjevanje dobrobiti). Glej
http://www.nc3rs.org.uk/welfareassessment.
National Health and Medical Research Council (2008): Guidelines to Promote the Wellbeing
of Animals Used for Scientific Purposes: The Assessment and Alleviation of Pain and
Distress in Research Animals (Smernice za spodbujanje dobrobiti živali, ki se uporabljajo v
znanstvene namene: Ocenjevanje in lajšanje bolečine in stiske pri živalih za raziskave).
Canberra: avstralska vlada. Glej http://www.nhmrc.gov.au in išči „pain and distress“
(bolečina in stiska).
Organizacija za gospodarsko sodelovanje in razvoj (OECD) (2000): Guidance Document on
the Recognition, Assessment, and Use of Clinical signs as humane endpoints for experimental
animals used in safety evaluation (Smernice za prepoznavanje, ocenjevanje in uporabo
kliničnih znakov za humano usmrtitev poskusnih živali, ki se uporabljajo pri oceni varnosti).
OECD Environmental Health and Safety Publications Series on Testing and Assessment No.
19 (Publikacije OECD o zdravstveni ekologiji in varnosti, prispevki o preskušanju in
ocenjevanju, št. 19). Pariz: OECD.
Wells DJ, Playle LC, Enser WEJ, et al.: Assessing the welfare of genetically altered mice
(Ocenjevanje dobrobiti gensko spremenjenih miši). Celotno besedilo na spletnem naslovu
http://www.nc3rs.org.uk/gamice. Povzetek v Laboratory Animals 40: 111–114.
Workman P et al. (2010): Guidelines for the welfare and use of animals in cancer research
(Smernice za dobrobit in uporabo živali pri raziskavah raka). British Journal of Cancer 102:
1555–1577, prenos na spletnem naslovu
http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC2883160/?tool=pubmed.
1.2 Predlagane uporabne revije za nadaljnje branje
Applied Animal Behaviour Science http://www.applied-
ethology.org/applied_animal_behaviour_science.html
Animal Technology and Welfare http://www.iat.org.uk/publications/atw.htm
Animal Welfare http://www.ufaw.org.uk/animal.php
Sodobne teme v
Laboratory Animal Science in
Journal of the American Association
http://www.aalas.org/publications/index.aspx#ct
18
for Laboratory Animal Science
Lab Animal in Lab Animal
Europe
http://www.labanimal.com/laban/index.html
http://www.labanimaleurope.eu/
Laboratory Animals http://la.rsmjournals.com/
1.3 Predlagane ključne besede za pregledovanje literature
Pri iskanju informacij o ocenjevanju težavnosti so koristne naslednje ključne besede:
vplivati ocena škode in
koristi pozitivni kazalniki lestvica težavnosti
dobrobit živali humane končne
točke pozitivna dobrobit bolezensko vedenje
trpljenje živali potrebe kvalitativna ocena
vedenja stres
ocena objektivna ocena kakovost življenja trpljenje
neugodje bolečina izboljšanje ocena dobrobiti
stiska ocena bolečine protokoli za
točkovanje kazalnik dobrobiti
ocena škode meritev bolečine sistem točkovanja rezultati dobrobiti
Referenčna besedila, povezana z razvrstitvijo po dejanski težavnosti
CCAC (1998): Guidelines on: Choosing an Appropriate Endpoint in Experiments Using
Animals for Research, Teaching and Testing (Smernice za izbiro ustrezne metode usmrtitve
pri poskusih, pri katerih se za raziskave, učenje in preskušanje uporabljajo živali). Canadian
Council on Animal Care, na voljo na spletnem naslovu:
http://www.ccac.ca/en_/standards/guidelines (v angleščini) in
http://www.ccac.ca/fr_/normes/lignes_directrices (v francoščini).
Delovna skupina FELASA za bolečino in stisko (1994): Pain and distress in laboratory
rodents and lagomorphs (Bolečina in stiska pri laboratorijskih glodavcih in lagomorfih).
Laboratory Animals 28: 97–112.
19
Jones HRP, Oates J in Trussell BA (1999): An applied approach to the assessment of severity
(Uporabni pristop k ocenjevanju težavnosti). V: Hendriksen CFM in Morton DB (eds):
Humane Endpoints in Animal Experiments for Biomedical Research (Humane metode
usmrtitve pri poskusih na živalih za biomedicinske raziskave). Zapisniki mednarodne
konference, 22. in 25. novembra 1998, Zeist, Nizozemska. Royal Society for Medicine Press
Ltd., London, str. 40–47.
LASA/APC (2008): Final Report of a LASA/APC Working Group to Examine the Feasibility
of Reporting Data on the Severity of Scientific Procedures on Animals (Končno poročilo
delovne skupine LASA/APC o proučitvi izvedljivosti sporočanja podatkov o težavnosti
znanstvenih postopkov na živalih). Na voljo na spletnem naslovu:
http://www.lasa.co.uk/publications.html.
Morton, DB in Hau J (2011): Chapter 18: Welfare assessment and humane endpoints
(Poglavje 18: Ocena dobrobiti in humane metode usmrtitve). V: Handbook of Laboratory
Animal Science, 3rd
Edition, Volume 1 Essential Principles and Practices (Priročnik o
znanosti o laboratorijskih živalih, 3. izdaja, zvezek 1 Pomembna načela in prakse). Hau J in
Schapiro, SJ (eds), CRC Press LLC, USA, str. 535–572.
Prescott MJ, Morton DB, Anderson D, Buckwell A, Heath S, Hubrecht R, Jennings M, Robb
D, Ruane B, Swallow J in Thompson P (2004): Refining dog husbandry and care, Eighth
report of the BVAAWF/FRAME/RSPCA/UFAW Joint Working Group on Refinement
(Izboljšanje reje in oskrbe psov, Osmo poročilo skupne delovne skupine
BVAAWF/FRAME/RSPCA/UFAW o izboljšanju). Laboratory Animals 38 Suppl 1: S1:1–
S1:94.
Wolfensohn S in Lloyd M (2003): Handbook of Laboratory Animal Management and
Welfare, 3rd
Edition (Priročnik o upravljanju in dobrobiti laboratorijskih živali, 3. izdaja).
Blackwell Publishing Ltd, Oxford (4. izdaja v pripravi).
(Vsi spletni naslovi so bili nazadnje pregledani 24. maja 2012.)
20
Primeri za ponazoritev postopka razvrstitve po težavnosti,
vsakodnevnega ocenjevanja in ocenjevanja dejanske težavnosti
Bruselj, 11. januarja 2013
V Delovnem dokumentu o okviru ocenjevanja težavnosti, ki ga je pripravila strokovna delovna skupina Evropske komisije in so ga nacionalni
pristojni organi za izvajanje Direktive 2010/63/EU o zaščiti živali, ki se uporabljajo v znanstvene namene, podprli na sestanku julija 2012, je
priporočilo, naj se pripravijo primeri za ponazoritev „postopka razvrstitve po težavnosti, vsakodnevnega ocenjevanja in ocenjevanja končne,
dejanske težavnosti“ ter dajo na voljo znanstveni skupnosti.
Na podlagi tega je strokovna delovna skupina izdelala več primerov za ponazoritev, kako bi se proces, opisan v delovnem dokumentu, lahko
uporabil za različne postopke. Ti primeri naj bi pristojnim organom, uporabnikom, zootehnikom, veterinarjem in drugemu ustreznemu osebju
pomagali zagotoviti, da se bolečina, trpljenje in stiska učinkovito predvidijo, prepoznajo, olajšajo, kjer je mogoče, in dosledno ocenijo med
postopki. Nacionalni pristojni organi za izvajanje Direktive 2010/63/EU so ta dokument podprli na sestanku 23. in 24. januarja 2013.
Pri uporabi teh primerov je treba nujno upoštevati več pomembnih dejavnikov:
Predpostavlja se, da se ves čas izvaja dobra praksa v povezavi z nastanitvijo, rejo in oskrbo; izboljšanjem postopkov;
izobraževanjem in usposabljanjem; ocenjevanjem usposobljenosti; pridobivanjem in uporabo tekočih informacij o zamenjavi,
zmanjšanju in izboljšanju; ter zasnovo poskusov.
Listi za točkovanje, vključeni v primere, naj bi dopolnili in ne nadomestili presojo usposobljenega, kompetentnega in obzirnega
osebja. Cilj je omogočiti bolj sistematično in objektivno opazovanje, vodenje evidenc in ocenjevanje trpljenja, vendar ne tako, da bi
to imelo prednost pred poklicno presojo.
Vsi primeri se nanašajo na hipotetično, vendar realistično stanje. Vključitev vseh podrobnosti, ki bi bile na voljo v praksi, ne bi
bila primerna, vendar je vključenih dovolj podrobnosti za to, da se razloži, kako je bil postopek uporabljen.
21
Kot je navedeno v delovnem dokumentu, je nujno, da se ocena težavnosti prouči ter prilagodi vrsti, liniji in postopku, kakršen se
izvaja v posamezni uporabniški organizaciji. Na podlagi tega strokovna skupina odločno odsvetuje uporabo tabel in listov za
točkovanje v obliki, v kakršni so navedeni v primerih, tudi kadar gre za enake postopke. Redno je treba pregledovati učinkovitost
vseh protokolov za ocenjevanje težavnosti in jih po potrebi spremeniti.
Tudi primeri se lahko spremenijo, saj se poglablja znanje o kazalnikih bolečine, trpljenja in stiske ter spreminjajo pristopi k
ocenjevanju težavnosti in razvrščanju po težavnosti. Pri vseh primerih je naveden datum; na spletnem mestu Evropske komisije
http://ec.europa.eu/environment/chemicals/lab_animals/interpretation_en.htm lahko preverite posodobitve.
Dobrodošle so povratne informacije o uporabnosti primerov in predlogi za vključitev nadaljnjih postopkov; pripombe lahko
pošljete na elektronski naslov [email protected].
22
Kazalo vsebine:
Model 1 – Onkološke študije …………...……………………………………………………………………………………………………..23
Model 1(a) – Vzdrževanje človeških tumorskih celičnih linij v imunokompromitiranih golih miših ..………………….……........24
Model 1(b) – Učinkovitost novih farmacevtskih učinkovin na rast tumorja ..…..………………….……........................................27
Model 2 – Eksperimentalni avtoimunski encefalomielitis (EAE) pri miših ….……………………………………………………………......33
Model 3 – Artritis …..………………………….……………………………………………………………….……………………………....40
Model 4 – Možganska kap ..………………………………………….………………………………………………………………………...48
Model 5 – Proizvodnja poliklonskih protiteles v kuncu ……....………………………………………………………………………..………57
Model 6 – Proizvodnja in vzdrževanje gensko spremenjenih živali ………………...…………………………………………………………62
Model – GenAtm1a(Funding)Lab….……………….………………….………………………………………………………………...…63
Model – Tg(GenB)Labcode……..……………………………………………………………………………………………………....67
Model – GenCtm1a(Funding)Lab…….…………….…………..…….……….…………………………………………………………….69
23
Primeri za ponazoritev postopka težavnosti Model 1 – Onkološke študije (1a in 1b)
Nazadnje posodobljeno: 5. februar 2013
1. Živalski modeli v onkoloških študijah (1a in 1b) Splošni okvir: ocena novih učinkovin proti raku in vivo Rak je pomemben vzrok smrti v razvitem svetu in staranje prebivalstva bo neizogibno privedlo do povečanja bremena te bolezni. Verjetnost z rakom povezane smrti pri mlajših od sedemdeset let je leta 2010 v EU znašala približno ena proti sedem. Zato je treba razviti nova, učinkovitejša zdravila za zdravljenje raka. Koristi bodo vključevale zmanjšanje umrljivosti zaradi raka in izboljšanje kakovosti življenja ljudi, ki bodo oboleli za rakom v prihodnosti. Zdaj se pri razvoju novih zdravil za zdravljenje raka poleg računalniškega modeliranja in metodologij in vitro, kot so preskusi celičnih kultur, uporabljajo tudi živalski modeli. Potem ko se selektivnost in aktivnost spojin potrdita in vitro, se na živalih preskušajo le učinkovite spojine. Študije tolerance se izvajajo na majhnih skupinah živali, da se pred obsežnejšimi študijami učinkovitosti ugotovita največji tolerančni odmerek (MTD) in primernost predpisanega odmerjanja. Težavnost učinkov na živali je odvisna od modelov in namena študije. Na primer vzdrževanje tumorskih celičnih linij ne bi smelo imeti znatnega učinka na dobrobit pod pogojem, da se ves čas postopka upošteva dobra praksa, vključno z ustreznim spremljanjem živali in uporabo zgodnjih humanih končnih točk. Vendar pa bi bile študije za oceno novega zdravljenja v modelih metastaz verjetno precej zahtevnejše z vidika dobrobiti zaradi razvoja več tumorjev in verjetnih škodljivih učinkov citotoksičnih zdravil. Objavljenih je bilo več smernic za dobrobit in uporabo živali pri raziskavah raka, na primer v reviji British Journal of Cancer (Workman et al., 2010). V teh smernicah je podroben pregled različnih živalskih tumorskih modelov, ki so na voljo, njihovih učinkov na živali in možnih načinov zmanjšanja trpljenja. Tukaj sta predstavljena dva primera za ponazoritev onkoloških živalskih modelov, ki sta različno razvrščena po težavnosti. Referenčno besedilo Workman et al. (2010): Guidelines for the welfare and use of animals in cancer research (Smernice za dobrobit in uporabo živali pri raziskavah raka). British Journal of Cancer (2010) 102(11), 1555–1577; brezplačni prenos na spletnem naslovu
http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC2883160/pdf/6605642a.pdf.
24
1 (a) – Vzdrževanje človeških tumorskih celičnih linij v imunokompromitiranih golih miših Nekatere človeške tumorske celične linije se v kulturi ne razmnožujejo zanesljivo in občasno je treba človeške celične linije opredeliti in vzdrževati v ksenogenskem modelu in vivo. Študija 30 golih miši BALB/C moškega spola se bo podkožno injiciralo na levem boku s celično suspenzijo 10³ HCT 116 v 0,1 ml solne raztopine. Živali bodo skupinsko nastanjene v kletkah z ločenim prezračevanjem s steljo in materialom za gnezda. Dobrobit živali se bo ocenila vsak dan, živali pa se bodo stehtale vsake 4 dni. Prisotnost tumorja se bo ugotavljala z otipavanjem posameznih živali vsak drugi dan in tudi vsi zaznavni tumorji bodo izmerjeni s kljunastim merilom vsak drugi dan. Živali bodo evtanazirane 15. dan, da se bo odvzel tumor.
Začetna predhodna ocena ter proučitev posebnih izboljšav in humanih končnih točk
Kakšne posege na živalih obsega ta študija?
Kaj bodo občutile živali? Koliko trpljenja lahko to povzroči? Kaj lahko to poslabša?
Kako bo trpljenje zmanjšano na minimum?
Škodljivi učinki Metodologija in posegi Usmrtitev
Vzdrževanje imunokompromitiranih miši
Živali so občutljive za okužbo. Nastanitev v kletkah z ločenim prezračevanjem in prakse reje, prilagojene zmanjšanju tveganja kontaminacije. Skupinska nastanitev živali in obogatitev okolja za zmanjšanje stresa. Pregled reje in oskrbe, če se opazijo kakršni koli znaki stiske, napadalnosti ali nenormalnega vedenja.
Vse živali, ki kažejo znake slabega zdravja, se usmrtijo.
Podkožno injiciranje tumorskih celic
Prehodno neugodje po injiciranju Injiciranje se izvede le enkrat. Injicira se ustrezna količina (največ 0,2 ml). V obdobju takoj po injiciranju se živali natančno spremljajo.
Živali se humano usmrtijo, če se po injiciranju opazi več kot le blaga stiska ali neugodje brez hitrega okrevanja (zelo redko).
Rast tumorja Lahko povzroči neugodje ali vpliva na normalno vedenje ali gibanje.
Rast tumorja se meri vsak drugi dan. Načrt spremljanja vključuje skrbno
Žival se usmrti, če se tumor vname, če vpliva na normalno vedenje, držo ali
25
Analiza Po pričakovanjih naj bi živali občutile le BLAGO neugodje in se jih usmrti, če kakršne koli težave, povezane z zdravjem ali dobrobitjo, presežejo to stopnjo. Predhodna razvrstitev po težavnosti v BLAGO kategorijo je zato ustrezna. Primer izpolnjenega lista za opazovanje je vključen na koncu tega modela. Klinična opažanja Pripravljen je bil osnovni list za točkovanje, ki je osredotočen na velikost tumorja, telesno težo, držo in hojo, ker se pričakuje malo drugih kliničnih znakov. Vključeno je bilo polje za nepričakovane klinične znake, ki se evidentirajo s poljubnim besedilom. Vpis NAD (no abnormality detected – nepravilnost ni zaznana) potrjuje, da so bile živali pregledane in da nepravilnosti niso bile opažene. Spodaj je vključen primer. Rezultati
Pri nobeni od živali ni bila evidentirana znatna izguba telesne teže.
Pri 5 živalih ni bil opažen razvoj tumorja.
Pri 25 živalih so se tumorji razvili na boku. Ti tumorji niso vplivali na normalno vedenje in so 14. dan, ko so bile živali evtanazirane v skladu s protokolom študije za odvzem tumorjev, merili največ 1 cm.
V eni kletki je prišlo do napadalnega vedenja in boja; ena žival je imela ugrizne rane na repu in hrbtu in je bila posamezno nastanjena v drugo kletko, rane so se vsak dan lokalno razkužile, dokler se niso zacelile, in žival se je obdržala do konca postopka.
Tumor se lahko okuži ali vname (vendar ne sme metastazirati).
opazovanje drže, hoje ter velikosti in stanja tumorja.
gibanje ali če v premeru preseže 1,2 cm (Workman et al., 2010).
26
Ocena dejanske težavnosti
29 živali je do konca študije občutilo največ blago trpljenje, povezano z injiciranjem in rastjo tumorjev. Dejanska težavnost za te živali se je štela za BLAGO. 1 žival je imela ugrizne rane, ki so bile učinkovito oskrbljene. Pri tej živali je bilo nekaj dodatnega trpljenja, ki je nastalo kot posledica napadalnosti, vendar to ni bilo povezano s postopkom. Ti izredni dogodki so bili učinkovito obravnavani in trpljenje zmanjšano. Čeprav je ta žival občutila zmerno raven trpljenja, se je dejanska, s postopkom povezana težavnost, ki se sporoči, štela za BLAGO, saj ta izredni dogodek ni bil povezan s postopkom.
Primer lista za opazovanje (izpolnjenega za hipotetični primer)
Rast tumorja v golih miših – list za postopke in opazovanje
Kletka 1 – številke miši 1–5
Datum Postopek Velikost tumorja (cm)
Teža (g) Klinična opažanja – skrbno preverjanje drže in hoje
28/02 Podkožno injiciranje
1 – 21 2 – 22 3 – 21 4 – 22 5 – 22
Nobenih znakov težav, povezanih z dobrobitjo, po injiciranju
01/03 Nepravilnost ni zaznana (NAD)
02/03 Otipavanje NAD
03/03 NAD
04/03 Otipavanje 1 – 21 2 – 22 3 – 21 4 – 22 5 – 22
NAD
05/03 NAD
06/03 Otipavanje NAD
07/03 Nekaj napadalnega vedenja; ni videti ran
08/03 Meritev 1 – 0,1 1 – 21 Miš 1 je imela ugrizne rane na repu in hrbtu – lokalno
27
tumorja 2 – 0,1 3 – 0,1 4 – ni tumorja 5 – 0,2
2 – 22 3 – 21 4 – 22 5 – 22
oskrbljena; posamezno nastanjena. Predelek z gnezdišči je bil zagotovljen za posamezno nastanjeno žival, odstranjen pa je bil iz kletke s preostalimi štirimi mišmi, saj je morda to povzročilo napadalnost.
09/03 Rane miši 1 razkužene, dobro celjenje; nobenih znakov napadalnosti med preostalimi živalmi
10/03 Meritev tumorja
1 – 0,2 2 – 0,1 3 – 0,1 4 – ni tumorja 5 – 0,2
Rane miši 1 razkužene
11/03 Rane miši 1 razkužene
12/03 Meritev tumorja
1 – 0,4 2 – 0,3 3 – 0,3 4 – ni tumorja 5 – 0,5
1 – 22 2 – 22 3 – 21 4 – 21 5 – 23
Rane miši 1 zaceljene, prenehanje razkuževanja.
13/03 NAD
14/03 Evtanazija in odvzem tumorjev.
1 (b) – Učinkovitost novih farmacevtskih učinkovin na rast tumorja – postopek z več koraki Namen študije je oceniti učinkovitost novih učinkovin na zmanjšanje ali zaustavitev rasti tumorskih celic. Pred začetkom obravnavanja mora biti tumor dovolj velik (navadno zadostuje premer 0,5 cm) – zaradi trajanja študije lahko nekateri tumorji zrastejo do premera največ 1,2 cm, navadno v kontrolni skupini z nosilcem. Citotoksična zdravila lahko povzročijo nekaj škodljivih učinkov za dobrobit. 30 golih miši BALB/C moškega spola se bo injiciralo s počasi rastočimi tumorskimi celicami (0,1 ml). Dobrobit živali se bo ocenila vsak dan, živali pa se bodo stehtale enkrat tedensko v obdobju 3 zaporednih tednov. Rast tumorjev bo izmerjena s kljunastim merilom 7. in 14. dan; 20. dan bodo tumorji ponovno izmerjeni, živali bodo naključno razvrščene in začelo se bo sedemdnevno obravnavanje z intraperitonealnim injiciranjem dvakrat na dan.
28
Začetna predhodna ocena ter proučitev posebnih izboljšav in humanih končnih točk
Kakšne posege na živalih obsega ta študija?
Kaj bodo občutile živali? Koliko trpljenja lahko to povzroči? Kaj lahko to poslabša?
Kako bo trpljenje zmanjšano na minimum?
Škodljivi učinki Metodologija in posegi Usmrtitev
Vzdrževanje imunokompromitiranih miši
Živali so občutljive za okužbo. Nastanitev v kletkah z ločenim prezračevanjem in prakse reje, prilagojene zmanjšanju tveganja kontaminacije. Skupinska nastanitev živali in obogatitev okolja za zmanjšanje stresa. Pregled reje in oskrbe, če se opazijo kakršni koli znaki stiske, napadalnosti ali nenormalnega vedenja.
Vsaka žival, ki sočasno kaže znake druge bolezni, se usmrti.
Podkožno injiciranje tumorskih celic
Prehodno neugodje po injiciranju Injiciranje se izvede le enkrat. Injicira se ustrezna količina (največ 0,2 ml). V obdobju takoj po injiciranju se živali natančno spremljajo.
Živali se humano usmrtijo, če se po injiciranju opazi več kot le blaga stiska ali neugodje brez hitrega okrevanja (zelo redko).
Rast tumorja Lahko povzroči neugodje ali vpliva na normalno vedenje ali gibanje. Uporabljeni tumor se lahko okuži ali vname (vendar ne sme metastazirati).
Vsakodnevno opazovanje živali, redno spremljanje splošnega zdravja in rasti tumorja. Načrt spremljanja vključuje skrbno opazovanje drže, hoje ter velikosti in stanja tumorja. Farmacevtski posegi se začnejo, ko premer tumorja doseže 0,5 cm (merjeno s kljunastim merilom).
Žival se usmrti, če se tumor vname, če vpliva na normalno vedenje, držo ali gibanje ali če v premeru preseže 1,2 cm (Workman et al., 2010).
Intraperitonealno injiciranje nove farmacevtske učinkovine
Prehodno neugodje po injiciranju. Citotoksična zdravila lahko povzročijo diarejo, izgubo telesne teže, neješčnost ali
V obdobju takoj po injiciranju se živali natančno spremljajo. Največja količina 10 ml/kg dnevno
Živali se usmrtijo, če izguba telesne teže preseže 20 % začetne telesne teže. Živali, ki ne jedo ali imajo diarejo
29
Analiza Zaradi velikosti tumorjev, večje možnosti vnetja, pogostosti injiciranja in škodljivih učinkov apliciranih zdravil je v tem primeru ustrezna predhodna razvrstitev po težavnosti v ZMERNO kategorijo. Bi bila meja težavnosti lahko BLAGA?
Malo verjetno, razen če bi bilo mogoče znanstvene cilje doseči z določitvijo zgodnejših humanih končnih točk, na primer z zmanjšanjem največje velikosti tumorja. To bi pomenilo tudi injiciranje odmerka zdravil, za katerega se ve, da ne povzroča nobenih znatnih škodljivih kliničnih učinkov. V teh okoliščinah bi se BLAGA težavnost lahko štela za ustrezno. Klinična opažanja Primer lista za opazovanje in primer lista za točkovanje sta vključena na koncu tega modela. Rezultati
Od 30 miši BALB/C moškega spola jih je bilo 25 uporabljenih za oceno učinkovitosti; 10 živali je prejelo zdravilo B v odmerku H, 10 zdravilo B v odmerku X in 5 zdravilo C v odmerku Y. Ocena dejanske težavnosti
Pri 3 živalih se niso razvili tumorji in so bile evtanazirane kot neuporabne za poskus – BLAGO.
Pri 2 živalih je na mestu injiciranja tumorskih celic nastalo vnetje pred začetkom obravnavanja in sta bili evtanazirani – ZMERNO.
Pri 10 živalih, ki so prejemale zdravilo B v odmerku H, so tumorji ostali razmeroma majhni, živali pa niso znatno izgubile telesne teže in imele kliničnih znakov – BLAGO.
otopelost. sedem dni zapored. Uporabijo se minimalne velikosti odmerkov (določene na podlagi študij obsega odmerkov). Za oceno dobrobiti se uporabi sistem kliničnega točkovanja.
več kot 48 ur, se usmrtijo. Zgornja meja za število kliničnih točk se določi kot humana končna točka.
30
Pri 7 živalih, ki so prejemale zdravilo B v odmerku X, se je velikost tumorjev zmanjšala, živali so izgubile 15 % telesne teže in prisotni so bili mehki iztrebki, vendar so se živali obdržale do konca poskusa – ZMERNO.
Pri 3 živalih, ki so prejemale zdravilo B v odmerku X, se je velikost tumorjev zmanjšala, živali so izgubile 15 % telesne teže, prisotni so bili mehki iztrebki, živali so bile neješče in zelo otopele; te živali so bile humano usmrčene 25. dan – TEŽAVNO.
Pri 5 živalih, ki so prejemale zdravilo C v odmerku Y, so se tumorji še naprej povečevali, povečala se je telesna teža, drugih kliničnih znakov razen rasti tumorjev pa ni bilo. Te živali so bile evtanazirane, ko je velikost tumorjev presegla 1,2 cm – ZMERNO.
Primer lista za točkovanje
Št. živali
Datum 01/06 02/06 03/06 04/06
Videz Telesna teža
Stanje dlake
Telesne funkcije Dispnea in/ali tahipnea
Vnos hrane
Okolje Mehki iztrebki ali diareja
Kri v diareji
Vedenje Ravnanje z živaljo
Napadalnost
Nenormalna hoja
Nenormalna drža
Nerazpoloženost za premikanje
Posebni kazalniki postopka Velikost tumorja
Vnetje tumorja
31
Ukrepi
1 točka Pregled pogostosti spremljanja
2 točki Proučitev dodatne oskrbe, npr. dodatne tekočine
4 točke Posvet z veterinarjem
6 točk Humana usmrtitev
Primeri kliničnih točk
Tumor ovira gibanje
Vsota točk
Vsa druga opažanja
Videz Točke
Telesna teža
Izguba 5–10 % telesne teže 1
Izguba 11–15 % telesne teže 2
Izguba 16–20 % telesne teže 3
Izguba več kot 20 % telesne teže Humana usmrtitev
Stanje dlake
Nekoliko neurejena dlaka 1
Rahla piloerekcija 2
Opazna piloerekcija 3
Telesne funkcije
Tahipnea (hitro dihanje) 1
Dispnea (oteženo dihanje) 3
Okolje
Mehki iztrebki ali diareja 1
Kri v diareji Humana usmrtitev
Vedenje
Napetost in živčnost pri ravnanju 1
V opazni stiski pri ravnanju, npr. tresenje, oglašanje, napadalnost
3
Gibanje
Nekoliko nenormalna hoja/drža 1
32
Opazno nenormalna hoja/drža 2
Znatne težave z gibanjem/nerazpoloženost za premikanje
3
Negibnost > 24 h Humana usmrtitev
Posebni kazalniki postopka
Velikost tumorja > 1,2 cm Humana usmrtitev
Vnetje tumorja Humana usmrtitev
Tumor ovira gibanje Humana usmrtitev
33
Primeri za ponazoritev postopka težavnosti Model 2 – Eksperimentalni avtoimunski encefalomielitis (EAE) pri miših
Nazadnje posodobljeno: 5. februar 2013
Splošni okvir Eksperimentalni avtoimunski encefalomielitis (EAE) se uporablja za modeliranje različnih vidikov multiple skleroze pri glodavcih in primatih. Multipla skleroza je multiformna, kompleksna nevrološka motnja, ki se pojavi pri mladih odraslih osebah. Med njene bolezenske znake spadajo vnetje, demielinizacija in izguba aksonov. Živalski modeli se uporabljajo za raziskovanje patofiziologije te bolezni in ocenjevanje potencialnih zaščitnih ali zdravilnih strategij, vključno z imunomodulacijo, imunološko zaščito, obnovitvijo aksonov in mielina. Za multiformne in multifazne lastnosti multiple skleroze je treba uporabiti ustrezne modele za obravnavanje posebnih vprašanj, povezanih z različnimi stopnjami bolezni. EAE vključuje aktivacijo imunskega sistema, ki je usmerjen v mielin ter povzroči vnetje v osrednjem živčnem sistemu in povečanje prepustnosti krvno-možganske pregrade. To lahko povzroči hud nevrološki sindrom v živalskem modelu, ki bi mu moralo slediti delno okrevanje med prvo kronično reminentno recidivno stopnjo. Ta stopnja je povezana z vnetjem in reverzibilno demielinizacijo. Po 9–10 tednih žival preide v progresivno obliko, ki je povezana s kronično demielinizacijo in izgubo aksonov. Med to stopnjo je mogoče oceniti različne terapevtske strategije. Humane in znanstvene končne točke je treba skrbno izbrati ob upoštevanju ciljev študije. Referenčna besedila Emerson MR et al. (2009): Enhancing the ability of Experimental Autoimmune Encephalomyelitis to serve as a more rigorous model of Multiple Sclerosis through refinement of the experimental design (Izboljšanje zmožnosti eksperimentalnega avtoimunskega encefalomielitisa za zagotovitev natančnejšega modela multiple skleroze prek izboljšanja zasnove poskusa). Comparative Medicine 59: 112–128. Miller SD et al. (2010): Experimental Autoimmune Encephalomyelitis in the mouse (Eksperimentalni avtoimunski encefalomielitis pri miši). Current Protocols in Immunology 88: 15.1.1–15.1.20. Weissert R (ed) (2012): Experimental Autoimmune Encephalomyelitis - Models, Disease Biology and Experimental Therapy (Eksperimentalni avtoimunski encefalomielitis – modeli, biologija bolezni in eksperimentalna terapija). Objavil In Tech, DOI: 10.5772/1190, http://www.intechopen.com.
Wolfensohn S et al. (v pripravi): Reducing suffering in Experimental Autoimmune Encephalomyelitis (Zmanjšanje trpljenja pri eksperimentalnem avtoimunskem encefalomielitisu).
34
Študija
V tem primeru se bo EAE povzročil pri štirih miših Biozzi ABH moškega spola in štirih miših Biozzi ABH ženskega spola (pogosto uporabljena linija, ki naj bi imela visoko translacijsko vrednost), da se oceni potencialna terapija za multiplo sklerozo. Na začetni stopnji načrtovanja projekta uporabnik prouči vse možne škodljive dogodke za živali ter določi potencialne vzroke trpljenja v pogovoru z zootehnikom, osebjem za oskrbo in lečečim veterinarjem. Ti so raziskali izboljšave, ki se vključijo v projekt. Miši bodo skupinsko nastanjene v enospolnih skupinah štirih osebkov. Posebna pozornost bo namenjena lokalnemu okolju, saj bodo živali z EAE imele znatne gibalne motnje. Kletke bodo imele trda tla, steljo iz žaganja, ustrezna zatočišča in material za gnezda ter predmete za žvečenje. Živali bodo prejele vnetni adjuvant za povzročitev EAE ter se spremljale med okrevanjem in kronično reminentno recidivno stopnjo (od 9 do 10 tednov). Ko se bo razvila progresivna oblika, se bodo v tritedenski študiji pri miših ocenile možne testne terapevtske spojine. Začetna predhodna ocena ter proučitev posebnih izboljšav in humanih končnih točk
Kakšne posege na živalih obsega ta študija?
Kaj bodo občutile živali? Koliko trpljenja lahko to povzroči? Kaj lahko to poslabša?
Kako bo trpljenje zmanjšano na minimum?
Škodljivi učinki Metodologija in posegi Usmrtitev
Več injiciranj vnetnega adjuvanta
Neugodje ali bolečina zaradi injiciranja osnovnega odmerka. Možna reakcija na mestu injiciranja, ki povzroča draženje ali neugodje.
Majhni odmerki se injicirajo na več podkožnih mestih (ne na blazinicah tac ali korenu repa). Adjuvant in nosilec sta sestavljena tako, da sta minimalno dražeča. Živali se po injiciranju spremljajo.
Živali se humano usmrtijo, če se po injiciranju opazi več kot prehodna zmerna bolečina ali stiska.
Povzročitev EAE – hud nevrološki sindrom na začetku, ki mu sledi stopnja okrevanja
Ohromelost, ki lahko povzroči stisko ali tesnobo: ohlapnost repa, oslabelost zadnjih okončin, hipomotiliteta, ohromelost okončin. Urinarna disfunkcija (inkontinenca ali retenca)
Delovanje urinarnega trakta se spremlja z dnevnim preverjanjem mehurja. Mehur se ročno iztisne, če je to potrebno v primerih retence (skrbno spremljanje znakov bolečine ali stiske po izpraznitvi mehurja). Če so živali inkontinentne, se pogosto preveri, ali sta stelja in material za gnezda v kletki mokra; po potrebi se ju zamenja s svežimi materiali. Zagotovijo se ustrezna zatočišča in material za gnezda.
Humana usmrtitev ob izpolnitvi katerega koli od naslednjih meril:
Ohromelost obeh sprednjih okončin za > 24 h
Ohromelost obeh zadnjih okončin za največ 5 dni
Kakršno koli samopoškodovanje
Trajna urinarna retenca/nezmožnost izpraznitve mehurja
Omrtvelost (izguba gibljivosti;
35
* Izguba 35 % telesne teže je skrajna humana končna točka, za katero je potrebna dobra znanstvena utemeljitev. V tem primeru ni mogoče preprečiti znatne izgube teže in živali si od tega lahko opomorejo z ustrezno podporo, npr. dodatnim ogrevanjem in dodatnim hranjenjem, po potrebi tudi z ročnim hranjenjem. Skrajna humana končna točka pri izgubi 35 % telesne teže je za to študijo določena kot način zmanjšanja potrebe po povzročitvi EAE pri nadaljnjih netretiranih živalih, ki bi bila pri bolj „konvencionalni“ končni točki znatno nižja (npr. 20 %). Analiza Šteje se, da je predhodna razvrstitev po težavnosti v TEŽAVNO kategorijo ustrezna, saj naj bi postopek povzročil hudo poslabšanje splošne dobrobiti in stanja živali.
Znatna izguba telesne teže (npr. do 35 %)
Zagotovi se stalen dostop do vode in hrane, ki se položita v posode na tleh kletke. Telesna teža in stanje se spremljata vsak dan in pogosteje (po potrebi) točkujeta po začetku izgubljanja telesne teže. Zagotovijo se namočena hrana in briketi, po potrebi s podkožnim dodajanjem.
delna ohromelost)
Izguba 35 % telesne teže*
Prenehanje hranjenja ali pitja za > 24 h po nastopu bolezni
Žival ne okreva po EAE v obdobju 3 tednov po nastopu klinične bolezni
Klinični znaki sočasno prisotne bolezni, npr. zgrbljenost
Reminentni/recidivni klinični potek
Kronične nevrološke motnje Zmanjšajo se vsi dejavniki stresa, tudi raven hrupa. Temperatura okolja se po potrebi poviša z grelnimi podlogami, dodatno steljo in materialom za gnezda.
Aplikacija nove terapevtske učinkovine (med progresivno obliko)
Neugodje zaradi injiciranja. Stranski učinki ali neučinkovitost učinkovine
Po injiciranju kandidatne učinkovine se živali natančno spremljajo.
Živali se humano usmrtijo, če se opazi kateri koli od zgoraj navedenih kazalnikov ali če se pojavijo težavni stranski učinki zaradi nove terapevtske učinkovine.
36
Bi bila težavnost lahko ZMERNA?
Čeprav naj bi bila predvidena težavnost tega modela zaradi zgoraj navedenih razlogov vedno TEŽAVNA, je glede na trajanje študije in uporabo zgodnjih humanih končnih točk, kakršna je navedena tukaj, retrospektivna razvrstitev po težavnosti lahko ZMERNA. Klinična opažanja Med študijo so zootehniki in osebje za oskrbo spremljali miši s sistemom za klinično točkovanje, ki je bil prilagojen protokolu po pogovoru z uporabniki, zootehniki in osebjem za oskrbo ter veterinarjem. To je zajemalo parametre, povezane s telesno težo, stanjem kožuha, tonusom repa, nadzorom mehurja, obračanjem in vstajanjem, hojo, omrtvelostjo in znaki napredovanja (počivanje na boku; skoraj popolna ohromelost; hitro, počasno ali globoko dihanje). Ker je projekt obsegal težavne postopke, je bilo spremljanje živali zelo natančno, uporabnik pa je v pogovoru s Komisijo za dobrobit živali, zootehnikom in imenovanim veterinarjem redno opravljal stalne preglede težavnosti. Spodaj je prikazan primer za ponazoritev lista za točkovanje. Primer ustreznega lista za točkovanje Tabela. List za klinično točkovanje, uporabljen za miši z EAE
Datum:
Videz
Telesna teža
Stanje dlake
Telesne funkcije
Nadzor mehurja
Tonus repa
Dihanje
Okolje
Stanje gnezda
Vedenje
Socialno vedenje
Hoja
Posebni kazalniki postopka
Počivanje na boku
37
Čas obračanja in vstajanja
Omrtvelost
Ohromelost
Druga opažanja
(Poljubno besedilo)
Opombe: vsi kazalniki so bili ocenjeni v skladu s sistemom v spodnji tabeli, po katerem bi se (na primer) „1“ vneslo v tabelo poleg „tonus repa“, če bi bilo opaženo zmanjšano dviganje, in „2“ poleg „stanje gnezda“, če bi bilo gnezdo neurejeno. Tabela. Sistem ocenjevanja kazalnikov na listu za klinično točkovanje EAE
Točke: 1 = blago 2 = zmerno 3 = težavno
Izguba telesne teže Do 10 % Od 10 do 20 % Od 20 do 35 %
Stanje dlake Nekoliko neurejena Nenegovana Opazna/dolgotrajna piloerekcija
Nadzor mehurja – inkontinenca
Znak nekoliko zmanjšanega nadzora, npr. majhna količina urina v gnezdu
Bolj izrazito „uhajanje“ urina Inkontinenca
Nadzor mehurja – retenca Mehur je mogoče otipati, vendar se izprazni ob ravnanju z živaljo.
Za izpraznitev mehurja je potrebno nekoliko več truda.
Nezmožnost uriniranja brez pomoči; znaki neugodja/stiske med ali po ročnem praznjenju
Tonus repa Zmanjšano dviganje ali zvijanje repa Ohlapnost zadnje polovice repa Ohlapnost celotnega repa
Dihanje: hitro, počasno ali globoko
Rahlo Zmerno Opazno
Stanje gnezda Nekoliko neurejeno Nekaj poskusov ureditve gnezda, vendar neurejeno gnezdo
Ni gnezda
Socialno vedenje Pri blagem trpljenju ni pričakovati sprememb; točkovanje se začne pri 2
Zmanjšana interakcija z drugimi živalmi
Znatno zmanjšana interakcija; pasivnost
Hoja Okorna Vlečenje ene zadnje okončine Vlečenje obeh zadnjih okončin
Počivanje na boku Pri blagem ali zmernem trpljenju ni pričakovati sprememb; točkovanje
Pri blagem ali zmernem trpljenju ni pričakovati sprememb; točkovanje
Prisotno
38
se začne pri 3 se začne pri 3
Čas obračanja in vstajanja Žival se počasi obrača in vstaja, ko se jo položi na hrbet.
Opazne težave pri obračanju in vstajanju
Žival se ni zmožna obrniti in vstati v 5 sekundah, ko se jo položi na hrbet.
Omrtvelost Počasno iztegovanje sprednjih okončin, ko se žival položi na hrbet.
Zmanjšan obseg iztegovanja sprednjih okončin, ko se žival položi na hrbet.
Žival ne izteguje sprednjih okončin.
Skoraj popolna ali popolna ohromelost
Pri blagem ali zmernem trpljenju ni pričakovati sprememb; točkovanje se začne pri 3.
Pri blagem ali zmernem trpljenju ni pričakovati sprememb; točkovanje se začne pri 3
Prisotna
Ocena dejanske težavnosti Na koncu postopka so se pregledali listi za točkovanje vsake posamezne živali, da se je ugotovilo, koliko točk je bilo dodeljenih kazalnikom in kako se je to spreminjalo v določenem obdobju.
Dve miši sta izgubili 8 % telesne teže po povzročitvi EAE, njuna kožuha sta bila nekoliko neurejena in počasi sta iztegovali sprednje okončine, vendar sta bili prvih 5 dni projekta za vse druge kazalnike ocenjeni z „2“. Število njunih točk se je potem vrnilo na „1“ ali „0“ za vse kazalnike med recidivno/reminentno stopnjo in med preskušanjem zdravila. Težavnost = ZMERNO.
Tri miši so izgubile od 22 do 32 % telesne teže in bile ocenjene s kombinacijo točk „3“, „2“ in „1“ ves čas recidivne/reminentne stopnje in med preskušanjem zdravila. Težavnost = TEŽAVNO.
Ena miš je izgubila 37 % telesne teže med stopnjo po povzročitvi in je bila humano usmrčena. Težavnost = TEŽAVNO.
Dve miši sta izgubili 15 oziroma 18 % telesne teže in sta bili prve 4 dni študije ocenjeni s kombinacijo točk „2“ in „3“ za vse druge kazalnike. Potem sta bili ocenjeni s kombinacijo točk „1“ in „2“ ves čas recidivne/reminentne stopnje in med preskušanjem zdravila. Težavnost = TEŽAVNO.
Ohromelost ni bila opažena in izkazalo se je, da je ocenjevanje dihanja v kletki pretežavno, zato sta bili ti kategoriji izbrisani z evidenčnih listov. V poljih za poljubno besedilo je bilo pogosto zabeleženo daljše zadrževanje v zatočišču kot zgodnji pokazatelj trpljenja, zato se je to dodalo na liste za prihodnje projekte. Težavnost pri šestih živalih velja za TEŽAVNO, pri dveh pa za ZMERNO.
39
Možnosti za nadaljnjo uporabo načela 3R Uporabniki so se na podlagi svoje ocene dejanske težavnosti posvetovali s kolegi in poiskali nadaljnje izboljšave v literaturi. Določene so bile naslednje dodatne izboljšave:
hranjenje živali z visokoenergijskimi prehranskimi dopolnili, kot sta želatina in kondenzirano mleko, pred aplikacijo adjuvanta;
uporaba manjšega odmerka adjuvanta;
uporaba alternativnega protokola študije, da bi bilo mogoče skrajšati trajanje projekta. Te izboljšave so se vključile v protokol za prihodnje študije zato, da bi se primerjale stopnje dejanske težavnosti in bi se tako ugotovilo, ali so izboljšave učinkovite.
40
Primeri za ponazoritev postopka težavnosti Model 3 – Artritis
Nazadnje posodobljeno: 01 junij 2016
Splošni okvir Živalski modeli artritisa se uporabljajo za proučevanje patogeneze te bolezni in ocenjevanje potencialnih zdravil proti artritisu za klinično uporabo. Med pomembnimi merili za izbiro modela so zato morfološke podobnosti s človeško boleznijo in zmožnost modela, da predvidi učinkovitost kandidatnih terapevtskih spojin pri ljudeh. Med pogosto uporabljenimi živalskimi modeli revmatoidnega artritisa so: adjuvantni artritis pri podganah, s kolagenom tipa II povzročeni artritis pri podganah, s kolagenom tipa II povzročeni artritis pri miših ter z antigenom povzročeni artritis pri več živalskih vrstah (Bendele, 2001). Pogosto se uporablja injiciranje pri korenu repa, saj to zagotavlja dober imunogeni odziv, čeprav se v literaturi navajajo tudi druga mesta injiciranja. Obstajajo tudi znatne razlike med sevi glede občutljivosti, težavnosti in latentnega obdobja do nastopa artritisa. Na primer občutljivost gensko spremenjenih linij na razvoj artritisa se lahko spremeni (poveča ali zmanjša) glede na učinke genskih sprememb. Pri živalskih modelih artritisa, ki se pogosto uporabljajo in so zato dobro validirani, je nastop bolezni predvidljiv, ocenjevalne tehnike pa so po vsej verjetnosti dobro opredeljene in opisane. Pri takšnih modelih se lahko uporabi večkratno ocenjevanje, vključno z analizo hoje in uporabo von Freyevih laskov, v nasprotju z enkratnimi opazovalnimi meritvami. Upoštevati je treba, da je potrebno redno pregledovanje razpoložljivih sevov, protokolov in izboljšav, tako da se za vsak primer posebej izberejo najprimernejši za zastavljeno znanstveno vprašanje (Joe et al., 1999). Model, predstavljen v tem primeru, je s kolagenom tipa II povzročeni artritis pri podganah, ki lahko povzroči hudo trpljenje. Zato je nujno potrebna tehtna znanstvena utemeljitev njegove uporabe. Podgane se imunizirajo proti heterolognemu kolagenu tipa II, kar povzroči poškodbe, ki so podobne poškodbam pri človeškem revmatoidnem artritisu (Bendele, 2001). Za povzročeni poliartritis je značilno opazno propadanje hrustanca, ki je povezano z odlaganjem imunskega kompleksa na sklepne površine, resorpcijo kosti in proliferacijo pokostnice ter zmernim do opaznim sinovitisom in obsklepnim vnetjem. Referenčna besedila
Bendele, A.M.: Animal models of rheumatoid arthritis (Živalski modeli revmatoidnega artritisa), Journal of Musculoskeletal and Neuronal Interactions 2001; 1(4): 377–385.
Jasemian Y et al. (2011): Refinement of the collagen induced arthritis model in rats by infrared thermography (Izboljšanje modela s kolagenom povzročenega artritisa pri podganah z infrardečo termografijo). British Journal of Medicine and Medical Research 1(4): 469–477.
41
Joe, B., Griffiths, M.M., Remmers, E.F., Wilder,R.L.: Animal models of rheumatoid arthritis (Živalski modeli revmatoidnega artritisa). Current Rheumatology Reports 1999 ; 1 139–149.
Študija V tem primeru se bo artritis razvil pri 18 podganah Lewis moškega spola in 18 podganah Lewis ženskega spola s ponavljajočim se injiciranjem nepopolnega Freundovega adjuvanta (FIA) in kolagena. Mesto injiciranja bo koren repa. Vsakodnevno obravnavanje se bo začelo 10 dni pozneje (D10), ko bo artritis razvit, in se bo potem nadaljevalo vsak dan še nadaljnjih 14 dni (do D24). Cilj študije bo preskus domnevnih terapevtskih učinkovin. Pregledali so se objavljeni podatki o povezanih spojinah, da bi se odkrilo, ali bi zagotavljanje analgezije vplivalo na znanstvene cilje, in ugotovilo se je, da bi to povzročalo motnje pri eksperimentu. Analgezija se zato ne bo zagotavljala med razvojem artritisa ali kontrolnim osebkom, posebna pozornost pa bo namenjena metodam blaženja bolečin, ki niso farmakološke (npr. izboljšavam reje), da se olajša trpljenje. Vse živali se bodo opazovale in stehtale vsak dan ter ocenile s točkami na splošnem listu za klinično točkovanje, testirale pa se bodo na D0 (pred prvim injiciranjem) ter na D10 (pred začetkom obravnavanja), D13, D16, D20 in D24. Testiranje bo obsegalo posredne meritve poslabšanja telesne zmogljivosti, kot je premer sklepov (izmerjen s kljunastim merilom), in klinično točkovanje v skladu s sistemom točkovanja za artritis. Humane končne točke se bodo uporabile na podlagi kliničnih točk (glej spodaj).
42
Ocena novih terapevtskih farmacevtskih učinkovin v podganjem modelu artritisa (kolagen tipa II) TEŽAVNA težavnost
Kakšne posege na živalih obsega ta študija?
Kaj bodo občutile živali? Koliko trpljenja lahko to povzroči? Kaj lahko to poslabša?
Kako bo trpljenje zmanjšano na minimum?
Škodljivi učinki Metodologija in posegi Usmrtitev
Podkožno injiciranje govejega kolagena tipa II v nepopolnem Freundovem adjuvantu (FIA) pri korenu repa ob največ treh priložnostih
Stres zaradi omejitve premikanja. Prehodna bolečina, zmerna oteklina na mestu injiciranja in neugodje, ki traja en do dva dneva.
Kožno vnetje je možno, vendar malo verjetno pri FIA.
Obziren odnos in kompetentno ravnanje z živalmi ves čas postopkov. Standardizirani odmerek in formulacija izbrana za zmanjšanje otekanja in bolečine.
Če je koža še naprej vneta ali se mesto vnetja okuži, se živali humano usmrtijo.
Razvoj artritisa (D0–D10) Neugodje, bolečina, prizadetost in stiska; žival lahko kaže znake slabega zdravja, med drugim oslabelost, neješčnost, nerazpoloženost za premikanje, izgubo teže, otekanje sklepov, slišno oglašanje pri ravnanju.
Skrbno klinično spremljanje z uporabo splošnega lista za klinično točkovanje s pogostejšim spremljanjem ob nastopu kliničnih znakov (navadno približno od D8–D10 naprej) .
Dodatna mehka stelja in material za gnezda se zagotavljata ves čas študije.
Lahek dostop do vode in hrane (npr. na tleh kletke) ves čas študije.
Uporabi se sistem kliničnega točkovanja za artritis, s katerim se oceni stopnja otekanja in število prizadetih sklepov.
Živali se humano usmrtijo, ko dosežejo predhodno določeno število kliničnih točk za humano usmrtitev (glej spodnjo tabelo) .
Aplikacija farmakoloških učinkovin (poskusni in kontrolni osebki, dvakrat na dan) s podkožnim ali intraperitonealnim injiciranjem (od D10 do D24)
Prehodno neugodje po injiciranju.
Na podlagi prejšnjih podatkov o živalih ni pričakovati, da bi farmakološke učinkovine povzročile škodljive učinke.
Vsakodnevno skrbno klinično spremljanje z uporabo splošnega lista za klinično točkovanje.
Humane končne točke se uporabijo v primeru znatnih škodljivih učinkov.
43
Ocena učinkov farmakoloških učinkovin na težavnost artritisa (D0, D10, D13, D16, D20 in D24)
Glede na uporabljene metode se lahko pojavi nekaj dodatne prehodne bolečine ali neugodja, npr. zaradi uporabe von Freyevih laskov, kljunasta merila, potrebe po ravnanju z živalmi.
Skrbno klinično spremljanje. Zmanjšanje pogostosti spremljanja (na minimum v skladu z znanstvenimi cilji), dokler si žival ne opomore.
Glej spodnjo tabelo
Opomba O sistemu kliničnega točkovanja in sistemu točkovanja za artritis se je treba pogovoriti z raziskovalcem, veterinarjem, zootehniki in osebjem za oskrbo ter dogovoriti pred začetkom študije. Analiza Zaradi verjetnosti znatnega kliničnega učinka na žival, ki lahko traja več tednov, se šteje, da je predhodna razvrstitev po težavnosti v TEŽAVNO kategorijo ustrezna. Bi bila težavnost lahko ZMERNA?
Ali je težavnost mogoče zmanjšati na zmerno, je odvisno od namena študije. Na primer s pogostim, natančnim spremljanjem živali in če obstaja možnost uporabe zgodnejših humanih končnih točk (npr. ob nastopu hromosti ali po obdobju blage hromosti v eni okončini ali z uporabo metod slikanja in vivo, da se odkrijejo zgodnje spremembe v patologiji sklepov), bi bilo mogoče postopek razvrstiti kot ZMEREN. Uporaba zgodnejših končnih točk (npr. končanje študije 6. dan po slikanju) bi bila možna pri projektih, ki raziskujejo zgodnje vnetne spremembe. Tudi profilaktično obravnavanje (ki se začne, preden se artritis popolnoma razvije) z novimi farmacevtskimi učinkovinami, ki imajo močne protivnetne učinke in zavrejo razvoj polnega artritisa, lahko privede do zmanjšanja težavnosti na ZMERNO. Vendar je cilj vrste študije, ki je ponazorjena tukaj, oceniti obravnavanje popolnoma razvitega artritisa, zato razvrstitev po težavnosti ostane TEŽAVNA. Bi težavnost lahko presegla zgornjo mejo?
V skladu s členom 15(2) Direktive „države članice zagotovijo, da se postopek ne izvede, če bi povzročil hude bolečine, trpljenje ali stisko, ki so po vsej verjetnosti dolgotrajni in jih ni mogoče olajšati“. Ta študija bi lahko povzročila več tednov trajajoče hudo trpljenje, ki bi ga bilo treba šteti za dolgotrajno. Če bi se hud artritis razvil v vseh štirih okončinah in se trpljenje živali ne bi olajšalo, bi študija presegla zgornjo mejo težavnosti in bi jo bilo treba nujno znatno izboljšati ali pa bi bilo treba uveljaviti „zaščitno klavzulo“ (člen 55 Direktive) ter Komisiji predložiti vlogo za izdajo odobritve.
Vendar pri tem primeru obstajajo ukrepi za zmanjšanje trpljenja ob hkratnem upoštevanju znanstvenega cilja, vključno z izboljšanjem sestave, aplikacije in izbire adjuvanta, dopuščanjem, da se artritis razvije samo na zadnjih okončinah, zagotavljanjem udobnega okolja in lahkega dostopa do hrane in vode,
44
celovitim sistemom spremljanja in določitvijo humanih končnih točk. Zato se za ta projekt ne bi štelo, da je presegel zgornjo mejo, in ga je mogoče odobriti na podlagi sicer pozitivne ocene projekta, ki vključuje pregled škode in koristi.
Primer lista za klinično točkovanje za vsakodnevno opazovanje artritičnih podgan je prikazan spodaj.
Datum: Dan 1 Dan 2 Dan 3 Dan 4
Videz
Telesna teža
Nenegovana dlaka
Dehidracija
Telesne funkcije
Dispnea
Tahipnea
Vedenje
Nerazpoloženost za premikanje
Otopelost/apatija
Negibnost
Oglašanje
Posebni kazalnik postopka
Točke za artritično okončino (glej tabelo 2)
Druga opažanja
(Poljubno besedilo)
Vsota točk
Opomba: vsi kazalniki so bili ocenjeni v skladu s sistemom v spodnjih tabelah 1 in 2. Na primer „1“ bi se vneslo na list za točkovanje poleg „nenegovana dlaka“ (tabela 1) in „5“ poleg „posebni kazalnik postopka“, če bi se zadnji okončini ocenili s točkami „3“ oziroma „2“ (tabela 2). Pri spodaj določenih ukrepih in končnih točkah se upoštevajo zahteve za preprečitev hudega trpljenja, kadar je to mogoče, vendar pa ne za humano usmrtitev živali, preden se pridobi dovolj podatkov, ker bi bilo treba zaradi tega uporabiti nadaljnje netretirane živali.
45
Tabela 1. Sistem točkovanja kazalnikov, ki se uporabljajo na listu za klinično točkovanje
Točke
Videz
Normalna izguba teže < 5 % 0
Izguba 5–10 % telesne teže 1
Izguba 11–15 % telesne teže 2
Izguba 16–20 % telesne teže 3
Izguba več kot 20 % telesne teže HEP
Nenegovana dlaka 1
Izguba elastičnosti kože/dehidracija
1
Telesne funkcije
Dispnea 2
Tahipnea 1
Vedenje
Nerazpoloženost za premikanje 1
Otopelost/apatija 2
Trajna negibnost < 24 h 3
Negibnost > 24 h HEP
Oglašanje pri ravnanju 1
Oglašanje, napetost in živčnost pri ravnanju
2
Oglašanje pri premikanju/spontano
3
Posebni kazalnik postopka
Točke za artritično taco (tabela 2) 0–8
Tabela 2. Posebni kazalnik postopka – točke za artritično okončino
0 Normalno
1 Kožna rdečina in otekanje enega gležnja
2 Kožna rdečina ter otekanje gležnja in zgornje polovice tarzalnih sklepov
3 Kožna rdečina ter otekanje gležnja in vseh tarzalnih sklepov do metatarzalnih sklepov
4 Kožna rdečina in otekanje celotne tace, vključno s prsti Ta sistem točkovanja za artritis, ki se uporablja kot posebni kazalnik postopka, temelji na naraščajočih stopnjah otekanja in obsklepne kožne rdečine. Točke temeljijo na fizičnem in vizualnem pregledu, uporabljajo pa se za izračun „artritičnega indeksa“, ki je opredeljen kot vsota točk za obe zadnji okončini.
46
HEP: humana usmrtitev se izvede ne glede na prisotnost ali odsotnost drugih kliničnih znakov. Primeri ustreznega ukrepanja v skladu z vsoto kliničnih točk
Potrebni ukrepi Vsota točk
Povečanje pogostosti spremljanja; proučitev dodatnih tekočin/oskrbe ≥ 4
Pregled napredovanja skupaj z veterinarjem 5–15
Humana usmrtitev 16
Opomba: vsote točk so navedene na listih za klinično točkovanje, ki so izpolnjeni v skladu s sistemoma točkovanja v tabelah 1 in 2. Na primer pri živali z izgubo 12 % telesne teže, znaki zmanjšanega negovanja ter otekanjem obeh zadnjih gležnjev bi vsota točk znašala 5.
Retrospektivna ocena:
36 podgan je bilo imuniziranih z govejim kolagenom tipa II v nepopolnem Freundovem adjuvantu (FIA). Artritis se je razvil pri vseh živalih: do D10 je število točk za artritično taco znašalo 6. Vse živali so izgubile 5–10 % telesne teže. Meritve premera sklepov so pokazale znatno spremembo glede na osnovne podatke. Dnevna klinična opažanja so obsegala nenegovano dlako, nerazpoloženost za premikanje, apatijo, oglašanje pri ravnanju (med opazovanjem in menjavo kletke), zmanjšan vnos hrane in obdobja negibnosti.
12 živali je bilo uporabljenih v skupini, ki je prejela solno raztopino. Najvišje število točk za artritično okončino je znašalo od 6 do 8 pri vseh meritvah (D13, D16, D20 in D24). Tudi meritve premera sklepov so ob vseh meritvah pokazale znatno povečanje glede na osnovne podatke. Število kliničnih točk je znašalo od 4 do 8 z izgubo 5–15 % telesne teže, razen pri eni živali, ki je do D17 izgubila 21 % telesne teže in je bila potem humano usmrčena. Retrospektivna ocena: TEŽAVNO
47
12 živali je prejelo ZDRAVILO A v majhnem odmerku. Pri nobeni živali se število točk za artritično okončino do D16 ni razlikovalo od števila točk skupine, ki je prejela solno raztopino. Na D20 je število točk za artritično okončino pri eni živali znašalo 8, pri drugih pa od 6 do 7. Na D24 je pet živali imelo nekoliko nižje število točk za artritično okončino (od 5 do 7). Klinični znaki teh petih živali so se nekoliko izboljšali, njihova telesna teža je bila še vedno manjša za od 5 do 10 %; živali pa so se tudi še vedno manj gibale po kletki. Pri drugih sedmih živalih artritični in klinični znaki niso bili manjši kot pri skupini, ki je prejela solno raztopino. Retrospektivna ocena: TEŽAVNO
12 živali je prejelo ZDRAVILO A v velikem odmerku. Na D13 je število točk za artritično okončino znašalo od 4 do 6; tudi premeri sklepov so se neznatno zmanjšali. Klinični znaki so obsegali nenegovano dlako in izgubo < 10 % telesne teže. Na D16 se je število točk za artritično okončino znižalo na 4, premeri sklepov pa so se znatno zmanjšali. Telesna teža se je ustalila na D16. Pri nekaterih živali je bila še vedno opažena nerazpoloženost za premikanje. Od D20 naprej se je otekanje sklepov zmanjšalo na od 2 do 4. V kletki je bilo opaženo normalno vedenje. Telesna teža se je vrnila na ravni pred postopkom. Retrospektivna ocena: TEŽAVNO
Opomba: do konca študije se je v tretji skupini dvanajstih živali izkazalo, da je preskusna učinkovina „ZDRAVILO A“, ki je bila aplicirana v velikem odmerku, učinkovita pri zmanjšanju dejanske težavnosti na zmerno. Ker pa je bilo za model potrebno, da imajo vse živali popolnoma razvit artritis pred začetkom obravnavanja, ko so živali kazale klinične znake v skladu z razvrstitvijo „težavno“, je razvrstitev po dejanski težavnosti za te živali ostala težavna.
Ker ta projekt vključuje težavne postopke, mora uporabnik v pogovoru z organom za dobrobit živali, zootehnikom in imenovanim veterinarjem redno opravljati stalne preglede težavnosti, da se zagotovi neprekinjeno izvajanje načela 3R.
48
Primeri za ponazoritev postopka težavnosti Model 4 – Možganska kap
Nazadnje posodobljeno: 5. februar 2013
Splošni okvir Možganska kap je opredeljena kot izguba ali sprememba normalne telesne funkcije, ki je posledica nezadostne preskrbe dela možganov s krvjo. Kljub boljšemu razumevanju patofiziologije vaskularne poškodbe možganov je učinkovito zdravljenje možganske kapi še vedno pomembna in pereča zdravstvena potreba, zato potekajo raziskave, da bi se odkrili ustrezni preventivni in terapevtski ukrepi. Pri bolnikih se pojavljajo tri različne vrste možganske kapi: ishemična, intracerebralna krvavitev in subarahnoidna krvavitev, vendar večina živalskih modelov, ki so zdaj na voljo, temelji na ishemični vrsti. Modeli možganske kapi so po svoji naravi izziv z vidika dobrobiti živali. Dobra interakcija in komunikacija med vsemi posamezniki, ki so vključeni v znanstvene postopke (veterinarji, raziskovalci, zootehniki in osebjem za oskrbo), so ključni za zagotavljanje ustreznega ravnovesja med vzpostavitvijo veljavnega modela na tem raziskovalnem področju in zmanjšanjem trpljenja živali. Možganska kap se pri glodavcih rutinsko povzroča z začasno ali trajno zaporo srednje cerebralne arterije (model MCAO – Middle Cerebral Artery Occlusion). Cilj tega modela MCAO je eksperimentalno reproducirati žariščno cerebralno ishemijo, ki se pojavi pri možganski kapi, in ta model se zelo pogosto uporablja za proučevanje mehanizmov poškodbe, določanje potencialnih ciljev in preskušanje domnevnih nevroprotekcijskih učinkovin. Ugotovljene so bile razlike med linijami miši in podgan ter zapleten in znaten vpliv starosti, spola in nekaterih sočasno prisotnih bolezni, kot so sladkorna bolezen, visok krvni tlak in ateroskleroza. Medtem ko se pri predkliničnih raziskavah možganske kapi pogosto uporabljajo zdravi mlajši glodavci moškega spola, je mogoče vpliv zgoraj omenjenih dejavnikov raziskati na modelih z drugimi bolezenskimi stanji (npr. spontano hipertenzivne podgane, sladkorna bolezen pri podganah, povzročena s streptozotocinom (STZ)). V takšnih primerih uporabe modelov z bolezenskimi stanji sta lahko potrebna skrbnejše opazovanje kliničnih znakov in zgodnejša uporaba humanih končnih točk (HEP). V standardni zasnovi študije se živali urijo za opravljanje določenih vedenjskih preskusov pred postopkom MCAO. V terapevtskem obdobju, ki se določi v skladu z mehanizmom delovanja zdravila in ciljem študije, živali prejmejo testno spojino. Analiza rezultatov bi morala vključevati informacije o velikosti infarkta, umrljivosti in pogostosti zapletov (npr. subarahnoidna krvavitev) ter oceno telesnih funkcij in nevrološko oceno za spremljanje napredka. Zaporedno magnetnoresonančno slikanje (MRI) se je izkazalo kot zelo koristno orodje za pridobivanje informacij o tem, kako se v določenem obdobju spreminja velikost infarkta, vendar MRI lahko zagotovi tudi dodatne informacije o pretoku krvi in stanju presnove. Vključijo se lahko tudi histološke, biokemične in molekularne meje za določitev humanih končnih točk. Za modele možganske kapi se lahko uporabijo različni vedenjski preskusi. Najpreprostejši preskusi vključujejo sisteme nevrološkega točkovanja, s katerimi se oceni splošno nevrološko stanje, in preskuse položaja okončin, ki se uporabljajo za merjenje motoričnih refleksov. Ti se ponavadi uporabljajo za oceno
49
živali na akutni stopnji po možganski kapi. Pri dolgotrajnih študijah se lahko uporabijo zapletenejši preskusi za ocenjevanje senzoričnih in motoričnih funkcij (npr. obojestranski preskus z nalepko, hoja po palici, rotirajoča palica ali stopnice) ter kognitivnih funkcij, kot je spomin (npr. preskusi pasivnega izogibanja ali ocenjevanje strategij učenja). Kot dobra praksa se izvede skupina vedenjskih preskusov, pri čemer se za vsako stopnjo (akutno in dolgotrajno) vključi vsaj en preskus, da se zberejo izčrpne informacije o vplivu na senzorične, motorične in kognitivne funkcije. Te preskuse je treba skrbno izbrati, da se zajamejo morebitni učinki domnevnih terapevtskih strategij. Tukaj niso vključeni podrobni opisi vseh teh vedenjskih preskusov in načrtov urjenja, sta pa celovit pregled in razprava o uporabi teh preskusov objavljena v Schaar et al. (2010). Referenčna besedila
Braeuninger S in Kleinschnitz C.: Recent models of focal cerebral ischemia: procedural pitfalls and translational problems (Novi modeli žariščne cerebralne ishemije: postopkovne pasti in translacijske težave). Experimental & Translational Stroke Medicine, november 2009; 1:8.
Freret T in Bouet V. Improvements of the Stroke Model Guidelines – Animal body weight and long-term functional concerns (Izboljšave smernic za modele možganske kapi – pomisleki glede telesne teže in dolgoročne povrnitve funkcij živali). Experimental & Translational Stroke Medicine, 2009; 2(2): 28–31.
Graham SM et al.: Animal models of ischemic stroke: balancing experimental aims and animal care (Živalski modeli ishemične možganske kapi: ravnovesje med eskperimentalnimi cilji in oskrbo živali). Comparative Medicine, oktober 2004; 54(5): 486–496.
Yanamoto H et al.: Evaluation of MCAo stroke models in normotensive rats: standardized neocortical infarction by the 3VO technique (Ocena modelov možganske kapi MCAO pri normotenzivnih podganah: standardizirana povzročitev infarkta neokorteksa z zaporo treh žil). Experimental Neurology, avgust 2003; 182(2):261–74.
Liu S et al.: Rodent stroke model guidelines for preclinical stroke trials (1st edition) (Smernice za predklinično preskušanje možganske kapi z modeli možganske kapi pri glodavcih (1. izdaja)). Journal of experimental stroke and translational medicine, 1. januar 2009;2(2):2–27.
Schaar KL et al.: Functional assessments in the rodent stroke model (Ocenjevanje funkcij v modelu možganske kapi pri glodavcih). Experimental &Translational Stroke Medicine, 2010; 2: 13; prost dostop na spletnem naslovu http://www.etsmjournal.com/content/2/1/13.
Virley et al.: A temporal MRI assessment of neuropathology after transient middle cerebral artery occlusion in the rat: correlations with behaviour (Časovno ocenjevanje nevropatologije z MRI po prehodni zapori srednje cerebralne arterije pri podganah: korelacije z vedenjem). Journal of Cerebral Blood Flow & Metabolism, 2000; 20: 563–582.
Študija Učinkovitost nove terapevtske učinkovine na podganjem modelu zapore srednje cerebralne arterije (MCAO) z intraluminalno nitjo
50
V tem primeru se bo pri 40 mladih podganah Sprague-Dawley moškega spola (300–350 g) v splošni anesteziji povzročila trajna zapora srednje cerebralne arterije (MCAO) s tehniko, pri kateri se uporablja intraluminalna nit. Podgane bodo naključno razvrščene (n = 10/skupino) in bodo prejele nosilec (10 ml/kg) ali novo testno učinkovino (spojino A) v odmerku 1, 3 ali 10 mg/kg z intravenozno infuzijo v repno veno, ki bo trajala 1 h in se bo začela 30 minut po MCAO. Naslednja odmerka (nosilec ali spojina A v odmerku 1, 3 ali 10 mg/kg) bosta aplicirana intraperitonealno 6 in 24 h po MCAO. Podgane bodo na začetku nastanjene v paru v kletkah s trdimi tlemi ter z globokim nastiljem in materialom za gnezda. Hrana bo med predhodnim urjenjem omejena, da se bo olajšala uspešnost na preskusu s stopnicami, pri katerem opravljanje naloge spodbuja želja po jedi. Živalim bo zagotovljena hrana ad libitum v obdobju od 6 ur pred operacijo do 6 dni po MCAO, da se bosta izboljšala pooperacijska teža in okrevanje. Rezultat delovanja funkcij se bo ocenjeval vsak dan s sistemom nevrološkega točkovanja (Bedersonova lestvica; glej Schaar et al., 2010) in vedenjskimi preskusi (obojestranski preskus z nalepko in hoja po palici); tudi preskus s stopnicami se bo izvajal vsak dan od 7. dneva po MCAO naprej, da bo dovolj časa za okrevanje po operaciji pred ponovno uvedbo omejevanja hrane. Pričakuje se, da vedenjski preskusi ne bodo povzročili znatne stiske. Magnetnoresonančno slikanje (MRI) bo opravljeno na anesteziranih podganah 1., 7., 14. in 28. dan, da se oceni velikost poškodbe. Vse živali bodo usmrčene 28 dni po MCAO. Začetna predhodna ocena ter proučitev posebnih izboljšav in določitev humanih končnih točk
Kakšne posege na živalih obsega ta študija?
Kaj bodo občutile živali? Koliko trpljenja lahko to povzroči? Kaj lahko to poslabša?
Kako bo trpljenje zmanjšano na minimum?
Škodljivi učinki Metodologija in posegi Usmrtitev
Predoperacijsko urjenje v vedenjskih preskusih v obdobju 2–3 tednov: obojestranski preskus z nalepko (za kontralateralno zanemarjanje), hoja po palici (za koordinacijo zadnjih okončin) in preskus s stopnicami (za priučeno iztegovanje sprednjih okončin)
Preden se živali privadijo preskusom, se lahko povzroči minimalni stres/tesnoba, saj je treba za opravljanje preskusov živali prenesti v nove prostore/arene.
Postopno privajanje preskusni napravi Umirjeno, obzirno ravnanje z živalmi
Izločitev iz urjenja, če se opazijo znaki stiske. Živali, ki ne dosežejo osnovne uspešnosti v predhodno določenem roku, se izključijo iz študije.
Omejevanje hrane (85–90 % teže pri prostem hranjenju) pred operacijo in od 7. dneva po MCAO, da se olajša uspešnost na preskusu s stopnicami
Blaga lakota; možna frustracija in tesnoba
Izguba telesne teže ne preseže 10 %, sicer se omejevanje hrane prekine.
Če se opazijo vedenjske težave zaradi manjšega vnosa hrane, se živali izločijo iz študije.
51
V splošni anesteziji se povzroči prehodna (90 minut) zapora srednje cerebralne arterije z intraluminalno nitjo, vstavljeno skozi skupno karotidno arterijo
Bolečina in neugodje, povezana z operacijo Možnost nepričakovanih kirurških zapletov, npr. subarahnoidna krvavitev, ipsilateralna poškodba očesne mrežnice, nastanek intraluminalnega krvnega strdka, prizadetost hipotalamusa zaradi možganskega edema s posledično hipertermijo ali nekrozo temporalne mišice. Ti zapleti se lahko pokažejo na veliko različnih načinov, na primer nenadni kolaps, ohromelost, močno nagibanje glave, napadi. Averzija in možno vplivanje anestezije na fiziološke spremenljivke (kot so hipotermija, nizek krvni tlak, hipoksija) Majhen vnos hrane zaradi zmanjšane stopnje zavesti, slabšega žvečenja in slabe motilitete, na splošno v prvih 48 h po MCAO Stopnja gibalne motnje, ki bi lahko povzročila stres in/ali frustracijo.
Uporaba ustreznih in minimalno averzivnih anestetikov ter ustreznih analgetikov (tj. učinkovitih, vendar z minimalnimi nevroprotekcijskimi lastnostmi) Dobro usposobljen kirurg, ki uporablja ustrezno aseptično kirurško tehniko (z rednim pregledovanjem stopnje uspešnosti) Vzdrževanje homeostaze med anestezijo Uporaba standardiziranih monofilamentov in kirurške tehnike, da se zmanjšajo spremenljivost in zapleti, ki izhajajo iz obsežnih poškodb. Intenzivna pooperacijska oskrba prve 3–5 dni, vključno z zunanjimi viri toplote. Redno preverjanje telesne teže; vsakodnevno opazovanje in oskrba ran Zagotavljanje lahko dostopne hrane in vode v obdobju okrevanja ali dodatne hrane
Živali se humano usmrtijo, če se zgodi kar koli od naslednjega:
znatne tehnične težave med operacijo
nepopolno okrevanje po anesteziji
znaki nepričakovanih kirurških zapletov
če izguba telesne teže živali preseže 20 % telesne teže pred operacijo kljub dodatnemu hranjenju in/ali rehidraciji ali če je žival negibna več kot 24 ur
52
(pretlačene, tekoče) ter po potrebi pomoči pri hranjenju; po potrebi rehidracija (npr. z injiciranjem solne raztopine)
Vedenjski preskusi (obojestranski preskus z nalepko in preskus s hojo po palici) se opravljajo vsak dan od 1. do 28. dneva po MCAO; preskus s stopnicami se opravlja vsak dan od 7. dneva po MCAO
Za živali so lahko te naloge stresne, če so zmanjšane njihove gibalne sposobnosti.
Spremljanje vedenjskih kazalnikov tesnobe ali stiske. Izkušeno osebje stalno opazuje živali.
Navadno se določi najdaljši čas (skrajna meja), v katerem mora biti naloga opravljena, in dodeli se končno število točk.
Aplikacija nove terapevtske učinkovine s podkožnim/intravenoznim/intraperitonealnim načinom pred in/ali po operaciji (profilaktično/terapevtsko)
Prehodno neugodje, povezano z načinom aplikacije Pri apliciranih odmerkih ni pričakovati škodljivih učinkov.
Aplikacija v skladu z uporabo dobre prakse ter z načinom in tehniko, ki povzročata kar najmanj bolečin/stiske, ob upoštevanju znanstvenih ciljev. Živali se natančno opazujejo, da se odkrije morebitni pojav škodljivih učinkov testnih snovi.
Živali se humano usmrtijo, če se opazi kakršen koli hud stranski učinek nove terapevtske učinkovine.
Longitudinalni MRI v anesteziji na 1., 7., 14. in 28. dan po MCAO
Ponavljajoča se anestezija Averzija in možno vplivanje anestezije na fiziološke spremenljivke (kot so hipotermija, nizek krvni tlak, hipoksija)
Uporaba ustreznih in minimalno averzivnih anestetikov Vzdrževanje homeostaze med anestezijo, vključno s tekočinsko terapijo pred ali med anestezijo, če obstajajo težave z dehidracijo, in ogrevanje, da se ohrani normalna telesna temperatura.
Živali, ki po anesteziji ne okrevajo popolnoma, se evtanazirajo. Živali se humano usmrtijo, če po okrevanju ni mogoče vzdrževati homeostaze.
53
Analiza Ta model se šteje za TEŽAVNEGA zaradi opravljenega kirurškega posega, škodljivih (vendar navadno prehodnih) učinkov MCAO na dobrobit živali in možnosti znatnih perioperativnih zapletov. Vendar je neugodni učinek na dobrobit živali mogoče zmanjšati z intenzivno pooperativno oskrbo, ki se zagotavlja vsaj prvih 48 h, in natančnim spremljanjem naslednje stopnje s takojšnjim ukrepanjem v primeru kakršnih koli težav. Z eksperimentalnega vidika je s pozornostjo, namenjeno izboljšanju in standardizaciji vseh posameznih postopkov, mogoče zmanjšati pogostost zapletov in spremenljivosti, s tem pa izboljšati kakovost podatkov in zmanjšati število uporabljenih živali. Predhodna razvrstitev po težavnosti v TEŽAVNO kategorijo je zato ustrezna. Bi bila težavnost lahko ZMERNA?
Čeprav naj bi bila predvidena težavnost tega modela zaradi zgoraj navedenih razlogov vedno TEŽAVNA, pogostost hudih učinkov lahko zmanjšajo izkušeni kirurgi v povezavi s strokovnim veterinarskim nadzorom in oskrbo živali ter dogovorjeni zgodnji posegi v primeru zapletov. ZMERNA težavnost bi se v nekaterih primerih lahko odobrila, vendar le za vsak primer posebej in za posamezne raziskovalne skupine, ki imajo dokazane izkušnje s tem modelom in za katere je znano, da lahko model uporabijo, ne da bi povzročile več kot zmerno trpljenje. Klinično opazovanje Živali se v pooperativnem obdobju zelo skrbno spremljajo. Po potrebi se zagotovita analgezija in lokalna podporna terapija. Primer sistema kombiniranega nevrološkega/kliničnega točkovanja, ki se uporablja kot pripomoček za spremljanje kliničnega stanja živali ves čas postopka, je vključen na koncu tega primera. Rezultati V skupini, ki je prejela nosilec, so vse živali razen ene zaradi intenzivne perioperativne podpore po operaciji okrevale brez nepričakovanih zapletov.
– Vseh 10 živali, ki so prejele nosilec, je imelo ves čas študije najnižje število nevroloških točk, hkrati pa so bile te živali pri vedenjskih preskusih manj uspešne od obravnavanih živali. Število kliničnih točk je bilo v obdobju takoj po MCAO (prvih 48 h) podobno kot pri obravnavanih živalih, pozneje so bile opažene razlike med živalmi v skupini, ki je prejela nosilec:
1/10 je bilo treba evtanazirati 2. dan po operaciji zaradi izgube > 20 % telesne teže (kljub dodatnemu hranjenju in rehidraciji). Ocena: TEŽAVNO
Pri 6/10 se je razvila zmerna nevrološka motnja, vendar se je število njihovih kliničnih točk v določenem obdobju minimalno izboljšalo.
54
Ukrepi
1 točka Pregled pogostosti spremljanja
4 točke Dodatna oskrba, npr. dodatne tekočine in namočena pretlačena hrana
5 točk Pregled napredovanja skupaj z veterinarjem
12 točk Izvedba humanega pokončanja
Ocena: TEŽAVNO
Pri 3/10 se je razvila zmerna nevrološka motnja in število njihovih kliničnih točk se je v določenem obdobju postopoma zmanjšalo, morda zaradi njihove sposobnosti kompenzacije in prilagajanja dolgotrajnim nevrološkim motnjam.
Ocena: ZMERNO
– Pri vseh 20 živalih, ki so prejele spojino A v manjših odmerkih (1 in 3 mg/kg), se je število nevroloških točk izboljšalo po 48 h po MCAO, izboljšalo pa se je tudi število kliničnih točk.
Ocena: ZMERNO
– Pri vseh 10 živalih, ki so prejele spojino A v največjem odmerku (10 mg/kg), se je število nevroloških točk po 24 h po MCAO izboljšalo v primerjavi s skupino, ki je prejela nosilec, v 24 urah po operaciji je bila izguba telesne teže le minimalna (5 %), število kliničnih točk pa se je po 48 h po MCAO znatno izboljšalo.
Ocena: ZMERNO Ocena dejanske težavnosti Težavnost pri 7 živalih velja za TEŽAVNO; težavnost pri 33 živalih velja za ZMERNO. Sistem točkovanja Ocena težavnosti se izvede s kombinacijo splošnih kliničnih opažanj (telesna teža, videz, vedenje, okolje v kletki) in posebne nevrološke ocene postopka. Bedersonova lestvica je splošna nevrološka ocena, ki je bila razvita za merjenje nevroloških okvar po možganski kapi. Uporablja se ocenjevalna lestvica 0–3, pri čemer je 0 = normalno in 3 = najvišja stopnja prizadetosti. Preskusi obsegajo upogib sprednjih okončin, odpornost proti stranskemu sunku in kroženje. Ocena 0: ni opazne motnje Ocena 1: upogibanje sprednjih okončin Ocena 2: zmanjšana odpornost proti stranskemu sunku (in upogibanje sprednjih okončin) brez kroženja Ocena 3: enako vedenje kot pri oceni 2 in kroženje HEP: humana usmrtitev
Točke
Videz
Izguba 5–10 % telesne teže 1
Izguba 11–15 % telesne teže 2
Izguba 16–20 % telesne teže 3
55
Ukrepi – upoštevati je treba, da se kirurški zapleti na splošno opazijo v obdobju okrevanja takoj po operaciji, zato sta v prvih 24 urah nujno potrebna natančno spremljanje in strokovna, obzirna presoja, da se ugotovijo škodljivi učinki in sprejmejo ukrepi za odpravljanje teh učinkov, živali pa se humano usmrtijo, če njihovo trpljenje preseže težavno kategorijo.
Izguba več kot 20 % telesne teže HEP
Nekoliko neurejena dlaka 1
Rahla piloerekcija 2
Opazna piloerekcija 3
Vedenje
Nekoliko nenormalna hoja 1
Opazno nenormalna hoja 2
Znatne težave z gibanjem 3
Negibnost > 24 h HEP
Napetost in živčnost pri ravnanju 2
V opazni stiski pri ravnanju, npr. tresenje, oglašanje, napadalnost
3
Okolje
Nekoliko neurejeno gnezdo 1
Komaj prepoznavno gnezdo 2
Ni gnezda 3
Nevrološko točkovanje
Upogibanje sprednjih okončin 1
Zmanjšana odpornost proti stranskemu sunku (in upogibanje sprednjih okončin) brez kroženja
2
Enako vedenje kot pri oceni 2 in kroženje 3
56
Primer lista za opazovanje posameznih živali (dnevi 0–4)
Dan 0 1 2 3 4
Videz
Telesna teža (g) (točke) 320 (0) 292 (1) 285 (2) 287 (1) 292 (1)
Stanje dlake
Neurejena dlaka/piloerekcija 1 1 0 1 0
Vedenje
Hoja 3 2 2 2 1
Odziv na ravnanje 0 0 2 0 0
Okolje
Stanje gnezda 3 2 1 0 0
Posebno nevrološko točkovanje za postopek 2 2 1 1 1
Vsota točk 9 8 8 5 3
Velikost poškodbe (ocena na podlagi MRI)*
11 %
Druga opažanja Okrevanje po operaciji brez posebnih dogodkov, ni zapletov. Odmerek pri 30 minutah in 6 h
Žival se giblje po kletki in poskuša narediti gnezdo.
Vedenjski preskusi, sprva tesnoba, vendar vse uspešno opravljeno, gnezdo je bolj dovršeno.
Danes dlaka malo slabše negovana, vendar stabilna teža in dobro gnezdo
Uspešno opravljeni vedenjski preskusi, manj tesnobe in opazno izboljšana hoja
* Polje „velikost poškodbe“ (ocenjena na podlagi MRI) raziskovalec izpolni na koncu študije. Te podatke je potem mogoče povezati s kliničnimi in vedenjskimi opažanji, da se omogoči nadaljnje izboljšanje spremljanja, oskrbe živali in postopkov.
57
Primeri za ponazoritev postopka težavnosti Model 5 – Proizvodnja poliklonskih protiteles v kuncu
Nazadnje posodobljeno: 5. februar 2013
Splošni okvir Glavni cilj proizvodnje protiteles v laboratorijskih živalih je pridobiti antiserume z visokim titrom in visoko afiniteto za uporabo v eksperimentalnih ali diagnostičnih testih. Velik del sodobne biologije in biokemije je odvisen od razpoložljivosti zelo specifičnih protiteles, ki se uporabljajo pri različnih tehnikah, kot so imunohistokemija, testi ELISA, imunoprecipitacija in imunski odtis. Zato je proizvodnja velikih količin specifičnih protiteles, usmerjenih v ustrezne proteine ali peptide, bistvena za uspeh številnih osnovnih in uporabnih raziskovalnih programov. V tem primeru se kunec uporabi za pridobivanje protiteles proti majhnim peptidom, ki naj bi imeli pomembno vlogo pri uravnavanju celične delitve, v okviru raziskovalnega programa, ki obsega biokemijske študije celične delitve pri sesalcih. Referenčna besedila
Canadian Council on Animal Care (2002): Smernice o proizvodnji protiteles. Prenos na spletnem naslovu http://www.ccac.ca/Documents/Standards/Guidelines/Antibody_production.pdf.
EFPIA/ECVAM (Diehl K-H et al.) (2001): A good practice guide to the administration of substances and the removal of blood, including routes and volumes (Napotki za uporabo dobre prakse pri apliciranju snovi in odvzemu krvi, vključno z načini in količinami). Journal of Applied Toxicology 21: 15–23
Skupna delovna skupina za izboljšanje (2001): Refining procedures for the administration of substances (Izboljšanje postopkov apliciranja snovi). Laboratory Animals 35: 1–41.
Keating SCJ, Thomas AA, Flecknell PA in Leach MC (2012): Evaluation of EMLA cream for preventing pain during tattooing of rabbits: changes in physiological, behavioural and facial expression responses (Ocena kreme EMLA za preprečevanje bolečine med tetoviranjem kuncev: spreminjanje fizioloških in vedenjskih odzivov ter odzivov z izrazi obraza). PLOS ONE 7(9): e44437 (prost dostop http://www.plosone.org).
Leenars M, Hendriksen CFM (2005): Critical steps in the production of polyclonal and monoclonal antibodies: evaluation and recommendation (Kritični koraki pri proizvodnji poliklonskih in monoklonskih protiteles: ocena in priporočilo). ILAR Journal 46: 269–279.
Stills HF (2005): Adjuvants and antibody production: Dispelling the myths associated with Freund’s complete and other adjuvants (Adjuvanti in proizvodnja protiteles: podiranje mitov, povezanih s popolnim Freundovim adjuvantom in drugimi adjuvanti). ILAR Journal 46: 280–293.
UFAW/RSPCA (2008) Refining Rabbit Care: A Resource for Those Working With Rabbits in Research (Izboljšanje oskrbe kuncev: dokumentacija za osebje, ki dela s kunci pri raziskavah). Southwater, UK: RSPCA (brezplačni prenos na spletnem naslovu http://www.rspca.org.uk/researchrabbits).
58
Študija Na podlagi izkušenj iz preteklosti je bilo ugotovljeno, da bi moral en kunec zagotoviti dovolj materiala za posamezne ustrezne peptide. Kunec bo nastanjen v talni kunčnici v stabilni skupini kompatibilnih kuncev (ki se prav tako uporabljajo za proizvodnjo protiteles), na voljo bo imel dovolj prostora za obogatitev, fizično aktivnost in normalno socialno vedenje (UFAW/RSPCA, 2008). Žival se bo imunizirala z mešanico antigena/adjuvanta. Ob predhodno določenih časih se bodo vzeli majhni vzorci krvi, da se bo ugotovilo, ali je bila imunizacija uspešna. Ko bo dosežen ustrezen titer protiteles, se bo opravila izkrvavitev živali v globoki anesteziji za odvzem protiteles v krvi. Ravnanje s kunci lahko povzroči stres in to delo bi moralo opravljati le usposobljeno in obzirno osebje. Vedenje kuncev je težko razlagati in dobra praksa vključuje redno seznanjanje z literaturo o vedenju in dobrobiti kuncev. Novejša literatura na primer navaja, da kunci v določenih okoliščinah pokažejo „trpeč izraz“ (Keating et al., 2012), in možnost uporabe tega kot orodje za ocenjevanje dobrobiti bi bilo treba proučiti za vsak primer posebej. Zaradi slabe imunogenosti kratkoverižnega peptida bo potrebna aplikacija skupaj z adjuvantom. V preteklosti se je uporabljal popolni Freundov adjuvant (FCA), vendar so zdaj na voljo sintetični adjuvanti, ki so prav tako učinkoviti za ta postopek in minimalno dražeči. Začetna predhodna ocena ter proučitev posebnih izboljšav in določitev humanih končnih točk
Kakšne posege na živalih obsega ta študija?
Kaj bodo občutile živali? Koliko trpljenja lahko to povzroči? Kaj lahko to poslabša?
Kako bo trpljenje zmanjšano na minimum?
Škodljivi učinki Metodologija in posegi Usmrtitev
Imunizacija z antigenom in adjuvantom; tri podkožna injiciranja na 8., 22. in 37. dan
Neugodje po injiciranju. Možen nastanek nebolečih bulic kot odziv na adjuvant. Možnost vnetja na mestu injiciranja (redko)
Količina, sestava in pogostost injiciranja bodo v skladu s smernicami za dobro prakso (npr. EFPIA/ECVAM ali skupna delovna skupina za izboljšanje), navadno največ štiri mesta injiciranja in 0,25 ml na posamezno mesto. Za kakršno koli vnetje se takoj zagotovi ustrezno veterinarsko
Žival se humano usmrti, če se pojavijo kakršni koli znaki dolgotrajnega neugodja, bolečine ali stiske (npr. trajno namenjanje pozornosti mestom injiciranja ali bulicam) ali če se pojavi vnetje, ki se ne celi.
59
Analiza Zaradi izboljšav reje in oskrbe, dobre prakse za apliciranje in odvzem vzorcev ter izbire minimalno dražečega adjuvanta se pričakuje le blaga težavnost. Predhodna razvrstitev po težavnosti v BLAGO kategorijo je zato ustrezna. Bi bilo mogoče postopek še izboljšati? Možnost uporabe minimalno dražečih adjuvantov in manj averzivnih anestetičnih učinkovin je treba redno preverjati s spremljanjem literature in razpravljanjem o tem vprašanju s kolegi. Lahko bi se pripravil načrt privajanja mlajših kuncev na postopek, da bi se stres še bolj zmanjšal (UFAW/RSPCA, 2008). Klinična opažanja Ker so se pri tej študiji pričakovali le manjši škodljivi učinki, je bil uporabljen osnovni sistem spremljanja, tj. žival se je preverjala vsak dan in opažanja so se evidentirala, vendar se je štelo, da ni potreben strukturiran list za evidentiranje. Primer za ponazoritev lista za opazovanje je vključen na koncu tega primera.
zdravljenje
Odvzem vzorcev krvi za oceno tvorbe protiteles (ob največ 5 priložnostih)
Ulov, ravnanje in omejevanje premikanja, kar je lahko stresno. Manjše neugodje zaradi vboda z iglo. Majhno tveganje za krvavitev ali hematom.
Vzorci se vzamejo iz površinske (ušesne) vene. Majhne količine krvi (< 5 ml) le za preverjanje titrov protiteles. Na mesto odvzema je treba pritisniti.
Če postopek pri živali povzroči preveč stresa, se odvzem vzorca odloži, dokler vedenje živali ne postane spet normalno.
Izkrvavitev v globoki anesteziji Manjše neugodje in morebitna averzija do učinkovine med dajanjem anestezije
Uporaba minimalno averzivne anestetične učinkovine
Žival ostane v anesteziji do smrti.
60
Ocena dejanske težavnosti Evidentiranega je bilo nekaj prehodnega, rahlega otekanja na enem mestu injiciranja, vendar zdravljenje ni bilo potrebno. Kunec je krajši čas posvečal nekaj pozornosti mestom injiciranja, vendar se je štelo, da to kaže le na blago neugodje. „Boleči izrazi“ niso bili opaženi. Škodljivi učinki zaradi dejanskega odvzema vzorcev krvi iz ušesne vene niso bili opaženi. Štelo se je, da je ustrezna dejanska težavnost za to žival BLAGA. Primer lista za opazovanje
Proizvodnja protiteles v kuncu – list za postopke in opazovanje
Datum Telesna teža (kg)
Pripombe
01/03 3,5 Predhodna krvavitev – 5 ml iz ušesne vene; škodljivi učinki niso bili opaženi
02/03 Nepravilnost ni zaznana (NAD)
06/03 NAD
07/03 NAD
08/03 3,6 Imunizacija – 0,25 ml na 2 mestih podkožno, nekajminutno namenjanje rahle pozornosti mestoma injiciranja (negovanje dlake), potem spet normalno
09/03 NAD
10/03 NAD
11/03 NAD
12/03 Rahla, mehka neboleča oteklina na mestu injiciranja na levi strani
13/03 Oteklina na mestu injiciranja na levi strani še vedno prisotna, brez poslabšanja
14/03 Oteklina na mestu injiciranja na levi strani še vedno prisotna, vendar ni boleča na otip
15/03 3,6 Oteklina izginila, vse normalno
21/03 NAD
61
22/03 3,6 Imunizacija – 0,25 ml na 2 mestih podkožno, kratko namenjanje pozornosti mestoma injiciranja
28/09 NAD
29/03 3,7 NAD
30/03 Preskusna krvavitev – 2 ml iz ušesne vene, brez škodljivih učinkov
05/04 NAD
06/04 3,6 Imunizacija – 0,25 ml na 2 mestih
14/04 3,6 NAD
15/04 Preskusna krvavitev – 2 ml iz ušesne vene, brez škodljivih učinkov
26/04 NAD
27/04 3,6 Izkrvavitev v globoki anesteziji, brez škodljivih učinkov
Hraniti je treba potrdilo o tem, da je bila žival pregledana vsaj enkrat na dan – npr. v evidenci posamezne živali (kot zgoraj) ali v evidenci prostora.
62
Primeri za ponazoritev postopka težavnosti Model 6 – Proizvodnja in vzdrževanje gensko spremenjenih živali
Nazadnje posodobljeno: 5. februar 2013
1. Splošni okvir Uporaba gensko spremenjenih živali v raziskavah prispeva k razumevanju delovanja genov in njihovih ustreznih proteinov. Različni fenotipi lahko različno vplivajo na dobrobit živali, nekateri pa lahko povzročijo bolečino, trpljenje ali stisko. Čeprav so nekateri fenotipi in rezultati predvidljivi, se med ustvarjanjem gensko spremenjenih linij lahko pojavi veliko nepričakovanih ali sekundarnih lastnosti, zato težavnosti ni mogoče vedno natančno predvideti. V praksi pri številnih gensko spremenjenih linijah ni vpliva na fenotip in lahko se pripravijo protokoli za ocenjevanje, s katerimi je mogoče zaznati vse neugodne fenotipe. Po drugi strani je lahko pričakovani fenotip pogosto povezan z nepredvidenimi sekundarnimi fenotipi, ki se pojavijo ob drugem času in na katere lahko vplivajo drugačni okoljski dejavniki. Pri ocenjevanju dejanske škode za žival je treba upoštevati več dejavnikov, kot so vrsta mutacije, genotip, fenotip in strategija vzreje (npr. preprečevanje pojavljanja škodljivih homozigotnih fenotipov s parjenjem heterozigotov in prostoživeče vrste), pa tudi naravo vseh dodatnih znanstvenih postopkov ali postopkov reje ter možne učinke vseh teh dejavnikov. Za učinkovito oceno stanja dobrobiti živali so potrebna sistematična in ustrezno časovno opredeljena opazovanja tako med napredovanjem kolonije kot ves čas eksperimentalne stopnje kolonije. Nove linije je treba skrbno spremljati in jih oceniti s standardno oceno dobrobiti. Ustrezno izobraženo in usposobljeno osebje mora posamično oceniti vse linije med napredovanjem in vzdrževanjem kolonije, informacije o posebnih neugodnih učinkih, ki so bili opaženi, pa je treba primerjati in o njih poročati. Osebje z ustreznimi dovoljenji mora uporabiti vse vključene znanstvene postopke ter skupaj z osebjem za oskrbo spremljati in evidentirati vse učinke na živali. Humane končne točke je treba predhodno določiti glede na parametre, kot so izguba telesne teže, telesno stanje in ustrezno vedenje, pa tudi posebne razvojne značilnosti. Živali se ne smejo ohraniti pri življenju, če presežejo predvideno mejo težavnosti, razen če obstajajo tehtni znanstveni razlogi, v tem primeru pa se ohranijo pri življenju le z odobritvijo pristojnega organa. Narava, časovna razporeditev in trajanje opazovanj so odvisni od številnih dejavnikov, ne samo od uporabljene mutacije. Genska podlaga in okoljske razmere, v katerih se vzdržujejo živali, lahko na primer znatno spremenijo izraženost fenotipa. Te posebne dejavnike je treba natančno evidentirati, da se olajšata boljše primerjanje med organizacijami in na splošno spremljanje gensko spremenjenih živali. Upoštevati je treba tudi življenjsko dobo posamezne linije v posamezni organizaciji, saj nekateri fenotipi nastopijo pozno in jih je mogoče opaziti le, če se živali ohranijo pri življenju dlje časa.
63
Referenčna besedila Delovna skupina RSPCA za potni list gensko spremenjenih živali (2010): GA Passports: The Key to Consistent Animal Care (Potni listi gensko spremenjenih živali: ključ do dosledne oskrbe živali). Southwater, UK: RSPCA (prenos na spletnem naslovu http://www.rspca.org.uk/sciencegroup/researchanimals/implementing3rs/gapassport). Wells DJ et al. (2006): Assessing the welfare of genetically altered mice (Ocenjevanje dobrobiti gensko spremenjenih miši) Laboratory Animals 40(2): 111–114 (prenos na spletnem naslovu http://www.nc3rs.org.uk/downloaddoc.asp?id=356&page=231&skin=0).
2 Primeri Trije primeri v spodnjih oddelkih od 2.1 do 2.3 ponazarjajo, kako se lahko oceni težavnost pri gensko spremenjenih miših, vključno s pregledom razvojnih mejnikov, vplivom postopka in razvojem kolonij. Vsi primeri se bolj osredotočajo na načela ocene težavnosti, kot da bi upoštevali vse možne scenarije med celotnim razvojem kolonije. Pri ustvarjanju posameznega modela se bodo upoštevali standardizirani postopki, pri katerih so potrebni kirurška priprava plemenskih samcev, na katerih se opravi vazektomija, ravnanje z zarodki ter kirurška vsaditev zarodkov v prejemne navidezno breje samice. Uporablja se dobra praksa v zvezi z asepso, uravnavanjem bolečine in usposobljenostjo kirurga. Potrditev prisotnosti genotipa pri potomcih izvorne ali zarodne linije, se bo preverila na podlagi vzorcev tkiva, pridobljenih kot stranski proizvod označevanja (zarezovanje ušes) ali z najmanj invazivno metodo, ki zagotavlja dovolj tkiva za oceno genotipa. Strategija fenotipizacije posamezne linije bo odvisna od gena, raziskovalnega področja in predvidenih učinkov. Ocena težavnosti se bo določila z vrsto standardiziranih opazovanj.
2.1 Model gensko spremenjene miši – GenAtm1a(Funding)Lab
2.1.1 Splošni okvir Ustvarjena je bila kolonija miši z novo mutacijo v genu GenA, ki je usmerjena v linijo izvornih celic zarodkov iz podlage C57BL/6N z neznanim fenotipskim potencialom. Model se je vzdrževal na opredeljeni podlagi (C57BL/6N). Po prenosu zarodne linije miši G1 se je opravil osnovni presejalni pregled za oceno dobrobiti na 30 mladičih iz 3–5 legel, dobljenih z neodvisnim parjenjem. Mladiči so se spremljali ob določenih mejnikih v razvoju kolonije – ob skotitvi, 14 dni po skotitvi (v povezavi z označevanjem mladičev in odvzemom tkiva za genotipizacijo) in ob odstavitvi. Ustrezen list za točkovanje se je pripravil na podlagi načrta ocenjevanja dobrobiti gensko spremenjenih živali (Wells et al., 2006). Opazovanja mladičev v kletki so izvedli zootehniki, pri čemer so upravljavci kolonije spremljali razmerja genotipov. Miši so bile po odstavitvi po možnosti skupinsko nastanjene v kletkah z ločenim prezračevanjem s steljo, materialom za gnezda in ustrezno obogatenim okoljem. Zootehniki so opravljali ocenjevanje v kletki med svojimi dnevnimi interakcijami, dokler miši niso
64
spolno dozorele. Dolgotrajnejše ocene s starostjo povezanih škodljivih učinkov na dobrobit so se spremljale in evidentirale pri gojenih živalih in bodočih plemenskih živalih. Vsa opažanja so se primerjala z linijo genetskega ozadja gensko spremenjene miši in ocenil se je njihov pomen. 2.1.2 Predhodna ocena
Kakšne posege na živalih obsega ta študija?
Kaj bodo občutile živali? Koliko trpljenja lahko to povzroči? Kaj lahko to poslabša?
Kako bo trpljenje zmanjšano na minimum?
Škodljivi učinki Metodologija in posegi Usmrtitev
Osnovni učinki genskega spreminjanja
Gensko spreminjanje lahko povzroči škodljive klinične učinke. V primerih, v katerih so ti učinki nepredvidljivi, bi lahko vsak znak, da živali z mutacijo odstopajo od normalnih fizičnih ali vedenjskih parametrov (tj. tistih, za katere je znano, da se pojavijo pri fenotipih, povezanih z gensko podlago, in/ali kontrolnih osebkih prostoživeče vrste), pomenil težave, povezane z dobrobitjo.
Stalno spremljanje v kletki Ocena dobrobiti ob določenih časih razvoja; skotitev, odstavitev in spolna zrelost Glede na naravo zaznanega škodljivega učinka se po možnosti uporabijo ustrezni dejavniki izboljšanja, kot so spremenjene strategije vzreje ali izboljšave reje (npr. več materiala za gnezda kot pomoč pri slabšem uravnavanju telesne temperature)
Živali se usmrtijo, če se preseže zmerna težavnost.
Odvzem vzorcev tkiva za genotipizacijo
Možna bolečina in/ali stiska zaradi metodologije odvzema vzorcev tkiva, npr. luknjanja/zarezovanja ušes ali prirezovanja repa Biopsija repa se navadno uporablja v primerih, v katerih so potrebne večje količine DNK, vendar lahko povzroči tako kratkotrajno kot dolgotrajno bolečino (slednjo zaradi oblikovanja nevroma).
Če se posamezne živali označijo z zarezovanjem ušes, dobra praksa po možnosti vključuje uporabo ušesnega tkiva za genotipizacijo. Pri prirezovanju repa je treba odvzeti čim manjši del repa (ob upoštevanju, da je ponavljajoče se odvzemanje vzorcev močno nezaželeno), ustrezno uporabiti anestezijo in analgezijo ter takoj zaustaviti čezmerno krvavenje.
Se ne uporablja, saj naj bi bil postopek „enkraten“ in ni verjetno, da bi povzročena bolečina ali stiska dosegla stopnjo, na kateri bi bilo potrebno humana usmrtitev.
65
Gen, ki se raziskuje, je nov mutant z neznanimi škodljivimi učinki. Izkušnje te organizacije kažejo, da ima velika večina podobnih modelov na splošno blag fenotip. Vendar se pri modelih občasno nepričakovano pojavijo zmerni klinični znaki, zato bi se ta primer na podlagi tega predhodno razvrstil kot ZMEREN. 2.1.3 Rezultati Začetna ocena novorojenih živali (ob skotitvi):
Barva mladičev (samo za novorojene)
Normalna
Aktivnost mladičev (samo za novorojene)
Normalna
Milije (samo za novorojene)
Prisotne
Leglo Vsi mladiči so v skladu s parametri podlage glede velikosti legel, homogenosti legel, razvoja in rasti mladičev.
Pri 14 dnevih po skotitvi in ob odstavitvi so bili opaženi naslednji kazalniki:
Spremljati je treba razvoj manj invazivnih tehnik ter jih lokalno oceniti in uporabiti, kadar je to izvedljivo.
Fenotipizacija Stres, povzročen z ravnanjem ali uporabo fenotipskega preskusa, npr. stres zaradi postavitve v neznano okolje, apliciranja eksperimentalnih spojin za povzročitev odziva, spremljanja okužbe, anestezije in omejitve premikanja pri slikanju itd.
Usposabljanje osebja, ki izvaja fenotipizacijo za kompetentno, obzirno in standardizirano ravnanje z živalmi in opazovanje. Uporaba anestezije med slikanjem ali bolečimi postopki. Strukturiranje fenotipskih preskusov od najmanj invazivnega (npr. opazovanje vedenja v odprtem polju) do najbolj invazivnega (npr. postopki, pri katerih je potrebna anestezija)
Če mutacija povzroči težaven odziv na fenotipski preskus, se dosežejo humane končne točke in se živali humano usmrtijo.
66
Splošni videz Vsi mladiči so bili z morfološkega vidika „normalni“. Znaki spačenosti niso bili opaženi.
Velikost, oblika in rast Normalna rast, v skladu s standardno krivuljo rasti za linijo genetskega ozadja
Stanje dlake Normalno
Vedenje – drža, hoja, aktivnost in interakcije z okoljem
Normalno vedenje in interakcije med vsemi živalmi v kletki; hiperaktivnost ali napadalnost ni bila opažena
Klinični znaki Niso bili zaznani
Relativna velikost Normalna v primerjavi s podlago
Število Umrljivost pred odstavitvijo je bila normalna v primerjavi s podlago
Klinična opažanja Vsa opažanja in razmerja novorojenih mladičev do odstavitve so se štela za normalna glede na gensko podlago (C57BL/6N), pri čemer so se homozigotne in heterozigotne miši ter miši divjega tipa skotile v normalnih Mendlovih razmerjih. Pri starosti 4 tednov se je na homozigotnih miših in kontrolnih miših prostoživeče vrste (7+7) opravila vrsta opazovalnih in blagih postopkovnih preskusov, kot so ocena SHIRPA, dismorfologija, odprto polje, kliničnokemijski pregled krvi, meritev z aparatom DEXA in slikanje z aparatom Faxitron v obdobju 16 tednov. Ob koncu tega eksperimenta se je pri fenotipski analizi pokazalo zmanjšanje sprejema glukoze pri homozigotnih miših po intraperitonealnem testu tolerance na glukozo (ipGTT). Čeprav se je sprejem glukoze med izzivom zmanjšal, se je stanje vseh živali po postopku vrnilo na osnovno raven in nadaljnji škodljivi učinki niso bili opaženi.
67
2.1.4 Analiza rezultatov Ocena dejanske težavnosti Po oblikovanju kolonije so se za ohranjanje in napredovanje kolonije uporabile heterozigotne miši in miši iz legla prostoživeče vrste. Pri nobeni od miši, uporabljenih za vzrejo in ohranjanje, niso bili opaženi škodljivi fenotipi, zato se je štelo, da pri teh miših ni škodljivih učinkov. Ker se ne pričakuje škodljivega fenotipa, bi ta linija lahko postala homozigotna in se ohranjala brez odobritve projekta. Z zgoraj navedenim parjenjem heterozigotnih miši so nastale homozigotne miši. Skupina teh miši se je uporabila za standardni presejalni pregled fenotipizacije, ki je obsegal več blagih postopkov, med drugim vstavljanje igle za odvzem vzorcev krvi med intraperitonealnim testom tolerance na glukozo. Hkrati so se preskusi opravili tudi na kontrolnih miših prostoživeče vrste. Zaradi odvzema vzorcev krvi in poznejših postopkov fenotipizacije bi bil kumulativni učinek na miši v nasprotju s splošnim učinkom genskega spreminjanja blag. Povzetek Vzreja in ohranjanje – ni škodljivih učinkov Homozigotne + kontrolne miši – BLAGO – zaradi presejalnih preskusov (ne učinek genskega spreminjanja) Lahko se šteje, da ima ta linija gensko spremenjenih miši neškodljiv fenotip. Za vzrejo teh linij ne bi bila potrebna odobritev projekta v skladu z direktivo.
2.2 Model gensko spremenjene miši – Tg(GenB)Labcode
2.2.1 Splošni okvir Kolonija miši z mutacijo, ki prekomerno izraža transgen, se bo ustvarila kot model za proučitev oblike raka. Linija bo ustvarjena na podlagi C57BL/6N. Vendar pa nastopa in hitrosti razvijanja tumorja ni mogoče opredeliti, zato bo v okviru opredelitve modela potrebna ocena. Po oblikovanju izvornih linij se opravi osnovni presejalni pregled za oceno dobrobiti, kot je opisano v oddelku 2.1. Najbolj uporabna linija se bo uporabila za proučitev te vrste levkemije.
68
2.2.2 Predhodna ocena
Pri raziskovanem modelu se povzroči mutacija, da se ustvari predvidena genska motnja. Začetka bolezni ni mogoče zlahka predvideti, je pa mogoče predhodno opredeliti klinične znake, da se omogoči opredelitev začetka. Po opredelitvi bi bilo treba model vzdrževati, da se omogoči njegova uporaba med naknadnim eksperimentalnim proučevanjem potencialnega zdravljenja te vrste raka v okviru študije. Na podlagi tega bi se ta primer predhodno razvrstil kot ZMEREN. 2.2.3 Rezultati Ocene dobrobiti so bile izvedene tako kot v oddelku 2.2 zgoraj. Nepravilnosti pri razvojnih mejnikih in rasti do spolne zrelosti niso bile opažene. Kolonija se je razširila s parjenjem gojenih živali in bodočih plemenskih živali, starejših od 10 tednov, da se je ohranjala kolonija in da so se pridobile nove poskusne živali. Živali so se spremljale ves ta čas in razvoj tumorja je bil opažen od starosti 18 tednov naprej pri 60 % živali z mutacijo. Klinični potek bolezni je trajal od 4 do 6 tednov, ko je bilo treba živali evtanazirati. 2.2.4 Analiza rezultatov
Kakšne posege na živalih obsega ta študija?
Kaj bodo občutile živali? Koliko trpljenja lahko to povzroči? Kaj lahko to poslabša?
Kako bo trpljenje zmanjšano na minimum?
Škodljivi učinki Metodologija in posegi Usmrtitev
Ocena in opredelitev razvoja tumorja
Izguba telesne teže in slabšanje stanja napredujeta z razvojem raka. Podkožne otekline lahko povzročijo neugodje ter vplivajo na normalno vedenje, držo ali gibanje. Živali so lahko bolj občutljive za obolenje zaradi oslabljenega imunskega sistema.
Posegi temeljijo na vsakodnevnih opazovanjih z uporabo meril, kot so izguba telesne teže, slabšanje telesnega stanja, otopelost itd. Vsakodnevno opazovanje in spremljanje splošnega zdravja in rasti tumorja.
Gojene in plemenske živali, ki kažejo klinične znake, ki ne spadajo v okvir eksperimentalnih postopkov, kot so izguba več kot 15 % telesne teže, slabo stanje dlake, otopelost, se humano usmrtijo. Živali se humano usmrtijo, če se tumor vname, če vpliva na normalno vedenje, držo ali gibanje ali če v premeru preseže 1,2 cm. Živali, ki sočasno kažejo znake druge bolezni, se humano usmrtijo.
69
Ocena dejanske težavnosti
Opaženo je bilo, da so se tumorji razvili pri 60 % živali z mutacijo, starejših od 18 tednov. V skladu s strategijo vzreje so se parile živali, starejše od 10 tednov. Štelo se je, da je možnost, da se pri vzrejnih parih razvijejo tumorji, tako velika, da je treba spremeniti vzrejo in ohranjanje. Vzrejni pari so se potem parili od starosti 6 tednov naprej, parjenje pa se je prekinilo do starosti 12 tednov, ko so bili plemenski samci usmrčeni. Gojene in plemenske samice so se spremljale vsak dan, da bi se odkrili zgodnji znaki razvoja tumorja. Živali, ki se niso uporabile ali ki niso bile potrebne, so bile humano usmrčene pred nastopom kakršnih koli kliničnih znakov.
Povzetek
Živali, mlajše od 18 tednov – ni škodljivih učinkov Živali, starejše od 18 tednov, pri katerih so se razvili tumorji – BLAGO zaradi določitve zgodnjih kliničnih končnih točk Živali, starejše od 18 tednov, pri katerih so se razvili tumorji in so bile namenjene uporabi – BLAGO ali ZMERNO glede na uporabo kliničnih končnih točk
2.3 Model gensko spremenjene miši – GenCtm1a(Funding)Lab
2.3.1 Splošni okvir
Kolonija miši z mutacijo v genu GenC je bila razvita za preskušanje lastnosti obnašanja in spomina. Genska sprememba je bila najprej narejena na embrionalnih matičnih celicah linije C57BL/6N z znanim fenotipskim potencialom za omenjeni lastnosti. Osnovni presejalni testi za oceno dobrobiti živali so bili izvedeni takoj na naslednji generaciji živali po potrditvi dedovanja mutacije preko spolnih celic. Model se je nato ohranjal na genetskem ozadju kontrolne linije C57BL/6N.
2.3.2 Predhodna ocena
Tako kot v oddelku 2.1 je raziskovani gen nov mutant. Model se namerava uporabljati v prihodnjih vedenjskih študijah, pri katerih se preskuša učinkovitost novih farmacevtskih spojin. Izkušnje te organizacije kažejo, da ima velika večina podobnih modelov na splošno blag fenotip. Vendar se pri modelih občasno nepričakovano pojavijo zmerni klinični znaki, zato bi se ta primer na podlagi tega predhodno razvrstil kot ZMEREN.
2.3.3 Rezultati
70
Vsa opažanja in razmerja so se štela za normalna glede na gensko podlago tega modela (C57BL/6N), pri čemer so se homozigotne in heterozigotne miši ter miši divjega tipa skotile v normalnih Mendlovih razmerjih.
Pri starosti 4 tednov se je na homozigotnih miših in kontrolnih miši divjega tipa opravila vrsta opazovanj in preskusov za oceno učenja in spomina. Preskusi so se opravljali v obdobju 10 tednov. Ob koncu te fenotipske analize niso bili opaženi škodljivi fenotipi. Model se je potem uporabil za preskušanje učinkovitosti novih farmacevtskih spojin.
Z vzrejo heterozigotnih miši so nastale zdrave homozigotne živali, ki so imele podobno sposobnost razmnoževanja kot sev podlage. Tako se je za zmanjšanje števila živali uporabila strategija vzreje s parjenjem homozigotnih živali. V nasprotju z izvornim parjenjem, pri katerem so homozigotne miši izhajale iz parjenja heterozigotnih miši, je nova skupina homozigotnih živali, ki je izhajala iz parjenja homozigotnih staršev, zaostajala v rasti ter ji ni uspelo popolnoma nadoknaditi velikosti in teže v primerjavi s sorojenci.
Čeprav se je linija prvotno nameravala uporabiti kot model za preskušanje vedenja in spomina, se je opravila nadaljnja analiza tkiva in krvi teh živali. Med analizo rezultatov biokemijskega pregleda krvi in naknadnim pregledom literature se je ugotovilo, da je gen GenC pomemben transportni protein, ki veže vitamin B12. Zaradi izbrisa gena GenC se je prekinil zunajcelični transportni mehanizem, kar je privedlo do poslabšanja sinteze DNK ter presnove maščob in proteinov. Učinka te mutacije ne bi bilo pri miših, ki bi jih skotila heterozigotna samica, saj se materinski vir vitamina B12 v maternici prenese prek posteljice do razvijajočega se ploda. Zato so imele izvorne živali, pri katerih je bil izklopljen ta gen, shranjenega dovolj vitamina B12, da so preživele in se uspešno razvijale vsaj do starosti 16 tednov, kar je zagotavljalo normalno vzrejo in plodnost v primerjavi s sevom podlage.
2.3.4 Analiza rezultatov
Ocena dejanske težavnosti Ta primer prikazuje, da ima ohranjanje kolonije lahko močan in pogosto nepričakovan učinek na miši. Glede na predhodno razpoložljive informacije ter rezultate prvotne vzreje in fenotipizacije ta kolonija ni kazala nobenih posebnosti. Seveda bi ohranjanje kolonije s strategijo parjenja homozigotnih živali običajno zagotovilo minimalno število živali, kar je zaželeno zaradi zmanjšanja uporabe živali. Nepredvideni škodljivi fenotipi se lahko pojavijo v linijah, ki so se prej ohranjale kot normalne živali brez odobritve projekta. Če bi se uporabljal tovrsten načrt vzreje, bi bila zaradi škodljivih učinkov na dobrobit živali v tem primeru potrebna odobritev projekta..
Povzetek
Vzreja in ohranjanje heterozigotnih parov – ni škodljivih učinkov Vzreja in ohranjanje homozigotnih parov – ZMERNA težavnost za potomce te generacije zaradi zaostajanja v rasti in neuspešnega razvoja
71
Primer 2.3 – to izpostavlja potrebo po prenosu natančnih in uporabnih podatkov o dobrobiti med inštituti v primerih, ko se lahko pojavijo škodljivi fenotipi, na primer v obliki „potnega lista za miši“i.
i Delovna skupina RSPCA za potni list gensko spremenjenih živali (2010): GA Passports: The Key to Consistent Animal Care (Potni listi gensko spremenjenih živali: ključ do dosledne oskrbe živali). Southwater, UK: RSPCA (prenos na spletnem naslovu http://www.rspca.org.uk/sciencegroup/researchanimals/implementing3rs/gapassport).
