实时荧光定量 PCR 技术的原理及应用 (Real time Quantitative PCR)

戚振华2012 年 12 月

15 日

Contents

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实时荧光定量 PCR 原理

实时荧光定量 PCR 的方法介绍

实时荧光定量 PCR 的应用

实时荧光定量 PCR 定义：

• 在 PCR 反应体系中加入荧光基团，利用荧光信号累积实现了实时监测整个 PCR 进程，对起始模板进行定量分析的方法。

与普通 PCR 的区别

普通 PCR 技术普通 PCR 技术 实时定量 PCR 技术实时定量 PCR 技术

在 PCR 结束后对终点产物进行定量分析。

实时检测 PCR 扩增，在扩增的指数期对起始模板进行定量。

相同模板进行 96 次扩增，终点处产物量不恒定； Ct 值则极具重现性。

Ct 值的定义： 扩增产物的荧光信号达到设定的阈值时所经过的扩增循环数。此时扩增是呈对数期增长。

Ct 值

定量 PCR 的数学原理

•理想的 PCR 反应： X=X0*2n

•非理想的 PCR 反应： X=X0(1+Ex)n

n ：扩增反应的循环次数X ：第 n 次循环后的产物量X0 ：初始模板量Ex ：扩增效率

在扩增产物达到阈值线时 : XCt=X0(1+Ex)Ct=M (1)XCt: 荧光扩增信号达到阈值强度时扩增产物的量。 在阈值线设定以后 , 它是一个常数 , 我们设为 M

方程式 (1) 两边同时取对数得 : log M=log X0(1+Ex)Ct (2)

整理方程式 (2) 得 : log X0= -log(1+Ex) *Ct+ log M (3)

最后结论： Log X0 与 Ct 呈线性关系，根据样品扩增的 Ct 值就可计算出样品中所含的模板量。

Log 起始拷贝量与 Ct 呈线性关系，通过已知起始拷贝数的标准品可作出标准曲线，根据样品 Ct 值，就可以计算出样品中所含的模板量。

标准曲线

实时荧光定量 PCR 的方法介绍

DNA 产物的荧光标记

非特异性荧光标记：1 、 SYBR Green

特异性荧光标记：2 、 TaqMan3 、 Molecular Beacon

SYBR Green 法工作机理

1.SYBR Green 只有和双链 DNA 结合后才发荧光。2.变性时， DNA 双链分开，无荧光。3.在延伸结束阶段采集荧光信号。4.SYBR Green 也能和非特异的双链 DNA 结合发光，所以必须在反应结束时做熔解曲线分析。

SYBR Green 熔解曲线分析

融解曲线分析，单一峰，无非特异性荧光，定量准确

融解曲线分析，出现杂峰其他产物出现非特异性荧光，因此定量不准确

SYBR Green 法优缺点

优点优点 缺点缺点

1. 对 DNA 模板没有选择性 -- 适用于任何 DNA

2. 使用方便 -- 不必设计复杂探针

3. 非常灵敏4. 便宜

1. 容易与非特异性双链 DNA 结合，产生假阳性，但可以通过融解曲线的分析，优化反应条件

2. 对引物特异性要求较高

TaqMan 法

1. 5′ 端标记有报告基团 (Reporter, R) ，如 FAM 、 VIC 等2. 3′ 端标记有荧光淬灭基团 (Quencher, Q)3. 探针完整， R 所发射的荧光能量被 Q 基团吸收，无荧

光， R 与 Q 分开，发荧光4. Taq 酶有 5′→3′ 外切核酸酶活性，可水解探针

TaqMan 法工作原理

每扩增一条 DNA 分子，释放一个荧光信号

TaqMan 法 PCR 反应的建立

1.引物、探针的设计：探针 Tm 为 68-70℃ ， <30 bp, 5’ 不能有 G ， G 可能会淬灭荧光素，引物尽量靠近探针，扩增片段 <400 bp ，引物 Tm 为 59-60℃2.反应参数的确定：一般为： 95 ,3min ℃ 、 94 ℃ ， 15S 、 60 ℃ ， 60S （ Taq 酶 5′→3′ 外切酶活性在 60℃ 最高也可通过温度梯度优化退火温度）3.优化引物和探针浓度：引物浓度： 50-900nM 探针浓度： 50-250nM4.其他与常规 PCR 相同

TaqMan 法优缺点

优点优点 缺点缺点

1. 对目标序列的高特异性 -- 阴性结果确定

2. 引物设计相对简单

3. 重复性比较好

1.只适合一个特定的目标2.委托公司标记，价格较高

荧光定量 PCR 技术的应用1. 绝对定量 基因表达研究 转基因食品检测2. 相对定量 基因在不同样本中的表达差异 药物疗效考核3. 阴阳性分析 病原体（ HBV ， HCV 等）检测 禽流感检测4. 等位基因分型 SNP 分析 与疾病相关的等位基因点突变检测

拓展应用1. MicroRNA 分析2. 基因拷贝数分析3. 表观遗传学分析4. 蛋白质分析5. 肿瘤稀有突变检

测

两种定量的不同方法

1.绝对定量检测起始模板数的精确拷贝数 标准曲线法

2.相对定量是确定经过不同处理的样本之间基因的表达 差异

2- Ct△ △

双标准曲线法

优点：给出的是目标基因的绝对数量，数据容易处理缺点：必须有标准品；标准品必须准确测定，难以制备和质控

绝对定量 相对定量优点：不需要知道模板的确切拷贝数。可以不做标准品；标准品容易制备；使用广泛缺点：数据处理比较麻烦，数据理解困难

相对定量—— ΔΔ Ct 法

相对定量——相对标准曲线法

当目的基因和内对照的扩增效率不一致时使用，只需知道稀释倍数 , 不需要知道准确拷贝数或浓度，需对每个基因作一条标准曲线

通过并列跑两条扩增曲线，查看指数增长期曲线是否平行来确定扩增效率是否相似 .

两种方法的区别

谢谢！